Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ex utero elektroporatie en Whole halfrond Explantaten: Een eenvoudige experimentele methode voor bestudering van vroege corticale ontwikkeling

Published: April 3, 2013 doi: 10.3791/50271
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Neuroscience and Physiology, SUNY Upstate Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft een verbeterde explantaat procedure die inhoudt dat

Abstract

Corticale ontwikkeling brengt complexe interacties tussen neuronen en niet-neuronale elementen waaronder precursor cellen, bloedvaten, meninges en bijbehorende extracellulaire matrix. Omdat ze een geschikte organotypische omgeving worden corticale slice explantaten vaak gebruikt om de interacties die neuronale differentiatie en ontwikkeling controleren onderzoeken. Hoewel nuttig, kan de slice explantaat model last hebben van nadelen waaronder afwijkende cellulaire lamineren en migratie. Hier rapporteren geheel hersenhelft explant voor studies van vroege corticale ontwikkeling die gemakkelijker te bereiden dan corticale schijfjes en shows consistente organotypische migratie en lamineren. In dit modelsysteem vroege lamineren en migratiepatronen normaal doorgaan gedurende twee dagen in vitro, inclusief de periode van preplate splitsen, waarbij potentiële corticale laag zes vormen. Vervolgens hebben we ontwikkelden een ex utero elektroporatie (EUEP)aanpak die ~ 80% succes bij de opsporing van GFP expressie om neuronen te ontwikkelen in de dorsale mediale cortex bereikt.

De hele halfrond explantatie model maakt vroege corticale ontwikkeling toegankelijk voor elektroporatie, farmacologische interventie en live imaging benaderingen. Deze methode vermijdt het voortbestaan ​​operatie vereist van in utero elektroporatie (IUEP) benaderingen, terwijl het verbeteren van zowel de transfectie en areal gericht consistentie. Deze werkwijze vergemakkelijkt experimentele studies van neuronale proliferatie, migratie en differentiatie.

Introduction

De zoogdieren hersenschors vormen door de gecoördineerde proliferatie, migratie en differentiatie van achtereenvolgens gegenereerde neuronen. Elk neuron is geboren in de ventriculaire zone (VZ) en migreert van de VZ in de tussenliggende zone (IZ), de vorming van de corticale plaat (CP) 1. Als ze door verschillende corticale gebieden, de migrerende neuronen tonen verschillende modi van migratie 2,3 die afhangen van het extracellulaire milieu en andere cellulaire elementen (bijv. radiale glia) in de zich ontwikkelende weefsel. Corticale neuronen dan arresteren migratie bovenaan de vormende corticale plaat in de samenvallende processen van neuronale migratie arrestatie en dendritogenesis 4.

Corticale ontwikkeling wordt gestart tussen embryonale dag 11-13 (E11-13) 5 tot oprichting van de primordiale plexiform laag 6 of preplate (PP), een laag van pionier neuronen die ligt over de VZ. Aanstaandelaag 6 corticale neuronen (dwz de eerste corticale neuronen geboren in de VZ), dan oriënteren hun somata in een stereotype patroon en samenvloeien tot een aparte laag in de PP 7. Deze gebeurtenissen splitsing van de preplate in een oppervlakkige marginale (toekomstige corticale laag 1) en een diepe zone, waarbij de laatste bestaat uit aansluitplaat cellen (voorbijgaande corticale laag 7). Dit proces, genaamd preplate splitsen, is een fundamentele gebeurtenis in de toekomstige groei van de hersenschors 8.

Veel genetische mutaties geïdentificeerd die verstoren de verschillende aspecten van de corticale ontwikkeling 9. Corticale ontwikkeling kan ook negatief worden beïnvloed door blootstelling aan geconsumeerde stoffen als cocaïne 10 en alcohol 11. Omdat corticale afwijkingen die ontstaan ​​tijdens de ontwikkeling zijn waarschijnlijk bijdragen aan neurologische aandoeningen (bijv. autisme, schizofrenie), empirische onderzoeken van storingen aan de corticale ontwikkeling zijn inherently belangrijk. Het is daarom van groot belang om benaderingen vast te stellen corticale ontwikkeling dat een snelle testen van genetische of toxine effecten toestaan, maar dat ook de mogelijke interacties tussen differentiëren neuronen, andere celtypes en extracellulaire matrix (ECM) behouden tijdens deze vroege periode van ontwikkeling van de hersenen 12 studiepunten .

