Summary
ממוקד ולין מושרה טעינת צבע (טד) תומכת בניתוח של דינמיקת חנות סיד תאיות על ידי דימות פלואורסצנטי. השיטה מתבססת על המיקוד של Carboxylesterase רקומביננטי לreticulum endoplasmic (ER), שבו משפר את הסרת המסכות המקומית של סינטטי נמוכה זיקת Ca
Abstract
ויזואליזציה של דינמיקת סידן חשובה להבין את תפקידו של הסידן בפיזיולוגיה תא. כדי לבחון את דינמיקת סידן, Ca 2 + דדי ניאון סינטטיים הפכו פופולריים. כאן אנו מדגימים TED (= טעינת צבע מושרה ממוקד-esterase), כדי לשפר את שיטת השחרור של Ca 2 + צבעי חיווי בלומן ER של תאים מסוגים שונים. נכון להיום, טד היה בשימוש בשורות תאים, תאי גלייה ונוירונים במבחנה. בסיסים על TED יעיל, רקומביננטי מיקוד של פעילות carboxylesterase גבוהה ללום ER באמצעות וקטור מבנים שCarboxylesterases Express (CES). וקטורי TED האחרונים מכילים רכיב ליבה של CES2 התמזג חלבון פלואורסצנטי אדום, ובכך מאפשרים הדמיה בשני צבעים בו זמנית. הדינמיקה של סידן חופשי בחדר המיון הם צילמו בצבע אחד, ואילו את מבנה חדר המיון המקביל מופיע באדום. בתחילתו של ההליך, תאי transduced עם lentivirus. בהמשך, התאים הנגועיםזורעים מחדש על coverslips סוף סוף יאפשר הדמיה תא חי. לאחר מכן, תאי חיים מודגרת עם אסתר acetoxymethyl (AM-אסתר) טופס הזיקה נמוכה Ca 2 + מחוונים, למשל Fluo5N-AM, מאג-Fluo4-AM, או מאג-Fura2-AM. פעילות ולין בדבק ER את צד רשתות הידרופובי מהטופס הנני Ca 2 + חיווי ומורכב + צבע / Ca 2 ניאון הידרופילי נוצר ונלכדה בלומן ER. לאחר טעינת צבע, התאים מנותחים במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal הפוך. תאי perfused ברציפות עם פתרונות כמו צלצול ואת דינמיקת סיד ER הן ישירות דמיינו ידי הדמיה זמן לשגות. שחרור סידן מחדר המיון מזוהה על ידי ירידה בעוצמת הקרינה באזורים של עניין, בעוד שהמילוי של חנות סיד ER מייצר עלייה בעוצמת הקרינה. לבסוף, השינוי בעוצמת ניאון לאורך הזמן נקבע על ידי חישוב ΔF / F 0.
Introduction
על מנת לפתור את התגובות פיסיולוגיות של סידן לחדר המיון, פיתחנו אסטרטגיה חדשה על מנת לשפר את ההשמנה של צבעים רגישים סינטטיים סידן לחדר המיון. השיטה מאפשרת ניטור הישיר, שאינו מפריע בזמן אמת של סידן ER החופשי בנוכחות של סידן תאי.
פונקציה ואיתות של סידן ER
אותות סידן נמצאים בסוגים שונים של תאים, תאי שרירים למשל, נוירונים ותאי גלייה ומגוון הפונקציות שלהם מתיווך התכווצות שרירים למעורבות בהעברה הסינפטית בלמידה ובזיכרון 1,2. שינויים בריכוז הסידן חופשי הם עניין מדעי גבוה בגלל סידן הוא מעורב בוויסות של שעתוק הגנים, התפשטות תאים, רגישות עצבית, מוות של תאים ותא אחרים מאותת אירועים 1-7. כל אותות הסיד הסלולריים אלה מחוברים באופן פונקציונלי ולתרום לתאיים סיד8-10 דינמיקת חנות.
תכונה משותפת בין כל אותות סידן היא הזרימה של סידן בין המרחב תאי, cytosol ואברונים, בעיקר ER ומיטוכונדריה. זה גורם לשינויים דינמיים בריכוז סידן בתוך אברונים אלה, החשים ידי רכיבי איתות שונים. באופן כללי, ריכוז הסידן בטווחי ER בין 100-800 מיקרומטר, בcytosol ריכוז הסידן הוא קרוב ל -100 ננומטר, ובמרחב תאי הוא הריכוז סביב 1-2 מ"מ. בהתאם לכך, יש כוח מניע כימי גבוה לזרימת הסידן לקראת cytosol 2,9,10.
את אותות סיד ER-derived נחקרו לרוב תלויים בגירוי של קולטני G-חלבון בשילוב (GPCR), אשר לאחר מכן מפעילים פוספוליפאז C (PLC). המועצה המחוקקת הפלסטינית בתורו מייצרת אינוזיטול 1,4,5-trisphosphate (IP 3) 1. על הכריכה של 3-IP לreceptor (IP 3-Rec, איור 1) בחדר מיון הקרום, יוני סידן משתחררים מחדר מיון הלום. מבחינה היסטורית, שחרור סידן 3 בתיווך ה-IP מחדר המיון היה ראשון - גם אם בעקיפין - שנמדד בתאי לבלב acinar ידי Streb et al בשנת 1983 11.. פרסום זה הציע בפעם הראשונה מפל איתות מעורב אצטילכולין, פוספוליפאז C, ו-IP 3. בדרך זו של שחרור סידן שמכונה בדרך כלל שחרור סידן-Induced 3-IP (IiCR) (איור 1). הפעלת קינאז תלויה של Cγ פוספוליפאז ידי קישורי tyrosin קינאזות קולט הפעולה של גורמי גדילה וגורמי neurotrophic לחדר מיון לאחר שסידן איתות IP 3 גובה 12. בנוסף לIiCR, גובה סידן עשויה להיות מתווך על ידי כניסת סיד ionotropic, למשל דרך ערוצי מתח מגודרת סידן (Ca V), ושחרור סידן-Induced סיד הבא (CiCR) על ידי ryanodine מחדשceptors (RyR). IiCR וCiCR קשורים מבחינה פיזיולוגית לכניסת סידן מופעל חנות (SOCE). SOCE כולל פעולה של STIM (מולקולת האינטראקציה סטרומה), שהוא חיישן לשחרור סידן ER. STIM הוכח לעורר כניסת הסידן תאית באמצעות ערוצים חולפים קולט פוטנציאלי (TRP) 13, 14 Orai ערוצי סידן ואפילו מתח מגודרת ערוצי סידן 15 (איור 1). אובדן של סידן ER הוא חולץ על ידי הפעולה דינמי של reticulum סיד ATPase sarco-endoplasmic (SERCA), אשר באופן פעיל משאבות סידן בחזרה לחדר המיון. חסימת SERCA עם תרופות כגון thapsigargin חושפת אובדן מתמשך של סידן לתא ER cytosolic. סיד "דליפה" ER זו נגרמת על ידי נקבוביות מתחמי intramembrane ER כגון חלבון המורכב Sec61 16,17 (איור 1).
בשנת 1998, שפורסם Berridge מודל, "נוירון במסגרת מודל נוירון", אשרשעות מצביעות על תפקיד פיסיולוגי עיקרון של חדר המיון בשילוב סידן עצבי 5. מודל זה לוקח בחשבון את קיומה של מערכת קרום ER רציפה יוצרת "תמונה" תאית של קרום הפלזמה העצבי 5. מערכת קרום אוקריוטים ינארי זו טענה שהוא תנאי בסיסי לשילוב של זמן ומרחב של אותות סידן מהירים ואיטיים בתאי עצב. אותות סידן המתרחשים גם במקביל או לאחריו בקוצים או דנדריטים שונים של אותו תא העצב הם העניקו לסומה של התא או גרעין באמצעות חדר המיון, שם הם סיכם 5,18. לאחר מכן, הסכום שלהם עשוי להיות השפעה על הרגישות של הנוירון, הרגולציה של שעתוק הגנים או שילוב של מפלי איתות. לפיכך, לחדר המיון תומך בשילוב של אותות סידן. תנאי אחד למושג הזה הוא ההמשכיות של ER בתא בודד, אשר כבר נטען על ידי מספר מחקרים ואשר הוכח, לפחות לsomato-Dאזורי endritic ומרחקים קצרים תחזיות axonal 19-21. בין אם יש המשכיות ER בתוך תחזיות axonal ארוכות הוא עניין של ויכוח.
