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Neuroscience

पूर्व utero electroporation और पूरे गोलार्ध explants: प्रारंभिक Cortical विकास के अध्ययन के लिए एक सरल प्रयोगात्मक विधि

Published: April 3, 2013 doi: 10.3791/50271
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Neuroscience and Physiology, SUNY Upstate Medical University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल में शामिल है कि एक बेहतर explant प्रक्रिया का वर्णन

Abstract

Cortical विकास न्यूरॉन्स और अग्रदूत साबित कोशिकाओं, रक्त वाहिकाओं, meninges और संबद्ध बाह्य मैट्रिक्स सहित गैर neuronal तत्वों के बीच जटिल बातचीत शामिल है. क्योंकि वे एक उपयुक्त organotypic वातावरण प्रदान करते हैं, cortical टुकड़ा explants अक्सर उन मुलाकातों है कि neuronal भेदभाव और विकास नियंत्रण की जांच करने के लिए किया जाता है. लाभकारी हालांकि, टुकड़ा explant मॉडल न्यायपालिका सेलुलर फाड़ना और माइग्रेशन सहित खामियों से ग्रस्त कर सकते हैं. यहाँ हम एक पूरी जल्दी cortical विकास है कि cortical स्लाइस और शो लगातार organotypic प्रवास और फाड़ना की तुलना में आसान करने के लिए तैयार है के अध्ययन के लिए मस्तिष्क गोलार्द्ध explant प्रणाली रिपोर्ट. इस मॉडल प्रणाली में, जल्दी फाड़ना और प्रवास पैटर्न इन विट्रो में दो दिन की अवधि के लिए सामान्य रूप से आगे बढ़ना है, preplate बंटवारे की अवधि के दौरान जो भावी cortical परत छह रूपों. हम तो एक पूर्व utero electroporation (EUEP) विकसितदृष्टिकोण है कि ~ पृष्ठीय औसत दर्जे का प्रांतस्था में विकसित न्यूरॉन्स GFP अभिव्यक्ति लक्ष्यीकरण में 80% सफलता प्राप्त करता है.

पूरे गोलार्द्ध explant मॉडल जल्दी cortical electroporation, औषधीय हस्तक्षेप और रहते इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए सुलभ विकास बनाता है. इस विधि अस्तित्व utero electroporation (IUEP) दृष्टिकोण में जबकि दोनों अभिकर्मक और areal लक्ष्यीकरण स्थिरता में सुधार के लिए जरूरी सर्जरी से बचा जाता है. इस विधि neuronal प्रवास, प्रसार और भेदभाव की प्रयोगात्मक अध्ययन की सुविधा होगी.

Introduction

स्तनधारी ठोस प्रसार, प्रवास और क्रमिक उत्पन्न न्यूरॉन्स की भेदभाव के माध्यम से मस्तिष्क प्रांतस्था रूपों. प्रत्येक न्यूरॉन वेंट्रिकुलर क्षेत्र (VZ) में पैदा होता है और मध्यवर्ती क्षेत्र (IZ) में VZ से migrates, cortical प्लेट (सीपी) 1 बनाने. के रूप में वे विभिन्न cortical डोमेन के माध्यम से गुजरती हैं, ओर पलायन न्यूरॉन्स 2,3 प्रवास के कई मोड जो कोशिकी विकसित ऊतक के भीतर पर्यावरण अन्य सेलुलर तत्वों (जैसे रेडियल glia) पर निर्भर प्रदर्शन. Cortical न्यूरॉन्स तो neuronal प्रवास गिरफ्तारी और dendritogenesis 4 संपाती प्रक्रियाओं में गठन cortical थाली के शीर्ष पर प्रवास गिरफ्तारी.

Cortical विकास भ्रूण 11-13 (E11-13) मौलिक उलझन - रूप परत 6 या preplate (पीपी), अग्रणी न्यूरॉन्स की कि overlies VZ परत की स्थापना के माध्यम से 5 दिनों के बीच शुरू की है. भावीपरत 6 cortical (यानी 1 cortical VZ में पैदा हुआ न्यूरॉन्स) तो पूरबी एक टकसाली पैटर्न में अपने somata और 7 पीपी के भीतर एक अलग परत में सम्मिलित न्यूरॉन्स. इन घटनाओं को एक सतही सीमांत (भविष्य cortical परत 1) और एक गहरी क्षेत्र, subplate कोशिकाओं (क्षणिक cortical परत 7) के बाद में preplate विभाजित. इस प्रक्रिया, preplate बंटवारे करार दिया, मस्तिष्क प्रांतस्था 8 के भविष्य के विकास में एक मूलभूत घटना है.

कई आनुवंशिक परिवर्तन की पहचान है कि cortical 9 विकास के विभिन्न पहलुओं को बाधित किया गया है. Cortical विकास भी नकारात्मक 10 कोकीन और 11 शराब के रूप में किया जाता विषाक्त पदार्थों को जोखिम से प्रभावित किया जा सकता है. क्योंकि cortical विरूपताओं है कि विकास के दौरान उत्पन्न होने की संभावना स्नायविक विकारों (जैसे एक प्रकार का पागलपन, आत्मकेंद्रित) योगदान कर रहे हैं, cortical विकास perturbations की प्रायोगिक जांच निहित हैंमहत्वपूर्ण ly. इसलिए यह काफी महत्व के दृष्टिकोण स्थापित करने के लिए cortical विकास के है कि आनुवंशिक या विष प्रभाव के तेजी से assays अनुमति है, लेकिन है कि मस्तिष्क विकास 12 के इस प्रारंभिक अवधि के दौरान भी फर्क न्यूरॉन्स, अन्य प्रकार सेल और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के बीच संभव बातचीत की रक्षा का अध्ययन .