Slice explantaten 13 hebben een dergelijk systeem en zijn alom gebruikt voor het testen corticale neuron ontwikkeling 14-16. Echter, slice assays het nadeel dat neuronale migratie en lamineren kan abnormaal mogelijk 17 door schade aan de meningeale cellen die de ontwikkelende hersenen en verankeren de radiale gliale steiger omringen. Als radiale gliale vezels een belangrijk substraat voor corticale neuron migratie 18 verstoring van de basale lamina door het snijden kan plaatselijk verstoren radiale gliale architectuur en leiden tot gewijzigde corticale migratie. Bovendien de sliCED oppervlakken van explantaten biedt een regio van dode cellen die de normale samenstelling van de ECM in deze gebieden kunnen veranderen.

Meer recente benaderingen richtten hun analyse op cellen diep in de slice die worden omringd door passende gezonde soorten cellen en ECM. In sommige gevallen deze nieuwere benaderingen vereisen dat de oorspronkelijke dikke plak gekweekte cryo-sectie of paraffine secties na fixatie zodat de relatief normale inwendige van het segment beschikbaar is voor analyse 19-21. Zowel de originele vibratome snijden de live segmenten voor cultuur en de daaropvolgende cryosectioning vaste segmenten voor analyse te maken dient zorg en inspanning voor deze assays werken.

Om een eenvoudige en complementaire aanpak voor de studie van de vroege corticale ontwikkeling te bieden, hebben we gewijzigd van een bestaande slice benaderingen 13 tot studies van de vroege corticale ontwikkeling mogelijk te maken. We hebben een whole halfrond explantaat model vergelijkbaar met een bestaande E14 hele halfrond model dat schudden culturen die op 65 omwentelingen per minuut en toegestane organotypische groei gedurende 16-18 uur 22,23. In onze benadering worden volledige halfrond explantaten bovenaan semi-permeabel membraan 13 met een zuurstofrijke atmosfeer cultuur 21,24 tot organotypische corticale groei verlengen gedurende 48 uur. Deze aanpak maakt het ook mogelijk consistente elektroporatie ontwikkelen corticale neuronen. De embryo's verwijderd uit de baarmoeder en geëlektroporeerd met plasmide DNA te introduceren en de grote hersenen wordt dan ontleed. Elk halfrond is geïsoleerd en geplaatst mediale zijde naar beneden op een collageen gecoate filter. Het explantaat wordt vervolgens gekweekt gedurende 48 uur, een periode die preplate splitsing 8 omvat. Tijdens de kweekperiode, L6 neuronen ontwikkelen van voorloper van gedifferentieerde neuron 25, de juiste positie binnen de corticale plaat. Gedurende deze periode is de ontwikkeling vanneuron wordt omringd door de juiste ECM en celtypen die de desbetreffende cel in vivo zouden voordoen. Dit systeem heeft al bewezen waardevol bij het ​​ontcijferen van de cellulaire gebeurtenissen die ethanol toxiciteit 26, laag 6 vorming en preplate splitsen 7,25 ten grondslag liggen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Ex utero elektroporaties met Green Fluorescent Protein expressieplasmide

  1. Plasmide DNA injectieoplossingen worden bereid met CAG-eGFP DNA 27 verdund tot de uiteindelijke werkende concentratie van 0,33 mg / ml in ddH 2 O. Endo-Free Qiagen Maxi-Preps worden gebruikt om het plasmide te zuiveren van getransformeerde bacteriën. Fast green kleurstof bij ~ 0,02% (w / v final) toegevoegd aan de DNA oplossing als injectie tracer.
  2. Om het operatiegebied te bereiden, Spuit werktafel, en dissectiemicroscoop podium met een 70% ethanol-oplossing en wrijf ze droog. Spuit chirurgische schaar en pincet met 70% ethanol voor dissectie en droog vegen.
  3. Timed Zwangere Zwitsers / Webster dammen worden geofferd op E13 door te brengen in een kamer gevuld met CO 2 uit een onder druk cilinder en de dam wordt gecontroleerd totdat alle delen volledig stilstaan ​​gedurende minstens 1 minuut. Na opoffering door CO2 inhalatie de embryo's uit de uterus en ineen 10 cm Petrischaal met ijskoude Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS).
  4. Voorzichtig ontleden elk embryo uit de omliggende extra-embryonale membranen en te houden in ijskoud HBSS.
  5. Breng elke individueel embryo een tweede 10 cm petrischaal met koude HBSS. Gebruik een Hamilton spuit tot 2-3 pi van het DNA fast green mengsel te injecteren in het ventrikel van de linker hersenhelft, zorg te injecteren in een corticaal gebied ruimtelijk gescheiden van de corticale gebied voor toekomstige analyse.
  6. Om electroporate, Houd het embryo met een tang en licht de positieve peddel van de pincet elektrode op de dorsale middellijn van het hoofd en licht plaats de negatieve peddel onder de embryo kin. Elektroporaties worden bereikt met een BTX830 electroporator geprogrammeerd vijf 30 V pulsen van 50 msec duur gescheiden door 950 msec intervallen leveren. Deze instellingen zijn voor de BTX830 model. Andere systemen kunnen worden gebruikt volgens de fabrikant INSTRUCTIEns.