אסטרטגיות כדי למדוד את זרימת הסידן חופשי על פני קרום ER
אותות סידן מנוטרים בתדירות הגבוהה ביותר ב22,23 cytosol. לכן, הוא לא יכול בקלות להבחין אם Ca 2 + זורם לתוך cytosol מתאי או מחנויות 6,24 תאיות. כדי להתגבר על מגבלה זו, אסטרטגיות מתודולוגיות להדמית סיד ER הישירה פותחו. לסיכום, את האסטרטגיות הבאות משמשות: (1) ER-ממוקד מהונדסים גנטי חלבון אינדיקטורים 25-27 Ca 2 + אינדיקטורים זיקה נמוכה מבוססי חלבון להשתמש בחלבון bioluminescent aequorin או GFP בשילוב עם חלבון חישת סיד.. Ca 2 + אינדיקטורים אלה מהונדסים גנטי (GECIs) יכוליםלהיות ממוקד לחדר המיון עם העזרה של פפטיד אות ונשמרים באופן פעיל בחדר המיון באמצעות שימור ומוטיב אחזור. 2 + בסיס משותף ER Ca אינדיקטורים על עיקרון Cameleon והם Cameleon YC4.3 26,28; Cameleon פיצול YC7.3ER 29, וCameleon D1 30. (2) טעינת צבע מבוססת ולין ישירה של AM-אסתר נמוכה זיקת Ca 2 + אינדיקטורים 31,32. AM-נגזרים של צבעי החיווי (מג-Fura2-AM, מאג-Fluo4-AM או Fluo5N-AM) להעביר את ממברנות ביולוגיות במדינה lipophilic, בסידן חסרת רגישות. ואז, בcytosol, כמו גם בחדר המיון, esterases אנדוגניים לדבוק בקבוצת AM-אסתר ולשחרר את מחוון Ca 2 +, והותיר אחריו כמות מסוימת של צבע פעיל בcytosol ובחדר המיון. לכן, גישה זו היא שימושית בתנאים של ריכוז סידן גבוה בחדר המיון, כל עוד ריכוז הסידן cytosolic נשאר הרבה מתחת לדהמגבלת tection של הזיקה נמוכה מחוונים, במיוחד באותות סידן אופייניים (ננומטר למשל למיקרומטר הנמוך). (3) טוען AM-אסתר בשילוב עם קרום הפלזמה permeabilization 32. כל Ca 2 + מחוון cytosolic הנותרים הוסר על ידי permeabilization קרום הפלזמה עם כמויות קטנות של חומר ניקוי "קל" (למשל saponin) בחיץ מלאכותי תאי. לפיכך, את הקרומים תאיים עשויים להיות מגורה, למשל עם ה-IP 3 בחיץ תאי, ישירות דרך "נקבוביות" בקרום הפלזמה. (4) דיאליזה של cytosol תחת תצורה כל התא ומדידות בו זמניות של Ca 2 + בלומן ER וcytosol 32,33. תא טעון ראשון עם זיקה נמוכה Ca 2 + מדד (לדוגמה: מאג-Fura2- בבוקר, ratiometric, UV-אור). לאחר מכן, בעזרת תיקון פיפטה, כל שנותר CYTCa 2 + מדד נמוך הזיקה osolic הוא dialysed מתוך cytosol עם מאגר המכיל Ca 2 + מדד גבוהה זיקה (למשל Fluo-3, אור הנראה). אסטרטגיה זו מאפשרת הקלטה בו זמנית של אותות שמקורם cytosolic וחדר מיון. (5), הנגרמת ממוקד ולין טעינת צבע 8,34. Carboxylesterase (CES) הוא ממוקד ללומן של ER ומספק פעילות ולין גבוהה ללכידה יעילה של טופס AM-אסתר זיקה נמוכה Ca 2 + מחוונים.
מושרה ממוקד ולין טעינת צבע (טד)
כדי לשפר את המיקוד של זיקה נמוכה Ca 2 + אינדיקטורים ללום ER, טד היה מפותח. TED דורש ביטוי היתר של carboxylesterase ER ממוקד עכבר (CES2) (איור 2), אשר מושגת באמצעות בונה ביטוי. תאים המבטאים CES-מבנה רקומביננטי מודגרת עם טופס AM-אסתר של סידן בdicator הצבע (Fluo5N-AM, איור 2). לאחר מכן, בחדר המיון, לצבוע מומר לCa 2 + רגיש, הקרום חדיר Ca 2 + מחוון מורכב (Fluo5N/Ca 2 +) על ידי פעילות ולין הגבוהה, ולכן לוכד את הצבע בריכוז גבוה בלומן ER 8 , 34. השיטה שימושית במיוחד כדי לחקור בסידן שחרור ER דרך IiCR-המסלולים למשל באמצעות קולטנים metabotropic, purinergic או גלוטמט 8,34 ולדמיין דלדול סיד ER באמצעות "ערוצי דליפה" ישירות, למשל, לאחר מצור של 17 SERCA , 34. הניסיון שלנו נמוכה זיקה Ca 2 + מחוון Fluo5N-AM הוא כיום האינדיקטור הטוב ביותר שקיים לשימוש עם אסטרטגיית טעינת צבע TED. יש Fluo5N-AM נמוכה זיקה לCa 2 + (דיסוציאציה קבועה K D ~ 90 מיקרומטר, איור 2), הוא כמעט לא פלורסנט בצורת AM-, אבל מספק פליטת הקרינה גבוהה על Calciuמ 'מחייב 8,34. + המורכב Fluo5N/Ca 2 יכול להיות נרגש עם מקור אור סטנדרטי של ~ 490 ננומטר, אשר תואם את צבעים סטנדרטיים כגון FITC, Alexa 488, או eGFP. אותות סידן cytosolic בקושי להגיע לריכוז בטווח מיקרומטר הנמוך ולכן הם בקושי זוהו על ידי Fluo5N ב35 cytosol.
כדי לשפר את הביצועים של TED, כמה מבני וקטור רקומביננטי פותחו (איור 3). במקור, וקטורי TED המבוססים על רצף הקידוד של CES2 (Refseq הצטרפות מספר NM_145603, CES2c) והביצועים הטובים ביותר TED הוא ציין עם ביטוי יציב של מבני CES. וקטורים חדשים TED להביע את רכיב ליבה של CES2 התמזג חלבון פלואורסצנטי האדום TagRFP-T2 36. יש הווקטורים האלה יש יתרון כי הם יכולים לשמש כדי לזהות transduced תאים ולהשתמש בקרינה האדומה כבקרה פנימית לנורמליזציה של שינויים בFluo5N/Ca 2 + הקרינה. הקרינה האדומה מציעה גם את האפשרות לדמיין את החלוקה המבנית של חדר המיון והשינויים בדינמיקת ER בתנאי גירוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה מציג TED יחול על שורות תאים, נוירונים בהיפוקמפוס ותאי גלייה בקליפת המוח. TED ביצועים הטובים ביותר כאשר וקטורי TED באים לידי ביטוי ביציבות, למשל על ידי וקטורי lentiviral. סקירה סכמטי של שיטת TED מוצגת באיור 4.
1. הכנת פתרונות
את פתרונות הבאים צריכים להיות מוכנים לפני שמתחילים ויכולים להיות מאוחסנות כפי שצוין. בדרך כלל אנו משתמשים בזכוכית מעוקרת וחומר פלסטי ומים autoclaved.
- הכן HEPES שרינגר (מ"מ): 125 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO 4 H 2 O 0.7, 2 CaCl 2, 1.25 אא 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H 2 א '. ללא סיד HEPES שרינגר מורכב (מ"מ): 127 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO 4 H 2 O 0.7, 1.25 אא 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H 2 O ו 0.1 EGTA.. ללא גלוקוז פתרונות הדמיה אלה יכולים בדואר מאוחסן ב 4 ° C. הכמות הנדרשת של D-גלוקוז הוא הוסיף טרי לפני השימוש.
- לניתוח TED בנוירונים בהיפוקמפוס, מלאכותי נוזל השדרתי (ACSF) מומלץ. ACSF מורכב (מ"מ): 127 NaCl, 23 NaHCO 3, 3 KCl, 2.5 NaHPO 4 H 2 O, D-25 glucose.H 2 O, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2 0.7 H 2 0 ב DDH. 2 0.
- הכן Fluo5N-AM לריכוז של 5 מ"מ. כדי לעזור solubilization להוסיף 8.9 μl של Pluronic 20% F-127 (ב DMSO, לאחסן בטמפרטורת חדר, מוגן מפני לחות ואור) עד 50 מיקרוגרם של lyophilized Fluo5N-AM. אז solubilize Fluo5N-AM באמצעות sonicator מים אמבטיה במשך לפחות 2 דקות. חנות aliquots של 0.5 μl ב -20 ° C, מוגן מפני אור ולחות.
