Summary
Gerichte-esterase geïnduceerde kleurstof laden (TED) ondersteunt de analyse van de intracellulaire calcium winkel dynamiek door fluorescentie beeldvorming. De methode baseert op richten van een recombinant carboxylesterase het endoplasmatisch reticulum (ER), waar het verbetert de lokale ontmaskering van synthetische lage affiniteit Ca
Abstract
Visualisatie van calciumdynamiek is belangrijk om de rol van calcium in celfysiologie begrijpen. Aan calcium dynamiek te onderzoeken, hebben synthetische fluorescerende Ca2 + indicatoren populair geworden. Hier laten we TED (= gericht esterase-geïnduceerde loading dye), een werkwijze voor de afgifte van Ca2 + verbetering indicator kleurstoffen in het ER lumen van verschillende celtypes. Tot op heden werd TED in cellijnen, gliacellen en neuronen in vitro. TED bases op efficiënte, recombinant richten van een hoge carboxylesterase activiteit om het ER lumen met behulp van vector-constructies die express carboxylesterasen (CES). De meest recente TED vectoren bevatten een kernelement van CES2 gefuseerd met een rood fluorescerend eiwit, waardoor gelijktijdig twee-kleuren beeldvorming. De dynamiek van de vrije calcium in het ER worden afgebeeld in een kleur, terwijl de desbetreffende ER structuur verschijnt in het rood. Aan het begin van de procedure worden cellen getransduceerd met een lentivirus. Vervolgens, de geïnfecteerde cellen eenopnieuw gezaaid op dekglaasjes om eindelijk live cell imaging mogelijk. Vervolgens worden levende cellen geïncubeerd met de acetoxymethylester (AM-ester) vorm van lage-affiniteit Ca 2 +-indicatoren, bijvoorbeeld Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, of Mag-fura2-AM. De esterase activiteit in de ER klieft uit hydrofobe zijketens van de AM-vorm van de Ca 2 +-indicator en een hydrofiele fluorescerende kleurstof / Ca 2 + complex wordt gevormd en opgesloten in het ER lumen. Na kleurstof laden, worden de cellen geanalyseerd op een omgekeerde confocale laser scanning microscoop. Cellen zijn continu geperfuseerd met Ringer-achtige oplossingen en de ER calciumdynamiek direct gevisualiseerd door time-lapse imaging. Calcium afgifte uit het ER wordt geïdentificeerd door een afname in fluorescentie-intensiteit in de gebieden van belang, terwijl het bijvullen van de ER calcium opslag veroorzaakt een toename in fluorescentie-intensiteit. Tenslotte wordt de verandering in fluorescentie-intensiteit in de tijd bepaald door berekening van AF / F 0.
Introduction
Om de fysiologische calcium reacties van de ER op te lossen, hebben we een nieuwe strategie om de vangst van synthetische calcium-gevoelige kleurstoffen in de ER verbeteren ontwikkeld. De methode kan de directe, niet-verstorende real-time monitoring van de vrije ER calcium in aanwezigheid van extracellulair calcium.
Functie en signalering van ER Calcium
Calcium signalen zijn te vinden in verschillende celtypen, bijvoorbeeld spier-cellen, neuronen en gliacellen en hun functies variëren van bemiddelen spiercontractie om een betrokkenheid bij synaptische transmissie in leren en geheugen 1,2. Veranderingen in de concentratie vrij calcium van groot wetenschappelijk belang omdat calcium is betrokken bij de regulatie van gentranscriptie, celproliferatie, neuronale prikkelbaarheid, celdood en andere cel signalerende gebeurtenissen 1-7. Al deze cellulaire calcium signalen functioneel verbonden en bijdragen tot intracellulaire calciumwinkel dynamiek 8-10.
Een gemeenschappelijk kenmerk van alle calcium signalen is de stroom van calcium tussen de extracellulaire ruimte, het cytosol en organellen, vooral de ER en mitochondria. Hierdoor dynamische veranderingen in calciumconcentratie in deze organellen, die worden waargenomen door verschillende signaleringscomponenten. In het algemeen is de calciumconcentratie in het ER varieert tussen 100-800 uM, in het cytosol de calciumconcentratie dicht bij 100 nM en in de extracellulaire ruimte is de concentratie ongeveer 1-2 mM. Dienovereenkomstig is er een grote chemische motor voor calcium stromen naar het cytosol 2,9,10.
De meest onderzochte ER-afgeleide calcium signalen afhankelijk van de stimulatie van G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR) die vervolgens activeren fosfolipase C (PLC). PLC op zijn beurt produceert inositol 1,4,5-trifosfaat (IP-3) 1. Na binding van IP3 zijn receptor (IP 3-Rec, figuur 1) in de ER-membraan, worden calciumionen vrij uit het ER lumen. Historisch gezien, IP 3-gemedieerde calcium vrijlating uit de ER was eerste - hoewel indirect - gemeten in acinar alvleeskliercellen door Streb et al. in 1983 11.. Deze publicatie voorgesteld voor het eerst een signalerende cascade met acetylcholine, fosfolipase C en IP3. Deze manier van calcium release algemeen aangeduid IP3-geïnduceerde calciumafgifte (IiCR) (figuur 1). Kinase-afhankelijke activering van fosfolipase Cy door receptor tyrosine kinases banden de actie van groeifactoren en neurotrofe factoren aan ER calcium signalering na IP 3 elevatie 12. Naast IiCR, kan calcium hoogte worden gemedieerd door ionotrope calciumingang, bijvoorbeeld via spanningsafhankelijke calciumkanalen (Ca V) en vervolgens calcium geïnduceerde calcium afgifte (CICR) door re ryanodineceptors (RyR). IiCR en CKP zijn fysiologisch gekoppeld aan winkel-bediende calciumingang (SOCE). SOCE omvat de werking van STIM (stroma interactie molecule), een sensor voor ER calcium release. STIM is aangetoond extracellulair calcium ingang stimuleren door transient receptor potential kanalen (Trp) 13 Orai calciumkanalen 14 en zelfs spanningsafhankelijke calciumkanalen 15 (figuur 1). Verlies van ER calcium wordt dynamisch gered door de werking van de sarco-endoplasmatisch reticulum calcium ATPase (SERCA), die actief pompen calcium terug in het ER. Het blokkeren van de SERCA met drugs zoals thapsigargin onthult een continu verlies van ER calcium aan de cytosolische compartiment. Deze ER calcium "lek" wordt veroorzaakt door ER intramembrane porie complexen zoals het Sec61-eiwitcomplex 16,17 (Figuur 1).
In 1998 Berridge publiceerde een model, de "neuron binnen een neuron model", which suggereert een principe fysiologische rol van de ER in het integreren van neuronale calcium 5. Dit model beschouwt het bestaan van een continu ER membraan systeem vormen een intracellulair "imago" van de neuronale plasmamembraan 5. Deze binaire eukaryote membraan systeem werd beweerd dat een basisvoorwaarde voor temporele en ruimtelijke integratie van snelle en langzame calcium signalen in neuronen zijn. Calcium signalen die ofwel optreden gelijktijdig of nadien in verschillende stekels of dendrieten van de zelfde neuron worden verleend aan soma of nucleus via de ER, waar ze worden opgeteld 5,18 van de cel. Dan kunnen hun som effecten op de prikkelbaarheid van het neuron, regulatie van gen transcriptie of integratie van signaleringscascades hebben. Dus de ER ondersteunt de integratie van calcium signalen. Een voorwaarde voor dit concept is de continuïteit van de ER in een cel, die is geclaimd door verscheidene studies die bewezen althans somato-dendritic gebieden en de korte afstand axonale projecties 19-21. Of sprake is van ER continuïteit binnen lange axonale projecties is een kwestie van debat.