2. Hele halfrond Explantatie Voorbereiding

  1. Na elektroporatie worden de embryo's teruggeplaatst in ijskoude HBSS. De hersenen worden verwijderd met twee nummer 5 jeweler forceps op de huid en kraakbeenachtige schedel uit de embryo hoofd. Een pincet wordt dan geschoven onder de hersenen om de intacte hersenen uit de schedel. De geëlektroporeerde halfrond (links) wordt vervolgens weggesneden uit de hersenen en de bijgevoegde tussentijdse hersenweefsel verwijderd. Gedurende de dissectie procedure zorg is genomen om geen schade aan de hersenvliezen bovenop de linker corticale halfrond.
  2. Eenmaal ontleed elk embryo wordt overgedragen in HBSS met behulp van een pipet met een cut 1 ml pipet tip. Het halfrond is zacht verdreven op een collageen gecoate cultuur insert. Tot zes halfrond explantaten zijn gerangschikt mediale zijde naar beneden op elke 24 mm insert. Eenmaal aangebracht, overmaat HBSS wordt uit het inzetstuk en het inzetstuk wordt vervolgens geplaatst in een 35 mm putje van een 6 putjes schaal. De goed bevat EXActly 2,7 ​​ml media: DMEM-F12 medium dat Glutamax en aangevuld met 2% B-27, 1% G5 en 1% penicilline-Strep. Een paar druppels van de media uit de put kan worden gepipetteerd op elkaar explant, maar niet media voeg dan de oorspronkelijke 2,7 ml per putje.
  3. Nadat de explantaten zijn geplaatst op de Collagen filters 6 well schaaltje met de explantaten wordt in een Billups Rothenberg (BR) kamer (die ook een bevochtigingsinrichting schotel water bevat). A 95% / 5% zuurstof / CO 2 gasmengsel wordt ingebracht in de kamer gedurende ten minste 1 min voor het afdichten van de kamer dicht en loskoppelen van de 95% / 5% zuurstof / CO 2 gastoevoerbuis. De BR kamer wordt vervolgens geplaatst in een 37 ° C incubator weefselkweek voor de rest van de kweekperiode, 1-2 DIV.

3. Fixatie van Explantatie weefsel voor histologie

  1. In een zuurkast bereiden Pagano fixatie-oplossing door eerst solubiliserende 8 g paraformaldehyde in 100 ml voorverwarmde (~ 80 & deg; C) ddH 2 O. Voeg 1-3 druppels geconcentreerd NaOH te solubilisatie bevorderen en voorzichtig roeren. Zodra opgelost mengen 8% paraformaldehyde oplossing 1:1 met een oplossing die 500 mM sucrose, 100 mM Hepes, pH 7,4, 50 mM MgCl2, 5 mM KCl een eindconcentratie van 4% paraformaldehyde in 250 mM sucrose 50 mM Hepes , 25 mM MgCl2, 2,5 mM KCl, pH 7,4.
  2. Om vast te stellen de explantaten de Pagano fix oplossing opwarmen tot 37 ° C. Snel het grootste deel van de DMEM/F12 media goed te verwijderen uit elke cultuur en voeg 5 ml van Pagano Fix aan elk putje van explantaten. Zorg ervoor dat u elke explantatie volledig te bedekken in fix. Oplossing voor 1 uur bij RT. Verwijder geen explantaten van filter voor 1 uur van fixatie.
  3. Na fixatie verwijderen Pagano fix oplossing en vervangen door Pagano oplossing zonder fix (250 mM sucrose 50 mM Hepes, 25 mM MgCl2, 2,5 mM KCl, pH 7,4). Enkele druppels van 10% natriumazide en bewaar bij 4 ° C tot inbedding.