- הכן אנטגוניסט ואגוניסט מניות בהתאם לצורך. לדוגמה: א) 10 מ"מ-ATP או ADP (בH 2 O, הפעלת metabotropic של קולטני purinergic), ב) 10 מ"מ carbachol בH 2 O (אגוניסטשל הקולטן muscarinic אצטילכולין), ג) חומצת 30 מ"מ cyclopiazonic (רו"ח) DMSO (חוסם של SERCA), ד) DHPG 50mm ב PBS (אגוניסט קולטן הגלוטמט metabotropic לmGluR אני וmGluR 5), ה) גלוטמט 10 מ"מ בגובה thapsigargin 2 O, F) ionomycin 1 מ"מ DMSO (ionophore), ז) 5 מ"מ DMSO (חוסם גבוהה זיקה של SERCA). aliquots החנות ב -20 ° C.
- וקטורי lentiviral: פרוטוקול זה כולל את השימוש של חלקיקי וקטור ביטוי TED lentiviral. הייצור והאחסון שלהם הוא לא חלק מפרוטוקול זה. אנו משתמשים בוקטורי lentiviral של בני הדור השני להעברת Carboxylesterases רקומביננטי לשורות תאים, תאי גלייה ונוירונים. הבסיסים שלנו lentiviral המערכת בביטוי הווקטור 37 FUGW, ופלסמידים אריזת pCMVΔR8.91 או psPAX2 וpseudotyping פלסמיד pMD2.G 38,39. זהירות: קחו בחשבון שהעבודה עם וקטורים רקומביננטי lentiviral inactivating עצמי מחייבת זהירהשיקול של הנחיות biosafety. במדינות רבות, וקטורים אלו מסווגים כקבוצת סיכון Biohazard 2. לקבלת מידע נוסף עיין בhttp://www.addgene.org/lentiviral/.
2. הכנה וזיהום נגיפי של נוירונים ביפוקמפוס עכבר
- לשטוף coverslips זכוכית בצלחת פטרי זכוכית של 20 ס"מ קוטר (לכל צלחת 100 coverslips) 1x באתנול 70% לכ 30 דקות. לבסוף, מוסיף 100% אתנול (PA) למשך 2 דקות. הסר אתנול שייר ויבש coverslips מתחת למכסת מנוע סטרילי.
- הכן את שני סוגים שונים של מדיה לתרבויות נוירון היפוקמפוס: (א) בינוני Neurobasal עם B27 01:50, (ב) בינונית מלא: בינוני Neurobasal עם B27 1:50, Glutamax 1:100, וN2 תוספת 1:100. תסנין סטרילי התקשורת ולאחסן אותם בתא החממה עד לשימוש.
- יום אחד לפני לנתיחה, את coverslips מוכן על ידי הצבת coverslip מ"מ אחד סטרילי 10 הראשונה בכלגם מצלחת תרבית תאי 4 היטב. לאחר מכן, בזהירות מעיל כל coverslip עם 80-100 μl 0.1% פולי-L-ליזין ולאחסן את הכלים באינקובטור במשך הלילה.
- ביום של ניתוח ותרבות תא, מתחיל בשטיפת שלוש הפעמים coverslips עם 100 HBSS μl ולהעביר את מדיום Neurobasal 100 μl לכל coverslip. מניחים את הכלים לחממה לאיזון (למשל בזמן הנתיחה של עכברים).
בתור
אנו מבצעים הניסויים שלנו עם עכברים בהתאם להנחיות איחוד אירופיות, כפי שאושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים הוועדה שלנו וניצול.
- הסר את המוח המוחלט ולנתח את hippocampi ילטרלי.
- מוציא בזהירות את כל קרומי המוח ורקמות אחרות מאשר היפוקמפוס היפוקמפוס ומקום אחד כל אחד בצינור 1.5 מ"ל המכיל 450 HBSS μl. אחסן את הרקמה על קרח עד מספר מספיק של hippocampi כבר מבודד.
- הוסף 50 μl 1% טריפסין (וורטינגטון) על צינור אחד ודגירה אותם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לנער את הצינורות מדי פעם. כדי לעצור את תגובת מערכת העיכול, להוסיף 50 מעכב טריפסין 1% μl לצינור אחד ולהפוך את הצינור מספר פעמים.
- העבר את כל הרקמה של עד 5 hippocampi לאחד צינור פלקון 15 מיליליטר הימנעות העברת הנוזל. הוסף B27 בינונית (א) לנפח סופי של 5 מ"ל.
- Triturate הרקמות באמצעות אש מלוטשת זכוכית פיפטה פסטר על ידי pipetting למעלה ולמטה בזהירות זהירות:. למנוע בועות אוויר!
- ספין עם XG 400 במשך 3 דקות, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 5 מ"ל B27 בינוני (א).
- Triturate הרקמה שוב עם פיפטה הזכוכית, ולאחר מכן פעמיים בעזרת קצה מסנן פלסטיק μl 1000. לבצע את זה כפי שמתואר בצעדים 2.9 ו 2.10.
- לאחר צנטריפוגה האחרונה, resuspend התא גלולה ב 2 מ"ל מלא mediuמ '(ב) וtriturate תאים עם קצה מסנן פלסטיק μl 200. כדי להפריד בין גושי תאים שנותרו מהשעית התא בודד, בואו גושי תאים להתיישב ל1-2 דקות.
- ספירת תאים ולחשב את המספר הכולל של תאים נחוצים לזיהום נגיפי. עבור TED הדמיה להשתמש 25,000 תאים לכל coverslip 10 מ"מ.
- ציפוי 25,000 הלא transduced תאים נוספים כשליטה מומלץ בשלב זה.
זיהום ויראלי
- מעבירים את ההשעיה התא לזיהום נגיפי לתוך צינור טרי 15 מ"ל פלקון ו צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 400 x גרם.
- לשאוב supernatant ו resuspend התאים במדיום μl 300 (ב)
- הוסף כמות מתאימה של חלקיקי וקטור ביטוי זיהומיות lentiviral TED ולתת צינור פלקון לעמוד בטמפרטורת חדר במשך 10 דקות.
- מלא את הצינור עם מדיום מלא (ב) לנפח הסופי הנחוץ לציפוי (100 μl עבור כל 10 מ"מ coverslip), לשאוב את המדיום מcoverslip, ולמקם 100 השעיה תא μl מייד על כל coverslip.
- מניחים את המנות לתוך החממה עד שכל התאים נרגעו (כ 2 שעות) ולמלא בקפידה את המנות עד שהם מכילים מדיום מ"ל 2 (ב).
- בואו נוירונים לגדול במשך שבוע אחד לפחות. להחליף 50% מבינוניים בכל שבוע.
3. תרבות וויראלי הדבקה של תאי גלייה קליפתיים עכבר
הכנה
- התחל על ידי הכנת בסיס גליה בינונית (1:1 תערובת של DMEM/F12 עם 10% FCS, 5% HS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 0.45% גלוקוז) וציפוי של בקבוק תרבות תא T75 עם 4 מ"ל 0.5 ng / ml פוליפוני -DL-ornithine hydrobromide (פורנו) (בדילול ב150 מ"מ פתרון חומצה בור, pH 8.35). לאחר דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 או במשך הלילה, לשטוף את בקבוק תרבית תאי שלוש פעמים עם HBSS ולהוסיף מצע המכיל B27 01:50 ו10 ng / ml EGF גליה הבזליים מ"ל 18. לאזן את בקבוק תרבית התאים בחממה (HR עד 3).
- אנו מבצעים הניסויים שלנו עם עכברים בהתאם להנחיות איחוד אירופיות, כפי שאושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים הוועדה שלנו וניצול.
- מנתחים את המוח של אחד עכבר P5-P7 ולהסיר את ההיפוקמפוס וקרומי המוח משני האונות כמתואר ב2.5.
- לנתח את קליפת המוח הקדמית, לחתוך אותו לכמה חתיכות קטנות ולאסוף אותם בצינור 1.5 מ"ל המכיל HBSS. אחסן את הצינור על קרח ולהמשיך לחלק תא התרבות.
תרבית תאים
- להעביר את כל הרקמות מהצינור לצינור פלקון 15 מ"ל באמצעות פיפטה זכוכית מלוטשת אש.
- הוסף מדיום בסיסי לנפח סופי של 5 מ"ל וtriturate הרקמה על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים עם טפטפת זכוכית מלוטשת אש. לאחר צנטריפוגה XG 300 במשך 3 דקות, לשאוב את המדיום, וresuspend התא גלולה במדיום בסיסי 5 מ"ל.
- חזור על שלב 3.5 פעמיים.