स्लाइस 13 explants एक ऐसी प्रणाली प्रदान की है और व्यापक रूप से परख cortical न्यूरॉन 14-16 विकास के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, टुकड़ा assays दोष यह है कि neuronal प्रवास और फाड़ना असामान्य 17 संभवतः मस्तिष्कावरणीय कोशिकाओं है कि चारों ओर विकासशील मस्तिष्क और लंगर रेडियल glial पाड़ को नुकसान की वजह से ग्रस्त कर सकते हैं. के रूप में रेडियल glial फाइबर टुकड़ा करने की क्रिया के द्वारा एक बेसल लामिना का cortical न्यूरॉन प्रवास 18 विघटन के लिए महत्वपूर्ण सब्सट्रेट स्थानीय रेडियल glial वास्तुकला को बाधित कर सकते हैं और बदल cortical प्रवास करने के लिए नेतृत्व. Sli अलावाexplants के ced सतहों मृत कोशिकाओं का एक क्षेत्र है कि इन क्षेत्रों में ईसीएम के सामान्य संरचना बदल सकता है प्रदान करता है.

अधिक हाल ही में दृष्टिकोण टुकड़ा है कि उपयुक्त स्वस्थ कोशिका प्रकार और ECM से घिरे रहे हैं में गहरी स्थित कोशिकाओं पर अपने विश्लेषण ध्यान केंद्रित किया है. हालांकि, कुछ मामलों में इन नए दृष्टिकोण की आवश्यकता कर सकते हैं कि मूल मोटी सुसंस्कृत टुकड़ा निर्धारण के बाद क्रायो sectioned या आयल - sectioned इतना है कि टुकड़ा अपेक्षाकृत सामान्य इंटीरियर 19-21 विश्लेषण के लिए उपलब्ध कराया जाता है. दोनों मूल रूप में के रूप में अच्छी तरह से विश्लेषण के लिए निश्चित स्लाइस के बाद cryosectioning संस्कृति के लिए जीना स्लाइस तैयार सेक्शनिंग vibratome देखभाल और इन assays के लिए काम करने के लिए प्रयास करने की आवश्यकता है.

लिए एक सरल, जल्दी cortical विकास के अध्ययन के लिए पूरक दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए, हम एक मौजूदा टुकड़ा दृष्टिकोण 13 को संशोधित किया है जल्दी cortical विकास के अध्ययन की सुविधा. हम विकसित किया है एक कole गोलार्द्ध explant एक मौजूदा E14 पूरे गोलार्द्ध मॉडल है कि प्रति मिनट 65 rotations और 16-18 22,23 घंटे के लिए अनुमति दी organotypic विकास मिलाते संस्कृतियों को शामिल करने के लिए इसी तरह के मॉडल. हमारे दृष्टिकोण में, पूरे गोलार्द्ध explants अर्द्ध पारगम्य झिल्ली 13 पर एक उच्च ऑक्सीजन संस्कृति 21,24 वातावरण में रखा जाता है के लिए 48 घंटे के लिए organotypic cortical विकास का विस्तार. यह दृष्टिकोण भी cortical न्यूरॉन्स के विकास के अनुरूप electroporation के लिए अनुमति देता है. भ्रूण गर्भाशय से हटा रहे हैं और प्लास्मिड डीएनए शुरू electroporated और telencephalon तो dissected है. प्रत्येक गोलार्द्ध अलग है और औसत दर्जे का पक्ष एक कोलेजन लेपित फिल्टर पर नीचे रखा. explant तो 48 घंटा, एक अवधि है कि preplate 8 बंटवारे शामिल की एक अवधि के लिए संवर्धित है. संस्कृति अवधि के दौरान, L6 न्यूरॉन्स अग्रदूत से cortical प्लेट के भीतर विभेदित न्यूरॉन 25, सही ढंग से तैनात करने के लिए विकसित करना. इस अवधि के विकासशील के दौरानन्यूरॉन उपयुक्त ECM और कोशिका प्रकार है कि vivo में इसी सेल का सामना से घिरा हुआ है. यह प्रणाली पहले से ही सेलुलर घटनाओं है कि इथेनॉल 26 विषाक्तता, परत 6 गठन और preplate 7,25 बंटवारे आबाद गूढ़ रहस्य में मूल्यवान साबित कर दिया है.

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Protocol

हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्लास्मिड अभिव्यक्ति के साथ 1. पूर्व utero Electroporations