4. Inbedding en Sectioning voor histologie

  1. Bereid een 10% gelatine oplossing kalfshuid door het oplossen van 10 g van kalfshuid gelatine in 100 ml warm water (55-60 ° C). Plaats gelatine-oplossing op een hete plaat is ingesteld op 60 ° C en schud regelmatig tot oplossing gebracht.
  2. Giet ongeveer 10 ml van de 10% gelatine-oplossing in de bodem van een 10 cm Petrischaal en laat 30 minuten stollen. Dit zal een "pad" voor het inbedden van de explantaten. Deze pads kunnen bereid dagen op voorhand en bewaard bij 4 ° C. Gebruik een liniaal om een ​​raster te tekenen op de bodem van de petrischaal en breng individuele explantaten in elk vakje van het rooster. Resten van Pagano oplossing en het gebruik van een pipet, bedek elk explantatie met warme 10% gelatine-oplossing en laat stollen. Resume langzame toevoeging van gelatine-oplossing totdat elke explantatie is volledig omringd door gelatine, zorg ervoor dat u de pad smelten door de toevoeging van te veel warm gelatine in een keer. Laat de gelatine te verharden voor ~ 1 uur. Eenmaal uitgehard de individuele explantaten kan worden gesneden in kleine blokjes gelatine. De blokken worden vervolgens nagefixeerd in Pagano vast gedurende 24-48 uur voorafgaand aan segmenteermiddelen een vibratome.
  3. Explantaten in gelatine blokken worden geplaatst reukkwab en doorgesneden in het frontale vlak van 100 pm dikte. De secties worden verzameld en opgeslagen in PBS + 0,1% natriumazide bij 4 ° C tot immunohistochemische verwerking.
  4. Immunohistochemische detectie wordt uitgevoerd door overdracht van secties in een plaat met 24 putjes (2-3 delen per well). Eerste blok niet-specifieke antilichaambinding door toevoeging van 0,5 ml PBST + B (PBS + 0,5% Triton X 100 en 2% BSA) aan elk putje, incubate 1 uur onder zachtjes schudden. De geschikte primaire antilichaam wordt vervolgens verdund in PBST + B en 0,4 ml per putje toegevoegd voor incubatie gedurende de nacht bij kamertemperatuur. De primaire uitgewassen met PBS wast 3X ten minste 10 minuten elk. Het secundaire antilichaam en 2 ug / ml Hoechst 33342 nucleaire vlek worden verdund in PBST + B en de monsters worden gedurende 2 uur bij KTonder voorzichtig schudden. Drie PBS wassingen (10 min elk) uitgevoerd en de secties zijn gemonteerd op objectglaasjes met een 90% glycerol 50 mM Tris, pH 7,4, fixeermiddelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De embryonale knaagdier cortex vertoont een dwarse neurogenetische gradiënt gedurende de ontwikkelingsperiode, zodanig dat laterale neocortex is ongeveer 1 dag volwassener dan dorsale mediale neocortex 28. Het grootste deel van laag 6 neuronen aldus verkregen (dwz vertonen hun laatste S-fase) op E12 in laterale cortex (ook wel Field 40 5) en E13 in de dorsale mediale cortex (ook wel Field 1 5). Preplate splitsen begint na ongeveer 1 dag Laag 6 neuron generatie en dus wordt ingewijd in de laterale cortex op E13 en de dorsale cortex op E14. Om preplate splitsing en de inleiding van corticale plaat ontwikkeling onderzoeken hebben we een stuk bewerkt explant assay 21,24 zodat gehele hersenhelften meestal werden gekweekt uit E13 tot E15 (Figuur 1).

We testten de levensvatbaarheid van de corticale explant techniek door onderzoek van de groei van gehele halfrond explantaten derived van Tg (Eomes :: eGFP) GSAT muizen (Figuur 2). Dit muizenstam bevat een transgen dat onvolwassen neuronen van de stimulerende corticale lijn 7,29,30 meldt. Whole halfrond corticale explantaten werden bereid bij E13, op een tijdstip voorafgaand aan splitsing preplate in de dorsale neocortex (Figuur 2A). Corticale explantaten uit hetzelfde nest werden achtereenvolgens daling vastgesteld over een periode van 2 DIV en bewerkt voor latere histologische analyse. Bij de eerste analyse tijdstip (DIV 0), heeft preplate splitsing nog niet plaatsgevonden in Veld 1 (Dorsale neocortex, Figuren 2A, 2E). 1 DIV door de CP blijkt (figuren 2B, 2C, 2F, 2G), en blijft groeien tot 2 DIV (figuren 2D, 2H). Dus de hele halfrond explantaten aanvankelijk gekweekt op E13 ondersteuning voor twee dagen de rijping van de cerebrale cortex en vangt preplate splitsen in de dorsale neocortex.

