Summary
このプロトコルは含ま改良植手順を説明
Abstract
皮質の発達は、前駆細胞、血管、髄膜および関連する細胞外マトリックスを含む神経細胞と非神経要素間の複雑な相互作用を伴います。彼らは適切な器官の環境を提供するため、皮質スライス外植片は、多くの場合、ニューロンの分化·発達を制御し、それらの相互作用を調べるために使用されます。有益なものの、スライス植モデルは異常な細胞積層および移行などの欠点に苦しむことができます。ここでは、皮質切片より準備が簡単で、一貫性のある器官の移行およびラミネーションを示す初期の皮質の発達についての研究のために全体の大脳半球の植システムについて報告する。このモデルシステムでは、初期のラミネーションと移行パターンは、preplate分割の期間を含め、in vitroでの 2日間にわたって、通常の前向き皮質層の間に6フォームを進みます。次に、 元の子宮内エレクトロポレーション（EUEP）を開発背内側皮質に開発ニューロンにGFPの発現を標的に〜80％の成功を実現したアプローチ。
全体の半球植モデルはエレクトロポレーション、薬理学的介入とライブイメージングアプローチのための初期の皮質発達にアクセスできるようになります。トランスフェクションおよび面積ターゲティング一貫性の両方を向上させながら、この方法では、 子宮内エレクトロポレーション（IUEP）アプローチで求められる生存の手術を回避することができます。この方法では、神経細胞の増殖、遊走および分化の実験的研究を促進するであろう。
Introduction
連続して生成されたニューロンの協調的な増殖、遊走及び分化を通じて哺乳類大脳皮質を形成する。各ニューロンは脳室帯に生まれた（VZ）と皮質板（CP）の1を形成し 、中間帯（IZ）にVZから移動されています。彼らは異なる皮質領域を通過する際、移行のニューロンが細胞外環境と開発組織内の他の細胞成分（ 例えば放射状グリア）に依存する移行2,3の複数のモードを表示します。皮質ニューロンはその後ニューロン移動の逮捕とdendritogenesis 4の同時プロセスにおける成形皮質板の上部に移行を逮捕。
皮質の発達は、胚の始原日網状層6またはpreplate（PP）、その上に重なるVZパイオニアニューロンの層の設立を通じて、11月13日（E11-13）5との間で開始されます。プロスペクティブその後層6皮質ニューロン（VZで生まれすなわち第一皮質ニューロン）の向きは、そのステレオタイプのパターンで細胞体およびPP 7内の別個の層に合体。これらのイベントは、表面的な限界（将来の皮質第1層）とディープゾーン、サブプレート細胞（一過性皮質の第7層）から成る後者にpreplateを分割します。このプロセスは、preplate分割と呼ばれる、大脳皮質8の将来の成長の基盤となるイベントです。
多くの遺伝的変異は皮質発達9の様々な側面を混乱させることが確認されている。皮質の開発も悪影響コカイン10とアルコール11と摂取毒素への暴露によって影響を受ける可能性があります。開発中に発生する皮質奇形、神経障害（ 例えば自閉症、統合失調症）への貢献者である可能性が高いので、皮質発達に摂動の実証的調査が内在している重要LY。これは、遺伝的または毒素効果の迅速なアッセイを可能にするだけでなく、脳の発達12の初めに、この期間中に差別ニューロン、他のタイプの細胞と細胞外マトリックス（ECM）との間の相互作用の可能性を維持することが皮質の発達を研究するための手法を確立するためにかなりのに重要である。
スライス外植片13は、このようなシステムを提供していると広くアッセイ皮質ニューロンの発達14から16に使用されてきた。しかし、スライスアッセイは、神経細胞の遊走およびラミネーションは、おそらく脳の発達とアンカー放射状グリア足場を囲む髄膜細胞への損傷によって17異常なことができないという欠点に苦しむことができます。放射状グリア繊維はスライスによる基底膜の皮質ニューロンの移行18中断のための重要な基質であるとしてローカルに放射状グリアアーキテクチャを混乱させ、変化した皮質の移行につながる可能性があります。加えてSLI外植片の表面CEDは、これらの分野におけるECMの通常の構図を変化させることができる死んだ細胞の領域を提供します。