  1. प्लास्मिड डीएनए इंजेक्शन समाधान सीएजी EGFP 27 डीएनए DDH 2 ओ में 0.33 मिलीग्राम / मिलीलीटर की अंतिम काम एकाग्रता को पतला के साथ तैयार कर रहे हैं Qiagen Endo मुक्त मैक्सी Preps तब्दील बैक्टीरिया से प्लाज्मिड को शुद्ध किया जाता है. ~ 0.02% (अंतिम w / v) में तेजी से हरे रंग के एक इंजेक्शन अनुरेखक के रूप में डीएनए समाधान के लिए जोड़ा गया है.
  2. शल्य चिकित्सा के क्षेत्र तैयार करने के लिए, नीचे एक 70% इथेनॉल समाधान के साथ बेंच शीर्ष और विदारक खुर्दबीन मंच स्प्रे और शुष्क पोंछ. 70% इथेनॉल के साथ शल्य कैंची और संदंश विच्छेदन करने से पहले स्प्रे और शुष्क पोंछ.
  3. समय पर गर्भवती / स्विस Webster बांधों E13 पर एक चेंबर में सीओ 2 के साथ एक दबाव सिलेंडर से भरा और बांध की निगरानी रखी जाती है हस्तांतरण द्वारा बलिदान कर रहे हैं जब तक सभी प्रस्ताव कम से कम 1 मिनट के लिए बंद कर दिया गया है. सीओ 2 साँस लेना द्वारा बलिदान के बाद भ्रूण को गर्भाशय से हटा दिया जाता है और में रखाएक 10 सेमी पेट्री डिश युक्त बर्फ के ठंडे हैंक्स संतुलित खारा समाधान (HbSS).
  4. ध्यान से आसपास के extraembryonic झिल्ली से प्रत्येक भ्रूण काटना और ठंडा HbSS में रहते हैं.
  5. प्रत्येक भ्रूण व्यक्तिगत स्थानांतरण एक दूसरे 10 सेमी पेट्री डिश के लिए ठंड HbSS युक्त. एक हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग करने के लिए बाएं मस्तिष्क गोलार्द्ध के निलय में डीएनए तेजी हरी मिश्रण के 2-3 μl इंजेक्षन, देखभाल करने के लिए एक cortical spatially भविष्य के विश्लेषण के लिए cortical क्षेत्र से अलग क्षेत्र में इंजेक्षन.
  6. Electroporate, भ्रूण धीरे संदंश के साथ और पकड़ हल्के से सिर के पृष्ठीय midline पर मोचनी इलेक्ट्रोड के सकारात्मक चप्पू जगह और हल्के भ्रूण ठोड़ी के नीचे नकारात्मक चप्पू जगह. Electroporations एक BTX830 पाँच 50 मिसे की अवधि का 30 वी दालों, 950 मिसे अंतराल से अलग देने क्रमादेशित electroporator साथ प्राप्त कर रहे हैं. ये सेटिंग्स BTX830 मॉडल के लिए कर रहे हैं. अन्य प्रणालियों निर्माता instructio अनुसार किया जा सकता हैएनएस.

2. पूरे गोलार्ध Explant तैयारी

  1. Electroporation के बाद भ्रूण वापस ठंडा HbSS में रखा जाता है. मस्तिष्क दो # 5 जौहरी संदंश का उपयोग करने के लिए भ्रूण सिर से त्वचा और कार्टिलेजीनस खोपड़ी निकाल निकाल दिया जाता है. Forcep तो मस्तिष्क के नीचे गिरावट खोपड़ी से बरकरार मस्तिष्क को दूर करने के लिए. electroporated गोलार्द्ध (बाएं) तो मस्तिष्क से दूर dissected और संलग्न के मध्य मस्तिष्क ऊतक निकाल दिया जाता है. विच्छेदन प्रक्रिया देखभाल के दौरान बाईं cortical गोलार्द्ध overlying meninges नुकसान नहीं लिया जाता है.
  2. एक बार dissected प्रत्येक भ्रूण एक कट 1 मिलीलीटर विंदुक टिप के साथ एक pipettor का उपयोग कर HbSS में स्थानांतरित कर रहा है. गोलार्द्ध धीरे एक कोलेजन लेपित संस्कृति डालने पर निष्कासित कर दिया है. छह गोलार्द्ध explants के लिए औसत दर्जे का पक्ष नीचे प्रत्येक 24 मिमी डालने पर व्यवस्था कर रहे हैं. एक बार की व्यवस्था, अतिरिक्त HbSS डालने से निकाल दिया जाता है और डालें तो एक 6 अच्छी तरह से पकवान की अच्छी तरह से एक 35 मिमी में रखा गया है. अच्छी तरह से exa शामिल हैंctly मीडिया के 2.7 मिलीग्राम: DMEM-F12 मीडिया Glutamax युक्त और 2% B-27, 1% g5 और 1% पेनिसिलिन - Strep के साथ पूरक. प्रत्येक explant के शीर्ष पर अच्छी तरह से मीडिया की कुछ बूँदें pipetted किया जा सकता है, लेकिन अच्छी तरह से प्रति मूल 2.7 मिलीलीटर की अतिरिक्त में जोड़ नहीं है मीडिया.
  3. एक बार explants कोलेजन फिल्टर पर रखा गया है, 6 अच्छी तरह explants युक्त पकवान Billups Rothenberg कक्ष (बीआर) (भी है कि पानी की एक humidifying पकवान शामिल हैं) में रखा गया है. एक 95% / 5% आक्सीजन / सीओ 2 गैस मिश्रण कक्ष में कम से कम 1 मिनट के लिए पहले कक्ष बंद सील और 95% / 5% आक्सीजन / सीओ 2 गैस की आपूर्ति ट्यूब रखती संचार होता है. BR कक्ष तो संस्कृति अवधि, 1-2 DIV के शेष के लिए एक 37 ° C टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रखा जाता है.

3. प्रोटोकॉल के लिए Explant ऊतक का फिक्सेशन

  1. एक धूआं हुड में 1 paraformaldehyde solubilizing 8 जी द्वारा preheated (~ 80 और डी के 100 मिलीलीटर में Pagano निर्धारण समाधान तैयारजी, सी) DDH 2 ओ 1-3 NaOH solubilization को बढ़ावा देने के लिए और धीरे हलचल ध्यान केंद्रित बूँदें जोड़ें. एक बार एक समाधान के साथ 8% paraformaldehyde 1:01 समाधान मिश्रण solubilized है कि 500 मिमी sucrose, 100 मिमी HEPES, पीएच 7.4, 50 मिमी 2 MgCl, 250 मिमी sucrose 50 मिमी HEPES में 4% paraformaldehyde की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 5 मिमी KCl , 25 मिमी 2 MgCl, 2.5 मिमी KCl, पीएच 7.4.
  2. तय करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस explants Pagano ठीक समाधान गर्म जल्दी से प्रत्येक संस्कृति से DMEM/F12 मीडिया की सबसे अच्छी तरह से हटाने और explants के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए Pagano फिक्स की 5 मिलीग्राम जोड़ने. तय में प्रत्येक explant पूरी तरह से कवर करने के लिए सुनिश्चित करें कि. आरटी पर 1 घंटा के लिए ठीक. फिल्टर से दूर मत निर्धारण के 1 घंटा पहले explants.
  3. बाद निर्धारण Pagano ठीक समाधान निकालने और बिना Pagano समाधान तय (250 मिमी sucrose 50 मिमी HEPES, 25 मिमी 2 MgCl, 2.5 मिमी KCl, पीएच 7.4) के साथ बदलें. Embedding तक 10% सोडियम azide और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस की कुछ बूँदें जोड़ें.