Om norm te bevestigenal histologische ontwikkeling in de dorsale neocortex, we immunogekleurd 2 DIV explantaten voor chondroïtinesulfaat proteoglycanen (CSPGs), een extracellulaire matrix component die ook een gevestigde marker van het PP en de derivaten MZ en SP 8,31,32. Immunokleuring voor CSPGs onthult twee banden van CSPG immunoreactiviteit in de dorsale cortex waarin passende splitsing van het PP in MZ en SP tijdens de in vitro kweekperiode (figuren 3A-3C). De PP wordt gesplitst door L6 corticale neuronen die bekend zijn bij de transcriptiefactoren Ctip2 en TBR1 7,33,34 drukken. De immunokleuring patroon van deze merkers (Figuren 3D-3F, 3G-I, respectievelijk) bevestigt de juiste expressie van deze transcriptiefactoren in de nieuw gevormde CP. Samen vormen deze analyses bevestigen organotypische vroege corticale ontwikkeling in het hele halfrond explantaten.

In utero elektroporaties zijn uitgebreid gebruiktte assay voor cel autonome genfunctie in ontwikkelingslanden cortex 35. Daarom testten of elektroporatie met succes zou kunnen neuronen in het hele halfrond explantaat model transfecteren. De linkerventrikel van intact E13 embryo's werden geïnjecteerd met 0,33 mg / ml CAG-GFP plasmide en geëlektroporeerd (zie werkwijzen) om het plasmide DNA in de neuronale precursors die langs de laterale ventrikel (Figuur 1A). Na 2 DIV de explantaten geseponeerd vaste en doorgesneden voor histologische analyse. Op dit tijdstip werden GFP tot expressie brengende cellen waargenomen bij alle zones in de corticale wand cerebrale (figuren 4A-4C). GFP expressie kon worden waargenomen van neuronale precursors in de VZ terwijl intense GFP tot expressie brengende cellen waargenomen in de IZ en CP. Belangrijk werden tal GFP + neuronen waargenomen bovenaan de vormende CP met opkomende dendrieten en axonen. De cellen vormden een discrete laag bij het grensvlak tussen de CP en MZ indicatie vang juiste migratie arrestatie en lamineren (Figuren 4A-4C, pijlen). De dendrieten verlengd terwijl de MZ corticofugal axons reiken dan CP en in de IZ (figuren 4A-4C en 5 Zie ook aanvullende Movie S1). Onder de differentiërende cellen GFP + cellen in verschillende staten van rijpheid, met inbegrip van neuronen met een bipolaire morfologie, naast elkaar geplaatst om radiale glia vezels en onder hen, multipolaire neuronen in de IZ (Figuren 4D-4F). Bovendien worden de dendrieten waargenomen uitstrekt in de MZ waar de ECM eiwit Reelin is geschikt immunolocalized (figuren 4G-4I). De elektroporatie en explantatie voorwaarden dus mogelijk een normale ontwikkeling van de corticale neuronen door de stadia van voorloper van migrerende neuron te onvolwassen differentiëren neuron.

Op het moment van elektroporatie (E13) 100% van de neuronen door de dorsale neocorticale VZ zijn L6 neuronen neuronendat splitsing van de PP 5. Succesvolle elektroporatie vereist dat constructen worden geïntroduceerd in neuronen tijdens de 6 uur onmiddellijk vóór of tijdens M-fase van de celcyclus 36. Het is dus te verwachten dat de vroegste postmitotische, GFP + neuronen na E13 elektroporatie in de dorsale cortex (Veld 1) moet de vorming CP bevolken. Dergelijke neuronen waargenomen (figuur 4) dat de protocol betrouwbaar L6 corticale neuronen voor studies van hun migratie en maturatie richten.

Om het "succes" van de elektroporatie / explantatie procedure schatten analyseerden we een lopend onderzoek van ons laboratorium. In de loop van deze studie hebben 21 nesten van explantaten opgesteld, in totaal 248 embryo's werden geëlektroporeerd (zoals hierboven beschreven) met CAG-GFP en een halfrond explant van elk embryo werd bereid. Van de oorspronkelijke 248 explantaten werden 195 (79%) beoordeeld geschikt voor beeldvorming en analyse. Ongeveer de helft van de 53explantaten die niet konden worden geanalyseerd geen GFP expressie of hadden verkeerd gerichte GFP expressie. De resterende verliezen werden verklaard door dysmorphic groei als gevolg van onthechting explanteren van de cultuur filter, of problemen in verband met histologische verwerking. Dit succespercentage van ongeveer 80% (figuur 5) is gemaakt het explantaat geschikt voor farmacologische studies 26 en de analyse van recessieve mutaties 7 die negatief vroege corticale ontwikkeling beïnvloeden.