より最近のアプローチは適切な健康な細胞型とECMに囲まれているスライスの奥深くにある細胞に自分の分析を当てている。しかし、いくつかのケースでは、これらの新しいアプローチは、元の厚い培養スライスはスライスの比較的正常なインテリアが分析19から21のために利用可能になるように固定後、凍結切片またはパラフィン包埋切片であることを必要とすることができます。文化だけでなく、分析のために固定されたスライスのその後の凍結セクショニングのライブスライスを準備するセクショニングオリジナルビブラトーム両方がこれらのアッセイのためのケアと労力が動作する必要があります。
初期の皮質の発達についての研究のためのシンプルな、補完的なアプローチを提供するために、我々は初期の皮質の発達についての研究を促進する13既存のスライスのアプローチを変更しました。我々は、WHを開発した65分当たりの回転数と16〜18時間22,23に対して許可される器官の成長で振とう培養を関与して既存のE14全半球モデルに似たOLE半球植モデル。我々のアプローチでは、全体の半球の外植片を48時間器官皮質の成長を延長するために、高酸素培養雰囲気21,24内で半透膜13の上に配置されます。また、このアプローチは、皮質ニューロンの開発の一貫したエレクトロポレーションを可能にします。胚が子宮から取り出され、プラスミドDNAを導入するエレクトロポレーションとは、その後、終脳解剖されています。各半球を単離し、コラーゲンコートフィルタで内側を下に配置されます。外植片は、その後、48時間、preplate分割8を含む期間の期間培養する。培養期間中、L6のニューロンは皮質板内に正しく配置区別ニューロン25に前駆体から開発しています。この期間を通じて開発神経細胞は、 生体内の対応するセルに立ち向かうであろう適切なECMと細胞型に囲まれています。このシステムはすでにエタノール毒性26、層6の形成とpreplate分割7,25の根底にある携帯電話のイベントを解読に貴重であると判明しました。
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Protocol
プラスミドグリーン蛍光タンパク質発現との1。 のEx子宮内エレクトロポ
- プラスミドDNAの注射液は、蒸留H 2 O中0.33 mg / mlの最終作業濃度まで希釈したCAG-EGFP DNAを27を用いて製造されるキアゲン遠藤フリーマキシプレップは、形質転換された細菌からプラスミドを精製するために使用されています。 〜0.02％（w / vの最終）での高速グリーン色素が注入トレーサとしてのDNA溶液に添加される。
- 外科領域を用意し、70％エタノール溶液でベンチトップと解剖顕微鏡のステージを下スプレーして拭いてください。前切開に70％エタノールで手術用のハサミとピンセットをスプレーし、水分を拭き取ります。
- すべての動きは、少なくとも1分間停止するまで時限妊娠スイス/ウェブスターダムは加圧シリンダからCO 2を充填し、ダムが監視されるチャンバ内に転送することによりE13に屠殺されています。 CO 2吸入によって犠牲にした後の胚は子宮から取り出され、内に配置10cmペトリ皿含む氷冷ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）。
- 慎重に周囲の胚体外膜から各胚を分析し、氷冷HBSSに保つ。
- 冷HBSSを含む第二の10cmペトリ皿に個別に各胚を転送します。将来の分析のために皮質領域から空間的に分離した皮質領域に注入するために世話をして、左大脳半球の脳室にDNA速い緑混合の2-3μlを注入するためにハミルトンシリンジを使用しています。
- エレクトロポには、鉗子で軽く胚を保持し、軽く頭の背側正中線上にピンセット電極の正のパドルを置き、軽く胚のあごの下に負のパドルを置く。エレクトロポを950ミリ秒間隔で区切った50ミリ長さの5〜30 Vのパルスを提供するようにプログラムBTX830エレクトロで達成される。これらの設定はBTX830モデル用です。他のシステムは、製造業者の命令に従って使用することができるNS。
2。全体の半球植準備
- エレクトロポレーション後の胚は氷冷HBSSに戻されています。脳は胚ヘッドから皮膚と軟骨頭蓋骨を除去するために2つの＃5宝石商の鉗子を用いて除去する。鉗子は、その後、頭蓋骨から無傷の脳を削除するには、脳の下にスライドさせる。エレクトロポレーションした半球（左）は、脳から離れて解剖され、添付された中脳組織が削除されます。解剖手順ケアを通して左半球皮質を覆う髄膜に損傷を与えないように注意されています。