4. Embedding और एसप्रोटोकॉल के लिए ectioning

  1. गर्म पानी (55-60 डिग्री सेल्सियस) के 100 मिलीलीटर में बछड़ा त्वचा जिलेटिन की 10 ग्राम solubilizing द्वारा एक 10% बछड़ा त्वचा जेलाटीन समाधान तैयार. एक गर्म थाली पर 60 ° ज़ुल्फ़ सी है और समय - समय पर जब तक solubilized जेलाटीन समाधान जगह.
  2. एक 10 सेमी पेट्री डिश के नीचे में 10% जेलाटीन समाधान की लगभग 10 मिलीलीटर डालो और जमना करने के लिए 30 मिनट की अनुमति. इस explants embedding के लिए एक "पैड" बनेगी. इन पैड तैयार दिन पहले हो सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है पेट्री डिश के तल पर एक ग्रिड आकर्षित करने के लिए और ग्रिड के प्रत्येक बॉक्स में व्यक्तिगत explants हस्तांतरण के लिए एक शासक का उपयोग. अवशिष्ट Pagano समाधान निकालें और एक pipettor का उपयोग, गर्म 10% जेलाटीन समाधान के साथ प्रत्येक explant कवर और कठियाना करने की अनुमति देते हैं. जेलाटीन समाधान की धीमी अलावा फिर से शुरू तक प्रत्येक explant जिलेटिन द्वारा पूरी तरह से घिरा हुआ है, देखभाल करने के लिए बहुत ज्यादा जेलाटीन एक बार में गर्म के अलावा द्वारा पैड नहीं पिघला. ~ 1 घंटा के लिए कठोर जिलेटिन के लिए अनुमति दें. एक बार जब individ कठोरual explants जिलेटिन के छोटे ब्लॉकों में कटौती कर सकते हैं. ब्लॉकों Pagano में तो बाद तय 24-48 घंटे के लिए एक vibratome साथ सेक्शनिंग करने से पहले तय.
  3. जेलाटीन ब्लॉकों में explants घ्राण बल्ब तैनात कर रहे हैं और 100 माइक्रोन मोटाई में राज्याभिषेक विमान में sectioned. वर्गों एकत्र कर रहे हैं और पीबीएस में 0.1% 4 सोडियम azide ° C immunohistochemical प्रसंस्करण तक संग्रहीत
  4. Immunohistochemical पता लगाने के एक 24 अच्छी तरह से थाली (अच्छी तरह से प्रति 2-3 वर्गों) में वर्गों द्वारा स्थानांतरित किया जाता है. पहले ब्लॉक एंटीबॉडी गैर विशिष्ट 0.5 मिलीलीटर PBST जोड़कर बाध्यकारी + B (पीबीएस + 0.5% ट्राइटन 100 एक्स और 2% BSA) प्रत्येक अच्छी तरह से कोमल झटकों के साथ सेते 1 घंटा. उचित प्राथमिक एंटीबॉडी तो PBST + B में पतला है और अच्छी तरह से प्रति 0.4 मिलीग्राम आरटी पर रातोंरात ऊष्मायन के लिए जोड़ा है. प्राथमिक 3X PBS प्रत्येक में कम से कम 10 मिनट के लिए washes से धोया जाता है. माध्यमिक एंटीबॉडी और 2 ग्राम / मिलीलीटर Hoechst 33342 दाग परमाणु तो PBST + B में पतला कर रहे हैं और नमूने आरटी पर 2 घंटे के लिए incubated हैंकोमल झटकों के साथ. तीन पीबीएस washes (10 मिनट प्रत्येक) का प्रदर्शन कर रहे हैं और फिर वर्गों एक 90% ग्लिसरॉल 50 मिमी Tris, pH7.4, बढ़ते मीडिया का उपयोग कर स्लाइड पर बढ़ रहे हैं.

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Representative Results

भ्रूण कृंतक प्रांतस्था विकास की अवधि के दौरान एक अनुप्रस्थ neurogenetic ढाल दर्शाती है, कि इस तरह के पार्श्व neocortex लगभग 1 दिन पृष्ठीय औसत दर्जे का neocortex 28 से अधिक परिपक्व है. इस प्रकार 6 न्यूरॉन्स की परत के थोक (यानी उनके एस चरण अंतिम एक्ज़िबिट) E12 पर पार्श्व प्रांतस्था में (भी बुलाया 40 फील्ड पाँच) और E13 पृष्ठीय औसत दर्जे का प्रांतस्था (भी बुलाया एक फ़ील्ड 5) में उत्पन्न कर रहे हैं. Preplate बंटवारे परत 6 न्यूरॉन पीढ़ी के बाद लगभग 1 दिन शुरू होता है और इस प्रकार पर पार्श्व प्रांतस्था E13 और E14 पर पृष्ठीय प्रांतस्था में शुरू की है. अध्ययन preplate बंटवारे और cortical थाली विकास की दीक्षा, हम एक टुकड़ा explant 21,24 परख संशोधित ऐसी है कि पूरे मस्तिष्क गोलार्द्धों आमतौर पर E13 E15 (1 चित्रा) से सुसंस्कृत थे.

हम पूरे गोलार्द्ध घ explants के विकास की जांच से cortical explant तकनीक की व्यवहार्यता का परीक्षण कियाटीजी (:: Eomes EGFP) जीसैट चूहों (2 चित्रा) से erived. यह माउस तनाव एक transgene कि उत्तेजक cortical 7,29,30 वंश की अपरिपक्व न्यूरॉन्स की रिपोर्ट शामिल हैं. पूरे गोलार्द्ध cortical explants E13 में तैयार किए गए थे, एक समय बिंदु पर पहले पृष्ठीय neocortex (2A चित्रा) में बंटवारे preplate. एक ही कूड़े से Cortical explants 2 DIV की अवधि में क्रमिक तय और बाद histological विश्लेषण के लिए कार्रवाई ड्रॉप थे. प्रारंभिक विश्लेषण के समय बिंदु (0 DIV), preplate बंटवारे 1 फील्ड (आंकड़े, 2A, 2E पृष्ठीय neocortex) में अभी तक नहीं हुआ है. DIV 1 द्वारा सी.पी. स्पष्ट है (आंकड़े 2B -2 सी, 2 एफ, 2 जी), और यह 2 DIV (आंकड़े 2 डी, 2H) करने के लिए विकसित करने के लिए जारी है. इस प्रकार पूरे गोलार्द्ध explants E13 समर्थन में शुरू में दो दिनों के लिए प्रमस्तिष्क प्रांतस्था की परिपक्वता और सुसंस्कृत पृष्ठीय neocortex में preplate बंटवारे कब्जा है.

के लिए आदर्श की पुष्टिपृष्ठीय neocortex में अल histological विकास, हम chondroitin सल्फेट proteoglycans (CSPGs), एक बाह्य मैट्रिक्स घटक भी है कि पीपी और उसके डेरिवेटिव MZ और 8,31,32 सपा के एक स्थापित मार्कर के लिए 2 DIV explants immunostained. CSPGs लिए immunostaining पृष्ठीय प्रांतस्था में इन विट्रो संस्कृति अवधि (आंकड़े 3A -3) में immunoreactivity दौरान MZ और सपा में पीपी के उचित बंटवारे का संकेत CSPG के दो बैंड का पता चलता है. पीपी L6 cortical न्यूरॉन्स कि प्रतिलेखन Ctip2 और Tbr1 7,33,34 कारकों को व्यक्त करने के लिए जाना जाता है के द्वारा विभाजित है. इन मार्कर (3D-3F आंकड़े, 3 जी मैं, क्रमशः) के immunostaining पैटर्न नवगठित सी.पी. में इन प्रतिलेखन कारकों के उपयुक्त अभिव्यक्ति की पुष्टि करता है. एक साथ इन विश्लेषण पूरे गोलार्द्ध explants में organotypic जल्दी cortical विकास की पुष्टि करें.

Utero में electroporations बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया हैसेल विकासशील 35 प्रांतस्था में स्वायत्त जीन समारोह के लिए परख के लिए. इसलिए हम परीक्षण किया कि electroporation सफलतापूर्वक पूरे गोलार्द्ध explant मॉडल में न्यूरॉन्स transfect सकता है. बरकरार E13 भ्रूण के बाएं वेंट्रिकल 0.33 मिलीग्राम / एमएल सीएजी GFP प्लाज्मिड और electroporated (तरीके देखें) के साथ अंतःक्षिप्त थे neuronal व्यापारियों में प्लास्मिड डीएनए परिचय है कि लाइन पार्श्व वेंट्रिकल (चित्रा 1 ए). 2 DIV के बाद explants तय की और sectioned histological विश्लेषण के लिए गिरा दिया गया था. इस समय बिंदु पर, GFP व्यक्त कोशिकाओं मस्तिष्क दीवार (4A-4C आंकड़े) भर में सभी cortical क्षेत्रों में मनाया गया. GFP अभिव्यक्ति VZ में neuronal व्यापारियों से देखा जा सकता है जबकि तीव्र GFP व्यक्त कोशिकाओं IZ और सी.पी. में मनाया गया. महत्वपूर्ण बात है, कई GFP + न्यूरॉन्स उभरते dendrites और axons साथ गठन सी.पी. के शीर्ष पर मनाया गया. कोशिकाओं सी.पी. और MZ indicatin के बीच एक अंतरफलक पर असतत परत का गठन किया हैछ उपयुक्त प्रवास गिरफ्तारी और फाड़ना (आंकड़े 4A-4C तीर). dendrites MZ में बढ़ाया जबकि मस्तिष्कप्रांतस्थापवाही axons CP नीचे और IZ आंकड़े (4A-4C और 5, भी पूरक मूवी S1 देखें) में विस्तार. नीचे फर्क कोशिकाओं रेडियल glial फाइबर juxtaposed एक द्विध्रुवी आकारिकी साथ न्यूरॉन्स और नीचे उन्हें IZ में बहुध्रुवीय न्यूरॉन्स (आंकड़े 4D-4F) सहित परिपक्वता के अलग - अलग राज्यों में GFP + कोशिकाओं रहे हैं. इसके अलावा, dendrites MZ में विस्तार जहां ECM प्रोटीन Reelin उचित immunolocalized (आंकड़े 4G-4i) मनाया जाता है. electroporation और explant शर्तों इस प्रकार अग्रदूत के चरणों के माध्यम से अपरिपक्व फर्क न्यूरॉन न्यूरॉन ओर पलायन करने के लिए cortical न्यूरॉन्स के सामान्य विकास की अनुमति.

Electroporation के समय (E13) पृष्ठीय neocortical VZ द्वारा उत्पादित न्यूरॉन्स की 100% L6 के न्यूरॉन्स, न्यूरॉन्सकि 5 पीपी विभाजित. सफल electroporation की आवश्यकता है कि constructs को 6 घंटा दौरान न्यूरॉन्स में पेश किया जा तुरंत करने से पहले, दौरान या कोशिका चक्र के एम चरण 36. यह इस प्रकार की उम्मीद है कि सबसे पहले postmitotic, GFP + पृष्ठीय प्रांतस्था (1 फील्ड) में E13 electroporation के बाद न्यूरॉन्स गठन सी.पी. आबाद करना चाहिए. इस तरह के न्यूरॉन्स (4 चित्रा) मनाया गया, यह दर्शाता है कि प्रोटोकॉल मज़बूती से उनके प्रवास और परिपक्वता के अध्ययन के लिए L6 cortical न्यूरॉन्स को लक्षित कर सकते हैं.

प्रक्रिया / electroporation explant की सफलता की दर का अनुमान लगाने के लिए हम हमारी प्रयोगशाला से चल रही जांच का विश्लेषण किया. कि अध्ययन के दौरान, explants के 21 litters के लिए तैयार किया गया है, 248 भ्रूण की कुल (जैसा ऊपर वर्णित) सीएजी-GFP साथ electroporated थे, और प्रत्येक भ्रूण से एक एकल गोलार्द्ध explant तैयार किया गया था. मूल 248 explants की, 195 (79%) इमेजिंग और विश्लेषण के लिए उपयुक्त आंका गया. 53 के बारे में आधेexplants है कि विश्लेषण नहीं किया जा सका GFP व्यक्त करने में विफल रहा है या गलत लक्षित GFP अभिव्यक्ति था. शेष नुकसान कुरूपता संस्कृति फिल्टर, या histological प्रसंस्करण के साथ जुड़ी समस्याओं से टुकड़ी explant के कारण विकास के द्वारा समझाया गया था. लगभग 80% की सफलता दर (5 चित्रा) explant औषधीय 26 अध्ययनों के लिए उपयुक्त प्रणाली है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पीछे हटने का 7 म्यूटेशनों का विश्लेषण है कि प्रतिकूल जल्दी cortical विकास को प्रभावित प्रदान की गई है.

चित्रा 1
चित्रा 1. पूर्व utero electroporation साथ पूरे गोलार्द्ध explant प्रक्रिया) E13 माउस भ्रूण. एक डीएनए प्लाज्मिड समाधान के साथ इंजेक्शन और electroporated. दिमाग dissected और रहे हैं sagitally transected. electroporatedगोलार्द्ध तो औसत दर्जे का पक्ष रखा जाता है नीचे और एक फिल्टर लेपित कोलेजन पर 2 DIV के लिए सभ्य. गोलार्द्धों रहते हैं तो imaged किया जा सकता है या तय ऊतक विज्ञान और बाद इमेजिंग विश्लेषण के लिए. बी) 10 एक छह अच्छी तरह से टिशू कल्चर पकवान). छह explants के साथ अच्छी तरह से पकवान एक उच्च ऑक्सीजन वातावरण में रखा जाता है में तीन फिल्टर पर रखा explants की एक तस्वीर (95 हे% 2/5% सीओ 2) के भीतर एक Billups Rothenberg इनक्यूबेटर कक्ष, जो फिर एक मानक 37 ° C टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रखा जाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. पूरे गोलार्द्ध Eomes की एक एकल कूड़े :: EGFP भ्रूण से प्राप्त explants में cortical प्लेट का organotypic विकास एक) पंथ की शुरुआत में एक ड्रॉप अचल मस्तिष्क से राज्याभिषेक अनुभाग ई. ure अवधि (हे DIV). ध्यान दें कि पीपी मौजूद है, लेकिन अभी तक कि सी.पी. के लिए फार्म. GFP अभिव्यक्ति द्वारा हरी झंडी अपरिपक्व उत्तेजक न्यूरॉन्स में उत्पादन किया जाता है और नीले रंग Hoechst डाई कि सभी कोशिकाओं के नाभिक लेबल बी, एफ). सी.पी. विकास, धराशायी लाइनों द्वारा चिह्नित किया जाता है, के द्वारा में 0.5 DIV और बढ़ जाती है 1 (सी और जी) DIV और 2 DIV (पैनल डी और एच) के द्वारा मनाया जाता है पैनलों ई. में सेल डोमेन व्यक्त GFP की वृद्धि की मोटाई नोट प्रसार का संकेत. और explant में उत्तेजक न्यूरॉन वंश का भेदभाव. स्केल सलाखों 500 (पैनल ए) सुक्ष्ममापी और 50 सुक्ष्ममापी (पैनल एच) हैं. Abbreviations: सी.पी., Cortical प्लेट, IZ, मध्यवर्ती क्षेत्र; MZ, सीमांत क्षेत्र; सपा, Subplate; VZ, वेंट्रिकुलर क्षेत्र.

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चित्रा 3. पूरे गोलार्द्ध explants में Preplate बंटवारे एसी) Chondroitin सल्फेट proteoglycan immunostaining (CSPG) पीपी (बंटवारे) MZ और सपा. DF में) नवगठित सी.पी. में प्रतिलेखन कारक Ctip2 की अभिव्यक्ति विभाजन दिखाता सैनिक) की अभिव्यक्ति नवगठित सी.पी. में प्रतिलेखन कारक Tbr1. स्केल सलाखों सी, एफ, पैनलों में 50 सुक्ष्ममापी हैं.

चित्रा 4
चित्रा 4. E13 पूर्व utero electroporation के बाद पूरे गोलार्द्ध explants में GFP अभिव्यक्ति एसी) DIV 2 के बाद GFP अभिव्यक्ति. Cortical न्यूरॉन्स सी.पी. (तीर) लोमो.) के शीर्ष Nestin immunoreactiv (लाल) में बनाने की परत पर ध्यान देंएक एक पूरे गोलार्द्ध explant से प्राप्त अनुभाग में एक पूरे गोलार्द्ध explant से एक अनुभाग में अल्पसंख्यक GH.) Reelin immunoreactivity (लाल). पैनलों सी, एफ, और मैं में स्केल सलाखों 50 सुक्ष्ममापी हैं.

चित्रा 5
चित्रा 5. पृष्ठीय औसत दर्जे का प्रांतस्था (1 फील्ड) पूर्व utero electroporations लक्ष्यीकरण में परिवर्तनशीलता एक ही कूड़े से ग्यारह भ्रूण सीएजी GFP अभिव्यक्ति (0.33 मिलीग्राम / एमएल) का निर्माण और पूरे गोलार्द्ध explants रूप सुसंस्कृत साथ electroporated थे ऐ.) नौ ग्यारह explants पता चला पृष्ठीय औसत दर्जे का प्रांतस्था में GFP की अभिव्यक्ति. हालांकि GFP अभिव्यक्ति explants के बीच होती है, प्रत्येक explant GFP में सभी तीन cortical क्षेत्रों (यानी VZ, IZ और सीपी) में पाया जाता है. स्केल बार एक पैनल में 50 सुक्ष्ममापी है.

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Discussion

हम सुधार हुआ है और एक प्रयोगात्मक मॉडल का मूल्यांकन जल्दी cortical विकास के अध्ययन के लिए (E13 E15) - पूरे गोलार्द्ध explants. मॉडल और उत्तेजक न्यूरॉन वंश के मस्तिष्क प्रांतस्था 25,37 6 परत का गठन के प्रवास भेदभाव के विश्लेषण के लिए उपयोगी साबित हो गया. प्रणाली के सिद्धांत लाभ कर रहे हैं 1) organotypic 2 DIV के लिए विकास, 2) तैयारी की सादगी, और 3) इस प्रारंभिक, मस्तिष्क के विकास के महत्वपूर्ण अवधि के दौरान electroporation, औषधीय हेरफेर और इमेजिंग के लिए न्यूरॉन्स के लिए प्रयोगात्मक उपयोग. हम इस प्रणाली का इस्तेमाल किया है आकारिकी, ओरिएंटेशन, और परत 6 preplate बंटवारे की अवधि के दौरान cortical 7,38 न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान विकास में सूक्ष्म अंतर दस्तावेज़.

उत्तेजक न्यूरॉन्स कि 6 परत आबाद काफी हद तक corticothalamic प्रक्षेपण न्यूरॉन्स है कि पृष्ठीय 39,40 thalamus पारस्परिक इनपुट प्रदान से बना रहे हैं 41 प्रांतस्था में तंत्रिका समारोह के तुल्यकालन में कार्यात्मक रूप से भाग लेने की धारणा कर रहे हैं. हालांकि इन न्यूरॉन्स physiologically विशेष परत की पीढ़ी, पलायन और परिपक्वता की प्रक्रिया 6 न्यूरॉन्स प्रांतस्था के 2-6 परतों में सभी उत्तेजक न्यूरॉन्स के साथ बुनियादी सुविधाओं के शेयरों. विशेष रूप से, सभी cortical उत्तेजक न्यूरॉन्स पृष्ठीय telencephalic VZ में उत्पन्न कर रहे हैं, बहुध्रुवीय न्यूरॉन्स के रूप IZ के माध्यम से विस्थापित, और सी.पी. 7 भीतर अंतर. Pax6, Tbr2, और Tbr1 29: उत्तेजक cortical न्यूरॉन्स की परिपक्वता sequentially व्यक्त प्रतिलेखन कारकों में से एक सेट कोर द्वारा संचालित है. इस क्रम 2-6 परतों में 42 सब उत्तेजक न्यूरॉन्स द्वारा साझा किया जाता है और हम नवगठित सी.पी. (3 जी-3I आंकड़े) में Tbr1 की उपयुक्त अभिव्यक्ति की पुष्टि की. परत 6 cortical न्यूरॉन्स के विकास की जांच के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए इस प्रकार Neu के विकास में आवश्यक अंतर्दृष्टि प्रदान करना चाहिएrons कि सभी cortical परतों का गठन.

पूरे गोलार्द्ध explants cortical न्यूरॉन विकास के अध्ययन के लिए मौजूदा तरीकों के पूरक हैं. पूर्व अध्ययनों एक E14 पूरे गोलार्द्ध explant 1 22,23 DIV के लिए cortical विकास अध्ययन दृष्टिकोण कार्यरत है. हम पूर्व utero electroporation साथ पूरे गोलार्द्ध explants युग्मित है L6 गठन और preplate बंटवारे की अवधि के दौरान cortical विकास के 2 दिनों की जांच करने के लिए. E13 पर utero electroporations में इसके विपरीत, पूर्व utero पूरे गोलार्द्ध explant द्वारा बाद electroporations की सफलता की दर अधिक है: हमारे हाथ में हम ~ पृष्ठीय telencephalon electroporation लक्ष्यीकरण में 80% सफलता हासिल. इसके अतिरिक्त, utero electroporations में एक अस्तित्व सर्जरी की आवश्यकता होती है और पूरे गोलार्द्ध पूर्व utero दृष्टिकोण की तुलना में काफी अधिक तकनीकी प्रयास ले. अंत में, utero अध्ययन में आसानी से सटीक औषधीय करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैंजोड़तोड़ और इमेजिंग दृष्टिकोण. सटीक या दवाओं और परिभाषित सांद्रता में आणविक एजेंट (अभिव्यक्ति वैक्टर, मुंह बंद constructs, आदि) के वितरण सक्रियण में अस्थायी नियंत्रण पूरे गोलार्द्ध explants के साथ प्रदान की जाती है, लेकिन अधिक utero में प्राप्त करने के लिए मुश्किल है. ऐसे जोड़तोड़ के परिणामी प्रभाव के ऑप्टिकल निगरानी जीते, माइक्रोन रेंज में स्थानिक संकल्प के साथ, तत्काल EUEP साथ उपलब्ध है, लेकिन IUEP नहीं है. ऐसी परिशुद्धता के लिए काफी हद तक cortical विकास और समारोह से जुड़े प्रयोगों से एकत्र आंकड़ों के व्याख्यात्मक शक्ति बढ़ाने की संभावना है. जल्दी cortical विकास पूरे गोलार्द्ध explants के अध्ययन के लिए इस प्रकार में utero दृष्टिकोण पर अलग प्रयोगात्मक फायदे के अधिकारी. इस समय, तथापि, लिए ऊपरी परत cortical न्यूरॉन्स और प्रयोगों के डेटा संग्रह> 48 घंटा, टुकड़ा explants utero दृष्टिकोण में और की आवश्यकता के अध्ययन बेहतर रहते हैं.

वहाँ रहे हैं कई पूरे गोलार्द्ध explant तकनीक की सफलता के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकताओं. पहले explant के विकास के अत्यधिक meninges की यांत्रिक अखंडता के प्रति संवेदनशील है. Meninges शारीरिक नुकसान (यानी punctures या आँसू) कम से कम एक अंतर्निहित प्रांतस्था के स्थानीय विकास को बाधित करेगा. दूसरे, explant विकास संस्कृति के भीतर अच्छी तरह से मीडिया की कुल मात्रा के प्रति संवेदनशील है: बहुत अधिक मीडिया के साथ explants फिल्टर से छुड़ाना और विकृत सी.पी. वास्तुकला का विकास होगा, बहुत कम मीडिया और explants साथ निर्जलीकरण और अत्यधिक कोशिका मृत्यु का अनुभव होने की संभावना हैं . अन्त में, वर्तमान तकनीक explants साथ हम 2 DIV के लिए cortical विकास प्रलेखित है. जब E13 इस विकास समय विंडो पर शुरू, हालांकि कई मूल्यवान जांच स्वीकार करने synaptogenesis और विहित neuronal संचार के लिए पहले एक अवधि के लिए विश्लेषण प्रतिबंधित करता है. हालांकि E14.5 व्यक्त कई mRNAs में cortical न्यूरॉन्स synaptic प्रोटीन एन्कोडिंग (में w.genepaint.org "लक्ष्य =" "> www.genepaint.org _blank), synaptogenesis E15 ~ तक पार्श्व प्रांतस्था में नहीं शुरू करता है, और इस synaptogenesis 6 परत न्यूरॉन्स 43 के बजाय कोशिकाओं preplate सीमित है कुछ महत्वपूर्ण से संबंधित प्रश्नों के. cortical synapse गठन और समारोह इसलिए कर रहे हैं पूरे गोलार्द्ध explant प्रणाली के साथ वर्तमान में नहीं पता है.

अंत में पूरी के गोलार्द्ध explant तैयारी मज़बूती से और लगातार इस्तेमाल किया जा सकता पैतृक मस्तिष्क विरूपताओं के माउस मॉडल में जल्दी cortical विकास की जांच. तकनीक आसानी से आरएनएआई, shRNA, और अन्य आणविक और औषधीय जोड़तोड़ अनुकूलनीय है. पूरे गोलार्द्ध explant भी प्रोटीन रीकॉम्बीनैंट लागू, दवाओं और पर्यावरण विषाक्त पदार्थों को शामिल अध्ययन के लिए उपयुक्त है.

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Disclosures

लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.

Acknowledgments

इस काम (NS066071) NINDS और NIAAA से अनुदान समर्थित किया गया. (P50AA017823) ईसीओ. लेखक डॉ. रॉबर्ट क्विन और जानवरों की देखभाल के लिए प्रयोगशाला के पशु संसाधन विभाग में कर्मचारियों धन्यवाद. हम तकनीकी समर्थन के लिए Judson Belmont धन्यवाद, एक ग्रीष्मकालीन अंडर रिसर्च फैलो (सर्फ) के रूप में सहायता के लिए निकोल Belletier. हम भी टिप्पणी के लिए धन्यवाद डॉ. डेविड कैमरून और पांडुलिपि के पहले के एक संस्करण पर संपादन.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM/F12 + GlutaMAX GIBCO 10565
G5 Supplement 100X Invitrogen 17503-012
B27 Serum-Free Suppl. 50X Invitrogen 1504-044
Pen / Strep Liquid 100X Invitrogen 15140-122
HBSS 500 ml GIBCO 14025
Culture insert collagen coated Costar 3492
Bovine skin gelatin Sigma G9382
H–chst 33342 Invitrogen H1399
Bovine Serum Albumin Sigma 7906
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
Equipment
BTX 830 Electroporator Harvard Apparatus 450052
Tweezer electrodes 10mm Harvard Apparatus 450166
Incubator Billups Rothenberg MIC-101
Hamilton syringe (5uL) Hamilton 87930
Hamilton syringe needle Hamilton 7803-04 Specify 1" and style 4
Dumont #5 Forceps FST 11251-10
Fine Scissors Tough Cut 9 cm FST 14058-09

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References

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<em>पूर्व utero</em> electroporation और पूरे गोलार्ध explants: प्रारंभिक Cortical विकास के अध्ययन के लिए एक सरल प्रयोगात्मक विधि
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Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development. J. Vis. Exp. (74), e50271, doi:10.3791/50271 (2013).

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