Strategieën om de stroom van vrij calcium via ER membraan meten
Calcium signalen worden meestal gevolgd in het cytosol 22,23. Derhalve kan niet gemakkelijk worden onderscheiden of Ca 2 + stroomt in het cytosol van extracellulaire of intracellulaire opslagplaatsen 6,24. Om deze beperking te omzeilen, hebben methodologische strategieën voor directe ER calcium beeldvorming ontwikkeld. Samenvattend worden de volgende strategieën: (1) ER-gerichte genetisch gemanipuleerde eiwit-indicatoren 25-27 eiwit gebaseerde lage affiniteit Ca2 + indicatoren de bioluminescent eiwit GFP aequorine of in combinatie met een calcium gevoelige eiwit.. Deze genetisch gemanipuleerde Ca 2 +-indicatoren (GECIS) kangericht naar de ER met behulp van een signaalpeptide en actief blijven in het ER met een retentietijd en retrieval motief. Gemeenschappelijke ER Ca 2 +-indicatoren te baseren op de Cameleon principe en zijn de Cameleon YC4.3 26,28; Cameleon split YC7.3ER 29, en Cameleon D1 30. (2) Direct esterase-based dye laden van AM-ester lage affiniteit Ca 2 +-indicatoren 31,32. AM-derivaten van de indicator kleurstoffen (Mag-fura2-AM, Mag-Fluo4-AM of Fluo5N-AM) passeren de biologische membranen in een lipofiele, calcium-ongevoelige toestand. Vervolgens, in het cytosol en in de ER, endogene esterases splitsen van de AM-estergroep en laat de Ca 2 +-indicator, met achterlating van een bepaalde hoeveelheid actieve kleurstof in het cytosol en in de ER. Daarom is deze benadering bruikbaar onder omstandigheden van een hoge concentratie calcium in de ER zolang de cytosolische calciumconcentratie ruim beneden de debescherming limiet van de lage-affiniteit-indicatoren, met name tijdens karakteristieke calcium signalen (bijv. nM tot laag uM). (3) AM-ester loading in combinatie met plasma membraan permeabilisatie 32. Overgebleven cytosolische Ca 2 +-indicator wordt verwijderd door plasma-membraan permeabilisatie met kleine hoeveelheden van een "mild" detergens (bijvoorbeeld saponine) in een kunstmatige intracellulaire buffer. Aldus kan de intracellulaire membranen worden gestimuleerd, bijv. met IP3 in de intracellulaire buffer, rechtstreeks via "poriën" in de plasmamembraan. (4) Dialyse van het cytosol onder whole-cell configuratie en gelijktijdige metingen van Ca 2 + in het ER lumen en het cytosol 32,33. Een cel wordt eerst geladen met een lage affiniteit Ca 2 +-indicator (bijv. Mag-fura2- AM, ratiometrisch, UV-licht). Daarna, met de hulp van een patch pipet, eventueel resterende cytosolic lage affiniteit Ca 2 +-indicator wordt gedialyseerd uit het cytosol met een buffer met een hoge affiniteit Ca 2 +-indicator (bijv. Fluo-3, zichtbaar licht). Deze strategie maakt het mogelijk gelijktijdig opnemen van cytosol en ER afgeleide signalen. (5) Gerichte-esterase-geïnduceerde kleurstof laden 8,34. A carboxylesterases (CES) is gericht op het lumen van het ER en biedt een high esterase activiteit efficiënte vangst van de AM-ester vorm van lage affiniteit Ca2 + indicatoren.
Gerichte-esterase geïnduceerde kleurstof laden (TED)
Het richten van lage-affiniteit Ca 2 +-indicatoren om de ER lumen te verbeteren, is TED ontwikkeld. TED vereist overexpressie van een ER gerichte muis carboxylesterase (CES2) (Figuur 2), hetgeen wordt bereikt door expressieconstructen. Cellen die een recombinant CES-construct worden geïncubeerd met het AM-ester vorm van calcium inindicator kleurstof (Fluo5N-AM, figuur 2). Vervolgens, in het ER, wordt de kleurstof omgezet in de Ca2 + gevoelige membraan doorlaatbare Ca 2 + complex indicator (Fluo5N/Ca 2 +) door de hoge esterase activiteit dan het vangen van de kleurstof in een hoge concentratie in het ER lumen 8 , 34. De werkwijze is bijzonder nuttig voor ER calcium-afgifte te onderzoeken via de IiCR-wegen bijvoorbeeld via metabotrope, purinerge-of glutamaatreceptoren 8,34 en ER calcium uitputting visualiseren via "lek kanalen" direct, bijvoorbeeld na blokkade van de SERCA 17 , 34. Onze ervaring de lage affiniteit Ca 2 +-indicator Fluo5N-AM is momenteel de best beschikbare indicator om te gebruiken met de TED kleurstof laden strategie. Fluo5N-AM heeft een lage affiniteit voor Ca 2 + (dissociatieconstante K D ~ 90 uM, figuur 2), is vrijwel non-tl in zijn AM-vorm, maar biedt een hoge fluorescentie-emissie bij calcium. binding 8,34. De Fluo5N/Ca 2 + complex geëxciteerd kan worden met een standaard lichtbron van ~ 490 nm, wat overeenkomt met standaard kleurstoffen zoals FITC, Alexa 488 of eGFP. Cytosolische calcium signalen nauwelijks een concentratie in het lage uM range bereiken en worden derhalve nauwelijks gedetecteerd door Fluo5N in de cytosol 35.
Om TED verbeteren, werden verschillende recombinante vector constructen ontwikkeld (figuur 3). Oorspronkelijk TED vectoren op basis van de coderende sequentie van CES2 (Refseq toegangsnummer NM_145603, CES2c) en best TED werking wordt waargenomen met stabiele expressie van CES constructen. Nieuwe TED vectoren drukken een kernelement van CES2 gefuseerd met de rode fluorescentie eiwit TagRFP-T2 36. Deze vectoren hebben het voordeel dat zij kunnen worden geïdentificeerd getransduceerde cellen en de rode fluorescentie als een interne controle voor de normalisatie van veranderingen in Fluo5N/Ca 2 + fluorescentie. De rode fluorescentie biedt ook de mogelijkheid om de structurele verdeling van de ER en veranderingen in ER processen onder de stimulatiecondities visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol introduceert TED toegepast op cellijnen, hippocampale neuronen en corticale gliacellen. TED prestaties best wanneer TED vectoren stabiel tot expressie gebracht, bijvoorbeeld door lentivirale vectoren. Een schematisch overzicht van de TED werkwijze wordt getoond in figuur 4.
1. Voorbereiding van Solutions
De volgende oplossingen worden bereid voordat en kunnen worden opgeslagen zoals aangegeven. Wij gebruiken over het algemeen gesteriliseerd glas en plastic materiaal en geautoclaveerd water.
- Bereid HEPES-Ringer (in mM): 125 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO4 .7 H2O, 2 CaCl2, 1,25 NaH 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H O. 2. Calcium-free HEPES-Ringer bestaat uit (in mM): 127 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO4 .7 H2O, 1,25 NaH 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H 2 O en 0,1 EGTA.. Zonder glucose deze beeldvormende oplossingen kunnen be bewaard bij 4 ° C. De benodigde hoeveelheid D-glucose wordt vers toegevoegd vóór gebruik.
- Voor TED analyse in hippocampale neuronen, is kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) aanbevolen. ACSF bestaat uit (in mM): 127 NaCl, 23 NaHCO3 3 KCl, 2,5 NaHPO 4 H 2 O 25 D-glucose.H 2 O, 2 CaCl2, 2 MgCl2 .7 H 2 0 in DDH. 2 0.
- Bereid Fluo5N-uur tot een concentratie van 5 mM. Om oplosbaarheid commentaar 8,9 pl 20% Pluronic F-127 (in DMSO, bewaard bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht en vocht) tot 50 ug gelyofiliseerd Fluo5N-AM. Dan oplosbaar Fluo5N-AM door middel van een waterbad ultrasoonapparaat minstens 2 minuten. Store porties à 0,5 ul bij -20 ° C, beschermd tegen licht en vocht.
- Bereid antagonist en agonist aandelen als nodig is. Bijvoorbeeld: a) 10 mM ATP of ADP (in H 2 O, metabotropische activering van purinerge receptoren), b) 10 mM carbachol in H2O (agonistmuscarine acetylcholine receptor), c) 30 mM Cyclopiazonzuur (CPA) in DMSO (inhibitor van de SERCA), d) 50 mM DHPG in PBS (metabotrope glutamaat receptor agonist voor mGluR I mGluR 5), e) 10 mM glutamaat in H 2 O, f) 1 mM ionomycine in DMSO (ionofoor), g), 5 mM thapsigargin in DMSO (hoge affiniteit blocker van de SERCA). WINKEL aliquots bij -20 ° C.
- Lentivirale vectoren: Dit protocol omvat het gebruik van lentivirale TED expressievector deeltjes. Hun productie en opslag is geen onderdeel van dit protocol. We gebruiken lentivirale vectoren van de tweede generatie voor de overdracht van recombinante carboxylesterasen cellijnen, gliale cellen en neuronen. Ons lentivirale systeem bases op de expressie vector FUGW 37, en de verpakking plasmiden pCMVΔR8.91 of psPAX2 en de pseudotypering plasmide pMD2.G 38,39 LET OP:. Bedenk dat het werken met recombinant self-inactiveren lentivirale vectoren vereist de zorgvuldigeafweging van bioveiligheid richtlijnen. In veel landen zijn deze vectoren geklasseerd als biologisch risicogroep 2. Voor meer informatie verwijzen naar http://www.addgene.org/lentiviral/ .
2. Voorbereiding en virale infectie van de muis hippocampus Neuronen
- Wassen dekglaasjes in een glazen petrischaal van 20 cm diameter (100 dekglaasjes per schaaltje) 1x in 70% ethanol gedurende ongeveer 30 minuten. Tot slot, voeg 100% ethanol (pa) voor 2 minuten. Verwijder de resterende ethanol en droog de dekglaasjes onder een steriele kap.
- Bereid twee verschillende soorten media voor hippocampale neuron culturen: (a) Neurobasal medium met B27 1:50; (b) volledige medium: Neurobasal medium met B27 01:50, Glutamax 1:100, en N2 supplement 1:100. Steriele filtraat de media en bewaar ze in de cel incubator tot gebruik.
- Een dag voor dissectie worden de dekglaasjes bereid door eerst een steriel 10 mm dekglaasje in elkgoed van een 4-well celkweek schotel. Daarna zorgvuldig jas elke dekglaasje met 80-100 ul 0,1% Poly-L-lysine en bewaar de gerechten in een incubator 's nachts.
- Op de dag van dissectie en celkweek, beginnen wassen van de dekglaasjes driemaal met 100 ul HBSS en breng 100 ui Neurobasal medium aan elk dekglaasje. Leg de schalen in een incubator voor evenwicht (bijv. tijdens dissectie van muizen).
Ontleding
Wij voeren onze experimenten met muizen in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Unie, zoals goedgekeurd door onze institutionele verzorging van dieren en het gebruik commissie.
- Verwijder de totale hersenen en ontleden de hippocampus bilateraal.
- Verwijder zorgvuldig de hersenvliezen en het weefsel dan de hippocampus en plaats elk in een 1,5 ml buis met 450 pi HBSS een zeepaardje. Sla het weefsel op ijs tot een voldoende hippocampus is geïsoleerd.
- Voeg 50 ul 1% trypsine (Worthington) aan elke buis en incubeer ze in een 37 ° C waterbad gedurende 15 minuten. Schud de buizen af. Om de spijsvertering reactie te stoppen, voeg 50 ul 1% trypsine-remmer aan elke buis en keer de buis een paar keer.
- Breng alle weefsels tot 5 hippocampus een 15 ml Falcon buis toelaat de overdracht van vloeistof. Voeg B27-medium (a) tot een eindvolume van 5 ml.
- Vermaal het weefsel met behulp van een brand gepolijste Pasteur glazen pipet door voorzichtig en neer te pipetteren. OPGELET: Vermijd luchtbellen!
- Spin bij 400 xg gedurende 3 min, aspireren en resuspendeer de celpellet in 5 ml B27-medium (a).
- Vermaal het weefsel opnieuw met de glazen pipet, en vervolgens twee keer met de hulp van een 1000 ui plastic filter tip. Voer deze zoals beschreven in stap 2.9 en 2.10.
- Na de laatste centrifugatie, resuspendeer de cel pellet in 2 ml volledig medium (b) en vermaal cellen met een 200 ul plastic filter tip. Om de resterende celklonten scheiden van de single-celsuspensie, laat celklonten settelen voor 1-2 minuten.
- Telling cellen en berekent het totale aantal cellen die nodig zijn voor virale infectie. Voor TED imaging 25.000 cellen per 10 mm dekglaasje.
- Plating om 25.000 niet-getransduceerde cellen als controle wordt aanbevolen met dit punt.
Virale infectie
- Breng de celsuspensie voor virale infectie in een frisse 15 ml falcon buis en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 400 x g.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 300 ul medium (b)
- Voeg een geschikte hoeveelheid infectieuze lentivirale TED expressievector deeltjes en laat de Falcon buis staan bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Vul de buis met volledig medium (b) het eindvolume nodig voor plating (100 ul per 10 mm dekglaasje), Zuig het medium van de coverslip, en meteen plaats 100 pi celsuspensie op elke dekglaasje.
- Leg de schalen in de broedstoof totdat alle cellen zijn neergestreken (ca. 2 uur) aandachtig en vullen de borden totdat ze bevatten 2 ml medium (b).
- Laat neuronen groeien ten minste een week. Vervang 50% van het medium elke week.
3. Cultuur en virale infectie van de Muis Corticale gliale cellen
Voorbereiding
- Begin met glia bereiden basaal medium (1:1 mengsel van DMEM/F12 met 10% FCS, 5% HS, 1% penicilline / streptomycine, 0,45% glucose) en bekleding van een T75 celkweek kolf met 4 ml 0,5 ng / ml Poly -DL-ornithine hydrobromide (PORN) (verdund in 150 mM boorzuur oplossing, pH 8.35). Na incubatie bij 37 ° C gedurende 2 uur of 's nachts, was de celkweek kolf driemaal met HBSS en voeg 18 ml glia basaal medium bevattende B27 1:50 en 10 ng / ml EGF. Equilibreer de celkweek kolf in de incubator (maximaal 3 uur).
- Wij voeren onze experimenten met muizen in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Unie, zoals goedgekeurd door onze institutionele verzorging van dieren en het gebruik commissie.
- Ontleden van de hersenen van een P5-P7 muis en verwijder de hippocampus en de hersenvliezen uit beide hemisferen, zoals beschreven in 2.5.
- Ontleden de frontale cortex, snijd deze in verschillende kleine stukjes en verzamel ze in een 1,5 ml buis met HBSS. Bewaar de buis op ijs en ga verder met de celkweek deel.
Celcultuur
- Breng alle weefsel van de buis naar een 15 ml falcon buis met behulp van een brand geslepen glazen pipet.
- Voeg basismedium tot een eindvolume van 5 ml en vermaal het weefsel door pipetteren meerdere malen op en neer met een vuur gepolijste glazen pipet. Na centrifugatie bij 300 xg gedurende 3 min, zuig het medium en resuspendeer de celpellet in 5 ml basismedium.
- Herhaal stap 3.5 tweemaal.
- Na de third centrifugatie, resuspendeer de cel pellet in 2 ml glia basaal medium bevattende B27 (01:50) en 10 ng / ml EGF.