- 一度解剖し、各胚は、カット1ミリリットルピペットチップでピペッターを使用してHBSS中に転送されます。半球は優しくコラーゲンコート培養インサート上に排出されます。最大6つの半球の外植片には、各24ミリメートルの挿入時に内側を下に配置されている。一度配置された、過剰HBSSをインサートから削除され、挿入はその後6ウェル皿のウェル1 35ミリメートルに配置されます。井戸はエクサが含まれていますメディアのctly 2.7ミリリットル：グルタマックスと2％のB-27を補充し、1％G5および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを含むDMEM-F12培地。井戸からのメディアの数滴は、各外植片の上にピペッティングすることができますが、ウェルあたり2.7ミリリットルのオリジナル過剰にメディアを追加しないでください。
- 外植片はコラーゲンフィルター上に配置されていたら、外植片を含む6ウェルディッシュはビラップスローゼンバーグ（BR）の室（また、水の加湿皿を含む）に置かれます。 95％/ 5％酸素/ CO 2混合ガスは、チャンバを閉じて密封し、95％/ 10％酸素/ CO 2ガス供給管を切断する前に、少なくとも1分間チャンバー内に注入される。 BR室は、その後培養期間の残りの37℃の組織培養インキュベーター、1-2 DIVに配置されます。
3。組織学的検査のための植組織の固定
- ドラフト内で予熱した（〜80＆ド100ml中のホルムアルデヒドの最初の可溶化8グラムによってパガーノ固定溶液を調製グラム、C）蒸留H 2 O可溶化を促進し、穏やかに攪拌し、NaOHを集中して1-3滴を追加します。一度500mMのスクロース、100mMのHEPES、pH7.4で、50 mMのMgCl 2、250mMスクロース、50mMのHEPES中4％パラホルムアルデヒドの最終濃度5mMのKClであることは、ソリューションに8％パラホルムアルデヒド溶液を1:1で混ぜて可溶化、25 mMのMgCl 2、2.5mMのKClで、pHは7.4。
- 外植片を37℃にパガーノ修正液を温める修正するには迅速に各ウェルの培養物からDMEM/F12メディアのほとんどを除去し、外植片の各ウェルにパガーノ修正5mlを加える。修正で完全に各外植片をカバーすることを確認してください。室温で1時間を修正しました。前に固定の1時間にフィルターから外植片を外さないでください。
- 固定後パガーノ修正液を除去し、修正せずにパガーノ溶液（250mMスクロース50mMのHepes、25mMのMgCl 2を 、2.5mMのKClを、pH 7.4）で置き換えます。埋め込みまで4℃で10％のアジ化ナトリウムや店舗℃で数滴を追加します。
4。埋め込みとS組織学のためectioning
- 温水（55℃）100mlにふくらはぎ皮ゼラチン10gを可溶化することにより10％ウシ皮膚ゼラチン溶液を調製します。ホットプレートの上に置いてゼラチン溶液は、可溶化されるまで、定期的に60℃と渦を設定します。
- 10cmペトリ皿の底に10％のゼラチン溶液約10mlを注ぎ、30分が凝固することができます。これは、外植片を埋め込むための "パッド"を形成します。これらのパッドは、事前に準備された日とし、4℃で保存することができますシャーレの底に格子を描き、グリッドの各ボックスに、個々の外植片を転送するために定規を使用しています。残留パガーノ溶液を除去し、ピペッターを使用して、暖かい10パーセントゼラチン溶液で各外植片をカバーし、固化することができます。各外植片が完全にあまりにも多く、一度に温めるゼラチンを添加することによりパッドを溶融しないように注意しながら、ゼラチンで囲まれるまでゼラチン溶液をゆっくり添加を再開します。 〜1時間硬化さゼラチンを可能にします。一度個々ををかたくなにUAL外植片は、ゼラチンの小さなブロックに切り出すことができる。ブロックは、前ビブラトームとセクショニングに24〜48時間の修正パガーノで後固定されています。
- ゼラチンブロック内の外植片は嗅球を配置し、厚さ100μmにおける前頭面に区画されています。セクションは、収集され、保管され、PBS中の4で+ 0.1％アジ化ナトリウム°Cの免疫組織化学的処理まで。