- לאחר thiצנטריפוגה Rd, resuspend התא גלולה ב 2 בינוני גליה הבזליים מ"ל המכילים B27 (1:50) ו10 ng / ml EGF.
- Titruate שוב ולהעביר את ההשעיה התא לבקבוק תרבית תאי T75 המוכן ולתת לתאים לגדול במשך 3-4 ימים.
כביסה של תאי גליה (לאחר 3-4 ימים בתרבות):
- לשטוף את תאי פעם אחת עם 10 מ"ל PBS ונמרץ הקש או פגע בעדינות את הבקבוק כמה פעמים עם היד שלך, כשהוא אוחז אותו בחוזקה ביד השנייה. על ידי פסולת תא שלב זה וצבירי תאים יוסרו מן התרבות.
- לשאוב PBS ולהוסיף בינוני גליה בסיס טרי המכיל B27 (1:50) ו10 ng / ml EGF. יתר על כן לטפח את התרבות במשך 5-7 ימים עד שהתאים מגיעים 80% confluency.
פיצול, התמרה וזריעה סופית של תאי גליה:
- coverslips 10 מ"מ מעיל עם 100 μl פולי-D-ליזין (פתרון המלאי: 0.1%, בדילול מודעה 1/50 20 מיקרוגרם / מ"ל PBS או HBSS) ו דגירהשלהם באינקובטור במשך הלילה. לשטוף coverslips שלוש פעמים עם HBSS ולהוסיף 100 בינוני גליה הבזליים μl. לאזן coverslips בחממה (3 שעות).
- לשטוף את תאי גלייה פעמיים עם 10 מ"ל PBS, לשאוב את PBS, ולהוסיף 3 מ"ל טריפסין (TrypLE, חי). Trypsinize תאים לתקופה של עד 1 דקות זהירות:. הימנע יתר trypsinization. בדרך כלל יותר מ -80% מכל התאים מנותקים לאחר 1 דקות ודי בכך כדי לקבל כמה מיליון של תאים בריאים.
- לעצור את התגובה על ידי הוספת 10 מיליליטר מדיום גליה בסיסית, להעביר את ההשעיה תא צינור פלקון 15 מ"ל, צנטריפוגות ב XG 300 במשך 3 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 5 בינוני גליה הבזליים מ"ל.
- שוב, ספין ולשאוב כמתואר בשלב 3.15, אז תאי resuspend ב 5 מ"ל בינוני גליה בסיסית.
- העבר את המספר הדרוש של תאים לצינור 1.5 מ"ל. 10 4-2x10 4 תאי גלייה מספיקים לאחד coverslip 10 מ"מ. בדרך כלל, את ההשעיה כרךUme לtransduce תאים לאחד 4 היטב צלחת היא פחות מ 200 μl. הוסף כמות מתאימה של חלקיקי וקטור ביטוי TED lentiviral לתאי דגירה אותם על RT במשך 10 דקות. ואז למלא את ההשעיה עם מדיום גליה בסיס להיקף הזריעה (100 μl לכל coverslip).
- זרעי μl 100 של תאים נגועים לכל coverslip ודגירה של בערך 2 שעות, ולאחר מכן להוסיף בינוני גליה בסיסית המכילים B27 01:50 ו10 ng / ml EGF לנפח סופי של 2 מ"ל.
- לתנאי התרבות אידיאליים להשתמש בתאים לניסויים ביום 3-7 לאחר ציפוי.
4. דור ותרבות של שורת תאי כתב
שורות תאי כתב TED הוקמו על הבסיס של הלה, BHK21, HEK293 וSH-SY5Y. כאן אנו מספקים פרוטוקול לתאי הלה, אבל הפרוטוקול עשוי להיות מועברים לכל שורת תאים אחרות גם כן.
דור של קו תא הלה יציב
- פיצול קו פראי סוג הלה תא והעברת 100,000 גאמות בהיקף של 200 μl לצינור 1.5 מ"ל.
- הוסף כמות מתאימה של חלקיקי וקטור ביטוי TED lentiviral לצינור ודגירת ההשעיה תא וירוס במשך 10 דקות ב RT. לאחר מכן את תאי זרע בנפח כולל של מדיום מ"ל 2 (DMEM, 10% FCS, 1% פניצילין סטרפטומיצין /) בצלחת 30 מ"מ ו דגירה במשך 3 ימים.
- אחרי הכביסה פעם עם PBS, לשאוב בינוניות ומוסיף 500 טריפסין μl (TrypLE, 02:03 PBS). דגירה של כ. 3 דקות ולאחר מכן לעצור את התגובה על ידי הוספת מדיום מ"ל 3. מעבירים את ההשעיה לתוך צינור פלקון 15 מ"ל ו צנטריפוגות ב XG 400 במשך 3 דקות.
- Resuspend התא גלולה ב 200 בינונית μl ושוב להדביק את התאים עם חלקיקי lentiviral כפי שמתואר ב4.2. לאחר מכן, תאי זרע בתרבית תאים בקבוקון T25 במדיום 10 מ"ל.
- לגדל תאים עד confluency של 60-80% הוא הגיע. ואז לפצל את התרבות.
שורות תאי כתב TED
- שורות תאי כתב TED ניתן לשמוראד בכל מדיום סטנדרטי, למשל DMEM המכיל 5% או 10% FCS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין משמש.
- צלחת מספר מתאים של תאים בצלחת 4 היטב המכילה 10 coverslips סטריליים מ"מ (ראה לעיל), למשל 10,000 עד 20,000 תאים לכל coverslip.
- לגדל תאים לפחות יומיים לפני השימוש בהם לTED הדמיה.
5. הכנה לנוהל הדמית החיה במיקרוסקופ הפוכה
- Prewarm HEPES שרינגר לטמפרטורת חדר ולהוסיף D-גלוקוז.
- Prewarm ACSF (ללא Ca 2 + ו Mg 2 +) לטמפרטורת חדר ולהוסיף D-גלוקוז. לאוורר את ACSF עם carbogen במשך 5 דקות. ואז 1 מ 'של פתרונות מניות CaCl 2 וMgCl 2 להוסיף לריכוזים סופיים של 2 מ"מ כל אחד.
- התחל את המיקרוסקופים ההדמיה חיים וכל תוכנות מחשב.
- התחל זלוף בחדר הדמיה "דמה" ולאזן את מערכת הרכבת התחתית.
- Prewarm דוד מוטבע הפתרון וחדר ההדמיה בבמת מיקרוסקופ. תקן את חדר ההדמיה בהוספת חימום.
- לאזן את המערכת כדי 32-37 מעלות צלזיוס לפני שאתם מתחילים את הליך טעינת צבע זהירות:. כדי למנוע זרימה מקרית של פתרון זלוף למערכת מיקרוסקופ אנו משתמשים בקשרי שיער סביב המטרות ויריעות סיליקון אלסטומרי (1 מ"מ) כדי להגן על הבמה מיקרוסקופ.
6. טעינת צבע של כל אחד מסוגי התאים
- Resuspend aliquot 1 של Fluo5N-AM (ראה 1.3) בפתרון הדמיה 100 μl prewarmed (HEPES שרינגר או ACSF).
- Solubilize Fluo5N-AM בפתרון ההדמיה (HEPES שרינגר או ACSF) בsonicator מים אמבטיה במשך 90 שניות.
- השתמש טרי 4 - או צלחת והעברת פתרון 24 גם 400 μl prewarmed הדמיה לאחד טוב. הוסף פתרון לצבוע לאותו גם לבוא ל500 μl של פתרון 5 מיקרומטר.
- במקום coverslip בזהירות עם תאים (לדוגמה:10-18 מ"מ קוטר) בבאר, תאים פונים כלפי מעלה.
- דגירה לתקופה מתאימה של זמן בתרבית תאים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס (בינתיים להכין הגדרות הדמיה בשלב המיקרוסקופ). פעמים צבע לטעינה אופייניות הן לתאי עצב ותאי גליה 7-15 דקות ולשורות תאים 10-20 דקות.
קריטי: זמן ולצבוע ריכוז צבען טעינה תלוי בסוג התא, צפיפות תאים, וניסוי הצרכים ספציפיים! פעמים דגירה ארוכות בנוכחותו של הצבע עלולות להזיק לתאים, תאי עצב ותאים ראשוניים במיוחד גליה יסודיים וזו היא קריטית ליכולת התגובה לגירויים פיסיולוגיים. פעמים דגירה ארוכה (30 דקות לדוגמה) תהיה שימושיות רק עבור ניסויי לוקליזציה סיד ER לחקור את התפלגות הסידן חדר מיון במבנים קטנים, למשל subcellular neurites קנס או קוצים. בניסויים מסוימים, תערובת של מדיום 1/3 צמיחה עם פתרון הדמיה עשויה לעזור להגן על תאים במהלך Fluo5N-AMטעינה.