- Titruate nogmaals en breng de celsuspensie op de voorbereide T75 celkweek kolf en laat cellen groeien gedurende 3-4 dagen.
Wassen van gliacellen (na 3-4 dagen in cultuur):
- Was de cellen eenmaal met 10 ml PBS en krachtig tik of zachtjes raakte de kolf een paar keer met je hand, terwijl het strak in de andere hand. Door deze stap celafval en celgroepen uit de kweek worden verwijderd.
- Zuig het PBS en voeg verse basaal glia medium met B27 (01:50) en 10 ng / ml EGF. Verder cultiveren de cultuur voor 5-7 dagen tot de cellen te bereiken 80% confluentie.
Splitsen, transductie en laatste zaaien van gliacellen:
- Coat 10 mm dekglaasjes met 100 ul Poly-D-lysine (Stockoplossing: 0.1%, 1/50 verdund ad 20 ug / ml in PBS of HBSS) en incubeerze in een incubator 's nachts. Was de dekglaasjes drie keer met HBSS en voeg 100 ul basaal glia medium. Evenwicht dekglaasjes in de incubator (3 uur).
- Was tweemaal het gliacellen met 10 ml PBS, zuig het PBS, en voeg 3 ml trypsine (TrypLE, onverdund). Trypsinize cellen voor maximaal 1 minuut. OPGELET: Vermijd over-behandeling met trypsine. Gewoonlijk meer dan 80% van de cellen losgemaakt na 1 min en dit is voldoende om miljoenen van gezonde cellen.
- Stop de reactie door het toevoegen van 10 ml basaal glia medium, breng de celsuspensie om een 15 ml falcon buis, centrifuge bij 300 xg gedurende 3 minuten. Zuig het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 5 ml basale glia medium.
- Opnieuw draaien en aspireren zoals beschreven in stap 3.15, dan resuspendeer cellen in 5 ml Glia basaal medium.
- Breng het vereiste aantal cellen een 1,5 ml buis. 10 4-2x10 4 gliacellen zijn voldoende voor een 10 mm dekglaasje. Meestal is de schorsing volume te transduceren voor een 4-well-dish minder dan 200 pl. Voeg een geschikte hoeveelheid lentivirale TED expressievector deeltjes aan de cellen en incubeer deze bij kamertemperatuur 10 minuten. Vul dan de ophanging met basale glia medium tot het zaaien volume (100 pl per dekglaasje).
- Zaad 100 pi geïnfecteerde cellen per dekglaasje en incubeer gedurende ongeveer 2 uur, voeg glia basaal medium met B27 1:50 en 10 ng / ml EGF tot een eindvolume van 2 ml.
- Voor ideale kweekomstandigheden te gebruiken cellen voor experimenten op dag 3-7 na plating.
4. Generatie en cultuur van Reporter Cell Line
TED reporter cellijnen werden vastgesteld op basis van HeLa, BHK21, Hek293 en SH-SY5Y. Hier bieden wij het protocol voor HeLa-cellen, maar het protocol kan worden overgedragen naar een andere cellijn ook.
Generatie van stabiele HeLa-cellijn
- Splits een wild-type HeLa-cellijn en overdracht 100.000 cel in een volume van 200 ul van een 1,5 ml buis.
- Voeg een geschikte hoeveelheid lentivirale TED expressievector deeltjes aan de buis en incubeer de cel-virus suspensie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Dan zaad de cellen in een totaal volume van 2 ml medium (DMEM, 10% FCS, 1% penicilline / streptomycine) in een 30 mm schaal en incubeer gedurende 3 dagen.
- Na een keer wassen met PBS, zuigen medium en voeg 500 ul trypsine (TrypLE, 2:03 in PBS). Incubeer gedurende ca. 3 min en dan stoppen de reactie door het toevoegen van 3 ml medium. Breng de suspensie over in een 15 ml falcon buis en centrifugeer bij 400 xg gedurende 3 minuten.
- Resuspendeer de celpellet in 200 pl medium en opnieuw infecteren van de cellen met lentivirale deeltjes zoals beschreven in 4.2. Vervolgens zaadcellen in een T25 celkweek kolf in 10 ml medium.
- Groeien cellen tot een confluentie van 60-80% wordt bereikt. Vervolgens splitsen de cultuur.
TED reporter cellijnen
- TED reporter cellijnen kan worden behoudened in een standaard medium, zoals DMEM dat 5% of 10% FCS en 1% penicilline / streptomycine gebruikt.
- Plaat een geschikt aantal cellen in een 4-putjes bevattende steriele 10 mm dekglaasjes (zie boven), bijvoorbeeld 10.000 tot 20.000 cellen per dekglaasje.
- Groeien cellen gedurende ten minste twee dagen alvorens ze voor TED beeldvorming.
5. Voorbereiding voor de Live Imaging Procedure op een omgekeerde microscoop
- Voorverwarmen HEPES-Ringer tot kamertemperatuur en voeg D-glucose.
- Voorverwarmen de ACSF (zonder Ca2 + en Mg2 +) tot kamertemperatuur en voeg D-glucose. Beluchten de ACSF met carbogen gedurende 5 minuten. Voeg dan 1 M voorraadoplossingen van CaCl2 en MgCl2 tot eindconcentraties van 2 mM elk.
- Start de live-imaging microscopen en alle computerprogramma's.
- Start perfusie op een "dummy" imaging kamer gebracht en evenwicht de buis systeem.
- Voorverwarmen de inline oplossing kachel en de beeldvorming kamer in de microscoop podium. Bevestig de beeldvorming kamer in een verwarmings-inzetstuk.
- Evenwicht van het systeem tot 32-37 ° C voordat u de kleurstof laden te starten. LET OP: Om onbedoelde stroming van perfusie-oplossing in de microscoop systeem dat we gebruiken haar banden rond de doelstellingen en elastomeer silicone sheets (1mm) ter bescherming van de microscoop podium te vermijden.
6. Dye Laden van beide Cell Type
- Resuspendeer 1 portie van Fluo5N-AM (zie 1.3) in 100 ul voorverwarmde imaging-oplossing (HEPES-Bel of ACSF).
- Oplosbaar Fluo5N-AM in de imaging-oplossing (HEPES-Bel of ACSF) in een waterbad ultrasoonapparaat gedurende 90 sec.
- Gebruik een vers 4 - of 24-well plaat en overdracht 400 ul voorverwarmde imaging oplossing voor een goed. Voeg de kleurstofoplossing aan dezelfde put naar 500 pi van een 5 uM oplossing te komen.
- Plaats een dekglaasje voorzichtig met cellen (bv.10-18 mm in diameter) in de put, cellen naar boven.
- Incubeer gedurende een passende tijd in een celkweek incubator bij 37 ° C (inmiddels beeldvorming instellingen voor te bereiden op de microscoop podium). Typische dye-laadtijden zijn voor neuronen en gliacellen 7-15 min en voor cellijnen 10-20 min.
CRUCIALE: Dye-laadtijd en kleurstof concentratie afhankelijk van het celtype, celdichtheid, en experiment-specifieke behoeften! Lange incubatietijden in aanwezigheid van de kleurstof kan schadelijk zijn voor de cellen, in het bijzonder primaire neuronen en primaire gliale cellen en dit is essentieel voor de respons op fysiologische stimuli. Lange incubatietijden (bijvoorbeeld 30 min) zijn alleen nuttig voor ER calcium lokalisatie experimenten de verdeling van ER calcium investigeren in subcellulaire structuren, bijvoorbeeld fijn neurieten of stekels. In sommige experimenten, kan een mengsel van 1/3 groeimedium met beeldvormingsoplossing helpen om cellen te beschermen tijdens Fluo5N-AMladen.
- Direct, de overdracht van de dekglaasje aan een andere celcultuur putje met imaging-oplossing (HEPES-Bel of ACSF) en start de montage van de cellen in de beeldvorming kamer.