- 免疫組織化学的検出、24ウェルプレート（ウェルあたり2から3節）にセクションを転送することによって行われます。 + B（PBS + 0.5％トリトンX 100、2％BSA）を0.5ミリリットルPBSTを追加することにより、結合の最初のブロック、非特異的抗体を各ウェルに、穏やかに振盪しながら1時間インキュベートする。適切な一次抗体は、その後、PBST + Bで希釈し、ウェルあたり0.4mlを室温で一晩のインキュベーションのために追加されます。プライマリは3X PBSは、少なくとも10分間ずつ洗浄して洗い流す。二次抗体、2μg/ mlのヘキスト33342核染色法は、その後、PBST + Bで希釈し、サンプルを室温で2時間インキュベートする。穏やかに振盪しながら。三PBSの洗浄（10分毎に）が実行され、その後のセクションでは、90％グリセロール、50mMトリス、pH7.4の、マウントメディアを使用して、スライド上に搭載されている。
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Representative Results
げっ歯類の胚性皮質が発達期間を通して横neurogenetic勾配を示し、そのようなその横新皮質は、背内側皮質28よりも約1日より成熟している。 6層のニューロンの大部分はこのように横皮質でE12に（また、フィールド40 5と呼ばれる）とE13で背内側野（またフィールド1〜5と呼ばれる）で（S期の最終的なを示すIE）が生成されます。 Preplate分割は6層ニューロンの生成後約1日から始まりますので、E13の上の横皮質およびE14の上で背側皮質で開始されます。 preplate分割と皮質板の開発の開始を検討するために、我々は全体の大脳半球がE13からE15（ 図1）に一般的に培養されたことを21,24などのスライス植アッセイを変更しました。
我々は全体の半球外植dの成長を調べることにより、皮質植技術の実行可能性をテストしたTG（Eomes :: EGFP）GSATマウス（ 図2）からerived。このマウス系統は、興奮性皮質7,29,30系統の未熟なニューロンを報告する導入遺伝子を含んでいます。全体の半球皮質の外植片は背側皮質（ 図2A）に分割することをpreplateする前の時点で、E13になるように調製した。同腹から皮質外植片は、ドロップ2 DIVの期間にわたって順次固定し、その後の組織学的分析のために処理した。初期の分析時点（DIV 0）で、preplate分割はまだフィールド1（; 図2A、2E背びれ新皮質）で発生していない。 1 divでCPが（ 図2B、2C、2F、2G）は明らかである、そして、それは2のDIV（ 図2D、2H）まで成長し続けています。したがって全体半球外植片は二日、大脳皮質の成熟のためにE13のサポートで最初に培養し、背側皮質にpreplate分割をキャプチャします。
ノルムを確認するには背側皮質のアルカイダ組織学的開発は、我々は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（柔毛）、またPPおよびその誘導体MZとSP 8,31,32の確立されたマーカーである細胞外マトリックス成 分の2 DIVの外植片を免疫染色した。柔毛のための免疫染色をin vitroでの培養期間（ 図3A-3C） の中にMZとSPにPPの適切な分割を示す背側皮質に免疫反応性をCSPGの2つのバンドを明らかにする。 PPは、転写因子Ctip2とTbr1 7,33,34を発現することが知られて L6皮質ニューロンによって分割されます。これらのマーカーの免疫染色パターンは（ 図3D-3F、3G-Iを 、それぞれ）、新たに形成されたCPにおけるこれらの転写因子の適切な表現を確認する。一緒に、これらの分析は、全体の半球外植片の器官早期皮質の発達を確認します。
子宮内エレクトロポ中で広く使用されている開発皮質35細胞自律的遺伝子機能をアッセイする。そこで我々は、エレクトロポレーションが正常に全体の半球外植片モデルにおける神経細胞をトランスフェクトすることができるかどうかテストされています。無傷E13胚の左心室は神経前駆細胞にプラスミドDNAを導入するために0.33 mg / mlのCAG-GFPプラスミドとエレクトロポレーション（メソッドも参照）を注射したそのライン側脳室（ 図1A）。 2 DIV後植片を組織学的分析のために固定し、切片に落とされました。この時点では、GFPを発現する細胞は、脳の壁（ 図4A-4C）全体のすべての皮質帯で観察された。強烈なGFP発現細胞はIZとCPで観察されたGFP発現がVZで神経前駆細胞から観察することができた。重要なのは、多数のニューロンがGFP +新興樹状突起と軸索を持つ成形CPの一番上に観察された。細胞は、CPとMZ indicatin間の界面で不連続層を形成しているグラム適切な移行逮捕とラミネーション（ 図4A-4C、矢印）。 corticofugal軸索は、CPの下、IZに延びているMZに拡張樹状突起は（ 図4A-4Cおよび5は、また補足ムービーS1を参照してください）。分化細胞の下バイポーラ形態を有するニューロン、放射状グリア繊維に並置し、それらの下に、IZ内多極神経細胞（ 図4D-4F）を含む満期の変動状態、でGFP +細胞である。また、樹状突起は、ECMタンパク質リーリンは（ 図4G-4I）を適切に局在であるMZへ延びる観察される。エレクトロポレーションおよび植条件はこのように未熟なニューロンに分化するニューロンを移行する前駆体の段階を経て大脳皮質ニューロンの正常な発展を可能にする。