- באופן מיידי, להעביר את coverslip לתרבות תא אחר המכילה גם פתרון הדמיה (HEPES שרינגר או ACSF) ולהתחיל הרכבה התאים לחדר ההדמיה.
7. הדמיה של תא חי ER-סידן עם לייזר הפוך סריקת מיקרוסקופ confocal
- השתמש במברשת צבע כדי למרוח משחה ואקום גבוהה לחדר הדמיה. יש צורך בגריז לקבע את coverslip התחתון של חדר זלוף. אנו משתמשים בתאי הדמיה מתוצרת עצמית במשך 10-12 coverslips מ"מ עם נפח קטן, ובכך מאפשרים מהירויות זלוף גבוהות של עד חיץ חילופי פי 15 לדקה. תא זלוף זמין מסחרי במשך 18 מ"מ coverslips, ניתן לרכוש ממכשירים וורנר (RC-49FS). אולם זו גם מאפשר גירוי תחום של תאי עצב.
- תרים את coverslip עם התאים Fluo5N הטעון ולהוסיף טיפה קטנה של פתרון הדמיה (50-100 μl) על גבי התאים כדי לשמור על התאים מכוסים בפתרון הדמיה.הפעל את coverslip במהופך ולעגן את התאים לתוך חדר ההדמיה. ללחוץ את coverslip לדבק סיליקון, השתמש מקלון צמר גפן (למשל Q-טיפים).
- למחות חיץ שייר מהחלק התחתון של coverslip הזכוכית עם ניצני כותנה זהירות:. נגב בזהירות משם שאריות לחות בעת שימוש ב- מטרת שמן עם צמצם מספרי גבוה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה. מלח שיורי מוסר הטוב ביותר על ידי מים. כתם מקרי של שומן ניתן להסיר עם אצטון או אתנול טהור.
- חילופי קאמרי "דמה" הדמיה עם חדר ההדמיה הניסיוני. לשטוף את התאים למשך 5-10 דקות על ידי זלוף הרציף.
- שטוף תאים במשך 5 - 10 דקות על ידי זלוף הרציף.
- לבחירת תא להשתמש בכמות מינימאלית של תאורת לייזר, שיעור גבוה סריקה (2-4 הרץ), גודל תמונה קטן, ורווח גבוה.
- זהירות: לבחירת תאי Fluo5N שכותרתו לא משתמשת בעודף תאורת אור או ישירה עם epifluorescenאור לא. תאורה בהירה של Fluo5N/Ca 2 + מתחמים גורם לאובדן המוחלט של הקרינה ER-ספציפית בתוך 2-4 שניות (איור 5).
- הגדרת מיקרוסקופ פי הניסוי המתוכנן. להתמצאות, הגדרות יציגים להדמיה עם וקטורי TED שונים מוצגות בטבלה 1. לליזר הפוך מיקרוסקופיית confocal, אנו משתמשים במיקרוסקופ אולימפוס IX81 בשילוב עם מערכת confocal 1000 FluoView כי הוא מצויד בלייזרי דיודה (473 ננומטר, 15 מגה ואט; 559 ננומטר, 20 MW) ומערכת גלאי רפאים.
- בתחילת מסמך ניסוי התאים של עניין על ידי X ברזולוציה גבוהה, ערימות תמונת YZ.
- לבצע X, yt הדמיה לפקח דינמיקת סיד ER תחת תנאי הניסוי הספציפיים. הגדרות אופייניות עבור המערכת שלנו מופיעות בטבלה 2.
- לעקוב אחר שינויים בסידן ER תחת זלוף הרציף עם פתרון הדמיה. שעיר חליפין חיץ אופייניים הם דוארxemplarily: (א) שטיפת תא וחנות דלדול ידי SERCA בלוק: 1.5 מ"ל / דקה, (ב) גירוי ה-ATP / DHPG: 3 מ"ל / דקה.
- לרכוש תמונות דיגיטליות מעדיפים עם 12-bit (4096 ערכים אפורים). הדמיה מקבילה של Fluo5N/Ca 2 + ו RFP, תמונות של 8 ביט (256 ערכים אפורים) עשויים להציל את המערכת מפני הצפת נתונים.
- אחסן תמונות תא לחיות סדרת זמן (x, יט) או ערימות תמונת 3D (X, YZ) (לחלוקה תאית של Fluo5N/Ca 2 + מתחמים) בפורמט תואם ImageJ (למשל TIFF).
8. עיבוד תמונה וניתוח נתונים
- פתח את מחסנית התמונה בתכנית ImageJ. במקרה של ססגוניות הדמיה, לפצל את ערוצי RGB כאשר נשאלים על ידי ImageJ.
- זהה את האזור שלך (ים) של עניין (ROI) על ידי בחינה מדוקדקת של ערימות התמונה (לדוגמה, עם עזרה של עצמת כפונקציה של זמן עלילה)
- השתמש בתוסף מנתח זמן הסדרה לקרוא את עוצמת פיקסל הממוצעת בהחזר על השקעה (F גלם). תלויגרם בכוונה, לצייר סביב ROIs או לחדר מיון המלא או אזורים קטנים של חדר המיון לדוגמא המיון של הדנדריטים של אזורי פריפריה סלולרי. כמו כן כולל החזר על השקעה 1-3 באזורים ללא תאים לרקע חיסור.
- חשב את ממוצע הקרינה הרקע (נ ב) על ידי חישוב ערך הקרינה הממוצע של ההחזר על ההשקעה של הרקע ולחסר ב F ערך הרקע מערכי F הגלם כדי לקבל את ההחזר על ההשקעה ערך F.
- חישוב F 0, שהיא הקרינה הבסיסית של התאים, על ידי חישוב הערך הממוצע של עשרה עד 30 ערכי ניאון לכל החזר על השקעה במצב מנוחה.
- לחשב את השינויים היחסיים רקע תוקנו בקרינה על ידי ΔF / F 0 על ידי נוסחה:
- שינויים יחסיים נוכחים בלזרוחNCE כעקבות עם ΔF / F 0 לציר ה-Y והזמן לציר ה-X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מספק גישה ללא הפרעה להדמיה ישירה של סידן חדר המיון ללא תשלום. הזיקה נמוכה הסינטטי Ca 2 + האינדיקטורים שפורסמו ונלכדו בלומן ER בעזרת ER ממוקד, פעילות אנזים רקומביננטי ולין. טעינה משופרת של 2 + Ca צבעי החיווי ללום ER מאפשרת הדמיה ישירה ומהירה של דינמיקת חנות סיד ER.
סוגי תאים לTED
ההיתכנות של השיטה הוכח בשורות התאים, BHK21 HEK293 34, 17 הלה, SH-SY5Y, האסטרוציטים תרבית 8,40 ונוירונים בהיפוקמפוס וקליפת המוח עיקריים 8,34,41. בניסויים שלנו, TED עובד היטב כאשר המבנים באים לידי ביטוי ביציבות TED, מעדיף על ידי וקטורי lentiviral inactivating עצמי 37,39 באמצעות אמרגן חלש יחסית (אמרגן היוביקוויטין לדוגמה) 35. יזמים אחרים, חזקים יותר נמצאים תחת חקירה.
ss> ER-סגוליות = "jove_step" של תווית TED
טעינת TED מוצלחת עם Fluo5N מציעה מכתים ברורה ובהירה של לומן ER, אשר חסך מהאזור הגרעיני 34,41. במדינות מנוחה, 2 + התווית המורכבת Fluo5N/Ca מייצגת את הלוקליזציה של סידן כאשר מחויב Fluo5N, ולכן, הוא מייצג את החלוקה האזורית של סידן חופשי בחלל חדר המיון. באיור 6, תמונות confocal של Fluo5N/Ca 2 + מתחמים ותוויות Tag-RFP-T2 של Red-CES2 מוצגים בתאי הלה, האסטרוציטים קליפת המוח ונוירונים בהיפוקמפוס. איור 6C מגלים 2 + ניאון מחוון המורכב CA בתא גוף, כמו גם neurites של נוירונים בהיפוקמפוס. זה מאפשר בדיקה של Ca 2 + אותות בתהליכים קטנים למדי (ראו גם 34,35).