7. ER-calcium live cell imaging met een Inverted laser scanning confocale microscoop
- Gebruik een kwast om hoog vacuüm vet op een imaging kamer. Het vet is nodig om het dekglaasje fixeren op de bodem van de perfusie kamer. We maken gebruik van self-made imaging kamers voor 10-12 mm dekglaasjes met een klein volume, waardoor hoge perfusie snelheden tot 15-voudig bufferuitwisseling per minuut. Een in de handel verkrijgbaar perfusie kamer voor 18 mm dekglaasjes, kunnen worden gekocht bij Warner instrumenten (RC-49FS). Deze kamer kan tevens gebied stimulatie van neuronen.
- Pak de dekglaasje met Fluo5N geladen cellen en voeg een druppeltje weergaveoplossing (50-100 ul) op de cellen om cellen bedekt met weergaveoplossing houden.Draai het dekglaasje ondersteboven en monteer de cellen in de beeldvorming kamer. Om het dekglaasje druk in de silicium-lijm, gebruik dan een wattenstaafje (bijv. Q-tips).
- Veeg resterende buffer van de bodem van het glas dekglaasje met wattenstaafjes. LET OP: voorzichtig wegvegen restvocht bij gebruik van een olie-objectief met een hoge numerieke apertuur voor hoge-resolutie imaging. Overblijvende zout wordt best verwijderd door water. Toevallige uitstrijkje vet kunnen worden verwijderd met aceton of pure ethanol.
- Exchange de "dummy" beeldvorming kamer met de experimentele beeldvorming kamer. Was de cellen gedurende 5-10 minuten door continue perfusie.
- Was de cellen gedurende 5-10 minuten door continue perfusie.
- Voor het selecteren van cellen gebruiken een minimale hoeveelheid laser belichting, hoge scansnelheden (2-4 Hz), een klein beeldformaat, en een high gain.
- LET OP: Voor de selectie van Fluo5N-gelabelde cellen niet meer dan licht of directe verlichting met epifluorescen gebruikent licht. Heldere verlichting van Fluo5N/Ca 2 + complexen veroorzaakt het volledig verlies van ER-specifieke fluorescentie binnen 2-4 sec (figuur 5).
- Stel de microscoop volgens de geplande experiment. Ter oriëntatie zijn representatieve gevallen voor beeldvorming met verschillende TED vectoren in tabel 1. Voor omgekeerde confocale laser scanning microscopie, gebruiken we een Olympus IX81 microscoop gecombineerd met een FluoView 1000 confocale systeem dat is voorzien van diode lasers (473 nm, 15 mW, 559 nm, 20 mW) en een spectrale detector systeem.
- Aan het begin van het experiment document de cellen van belang bij hoge-resolutie x, yz image stacks.
- Presteren x, yt beeldvorming om ER calciumdynamiek monitoren onder de specifieke experimentele omstandigheden. Typische waarden voor ons systeem worden in tabel 2.
- Monitor veranderingen in ER calcium onder continue perfusie met imaging-oplossing. Typische buffer wisselkoersen zijn exemplarily: (a) wassen en opslag cel depletie van SERCA block: 1,5 ml / min, (b) ATP / DHPG stimulatie: 3 ml / min.
- Acquire digitale beelden bij voorkeur met 12-bit (4096 grijswaarden). Voor parallelle beeldvorming van Fluo5N/Ca 2 + en RFP, 8-bits afbeeldingen (256 grijswaarden) kan uw systeem te redden van data overflow.
- Slaan wonen cel tijdreeksen afbeeldingen (x, yt) of 3D-beeld stacks (x, yz) (voor cellulaire distributie van Fluo5N/Ca 2 + complexen) in een ImageJ compatibel formaat (bijv. TIFF).
8. Image Processing en data-analyse
- Open de afbeelding stapel in de ImageJ programma. In het geval van multicolor beeldvorming, splitsen de RGB-kanalen wanneer gevraagd door ImageJ.
- Identificeer uw regio ('s) van belang (ROI) door een zorgvuldig onderzoek van het beeld stacks (bijv. met behulp van een intensiteit versus tijd grafiek)
- Gebruik de Time-Series Analyzer plugin om het uitlezen van de gemiddelde pixelintensiteit in een ROI (F rauw). Depending op doel, tekenen ROI rond ofwel de volledige ER of kleine gebieden van de ER bv ER van dendrieten van perifere cel regio. Ook 1-3 ROI in gebieden zonder cellen voor achtergrond aftrekken.
- Bereken de gemiddelde achtergrond fluorescentie (F b) door berekening van de gemiddelde fluorescentie waarde van de achtergrond ROI en aftrekken van de achtergrondwaarde F b van de F ruwe waarden van de F roi waarde te krijgen.
- Bereken F 0, de basale fluorescentie van de cellen, door berekening van de gemiddelde waarde van tien tot 30 fluorescerende waarden voor elke ROI in een rusttoestand.
- Bereken de achtergrond gecorrigeerde relatieve veranderingen in fluorescentie van AF / F 0 door de formule:
- Aanwezig relatieve veranderingen in fluorescerennce als een spoor met AF / F 0 voor de Y-as en tijd voor de X-as.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol voorziet in een niet-verstorende benadering voor directe beeldvorming van gratis ER calcium. Lage affiniteit synthetische Ca2 + indicatoren worden vrijgegeven en gevangen in het ER lumen met behulp van een ER gerichte recombinante esterase enzymactiviteit. Betere belading van de Ca 2 +-indicator kleurstoffen aan het ER lumen maakt een directe en snelle beeldvorming van ER calcium winkel dynamiek.
Celtypen voor TED
De haalbaarheid van de werkwijze is getoond in de cellijnen BHK21, HEK293 34, HeLa 17, SH-SY5Y, gekweekte astrocyten 8,40 en primaire hippocampale en corticale neuronen 8,34,41. In onze experimenten TED werkt goed wanneer TED constructen stabiel tot expressie worden gebracht, bij voorkeur door zelf-inactiverende lentivirale vectoren 37,39 behulp van een relatief zwakke promotor (bijv. ubiquitine-promoter) 35. Andere, sterkere promotors zijn in onderzoek.
Succesvolle TED laden met Fluo5N biedt een duidelijke en heldere kleuring van de ER lumen, die wordt gespaard uit de nucleaire regio 34,41. Bij rust staten, de Fluo5N/Ca 2 + complex label staat voor de lokalisatie van calcium wanneer gebonden door Fluo5N, vandaar, het vertegenwoordigt de regionale verdeling van vrije calcium in het ER lumen. In figuur 6, confocale beelden van Fluo5N/Ca 2 +-complexen en Tag-RFP-T2 labels van Red-CES2 wordt in HeLa cellen, astrocyten corticale en hippocampale neuronen. Figuur 6C toont de fluorescerende Ca2 + indicator complex in de cel lichaam als neurites van hippocampale neuronen. Dit maakt onderzoek van Ca 2 + signalen in vrij klein processen (zie ook 34,35).
Enige ervaring nodig om de typische ER label onderscheiden van een cytosolische label die wordt waargenomen when cellen zijn beschadigd of ongezond. Cytosol, endogene esterasen ook vrij Fluo5N, wat leidt tot een heldere kleuring van het cytosol en de kern wanneer calcium lekt door het plasmamembraan. Cytosolische kleuring van Fluo5N/Ca 2 + wordt waargenomen bij toevoeging TED-gemerkte cellen worden behandeld met de ionofoor ionomycine in de aanwezigheid van extracellulair calcium (figuur 7).
Directe beeldvorming van calcium vrijlating uit de ER
Een belangrijke toepassing van TED is de directe visualisatie van ER winkel uitputting 17,34. In figuur 8, tonen we een representatief experiment uitgevoerd met hippocampale neuronen, uiten Rood-CES2. Neuronen met Red-CES2 verrijken grote hoeveelheden Fluo5N in de perinucleaire regio (pijlen in figuur 8). Wanneer de SERCA blocker CPA door perfusie wordt toegepast, wordt een snelle uitputting van de ER calcium opslag waargenomen (Figuur 8B). Hier presenteren weonbewerkte waarden (y-as) die worden verkregen wanneer neuronen afgebeeld met 12-bits. Beeldomstandigheden worden vermeld in Tabel 2. Let op de enorme verandering in gemiddelde fluorescentie per ROI dichtheid dat wordt waargenomen wanneer TED wordt toegepast neuronen. Voor andere experimenten analyseren ER calcium release in neuronen met behulp van TED, willen we verwijzen naar eerdere experimenten, die reeds in detail 8,34,35 hadden besproken. In het kort, is TED in neuronen in vitro gebruikt om de SERCA-gevoelige ER calcium winkel in detail weer te geven door omgekeerde confocale laser scanning microscopie 8,34 en werd met succes toegepast voor snelle beeldvorming (15 Hz) van mGluR1 / 5 geïnduceerde IiCR 34.
Figuur 9 toont een typisch experiment met muizen corticale astrocyten in vitro gestimuleerd met 200 uM ATP door het perfusiesysteem lage resolutie met een 20x objectief water. Na lentivirale infectie, de hier getoonde cellen tot expressie Red-CES2, die wordt aangedreven door een ubiquitine promoter. Scansnelheid was ~ 2 Hz en beide kanalen (Fluo5N/Ca 2 + en Rood-CES2 fusie-eiwit) werden gelijktijdig afgebeeld (in lijn). Aan het begin van het experiment toonde de gliacellen goede infectie met de expressieconstructen en goede belading met Fluo5N-AM. De ROI's die werden geanalyseerd zijn gemarkeerd in figuur 9A. Een ROI werd ingesteld op de achtergrond fluorescentie (bg), ROI 1-2 meet de fluorescentie van volledige cellen te meten, ROI 3 dekt alleen de ER van de cel en ROI 4 werd getrokken rond het volledige gezichtsveld. Kort na stimulatie met ATP de fluorescentie van de Fluo5N/Ca 2 + complexen abrupt daalde als gevolg van Ca 2 + vrijlating uit het ER. Tenslotte wordt het ER gedeeltelijk gevuld met calcium weer. Tegelijkertijd, de fluorescentie van de RFP continu afneemt als gevolg van lichte bleken (figuur 9B, onderste paneel). Sporen die veranderingen in de tl- lingen intensiteit (figuur 9C) wijzen op een belangrijk nadeel van TED. In veel (niet alle) experimenten hoge hoeveelheden Fluo5N-complexen worden verloren tijdens de stimulatie. Bijgevolg kan de fluorescentie waarden niet terug naar de initiële fluorescentie intensiteit.
Figuur 10 toont een CES2 BHK21-geïnfecteerde cel bij hoge resolutie, gelabeld door Fluo5N/Ca 2 + en gestimuleerd met ATP. BHK21 cellen diende als vroeg model celsysteem voor ER calciumanalyse 31. Merk op dat ER calciumafgifte en winkel-navulling wordt gevisualiseerd in fijne structuren van de ER buisjes. De structuren werden afgebeeld op lage snelheid (~ 0,2 Hz), met 512 x 512 pixel, Airy disc 1 instelling voor de confocale pinhole, en met een 63x olie doelstelling.
"/>
Figuur 1. Overzicht van ER calcium signalering. ER calciumafgifte wordt veroorzaakt door "lekken" kanalen zoals de ER intramembranair porie complex Sec61. G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR) stimuleren IP-3 productie, die vervolgens leidt tot IP 3-induced calcium vrijstelling (IiCR). ER calciumafgifte wordt waargenomen door de STIM complexen en induceert winkel bediende calciumingang (SOCE) door ionen kanalen van de familie Trp en / of Orai calciumkanalen. Voltage-gated calcium kanalen (Ca V) bemiddelen fast calcium-induced calcium vrijstelling (CKP) door ryanodine receptoren (RyR) hetzij door directe eiwit interacties (skeletspieren) of fysiologische interactie (hartspiercellen, zenuwcellen). Het verlies van ER calcium wordt dynamisch gered door de werking van de pomp SERCA (sarcoplasmatisch-endoplasmatisch reticulum calcium ATPase).
res.jpg "src =" / files/ftp_upload/50317/50317fig2.jpg "/>
Figuur 2. Principe van gerichte-esterase geïnduceerde kleurstof laden (TED). Gerichte overexpressie van een carboxylesterase biedt een hoge esterase-activiteit (CES2) in het ER. De esterase zet de acetoxymethylester kleurstof Fluo5N-AM tot een calcium-gevoelige, fluorescente kleurstof die blijft gevangen in de ER. Fluo5N heeft een lage affiniteit voor calciumionen. Daarom wordt in rusttoestand, fluorescent Fluo5N/Ca 2 + complexen worden bij voorkeur gevormd in het ER, waarbij de calciumconcentratie ongeveer 1000 maal hoger dan in het cytosol.
Figuur 3. Vertegenwoordiger TED vectorconstructen CES2.: Inheemse versie van de muis CES2. CES2 OPT 43: The ERsignaal peptide werd uitgewisseld en bevat nu een intron, terwijl de ER retentie motief werd veranderd in het klassieke KDEL-ER retentie en ophalen motief van oplosbare ER eiwitten. Een myc tag verschaft een epitoop voor proteindetectie door indirecte immunofluorescentie labeling en Western blot analyse. Red-CES2 8,43: Een rood fluorescerend eiwit werd direct achter het aminoterminale signaal peptide toegevoegd. Rode LK CES2 43: A glycine-serine linker is ingevoerd om een flexibel scharnier tussen de RFP en de CES2 element vast te stellen.
Figuur 4. Werken flow voor directe ER calcium beeldvorming met behulp van TED. Celsuspensies van primaire cellen of cellijnen worden getransduceerd met een virus dat een TED expressieconstruct. De cellen worden vervolgens gezaaid op coverslips. Bij gebruik RFP-CES2 constructen getransduceerde cellen kunnen worden geïdentificeerd met de rode fluorescentie. Target-esterase geïnduceerde kleurstof lading wordt uitgevoerd door het incuberen van de cellen in een imaging oplossing met een AM-gekoppelde lage affiniteit Ca 2 +-indicator, zoals Fluo5N-AM of Mag-fura2-AM. ER calcium beeldvorming wordt uitgevoerd met een omgekeerde laser scanning microscoop (zie protocol) of een ander compatibel beeldapparaat. Tijdens de live-imaging zijn de cellen onder continue perfusie met een imaging-oplossing, zoals kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF). Cel stimulatie wordt uitgevoerd hetzij door perfusie of door lokale druk-ejectie.
Figuur 5. Sterke epifluorescentie verlichting vernietigt de ER-specifieke Fluo5N TED label binnen enkele seconden. Vertegenwoordiger beelden van een video, afgebeeld met een rechtopstaande imaging microscoop. Hier gliacellen expressing RFP-CES2 werden geladen met Fluo5N-AM. Eerst de rode fluorescentie van een geïnfecteerde cel werd onthuld met een CCD-camera. Vervolgens werd de Fluo5N/Ca 2 + signaal verlicht met een LED-lichtbron. Een eerste duidelijke ER lokalisatie van Fluo5N/Ca 2 + complexen (gele pijlen) wordt snel vernietigd door sterke verlichting met 470 LED-lichtbron en een verschuiving in de fluorescentie verdeling zichtbaar wordt op nucleair gebied (gele pijlen, 12,46 sec).
Figuur 6. TED laden met Fluo5N-AM in verschillende celtypes Bovenste paneel:. HeLa-cellen met stabiele RED-CES2 uitdrukking Midden paneel:. Corticale astrocyten na lentivirale transductie met Red-CES2 Onderste paneel:. Hippocampusneuronen met RED-CES2 bij DIV 8. Alle cellen werden gekweekt op dekglaasjes en gekleurd met Fluo5N-AM zoals beschreven onder methode. De Fluo5N/Ca 2 + label vertegenwoordigen ook de lokalisatie van calcium wanneer gebonden aan Fluo5N. Schaalbalk 40 micrometer.
Figuur 7. Fluo5N kleurstof in het cytosol zichtbaar na behandeling ionomycin. Gliale cellen werden geïnfecteerd met rode CES2, gelabeld met Fluo5N-AM en behandeld met de SERCA-blocker thapsigargin ER calcium afbreken. Ionomycine behandeling veroorzaakte een sterke instroom van extracellulair calcium. (Upper panel) Cellen tonen een drastische verhoging van Fluo5N/Ca 2 +-gemedieerde fluorescentie. (Neder-panel) De gemiddelde intensiteit projectie beeld van de Fluo5N/Ca 2 +-label onthult een typische cytosole etikettering door de fluorescerende calcium complex Blauwe pijl:. Een helder gelabelde cel geeft aan dat deze cel heeft hoge hoeveelheden calcium in the cytosol. Vermoedelijk wordt deze cel beschadigd Purple pijl:. Cellen raken helder gelabeld in het cytoplasma na ionomycine behandeling.
Figuur 8. ER calcium winkel uitputting in neuronen door het blokkeren van de SERCA. (A) hippocampus neuronen (DIV 9) uitdrukkelijke Rood-CES2 (A, rood) en worden aangeduid met Fluo5N-AM (A, groen). De pijlen wijzen naar twee geanalyseerde cellen. De afbeelding (maximale intensiteit projectie) is een bijgesneden element van bijl, yz-afbeelding die werd verworven aan het begin van het experiment. (B) Raw sporen die de ER calcium winkel uitputting na perfusie met 30 uM CPA. Hier 1000 beelden werden genomen met 1 Hz en 12-bit. De onbewerkte waarden van de gemiddelde fluorescentie dichtheid per ROI (Y-as) van de twee cellen getoond in A zijnuitgezet in de tijd (rood en blauw trace). De achtergrondwaarden (zwart trace) constant blijven. AU = willekeurige eenheden van grijswaarden die de fluorescentie dichtheid.
Figuur 9. ER calciumafgifte op ATP-stimulatie van gliacellen. Gliacellen werden geïnfecteerd met Rood-CES2 en geladen met de Ca 2 +-indicator Fluo5N-AM. Cellen werden gestimuleerd met 200 uM ATP via perfusie gedurende 10 sec. (A) gliale cellen die rode CES2 (midden) wordt gelabeld met Fluo5N-AM (links). De ROI's worden gemarkeerd. (B) Enkele foto's uit het time-lapse sequence. (Bovenste panel) De fluorescentie-intensiteit is hoog bij 0 sec en 71 sec voordat de cellen reageren. Het daalt abrupt (80 sec) en een minimum bij 86 se bereiktc, voordat deze weer stijgt (160 sec) als calcium wordt teruggepompt in het ER. (onderste panel) fluorescentie-intensiteit van de RFP daalt langzaam en continu in de tijd als gevolg van bleken. (C) Tijd sporen tonen AF / F 0-waarden voor de ROI aangegeven in A. De fluorescentie, met vermelding van de calciumconcentratie, zakt na ATP-stimulatie en gedeeltelijk herstelt. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 10. Hoge resolutie afbeelding van ATP-geïnduceerde calcium release in BHK21 cellen. Cellen werden beladen met Fluo5N-AM en afgebeeld in de aanwezigheid van extracellulair calcium. (A) Foto serie toont veranderingen in Fluo5N/Ca 2 +-afgeleide fluorescentie tijdens ATP-stimulatie. (B) image Gemiddeld intensiteit projectie geeft het in C. (C) ATP-geïnduceerde calcium vrijstelling en het opnieuw vullen van de ER calcium winkel wordt geanalyseerd in kleine subregio's van de ER ROI. De sporen vormen veranderingen in fluorescentie.
| Excitatielaser [nm] | Detectiebereik [nm] |
| TED met Red-CES2 vectorconstructen | |
| 473 (Fluo5N/Ca 2 +) | 507-545 |
| 559 (Tag-RFP-T2) | > 570 |
| TED met CES2 alleen vectorconstructen | |
| 473 nm (Fluo5N/Ca 2 +) | > 507 |
Tabel 1. Instellingen voor de spectrale detector.
| Experiment | ER uitputting met een Red-CES2 | Stimulatie van neuronen met behulp van een CES2 construct | Hoge ruimtelijke resolutie imaging, CES2 |
| Objectief (NA) | 20x water (0.7) | 20x water (0.7) | 40x oil/63x olie (≥ 1,3) |
| 473 nm laser | |||
| Vermogen | 1% | 1% | |
| HV A | 600-780 | 600-780 | 400-780 |
| Gain B | 0-1% | 1-2% | 0% |
| Compenseren | 0 | 0 | 0 |
| 559 nm laser | |||
| vermogen | 1% | optioNALC | optionalC |
| HV A | 600-780 | optionalC | optionalC |
| Gain B | 0-1% | optionalC | optionalC |
| Compenseren | 0 | optionalC | optionalC |
| Scansnelheid | 1-2 Hz | Free run | Free run |
| Beeldgrootte | 320x320 pixel | 240x240 pixel | 512x512 pixel |
| Scannen soort | In lijn | Bidirectionele | Nyquistcriterion (2 pixels / element) |
| Prikkel | 100-200 uM ATP :5-15 sec; 200-500 uM glutamaat voor 5-15 sec | 100-200 uM Agonist: 5-15 sec | |
| Pinhole | 2-5 luchtige schijven | 2-5 luchtige schijven | 1 luchtig disc |
Tabel 2. Voorbeelden van microscoop instellingen op basis van het type experiment A:. HV = stroom naar de photomultiplier detector, B: winst = amplificatie van het PMT-signaal, C: optioneel: kanaal vrij is voor gebruik met andere rode fluorescerende kleurstoffen (bv. CMX-Ros voor het visualiseren van de mitochondriale potentiële) of andere fluorescerende eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De voor-en nadelen van de TED-methode zijn uitgebreid besproken in recente publicaties 34,35. Vergeleken met andere werkwijzen die hierboven beschreven TED omzeilt het probleem te verstoren en perfuseren van de cellen. Bovendien, twee aspecten moeten worden benadrukt. Het beginsel van TED ER calcium imaging (1.) De gerichte expressie van actief carboxylesterase in het ER lumen met behulp van TED vector constructen en (2.) Rationeel en preferentiële afgifte van laag-affiniteit synthetische AM-esters of vereist calcium kleurstoffen in het ER lumen.
1. TED vectorconstructen
Figuur 3 vat de ontwikkeling van TED vector constructen. TED is ontwikkeld op basis van de CES familie eiwitten (EC 3.1.1.1). Deze eiwitten woonachtig zijn leden in het ER lumen. Voor in vitro studies van de recombinante administratie van CES-eiwitten werkt het beste na stabiele expressie van deeiwit of na virale infectie met matige expressieniveaus. Momenteel, is het onbekend of andere eiwitten met esterase activiteit CES eiwitten vervanging TED beeldvorming. Het wordt niet aanbevolen om transiënte transfectie van TED vectoren voor dynamische ER calcium analyse gebruiken omdat cellen zijn minder ontvankelijk na de transfectie procedure. CES eiwitten nodig hebben de juiste targeting naar de ER lumen en deze stap moet een efficiënte splitsing van de ER signaal peptide. Daarnaast wordt behouden en opvragen van CES eiwitten in het ER lumen gemedieerd door hun aminoterminale KDEL-achtige motief. Deze mechanismen kunnen verzadigd wanneer hoge expressie niveaus worden geproduceerd door TED vectoren na transiënte transfectie. Dit kan veroorzaakt een onjuiste lokalisatie van de CES-eiwitten en ondersteunt de vorming van eiwitcomplexen.
2. Lage affiniteit Ca 2 + Indicatoren voor TED
Het belangrijkste nadeel van TED wordt veroorzaakt door de beperkingen van de beschikbarekunnen indicator kleurstoffen voor de niet-verstorende analyse van ER calcium. ER calcium beeldvorming met TED nodig indicator kleurstoffen met een hoge K D (dat wil zeggen een lage affiniteit) en een lage fluorescentie in de afwezigheid van calcium. Op basis van onze ervaring Fluo5N-AM werkt het beste, maar deze indicator kleurstof is geen bleekmiddel-bestand. De lage-affiniteit Ca 2 +-indicatoren Mag-fura2-AM (K D ~ 25-50 uM) 34 en Mag-Fluo4 (K D ~ 20-25 uM) werden ook getest. Beide kleurstoffen zijn goed in ER structuren geladen door TED, maar de kans op het produceren van "gemengde signalen" na stimulatie van ER release is hoog. Een "mixed signal" staat eerst een snelle stijging van de fluorescentie in het cytoplasma, gevolgd door afname van de fluorescentie in de ER. Om deze beperking te omzeilen, kan verstorend benaderingen voor ER calcium beeldvorming helpen 32,35. Mag-Fluo4 (K D ~ 20-25 uM) toont een sterke TED-gemedieerde label van het Golgi cisternae, dat is minder uitgesproken wanneer Fluo5N-AM is gebruikt.
Toepassingen en perspectieven
Hier richten we ons op inverse laser scanning confocale analyse van ER calcium dynamiek met TED. TED metingen kunnen ook worden aangepast aan een standaard confocale systeem of groothoek-systeem met de geschikte excitatiebron (laser, LED, metaal halid lampen, monochromator), filters en fluorescentiedetectiesysteem 6.
TED is vooral nuttig in die cellen die onvoldoende endogene CES activiteit tot expressie in de ER. We zagen dat bijvoorbeeld BHK21 cellen voldoende endogene esterase activiteit in de ER te lage affiniteit indicatoren los. In onze handen, is dit niet het geval is met vele andere cellijnen (HEK293, SH-SY5Y, HeLa, PC12), primaire glia en primaire neuronen. Hier, de TED-methode maakt een succesvolle niet-verstorende kleurstof lading naar de ER.
Toekomstige TED vectoren kan hoeverre de toepassing van het ER lumen aanandere subcellulaire compartimenten of cellulaire microdomeinen. Het principe van de methode TED onafhankelijk is van de indicator kleurstof, en kan derhalve worden gebruikt met de AM-ester van een kleurstof, bijvoorbeeld voor het afbeelden van intracellulaire pH dynamica. Onlangs, het laboratorium van Lucas D. Lavis beschreven dat de recombinant varkens (PLE) CES1 vormt een selectieve esterase-ester pair met cyclopropylester kleurstoffen 42. Cyclopropylester agenten bleken resistent tegen hydrolyse door endogene esterases en de selectieve ontmaskering door de recombinante CES activiteit ingeschakeld cel specifieke molecule targeting 42 te zijn. Het zal interessant zijn om te onderzoeken of calcium indicatoren te baseren op die nieuwe techniek zal de subcellulaire targeting specificiteit van synthetische indicatoren te verbeteren.
TED werkt het beste in cellijnen wanneer TED eiwitten stabiel tot expressie worden gebracht. De oprichting van een verzameling met stabiele TED cellijnen gunstig zou zijn.
Transgene TED muismodellen zijn ook een belangrijk doel van ons werk en dit zal TED staat in specifiek weefsel voorbereidingen van specifieke neuronale circuits, skeletspieren, hart, of de voorbereidingen van het vasculaire systeem. Dit muizenmodel zal bijdragen tot de analyse van ER calciumdynamiek brengen van het celniveau meer fysiologisch weefsel context.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 en de Friedrich-Baur-Stiftung. Wij willen graag Roger Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute Laboratories dank aan de University of California, San Diego voor ons met Tag-RFP-T2. We dankbaar erkennen David Baltimore, California Institute of Technology, Pasadena, en Didier Trono, Universiteit van Genève, Genève, voor het verstrekken van ons de lentivirale plasmiden FUGW en psPAX2/pMD2.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine) | Tocris | 0805 | |
| 5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate | Sigma | A26209-1G | |
| B-27 supplement,50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Carbamoylcholine chloride (Charbachol) | Sigma | C4382-1g | |
| Cyclopiazonic acid (CPA) | Ascent scientific | Asc-300 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM with Glutamax | Invitrogen-Gibco | 31966-047 | |
| Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x | PAA | H15-002 | |
| Fetal calf serum | Invitrogen-Gibco | 10270-106 | |
| Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg | Invitrogen | F14204 | |
| Glutamate | Ascent scientific | Asc-049 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | |
| Ham's F12 nutrients mixture | Invitrogen-Gibco | 21765-029 | |
| Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS | PAA Laboratories | H15-010 | |
| Horse serum | SHD3250YK | Linearis | |
| Ionomycin Ca2+ salt | Ascent scientific | Asc-116 | |
| murine EGF | PreproTech | 315-09 | |
| N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen-Gibco | 21103-049 | |
| Pluronic F127, low UV absorbance,2g | Invitrogen | P6867 | |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN | Sigma | P8638 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Lysin | Sigma | P2636 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005-1mg | |
| TryLE Express | Invitrogen | 12605-028 | |
| Trypsin | Worthington | LS-003707 | |
| Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean) | Sigma | T6522 | |
| Materials | |||
| Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81 | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635) | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector | Olympus | user-specific configuration | |
| Heater controller TC-344B | Warner Instruments | 64-0101 | to control in line solution heater |
| NIH ImageJ software | WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006 | ||
| Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35 | Olympus | N2709100 | |
| Objective: UPLFLN40XO | Olympus | N1478700 | |
| Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15 | Olympus | N1480700 | |
| Perfusion chamber, inverse | custom-made | ||
| Perfusion chamber, RC-49FS | Warner Instruments | W4 64-1709 | |
| Perfusion tube: PT-49 | Warner Instruments | 64-1730 | for perfusion |
| Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels) | Gilson | n.a. | perfusion pump |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | controlled by heater controller |
| Suction tubes: ST3R | Warner Instruments | 64-1407 | for perfusion |
| Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel | Pecon | n.a. | |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).
- Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K.
- Berridge, M. J.
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59, 861-872 (2008).
- Jaepel, J., Blum, R.
- Verkhratsky, A. Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons. Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).
- Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate. Nature. 306, 67-69 (1983).
- Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction. Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).
- Clapham, D. E. TRP channels as cellular sensors. Nature. 426, 517-524 (2003).
- Cahalan, M. D.
- Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. Sensing cellular stress through STIM proteins. Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).
- Erdmann, F., et al. Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum. The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).
- Schäuble, N., et al. BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER. The EMBO Journal. , (2012).
- Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).
- Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).
- Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).
- Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J. Vis. Exp. (23), e1067 (2009).
- Lang, S., Schäuble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms. J. Vis. Exp. (53), e2730 (2011).
- Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. Looking forward to seeing calcium. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).
- Mank, M., Griesbeck, O.
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Montero, M., et al. Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells. The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).
- Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
- Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations. EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).
- Solovyova, N., Verkhratsky, A. Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches. Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).
- Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry. The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).
- Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).
- Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum. 43, Humana Press. (2010).
- Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 5, 545-551 (2008).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
- Zufferey, R., et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).
- Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).
- Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Calcium measurement methods. Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), Humana Press. 147-167 (2010).
- Tian, L., et al. Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).
- Samtleben, S., Blum, R. Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading. , In preparation (2012).