エレクトロポレーションの時点では（E13）新皮質の背VZによって生成される神経細胞の100％がL6ニューロン、ニューロンであるそれは、PP 5を分割します 。成功したエレクトロポレーションは、コンストラクトは直前に6時間の間に神経細胞内に導入されている必要があります、または最中に、細胞周期のM期36。それは、このように早い分裂ことが期待され、背側皮質（フィールド1）のE13のエレクトロポレーションに続いてGFP陽性ニューロンが形成CPを移入する必要があります。このようなニューロンは、プロトコルが確実に彼らの移行と成熟の研究のためのL6皮質ニューロンを標的とすることができることを示している（ 図4）が観察された。
エレクトロポレーション/植手順の "成功率"を推定するために、我々は我々の研究室からの継続的な調査を分析した。その研究の過程で、外植片の21リットルは248胚の合計はCAG-GFPで（前述のとおり）エレクトロポレーションした、準備されており、各胚から単半球の外植片を作製した。元の248の外植片、195（79％）のイメージングと解析に最適な判断された。 53の約半分分析することができませんでした外植片は、GFPを発現するために失敗したか、誤標的GFP発現を持っていた。残りの損失は、文化·フィルタ、または組織学的処理に関連する問題からの離脱を植による醜形成長によって説明された。約80％（ 図5）のこの成功率は初期の皮質発達に悪影響を及ぼすことを薬理学的研究26、ならびに劣性変異の解析7に適した外植片のシステムをレンダリングしている。
図1。 EX子宮内エレクトロポレーションで全体の半球植手順。）E13マウス胚は、プラスミドDNA溶液を注入し、エレクトロポレーションされています。脳を解剖し、sagitally離断されています。エレクトロポレーション半球は、フィルタコーティングされたコラーゲンで内側を下に置き、2 DIV培養する。半球は、その後、組織学及びその後の画像解析のためのライブや固定結像させることができる。B）10の外植片の写真が6ウェル組織培養皿で3フィルタ上に置かれています。C）植片で6ウェル皿は高酸素環境に置かれ（95％O 2/5％CO 2）で、標準的な37℃の組織培養インキュベーター内に配置されビラップス·ローゼンバーグインキュベータ室、内。
図2。 Eomesの単一ごみ:: EGFP胚由来の全半球外植片における皮質板の器官成長。、カルトの先頭でドロップ固定脳からE）の冠状断面 URE期間（O DIV）。 PPは存在するが、そのCPが形成するためにまだ持っていることに注意してください。緑色の信号が未熟な興奮性神経細胞にGFP発現によって産生され、青はすべての細胞の核にラベルを付けHoechst色素です。A、B、F）は 。破線で示され、CPの成長は、1 DIV（CとG）と2 DIV（パネルDおよびH）で0.5 DIVおよび増加によって観察される。増殖を示し、パネルADの細胞ドメインを発現するGFPの厚さの増加に注意してください。と植における興奮性神経細胞系譜の分化。スケールバーは500μm（パネルA）および50μm（パネルH）である。略語：CP、皮質板、IZ、中間ゾーン、MZ、辺縁帯、SP、サブプレート、VZ、脳室帯。
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図3。 Preplateの全半球外植片で分割。交流）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）免疫染色は、MZとSPにPPの分割（分割）を示している。DF）は 、新たに形成されたCPの転写因子Ctip2の発現を。GI）の発現新たに形成されたCPの転写因子Tbr1。スケールバーはパネルC、F、Iが50μmである。