Figuur 1
Figuur 1. Whole halfrond explant procedure ex utero elektroporatie. A) E13 muizenembryo's worden geïnjecteerd met een plasmide DNA oplossing en geëlektroporeerd. De hersenen worden ontleed en sagitally doorsneden. De geëlektroporeerdehalfrond Daarna worden mediale zijde naar beneden op een collageen gecoate filter en gedurende 2 DIV. De hersenhelften kan dan worden afgebeeld levend of gefixeerd voor histologie en daaropvolgende beeldanalyse. B) Een foto van 10 explantaten geplaatst op drie filters in een zes goed weefselkweekplaat. C) De zes goed schotel met explantaten wordt in een zuurstofrijke omgeving (95% O2 / 5% CO 2) in een Billups-Rothenberg Incubator kamer, waarna wordt geplaatst in een standaard 37 ° C weefselkweek incubator.

Figuur 2
Figuur 2. Organotypische groei van corticale plaat geheel halfrond explantaten uit een nest van Eomes :: eGFP embryo. A, E) Een coronale doorsnede van een drop-vaste hersenen aan het begin van de cult ure periode (O DIV). Merk op dat de PP aanwezig maar nog CP vormen. De groene signaal wordt geproduceerd door GFP expressie in onrijpe exciterende neuronen en de blauwe kleurstof Hoechst is dat de kern van alle cellen labelt. B, F). CP groei, aangegeven met stippellijnen, wordt waargenomen met 0,5 DIV en verhoogt met 1 DIV (C en G) en 2 DIV (panelen D en H). Let op de grotere dikte van de GFP expressie cel domein in panels AD, waarin de proliferatie en differentiatie van de excitatoire neuron lineage in het explantaat. Schaalbalken zijn 500 urn (panel A) en 50 pm (panel H). Afkortingen: CP, corticale plaat, IZ, intermediaire zone, MZ, marginale zone, SP, aansluitplaat, VZ, ventriculaire zone.

/ 50271/50271fig3.jpg "/>
Figuur 3. Preplate splitsing geheel halfrond explantaten. AC) Chondroïtinesulfaat proteoglycan (CSPG) immunokleuring toont de verdeling (splitsing) van het PP in de MZ en SP. DF) Expressie van de transcriptiefactor Ctip2 in de nieuw gevormde CP. GI) Expressie van het transcriptiefactor TBR1 in de nieuw gevormde CP. Schaal bars zijn 50 pm in panelen C, F, I.

Figuur 4
Figuur 4. GFP-expressie in zijn geheel halfrond explantaten na E13 ex utero elektroporatie. AC) GFP expressie na 2 DIV. Let op de laag van corticale neuronen die bovenaan de CP (pijlen). DF) Nestin (rood) immunoreactivheid in een sectie van een geheel halfrond explant. GH) Reelin (rood) immuunreactiviteit in een gedeelte afgeleid van een geheel halfrond explantaat. Scale bars in panelen C, F, en ik zijn 50 pm.

Figuur 5
Figuur 5. Variabiliteit in targeting ex utero elektroporaties met dorsale mediale cortex (veld 1). Elf embryo uit een nest werden geëlektroporeerd met het CAG-GFP expressie construct (0,33 mg / ml) en gekweekt als geheel halfrond explantaten. AI) Negen van de elf explantaten toonde expressie van GFP in dorsale mediale cortex. Hoewel GFP expressie varieert explantaten, is in elk explantaat GFP waargenomen in alle drie corticale zones (dwz VZ, IZ en CP). Scale bar is 50 um in paneel A.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We hebben verbeterd en geëvalueerd een experimenteel model - hele halfrond explantaten - voor de studie van de vroege corticale ontwikkeling (E13-E15). Het model nuttig is gebleken voor de analyse van migratie en differentiatie van de excitatoire neuron lijn die laag 6 van de cerebrale cortex 25,37 vormt. De belangrijkste voordelen van het systeem zijn 1) organotypische groei 2 DIV, 2) eenvoud van bereiding en 3) experimentele toegang tot de neuronen voor elektroporatie, farmacologische manipulatie en beeldvorming tijdens deze vroege, kritische periode van hersenontwikkeling. Wij hebben gebruik gemaakt van het systeem om subtiele verschillen in de morfologie, oriëntatie en dendritische groei van laag 6 corticale neuronen 7,38 tijdens de periode van preplate splitsen documenteren.