יש צורך בקצת ניסיון כדי להבדיל את תווית ER הטיפוסית מתווית cytosolic שתקוים wheתאי n פגומים או לא בריאים. esterases cytosolic, אנדוגני גם לשחרר Fluo5N, מה שמוביל לכתמים בהירים מאוד של cytosol והגרעין כאשר סידן דולף דרך קרום הפלזמה. מכתים cytosolic של Fluo5N/Ca 2 + גם הוא ציין כאשר מטופלים שכותרתו תאי TED עם ionomycin ionophore, בנוכחות של סידן תאי (איור 7).
הדמיה ישירה של שחרור סידן מחדר המיון
יישום מרכזי אחד של TED הוא להדמיה הישירה של ER דלדול חנות 17,34. באיור 8, אנו מראים ניסוי נציג אחד הופיע עם נוירונים בהיפוקמפוס, המבטאים אדום CES2. נוירונים עם Red-CES2 להעשיר כמויות גבוהות של Fluo5N באזור perinuclear (חיצים באיור 8). כאשר SERCA חוסם רו"ח מוחל על ידי זלוף, דלדול מהיר של חנות סיד ER הוא ציין (תרשים 8). כאן אנו מציגיםערכי גלם (ציר y) כי מתקבלים כאשר נוירונים הם צילמו עם 12-bit. תנאי הדמיה מפורטים בטבלה 2. שים לב לשינוי העצום בצפיפות הקרינה ממוצעת להחזר השקעה שהוא ציין כאשר טד מוחל על תאי עצב. לניסויים אחרים ניתוח שחרור סידן בחדר מיון הנוירונים באמצעות TED, ברצוננו להתייחס לניסויים קודמים, שכבר נדונו בהרחבה 8,34,35. בקיצור, TED בתאי עצב במבחנה משמש כדי להמחיש את חנות סיד ER SERCA רגישה בפירוט רב על ידי מיקרוסקופ confocal ההפוך סריקת לייזר 8,34 ויושם בהצלחה להדמיה מהירה (15 הרץ) של mGluR1 / 5 המושרית IiCR 34.
איור 9 מראה ניסוי טיפוסי עם האסטרוציטים קליפת המוח עכבר במבחנה, מגורה על ידי 200 מיקרומטר ATP דרך מערכת טפטוף ברזולוציה נמוכה באמצעות מטרת מים 20x. לאחר הדבקת lentiviral, התאים המוצגים כאן הביעו אדומיםCES2, אשר מונע על ידי אמרגן היוביקוויטין. סריקה מהיר הייתה ~ 2 הרץ ושני הערוצים (Fluo5N/Ca 2 + וחלבון היתוך אדום CES2) היו בו זמנית צילמו (בשורה). בתחילתו של הניסוי בתאי גלייה הראו זיהום טוב עם בונה הביטוי וטעינה טובה עם Fluo5N-AM. ROIs שנותחו מודגשים באיור 9 א. החזר על השקעה אחת הוקם על מנת למדוד את הקרינה הרקע (BG), החזר על השקעה 1-2 למדוד את הקרינה של תאים מלאים, ההחזר על ההשקעה של 3 מכסה רק חדר המיון של התא והחזר על ההשקעה של 4 צויר סביב שדה ראייה המלא. זמן קצר לאחר גירוי עם ATP הקרינה של Fluo5N/Ca 2 + מתחמי פתאומיות ירדו בשל Ca 2 + שחרור מחדר המיון. לבסוף, ER הוא מילא באופן חלקי עם סידן שוב. במקביל, הקרינה של RFP ברציפות יורדת כתוצאה מהלבנה קלה (איור 9 ב, פנל תחתון). עקבות המייצגות את השינויים בfluoresc עוצמת ence (איור 9 ג) לנקודת חסרון חשוב של TED. ברבים (לא כולם) ניסויי כמויות גבוהות של Fluo5N-מתחמים הולכות לאיבוד בזמן הגירוי. כתוצאה מכך, את ערכי הקרינה לא יחזרו לרמת עוצמת הקרינה הראשונית.
איור 10 מציג BHK21 תא CES2 נגוע ברזולוציה גבוהה, שכותרתו על ידי Fluo5N/Ca 2 + ו מגורה עם ה-ATP. BHK21 תאים שימש כמערכת תא מודל מוקדם לחדר מיון ניתוח סידן 31. שימו לב ששחרור סידן וER-חנות מילוי הוא מדמיין במבנים עדינים של צינוריות ER. המבנים שצלמו במהירות איטית (~ 0.2 הרץ), עם 512 x 512 פיקסלים, דיסק הגדרה 1 אוורירית לחריר confocal, ועם מטרת שמן 63x.
"/>
איור 1. סקירה כללית של איתות סיד ER. שחרור סידן ER נגרמת על ידי ערוצים "דליפה" כגון נקבובית intramembrane ER המורכב Sec61. קולטני ה-G-חלבון בשילוב (GPCR) לעורר 3 ייצור ה-IP, אשר לאחר מכן גורם לשחרור סידן-Induced 3-IP (IiCR). שחרור סידן ER הוא חש במתחמי סטים וגורם לכניסת סידן מופעל חנות (SOCE) על ידי תעלות יונים של המשפחה ו / או ערוצי סיד Orai TRP. ערוצי סיד מתח מגודרת (Ca V) לתווך שחרור סידן-Induced סיד מהיר (CiCR) על ידי קולטנים ryanodine (RyR) או על ידי אינטראקציה ישירה חלבון (שריר שלד) או אינטראקציה פיזיולוגית (תאי שריר לב, תאי עצב). האובדן של סידן ER הוא חולץ דינמי על ידי הפעולה של משאבת SERCA (ATPase סידן reticulum sarcoplasmic-endoplasmic).
res.jpg "src =" / files/ftp_upload/50317/50317fig2.jpg "/>
איור 2. עיקרון ממוקד ולין צבע מושרה הטעינה (TED). ביטוי יתר ממוקד של carboxylesterase מספק פעילות ולין גבוהה (CES2) בחדר המיון. ולין ממיר את צבע acetoxymethylester Fluo5N-AM ללצבוע בסידן רגיש, ניאון שנותר לכוד בחדר המיון. יש Fluo5N נמוכה זיקה ליוני סידן. לכן, בתנאי מנוחה, Fluo5N/Ca 2 + מתחמי ניאון נוצרים מעדיפים בחדר המיון, שבו ריכוז הסידן גבוה כ -1,000 פי מאשר בcytosol.
איור 3. בונה נציג TED וקטור CES2.: גרסה מקורית של עכבר CES2. CES2 שטחים 43: ERאות פפטיד הוחלף וכעת היא כוללת אינטרון, ואילו מוטיב שמירת ER שונה לשימור KDEL-ER המוטיב הקלסית ואחזור של חלבוני ER מסיסים. תג myc מספק epitope לגילוי חלבון על ידי תיוג immunofluorescence עקיף וניתוח כתם מערבי. האדום CES2 8,43: חלבון פלואורסצנטי אדום הוסיף ישר מאחורי פפטיד אות aminoterminal. האדום LK CES2 43: מקשר גליצין-סרין כבר הציג להקמת ציר גמיש בין RFP ואלמנט CES2.
איור 4. זרימת עבודה להדמיה ישירה באמצעות סיד ER-TED. השעיות תא של תאים ראשוניים או קווים סלולריים transduced בוירוס המכיל מבנה ביטוי TED. תאים לאחר מכן זורעים על coversliPS. בעת שימוש במבני RFP-CES2, transduced ניתן לזהות תאים באמצעות הקרינה האדומה. טעינת צבע מושרה יעד ולין מבוצעת על ידי דוגרים התאים בפתרון הדמיה המכיל AM-מצמידים נמוכה זיקת Ca 2 + מחוון, כגון Fluo5N-AM או מאג-Fura2-AM. ההדמיה סיד ER מתבצעת עם מיקרוסקופ הפוכה סריקת לייזר (ראה פרוטוקול) או כל מכשיר הדמיה תואם אחר. במהלך הדמיה לחיות את התאים נמצאים תחת זלוף הרציף עם פתרון הדמיה כגון מלאכותי נוזל השדרתי (ACSF). גירוי תא מתבצע או על ידי או על ידי זלוף לחץ פליטה מקומית.
איור 5. תאורת epifluorescence חזקה הורסת את תווית TED Fluo5N ER-הספציפית בתוך שניות. נציג תמונות מוידאו, צלמו עם מיקרוסקופ הדמיה זקוף. הנה, expr תאי גליהEssing RFP-CES2 היו עמוס Fluo5N-AM. ראשון הקרינה האדומה של תא נגוע התגלתה עם מצלמת CCD. בהמשך, + אות Fluo5N/Ca 2 הייתה מוארת במקור אור LED. לוקליזציה ER ברורה ראשונית של Fluo5N/Ca 2 + מתחמים (חצים צהובים) הוא נהרס במהירות על ידי תאורה חזקה עם מקור אור LED 470 ושינוי בחלוקת הקרינה הופך לגלוי באזור הגרעיני (חיצים צהובים, 12.46 שניות).
איור 6. TED טעינה עם Fluo5N-AM בתאים מסוגים שונים פנל עליון:. תאי הלה עם ביטוי יציב RED-CES2 פנל התיכון:. האסטרוציטים קליפת המוח לאחר התמרה lentiviral עם Red-CES2 פנל תחתון:. נוירונים בהיפוקמפוס באדום-CES2 בDIV 8. כל התאים בתרבית על coverslips ומוכתם בFluo5N-AM כפי שתואר בסעיף השיטה. Fluo5N/Ca 2 + התווית מייצגת גם הלוקליזציה של סידן כאשר חייבת Fluo5N. 40 מיקרומטר סרגל קנה המידה.
איור 7. Fluo5N לצבוע בcytosol הופך לגלוי לאחר טיפול ionomycin. תאי גליה היו נגועים באדום CES2, שכותרתו עם Fluo5N-AM, וטופלו בthapsigargin SERCA בחסמי סידן לרוקן את חדר מיון. טיפול ionomycin מושרה זרם חזק של סידן תאי. (פנל עליון) תאים מצביעים על עלייה דרסטית בFluo5N/Ca 2 + הקרינה בתיווך. (פנל תחתון) תמונת הקרנת העצמה הממוצעת של Fluo5N/Ca 2 + תווית מגלה תיוג cytosolic טיפוסי המורכב על ידי סיד ניאון החץ כחול:. תא שכותרת בהיר מצביע על כך שיש לו תא זה כמויות גבוהות של סידן בדואר cytosol. מן הסתם, זה תא פגום חץ סגול:. תאים הופכים לכותרת במאור פנים בcytosol על טיפול ionomycin.
איור 8. דלדול סיד ER חנות בנוירונים על ידי חסימת SERCA. () נוירונים בהיפוקמפוס (DIV 9) מפורש האדום CES2 (אדום) ומסומנים עם Fluo5N-AM (, ירוק). את החיצים מצביעים על שני תאים נותחו. התמונה (הקרנת העצמה מקסימלית) היא אלמנט קצוץ של גרזן, YZ-תמונה שנרכשה בתחילת הניסוי. (ב) עקבות גלם המייצגים את דלדול סיד חנות ER אחרי זלוף עם 30 מיקרומטר רו"ח. כאן 1,000 תמונות צולמו עם הרץ 1 ו -12 סיביות. ערכי הגלם של צפיפות הקרינה הממוצעת להחזר השקעה (ציר y) של שני התאים שמוצג בהםזמם לאורך זמן (אדום וכחול זכר). ערכי הרקע (זכר שחור) נשארים קבועים. AU = יחידות שרירותיות של ערכים אפורים המייצגים את צפיפות הקרינה.
איור 9. שחרור סידן ER-ATP על גירוי של תאי גלייה. תאי גליה היה נגוע באדום CES2 ועמוס Ca 2 + מחוון Fluo5N-AM. תאים היו מגורה עם 200 מיקרומטר ATP באמצעות זלוף עבור 10 שניות. () תאי גליה להביע אדום CES2 (באמצע) מסומנים עם Fluo5N-AM (משמאל). ROIs מודגשים. (ב ') ליחיד תמונות שחולצו מן הרצף זמן לשגות. (פנל עליון) עוצמת הקרינה היא גבוהה ב0 שניות ו -71 שניות לפני שהתאים מגיבים. זה בפתאומיות טיפות (80 שניות) ומגיע למינימום ב86 SEג, לפני שהוא עולה שוב (160 שניות), כמו סידן נשאב חזרה לחדר המיון. (פנל תחתון) עוצמת הקרינה של RFP יורדת באיטיות וברציפות לאורך זמן בשל להלבנה. (ג) עקבות זמן מראה ΔF / F 0 ערכים עבור ROIs מצויינים בא הקרינה, המציין את ריכוז סידן, יורד למטה לאחר גירוי ה-ATP ואופן חלקי מתאושש. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 10. הדמיה ברזולוציה גבוהה של שחרור סידן-Induced ATP בתאי BHK21. תאים הועמסה עם Fluo5N-AM וצלמה בנוכחות של סידן תאי. () סדרת תמונות המציגה שינויים בשפעתo5N/Ca 2 + נגזר הקרינה במהלך ATP-גירוי. (ב ') תמונת הקרנת העצמה ממוצעת מציינת ROIs מוצג בשחרור ג (ג) ה-ATP מושרה סידן ומילוי של חנות סיד ER מנותח באזורי משנה קטנים של חדר המיון. את העקבות מייצגות שינויים בקרינה.
| עירור לייזר [ננומטר] | טווח גילוי [ננומטר] |
| TED עם בונה וקטור האדום CES2 | |
| 473 (Fluo5N/Ca 2 +) | 507-545 |
| 559 (Tag-RFP-T2) | > 570 |
| TED עם CES2 בונה וקטור בלבד | |
| 473 ננומטר (Fluo5N/Ca 2 +) | > 507 |
טבלת מס '1. הגדרות עבור גלאי הרפאים.
| ניסיון | דלדול ER באמצעות אדום CES2 | גירוי של נוירונים בשימוש במבנה CES2 | ברזולוציה גבוהה הדמיה מרחבית, CES2 |
| אובייקטיבי (NA) | 20x מים (0.7) | 20x מים (0.7) | שמן oil/63x 40x (≥ 1,3) |
| לייזר ננומטר 473 | |||
| כוח | 1% | 1% | |
| HV | 600-780 | 600-780 | 400-780 |
| להשיג ב ' | 0-1% | 1-2% | 0% |
| לקזז | 0 | 0 | 0 |
| לייזר ננומטר 559 | |||
| כוח | 1% | OPTIOnalC | optionalC |
| HV | 600-780 | optionalC | optionalC |
| להשיג ב ' | 0-1% | optionalC | optionalC |
| לקזז | 0 | optionalC | optionalC |
| סריקה מהירות | 1-2Hz | לרוץ חופשי | לרוץ חופשי |
| גודל תמונה | 320x320 פיקסל | 240x240 פיקסל | פיקסל 512x512 |
| סריקת סוג | בקו | דו כיוונית | Nyquistcriterion (2 פיקסלים / אלמנט) |
| גרייה | 100-200 ATP :5-15 שניות מיקרומטר; גלוטמט מיקרומטר 200-500 במשך 5-15 שניות | 100-200 מיקרומטר אגוניסט: 5-15 שניות | |
| חריר | 2-5 דיסקים אווריריים | 2-5 דיסקים אווריריים | דיסק אוורירי 1 |
טבלת 2. דוגמאות להגדרות מיקרוסקופ בהתאם לסוג של ניסוי A:. HV = נוכחי לגלאי המכפיל ', ב': רווח = הגברה של אות PMT, C: אופציונלית: הערוץ הוא חופשי לשימוש עם צבעי ניאון אדומים אחרים (למשל CMX-Ros לדמיין את הפוטנציאל של המיטוכונדריה) או חלבוני ניאון אדומים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
את היתרונות והחסרונות של שיטת TED כבר נדונו בהרחבה בפרסומים האחרונים 34,35. בהשוואה לשיטות אחרות שתוארו לעיל, TED עוקף את הבעיה של שיבוש ומרוסס בתאים. יתר על כן, שני היבטים צריכים להדגיש. העיקרון של TED לחדר מיון סיד דורש הדמיה (1). הביטוי ממוקד של carboxylesterase הפעיל בלומן ER בעזרת בונה וקטור טד ו( 2). שחרור יעיל ומועדף של AM-אסטרים זיקה נמוכה הסינתטיים של צבעי סידן בלומן ER.
1. TED וקטור בונה
איור 3 מסכם את הפיתוח של מבנים וקטורית TED. TED פותח על הבסיס של חלבוני משפחת CES (EC 3.1.1.1). חלבונים אלה תושב חברים בלומן ER. במבחנה מלומד ממשל רקומביננטי של חלבוני CES עובד הכי טוב אחרי ביטוי יציב שלחלבון או לאחר זיהום ויראלי עם רמות ביטוי מתונות. נכון לעכשיו, לא ידוע אם חלבונים אחרים עם פעילות ולין יכולים להחליף חלבוני CES עבור TED הדמיה. זה לא מומלץ לשימוש transfection חולף של וקטורי TED לניתוח סיד ER דינמי, מכיוון שתאים מגיבים פחות לאחר הליך transfection. חלבוני CES צריכים מיקוד נכון ללום חדר המיון ושלב זה צריך מחשוף יעיל של פפטיד אות ER. בנוסף, שמירה ואחזור של חלבוני CES בלומן ER מתווכת על ידי המוטיב דמוי KDEL aminoterminal שלהם. מנגנונים אלה עשויים להיות רוויים כאשר רמות ביטוי גבוהות מיוצרות על ידי וקטורי TED לאחר transfection החולף. זה גורם למאי לוקליזציה שווא של CES-החלבונים ותומך בהיווצרות של אגרגטים חלבון.
2. זיקה נמוכה Ca 2 + אינדיקטורים לTED
החסרון המהותי ביותר של TED נגרמת על ידי מגבלות של הועילצבעי חיווי מסוגלים לניתוח שאינו מפריע לסידן ER. הדמיה סיד ER עם טד דורשת צבעי חיווי עם K D גבוה (כלומר זיקה נמוכה) וקרינה נמוכה בהיעדר סידן. בהתבססו על הניסיון שלנו Fluo5N-AM עובד הכי טוב, אבל צבע אינדיקטור זה הוא לא אקונומיקה עמידה. נמוכה זיקת Ca 2 + אינדיקטורים מאג-Fura2-AM (K d ~ 25-50 מיקרומטר) 34 ומאג-Fluo4 (K d ~ 20-25 מיקרומטר) נבדקו גם. שני הצבעים נטענים גם לתוך מבנים בחדרי מיון ב-TED, אבל את הסיכון של הפקה "אותות מעורבים" על גירוי של שחרור חדר מיון הוא גבוה. "אותות מעורבים" מייצגים ראשון גידול מהיר של הקרינה בcytosol אחריו הירידה של הקרינה בחדר המיון. כדי להתגבר על מגבלה זו, גישות מפריעות להדמית סיד ER עשויות לעזור 32,35. MAG-Fluo4 (K D ~ 20-25 מיקרומטר) מציג תווית חזקה TED בתיווך של cisternae גולגי, שהוא פחות בולט כאשר Fluo5N-אנישל שימוש.
יישומים והפרספקטיבות
כאן נתמקד בליזר ההפוך סריקת ניתוח confocal של ER סידן דינמי עם טד. יכולות גם להיות מותאמות לכל מדידות TED מערכת confocal סטנדרטית או מערכת שדה רחבה עם מערכת זיהוי הקרינה 6 המקור המתאים העירור (לייזר, LED, מנורות Halid מתכת, monochromator), מסננים ו.
TED הוא שימושי במיוחד באותם תאים שלא מבטאים פעילות CES אנדוגני מספיק בחדר המיון. הבחנו כי BHK21 תאים למשל לספק פעילות ולין מספיק אנדוגני בחדר המיון כדי לשחרר אינדיקטורים זיקה נמוכים. בידיים שלנו, זה לא המקרה עם הרבה קווים אחרים (סלולריים HEK293, SH-SY5Y, הלה, PC12), גליה העיקרית, ועל נוירונים עיקריים. כאן, בשיטת TED מאפשרת טעינת צבע שאינו משבשת מוצלחת לחדר המיון.
וקטורי TED עתיד עשויים היקף היישום שלה מחדר המיון ללוםתאי subcellular אחרים או microdomains הסלולרי. העיקרון של שיטת TED הוא עצמאי של צבע המחוון, ולכן יכול לשמש עם אסתר-AM של כל צבע, למשל להדמיה של דינמיקת pH תאיות. לאחרונה, מעבדתו של לוק ד Lavis תאר שולין הכבד חזירי רקומביננטי (PLE) CES1 יוצר זוג ולין-אסתר סלקטיבית עם cyclopropylester צבעים 42. סוכני Cyclopropylester נמצאו להיות עמיד בפני הידרוליזה על ידי esterases אנדוגני והסרת המסכות סלקטיבית על ידי מולקולת רקומביננטי CES אפשר פעילות התא הספציפית מיקוד 42. יהיה מעניין לבדוק האם מדדי סידן בהתבססו על טכניקה חדשה שישפרו את הספציפיות מיקוד subcellular של אינדיקטורים סינטטיים.
TED עובד הכי טוב בשורות תאים, כאשר חלבוני TED באים לידי ביטוי ביציבות. הקמת אוסף עם שורות תאי TED יציבות תהיה מועילה.
מודלים מהונדסים TED עכבר הם גם מטרה עיקרית של העבודה שלנו וזה יאפשר TED בהכנות רקמות ספציפיות ממעגלים עצביים ספציפיים, שרירי שלד, לב, או הכנות של מערכת כלי הדם. מודל עכבר זה יעזור להעביר את הניתוח של דינמיקת סיד ER מהרמה התאית לרקמת הקשר פיסיולוגי יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של Forschungsgemeinschaft BL567/3-1 דויטשה (DFG) ופרידריך באור-Stiftung. ברצוננו להודות לרוג'ר צ'יין, הווארד יוז מעבדות מכון רפואי באוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו שספק לנו תג-RFP-T2. אנו מכירים תודה לאל דייוויד בולטימור, מכון טכנולוגי של קליפורניה בפסדינה, ודידייה Trono, אוניברסיטת ג'נבה, ג'נבה, שספק לנו פלסמידים FUGW lentiviral, וpsPAX2/pMD2.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine) | Tocris | 0805 | |
| 5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate | Sigma | A26209-1G | |
| B-27 supplement,50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Carbamoylcholine chloride (Charbachol) | Sigma | C4382-1g | |
| Cyclopiazonic acid (CPA) | Ascent scientific | Asc-300 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM with Glutamax | Invitrogen-Gibco | 31966-047 | |
| Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x | PAA | H15-002 | |
| Fetal calf serum | Invitrogen-Gibco | 10270-106 | |
| Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg | Invitrogen | F14204 | |
| Glutamate | Ascent scientific | Asc-049 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | |
| Ham's F12 nutrients mixture | Invitrogen-Gibco | 21765-029 | |
| Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS | PAA Laboratories | H15-010 | |
| Horse serum | SHD3250YK | Linearis | |
| Ionomycin Ca2+ salt | Ascent scientific | Asc-116 | |
| murine EGF | PreproTech | 315-09 | |
| N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen-Gibco | 21103-049 | |
| Pluronic F127, low UV absorbance,2g | Invitrogen | P6867 | |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN | Sigma | P8638 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Lysin | Sigma | P2636 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005-1mg | |
| TryLE Express | Invitrogen | 12605-028 | |
| Trypsin | Worthington | LS-003707 | |
| Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean) | Sigma | T6522 | |
| Materials | |||
| Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81 | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635) | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector | Olympus | user-specific configuration | |
| Heater controller TC-344B | Warner Instruments | 64-0101 | to control in line solution heater |
| NIH ImageJ software | WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006 | ||
| Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35 | Olympus | N2709100 | |
| Objective: UPLFLN40XO | Olympus | N1478700 | |
| Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15 | Olympus | N1480700 | |
| Perfusion chamber, inverse | custom-made | ||
| Perfusion chamber, RC-49FS | Warner Instruments | W4 64-1709 | |
| Perfusion tube: PT-49 | Warner Instruments | 64-1730 | for perfusion |
| Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels) | Gilson | n.a. | perfusion pump |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | controlled by heater controller |
| Suction tubes: ST3R | Warner Instruments | 64-1407 | for perfusion |
| Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel | Pecon | n.a. | |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).
- Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K.
- Berridge, M. J.
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59, 861-872 (2008).
- Jaepel, J., Blum, R.
- Verkhratsky, A. Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons. Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).
- Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate. Nature. 306, 67-69 (1983).
- Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction. Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).
- Clapham, D. E. TRP channels as cellular sensors. Nature. 426, 517-524 (2003).
- Cahalan, M. D.
- Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. Sensing cellular stress through STIM proteins. Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).
- Erdmann, F., et al. Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum. The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).
- Schäuble, N., et al. BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER. The EMBO Journal. , (2012).
- Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).
- Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).
- Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).
- Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J. Vis. Exp. (23), e1067 (2009).
- Lang, S., Schäuble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms. J. Vis. Exp. (53), e2730 (2011).
- Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. Looking forward to seeing calcium. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).
- Mank, M., Griesbeck, O.
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Montero, M., et al. Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells. The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).
- Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
- Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations. EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).
- Solovyova, N., Verkhratsky, A. Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches. Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).
- Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry. The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).
- Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).
- Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum. 43, Humana Press. (2010).
- Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 5, 545-551 (2008).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
- Zufferey, R., et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).
- Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).
- Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Calcium measurement methods. Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), Humana Press. 147-167 (2010).
- Tian, L., et al. Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).
- Samtleben, S., Blum, R. Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading. , In preparation (2012).