図4。 2 DIVの後にE13 のex子宮内エレクトロポレーション後の全体の半球の外植片におけるGFP発現。AC）は GFP発現。 CPの上部（矢印）。DF）のネスチン（赤色）immunoreactivで形成皮質ニューロンの層に注意してください全体の半球の外植片から導出されるセクションの全体半球外植片からのセクションのITY。GH）リーリン（赤）免疫反応。 パネルC、FおよびIのスケールバーは50μmである。
図5。背内側野（フィールド1）に元子宮内エレクトロポをターゲットの変動。シングルごみからセブンイレブン胚はCAG-GFPの発現構築物（0.33 mg / ml）と全半球外植片として培養したエレクトロポレーションした。AI）はナイン11の外植片を示した背内側皮質におけるGFPの発現。 GFPの発現は、外植片との間で変化するが、各植GFP、3つすべての皮質領域（ すなわち VZ、IZとCP）で検出される。スケールバーはパネルでは50μmである。
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Discussion
全体の半球外植片 - - 早期皮質発達の研究（E13-E15）のための我々は実験モデルを改善し、評価した。モデルは、移行および大脳皮質25,37の層6を構成する興奮性ニューロン系統の分化の解析に有用であることが証明されました。システムの主な利点は、準備が単純、脳の発達のこの早期、臨界期中にエレクトロポレーション、薬理学的操作とイメージングのためのニューロン〜3）実験的なアクセス））2 DIVの器官の成長、2 1アール。我々は、形態、方向、およびpreplate分割の期間中に6層の皮質ニューロン7,38の樹枝状成長の微妙な違いを文書化するシステムを使用している。
層6を移入興奮性神経細胞は、主に背側視床39,40に逆数の入力を提供corticothalamic投射ニューロンから構成されている41における神経機能の同期で機能的に参加するという仮説を立てている。これらのニューロンは生理的に特化しているが、層の生成、移動および成熟過程6層ニューロンの大脳皮質の2-6のすべての興奮性ニューロンと株式の基本的な機能を。具体的には、すべての皮質興奮性神経細胞が背側終脳VZで生成され、多極ニューロンとしてIZを通って移動し、CP 7内で区別しています。 PAX6、Tbr2、とTbr1 29：興奮性皮質ニューロンの成熟が順次発現する転写因子のコアセットによって駆動されます。このシーケンスは、2から6層42内のすべての興奮性ニューロンによって共有され、我々は新たに形成され、CP（ 図3G-3I）にTbr1の適切な発現が確認されています。層6皮質ニューロンの発達を調査するために、この手法を活用することでこのように神経の開発に不可欠な洞察力を提供するべきであるすべての皮質層を構成rons。
全体の半球外植片は、皮質ニューロンの発達についての研究のための既存のアプローチを補完するものです。先行研究では、1 DIV 22,23に対して皮質発達を研究するためのE14全半球植アプローチを採用してきた。我々は、L6形成とpreplate分割の期間中に皮質発達の2日間を調査するために、元の子宮内エレクトロポレーションで全体の半球の外植片を結合しました。 E13での子宮内エレクトロポでは対照的に、全体の半球植続いて子宮内エレクトロポEXの成功率は高くなります：私たちの手の中に私たちは、背側終脳へのエレクトロポレーションをターゲットに〜80％ の成功を達成しています。また、 子宮内エレクトロポで生存の手術を必要とし、全体の半球を ex 胎内アプローチよりもかなり技術的な努力を要する。最後に、 子宮内での研究で正確な薬理学的に容易に適さない操作とイメージングの手法。定義されている濃度で薬や分子薬剤の送達または活性化の正確な時間的制御（発現ベクター、サイレンシングコンストラクト、 等 ） が全体の半球の外植片で提供されていますが、 子宮内で達成するのは困難です。このような操作の結果として得られる効果の光監視ライブ、ミクロン範囲の空間分解能で、IUEP EUEPと容易に利用可能ですが、ではない。このような精度は、実質的に皮質の発達と機能を含む実験から収集されたデータの解釈力を高める可能性があります。したがって初期の皮質発達全体の半球外植片の研究のためにある子宮内アプローチに比べて明確な実験的な利点を持っています。この時点では、しかし、データ収集> 48時間を必要とする上位層の皮質ニューロンおよび実験的研究、スライス用の外植片と子宮内アプローチで好ましい残る。