De prikkelende neuronen die laag 6 bevolken zijn grotendeels samengesteld uit corticothalamic projectie neuronen die wederzijdse bijdrage te leveren aan de dorsale thalamus 39,40 41. Hoewel deze neuronen zijn fysiologisch gespecialiseerde, de productie, migratie en rijpingsproces van laag 6 neuronen aandelen basisfuncties met alle prikkelende neuronen in lagen 2-6 van de cortex. Bijzonder alle corticale neuronen exciterend worden gegenereerd in de dorsale telencephalic VZ, migreren door de IZ als multipolaire neuronen en differentiëren binnen de CP 7. De rijping van prikkelende corticale neuronen wordt aangedreven door een kerngroep van achtereenvolgens uitgedrukt transcriptiefactoren: Pax6, tbr2 en TBR1 29. Deze sequentie wordt gedeeld door alle excitatoire neuronen in lagen 2-6 42 en we bevestigd de juiste expressie van TBR1 in de nieuw gevormde CP (figuren 3G-3I). Gebruik makend van deze benadering voor de ontwikkeling van laag 6 corticale neuronen onderzoek moet dus essentiële inzichten in de ontwikkeling van neuRons dat alle corticale lagen vormen.

Hele halfrond explantaten aanvulling op de bestaande benaderingen voor de studie van corticale neuron ontwikkeling. Voorafgaande studies hebben gebruikt een E14 hele halfrond explantatie benadering van corticale ontwikkeling te bestuderen voor 1 DIV 22,23. We hebben gekoppeld hele halfrond explantaten met ex utero elektroporatie 2 dagen corticale ontwikkeling onderzoeken tijdens de vorming en L6 preplate splitsen. In tegenstelling tot in de baarmoeder elektroporaties op E13, het slagingspercentage van ex utero elektroporaties gevolgd door hele halfrond explantatie is hoger: in onze handen bereiken we ~ 80% succes bij de opsporing van elektroporatie van de dorsale telencephalon. Bovendien, in utero elektroporaties vereisen een survival operatie en aanzienlijk meer technische inspanning dan het hele halfrond ex utero aanpak. Tenslotte in utero studies niet gemakkelijk vatbaar nauwkeurige farmacologischemanipulaties en imaging aanpak. Nauwkeurige tijdelijke controle in de levering of activering van drugs en ​​moleculaire middelen (expressievectoren, zwijgen constructen, etc) op vastgestelde concentraties is voorzien geheel halfrond explantaten, maar is moeilijker te bereiken in utero. Leven optische controle van de resulterende effecten van dergelijke manipulaties met ruimtelijke resolutie in het microngebied, gemakkelijk beschikbaar EUEP, maar niet IUEP. Een dergelijke precisie is waarschijnlijk belangrijke mate de interpretatieve kracht van de gegevens die experimenten met corticale ontwikkeling en functie. Dus voor studies van de vroege corticale ontwikkeling gehele halfrond explantaten bezitten duidelijke experimentele voordelen ten opzichte van de in de baarmoeder aanpak. Op dit moment, echter, voor studies van de bovenste laag corticale neuronen en experimenten die het verzamelen van gegevens> 48 uur, slice explantaten en in utero benaderingen blijven de voorkeur.

Er zijn verschillende kritische eisen voor het succes van het gehele halfrond explantaat techniek. Eerste groei van de explant zeer gevoelig is voor de mechanische integriteit van het hersenvlies. Fysieke schade aan de hersenvliezen (dat wil zeggen gaatjes of scheuren) zal verstoren op een minimum lokale ontwikkeling van de onderliggende cortex. Tweede explant groei gevoelig is voor het totale volume van media in de kweekputje: met teveel media de explantaten zal loskomen van de filter en ontwikkelen vervormde CP architectuur, met te weinig media en de explantaten waarschijnlijk uitdrogen en een overmatige celdood . Ten slotte, met de huidige techniek explantaten hebben we gedocumenteerd corticale groei voor 2 DIV. Bij het starten van op E13 deze ontwikkeling tijdvenster, hoewel toe veel waardevolle onderzoeken, beperkt analyses op een periode voorafgaand aan synaptogenese en canonieke neuronale communicatie. Hoewel de corticale neuronen op E14.5 express veel mRNA's die coderen voor synaptische eiwitten (w.genepaint.org "target =" _blank "> www.genepaint.org), is synaptogenese begint pas ~ E15 in de laterale cortex, en dit synaptogenese is beperkt tot cellen in plaats van laag 6 neuronen 43 preplate. Sommige kritische vragen over corticale synapsvorming en functie dus momenteel niet adresseerbaar met het hele halfrond explantaat systeem.