があります全体の半球植技術の成功のためのいくつかの重要な要件。まず、外植片の成長は、髄膜の機械的完全性に非常に敏感である。髄膜に物理的な損傷（ すなわち穿刺または涙は）最低でも、基礎となる大脳皮質の局所的な開発が中断されます。第二に、外植片の伸びがよく文化の中でメディアの総体積に敏感である：あまりにも多くのメディアで外植片は、フィルターから外れると歪んだCPのアーキテクチャを開発します。少なすぎるメディアや外植片は、過剰な細胞死を脱水し、経験する可能性が高いと。最後に、現在の技術の外植片と、私たちは2 DIVの皮質の成長を記録している。この発生時間ウィンドウE13から始まるとき、多くの貴重な調査を認めるものの、シナプス形成とカノニカルニューロン通信に先立って期間に分析を制限します。 E14.5急行多くのmRNAにおける皮質ニューロンは（シナプスのタンパク質をコードするもののw.genepaint.org "ターゲット=" _blank "> www.genepaint.org）〜横皮質におけるE15、このシナプスが細胞ではなく、6層のニューロン43 preplateに閉じ込められるまで。に関するいくつかの重要な質問は、シナプス形成は開始されません皮質のシナプス形成と機能は、したがって、全体の半球植システムと現在のアドレス指定ではありません。
結論として全体の半球外植片の準備は脳奇形の遺伝のマウスモデルで初期の皮質の発達を調査するために確実にかつ一貫して使用することができます。技法は、RNAiは、shRNA、および他の分子と薬理学的操作に容易に適用可能である。全体の半球植も適用組換えタンパク質、薬物や環境毒素を含む研究に適しています。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、NINDS（NS066071）とNIAAAからの助成金をサポートされていました。 （P50AA017823）エコへ。著者は、ロバート·クインと動物のケアのための実験動物資源学科のスタッフに感謝します。私たちは夏の学部リサーチフェロー（SURF）などの支援については、テクニカル·サポートのためにニコールBelletierをジャドソンベルモントに感謝します。また、コメントにデビッドキャメロンに感謝し、原稿の以前のバージョンで編集します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 + GlutaMAX | GIBCO | 10565 | |
| G5 Supplement 100X | Invitrogen | 17503-012 | |
| B27 Serum-Free Suppl. 50X | Invitrogen | 1504-044 | |
| Pen / Strep Liquid 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| HBSS 500 ml | GIBCO | 14025 | |
| Culture insert collagen coated | Costar | 3492 | |
| Bovine skin gelatin | Sigma | G9382 | |
| H–chst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 7906 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Equipment | |||
| BTX 830 Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Tweezer electrodes 10mm | Harvard Apparatus | 450166 | |
| Incubator | Billups Rothenberg | MIC-101 | |
| Hamilton syringe (5uL) | Hamilton | 87930 | |
| Hamilton syringe needle | Hamilton | 7803-04 | Specify 1" and style 4 |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11251-10 | |
| Fine Scissors Tough Cut 9 cm | FST | 14058-09 |
References
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