In de conclusie van de hele halfrond explantaat voorbereiding betrouwbaar en consistent worden gebruikt om de vroege corticale ontwikkeling te onderzoeken in muismodellen van erfelijke misvormingen hersenen. De techniek is eenvoudig aanpasbaar aan RNAi, shRNA en andere moleculaire en farmacologische manipulaties. Het gehele halfrond explant is ook geschikt voor studies met recombinant eiwit toegepast, drugs en giftige stoffen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund subsidies van NINDS (NS066071) en de NIAAA. (P50AA017823) naar ECO. De auteurs danken dr. Robert Quinn en het personeel van de afdeling Proefdierkunde Middelen voor verzorging van dieren. Wij danken Judson Belmont voor technische ondersteuning, Nicole Belletier voor bijstand als een zomer Undergraduate Research Fellow (SURF). We danken ook dr. David Cameron voor commentaar en bewerkingen op een eerdere versie van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM/F12 + GlutaMAX GIBCO 10565
G5 Supplement 100X Invitrogen 17503-012
B27 Serum-Free Suppl. 50X Invitrogen 1504-044
Pen / Strep Liquid 100X Invitrogen 15140-122
HBSS 500 ml GIBCO 14025
Culture insert collagen coated Costar 3492
Bovine skin gelatin Sigma G9382
H–chst 33342 Invitrogen H1399
Bovine Serum Albumin Sigma 7906
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
Equipment
BTX 830 Electroporator Harvard Apparatus 450052
Tweezer electrodes 10mm Harvard Apparatus 450166
Incubator Billups Rothenberg MIC-101
Hamilton syringe (5uL) Hamilton 87930
Hamilton syringe needle Hamilton 7803-04 Specify 1" and style 4
Dumont #5 Forceps FST 11251-10
Fine Scissors Tough Cut 9 cm FST 14058-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
  2. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).
  3. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. , (2004).
  4. Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression. J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).
  5. Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall. J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).
  6. Marin-Padilla, M. Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization. Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).
  7. Nichols, A. J., Olson, E. C. Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting. Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).
  8. Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse. J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).
  9. Manzini, M. C., Walsh, C. A. What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).
  10. Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure. Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).
  11. Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level. Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).
  12. Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. The critical impact of early cellular environment on neuronal development. Prev. Med. 27, 180-183 (1998).
  13. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  14. O'Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex. Science. 258, 299-302 (1992).
  15. Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex. Nature. 448, 901-907 (2007).
  16. Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
  17. Gotz, M., Bolz, J. Formation and preservation of cortical layers in slice cultures. J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).
  18. Cameron, R. S., Rakic, P. Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells. J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).
  19. Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (63), e3621 (2012).
  20. Jossin, Y., Goffinet, A. M. Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).
  21. Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development. J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).
  22. Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding. Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).
  23. Rehen, S. K., et al. A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization. J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).
  24. Jossin, Y., et al. The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).
  25. O'Dell, R. S., et al. Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone. Neural. Dev. 7, 25 (2012).
  26. Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons. Alcohol. , (2012).
  27. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).
  28. Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).
  29. Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).
  30. Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45, 208-217 (2007).
  31. Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. Extracellular matrix in early cortical development. Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).
  32. Milev, P., et al. Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).
  33. Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).
  34. McKenna, W. L., et al. Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).
  35. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  36. Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).
  37. Powrozek, T. A., Zhou, F. C. Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network. Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).
  38. O'Dell, R., et al. Society for Neuroscience. , Washington D.C. (2011).
  39. Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons. Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).
  40. Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex. Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).
  41. Jones, E. G. Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex. Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).
  42. Kowalczyk, T., et al. Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. , (2009).
  43. Konig, N., Roch, G., Marty, R. The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex. Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).

Tags

Neuroscience Genetica neurobiologie Developmental Biology Anatomie fysiologie moleculaire biologie celbiologie Bioengineering Tissue Engineering preplate splitsen, genfunctie assay, GFP halfrond explantaten genexpressie plasmide explantatie weefsel de celkweek weefselkweek diermodel
<em>Ex utero</em> elektroporatie en Whole halfrond Explantaten: Een eenvoudige experimentele methode voor bestudering van vroege corticale ontwikkeling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nichols, A. J., O'Dell, R. S.,… More

Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development. J. Vis. Exp. (74), e50271, doi:10.3791/50271 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter