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Biology

लक्षित-esterase साथ ईआर कैल्शियम की प्रत्यक्ष इमेजिंग प्रेरित डाई लोड हो रहा है (टेड)

Published: May 7, 2013 doi: 10.3791/50317
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 3, 1
1Institute for Clinical Neurobiology, University of Wuerzburg, 2Department of Synapses - Circuits - Plasticity, Max Planck Institute of Neurobiology, Martinsried, 3Walter Brendel Centre of Experimental Medicine, Ludwig-Maximilians University of Munich

Summary

लक्षित-esterase प्रेरित डाई लोड हो रहा है (टेड) प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा intracellular कैल्शियम की दुकान गतिशीलता के विश्लेषण का समर्थन करता है. विधि यह सिंथेटिक कम आत्मीयता सीए की स्थानीय अनमास्किंग को बेहतर बनाता है जहां जालिका (ईआर), के लिए एक पुनः संयोजक Carboxylesterase के लक्ष्य पर कुर्सियां

Abstract

कैल्शियम की गतिशीलता के दृश्य सेल फिजियोलॉजी में कैल्शियम की भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. कैल्शियम की गतिशीलता की जांच, सिंथेटिक फ्लोरोसेंट सीए 2 + indictors लोकप्रिय हो गए हैं. यहाँ हम टेड (= लक्षित-esterase प्रेरित डाई लोड हो रहा है), 2 सीए की रिहाई में सुधार करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन + विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के ईआर लुमेन में सूचक रंजक. तिथि करने के लिए, टेड सेल लाइनों, glial कोशिकाओं, और इन विट्रो में न्यूरॉन्स में इस्तेमाल किया गया था. वेक्टर निर्माणों का उपयोग कर ईआर लुमेन के लिए एक उच्च carboxylesterase गतिविधि को निशाना कुशल, पुनः संयोजक पर टेड ठिकानों कि एक्सप्रेस Carboxylesterases (CES). नवीनतम टेड वैक्टर इस प्रकार एक साथ दो रंग इमेजिंग सक्षम करने, एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े हुए CES2 के एक प्रमुख तत्व होते हैं. इसी ईआर संरचना लाल रंग में दिखाई देता है, जबकि ईआर में मुक्त कैल्शियम की गतिशीलता, एक रंग में imaged हैं. प्रक्रिया की शुरुआत में, कोशिकाओं एक lentivirus साथ transduced रहे हैं. बाद में, संक्रमित कोशिकाओं को एकफिर अंत में जीना सेल इमेजिंग सक्षम करने के लिए coverslips पर वरीयता दी गई. फिर, जीवित कोशिकाओं acetoxymethyl एस्टर (AM-एस्टर) कम आत्मीयता 2 सीए के फार्म के साथ incubated रहे हैं + संकेतक, उदाहरण के लिए Fluo5N-PM, पत्रिका Fluo4-PM, या पत्रिका Fura2-AM. सीए 2 + सूचक और एक हाइड्रोफिलिक फ्लोरोसेंट डाई / सीए 2 + परिसर का AM रूप से हाइड्रोफोबिक पक्ष श्रृंखला बंद ईआर cleaves में esterase गतिविधि का गठन और ईआर लुमेन में फंस गया है. डाई लोड करने के बाद, कोशिकाओं एक औंधा लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग में विश्लेषण कर रहे हैं. कोशिकाओं लगातार घंटी की तरह समाधान के साथ perfused और ईआर कैल्शियम गतिशीलता समय चूक इमेजिंग द्वारा सीधे कल्पना कर रहे हैं कर रहे हैं. ईआर कैल्शियम की दुकान के refilling प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि पैदा करता है जबकि ईआर से कैल्शियम रिहाई, हित के क्षेत्रों में प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी के द्वारा की पहचान की है. अंत में, समय के साथ फ्लोरोसेंट तीव्रता में परिवर्तन ΔF / एफ 0 की गणना के द्वारा निर्धारित किया जाता है.

Introduction

ईआर के शारीरिक कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को हल करने के लिए, हम ईआर में सिंथेटिक कैल्शियम संवेदनशील रंगों के फँसाने सुधार करने के लिए एक नई रणनीति विकसित की है. विधि कोशिकी कैल्शियम की मौजूदगी में मुक्त ईआर कैल्शियम की प्रत्यक्ष, गैर विघटनकारी वास्तविक समय की निगरानी में सक्षम बनाता है.

ईआर कैल्शियम के फंक्शन और संकेत

कैल्शियम संकेतों को विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, जैसे मांसपेशियों की कोशिकाओं, न्यूरॉन्स और सीखने और स्मृति 1,2 में synaptic प्रसारण में शामिल होने की मांसपेशियों में संकुचन मध्यस्थता से glial कोशिकाओं और उनके कार्यों रेंज में पाए जाते हैं. कैल्शियम जीन प्रतिलेखन, सेल प्रसार, neuronal excitability, कोशिका मृत्यु और घटनाओं 1-7 संकेत अन्य सेल के विनियमन में शामिल है क्योंकि मुक्त कैल्शियम एकाग्रता में परिवर्तन उच्च वैज्ञानिक रुचि के हैं. इन सभी सेलुलर कैल्शियम संकेतों कार्यात्मक जुड़ा हुआ है और कैल्शियम intracellular में योगदान कर रहे हैंदुकान गतिशीलता 8-10.

सभी कैल्शियम संकेतों के बीच एक आम सुविधा बाह्य अंतरिक्ष के बीच कैल्शियम के प्रवाह, cytosol और organelles है, मुख्य रूप से ईआर और mitochondria है. यह अलग संकेत घटकों द्वारा महसूस कर रहे हैं जो इन organelles के भीतर कैल्शियम एकाग्रता में गतिशील परिवर्तन का कारण बनता है. सामान्य तौर पर, 100-800 माइक्रोन के बीच ईआर पर्वतमाला में कैल्शियम एकाग्रता, cytosol में कैल्शियम एकाग्रता के करीब 100 एनएम है, और बाह्य अंतरिक्ष में एकाग्रता 1-2 मिमी के आसपास है. तदनुसार, साइटोसॉल 2,9,10 की ओर कैल्शियम प्रवाह के लिए एक उच्च रासायनिक प्रेरणा शक्ति है.

सबसे अधिक जांच की ईआर व्युत्पन्न कैल्शियम संकेत तो phospholipase सी (पीएलसी) को सक्रिय जो जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCR), की उत्तेजना पर निर्भर करते हैं. बदले में पीएलसी inositol 1,4,5-trisphosphate (आईपी 3) 1 पैदा करता है. इसके आरईसी के लिए आईपी 3 के बंधन परeptor (आईपी 3 आरईसी, चित्रा 1) ईआर झिल्ली में, कैल्शियम आयनों ईआर लुमेन से जारी कर रहे हैं. ऐतिहासिक, ईआर से आईपी 3 की मध्यस्थता कैल्शियम रिहाई पहला था - भले ही परोक्ष रूप से - Streb एट अल द्वारा कोष्ठकी अग्नाशय कोशिकाओं में मापा 1983 11 में.. इस प्रकाशन के लिए पहली बार सुझाव दिया acetylcholine, phospholipase सी, और आईपी 3 से जुड़े एक संकेत झरना. कैल्शियम की रिहाई के इस तरह आम तौर पर आईपी 3 प्रेरित कैल्शियम रिहाई (IiCR) (चित्रा 1) करार दिया है. रिसेप्टर tyrosin kinases लिंक आईपी 3 ऊंचाई 12 के बाद संकेत ईआर कैल्शियम के लिए वृद्धि कारकों और neurotrophic कारकों की कार्रवाई से phospholipase Cγ के kinase पर निर्भर सक्रियण. IiCR के अलावा, कैल्शियम ऊंचाई ryanodine फिर से वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल (सीए वी), और बाद में कैल्शियम प्रेरित कैल्शियम रिहाई (CiCR) के माध्यम से उदाहरण के लिए, ionotropic कैल्शियम प्रविष्टि द्वारा मध्यस्थता हो सकती हैceptors (RyR). IiCR और CiCR physiologically दुकान संचालित कैल्शियम प्रविष्टि (SOCE) से जुड़े होते हैं. SOCE ईआर कैल्शियम रिहाई के लिए एक सेंसर है जो STIM (स्ट्रोमा बातचीत अणु) की कार्रवाई भी शामिल है. STIM क्षणिक रिसेप्टर संभावित चैनल (टीआरपी) 13, उरई कैल्शियम चैनल 14 और यहां तक कि वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल 15 (चित्रा 1) के माध्यम से बाह्य कैल्शियम प्रवेश को प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया गया है. ईआर कैल्शियम की हानि गतिशील जो सक्रिय रूप से पंप कैल्शियम वापस ईआर में सारको-जालिका कैल्शियम ATPase (SERCA) की कार्रवाई से बचाया है. ऐसे thapsigargin के रूप में दवाओं के साथ SERCA अवरुद्ध साइटोसोलिक डिब्बे में ईआर कैल्शियम की एक निरंतर हानि का खुलासा किया. इस ईआर कैल्शियम "लीक" ऐसे Sec61 प्रोटीन जटिल 16,17 (चित्रा 1) के रूप में ईआर intramembrane ताकना परिसरों के कारण होता है.

1998 में, Berridge एक मॉडल, "एक न्यूरॉन मॉडल भीतर न्यूरॉन", जो प्रकाशितज न्यूरोनल कैल्शियम 5 एकीकृत करने में ईआर के एक सिद्धांत शारीरिक भूमिका का पता चलता है. इस मॉडल न्यूरोनल प्लाज्मा झिल्ली 5 के एक intracellular "छवि" बनाने की एक सतत ईआर झिल्ली प्रणाली के अस्तित्व को मानता है. इस द्विआधारी यूकेरियोटिक झिल्ली प्रणाली न्यूरॉन्स में तेज और धीमी कैल्शियम संकेतों के अस्थायी और स्थानिक एकीकरण के लिए एक बुनियादी शर्त होने का दावा किया गया था. एक ही न्यूरॉन के विभिन्न कांटा या dendrites में समन्वित रूप से या बाद में या तो होती है कि कैल्शियम संकेतों सेल की सोमा या वे 5,18 अभिव्यक्त किया जाता है जहां ईआर, के माध्यम से नाभिक को सम्मानित किया जाता है. फिर, अपनी राशि cascades संकेत के जीन प्रतिलेखन या एकीकरण के न्यूरॉन, विनियमन के excitability पर प्रभाव पड़ सकता है. इस प्रकार, ईआर कैल्शियम संकेतों के एकीकरण का समर्थन करता है. इस अवधारणा के लिए एक शर्त कई अध्ययनों से दावा किया गया है जो और कम से कम शारीरिक अथवा मानव शरीर संबंधी अर्थ में समास रूप घ के लिए सिद्ध किया गया है जो एक ही सेल में ईआर की निरंतरता हैendritic क्षेत्रों और कम दूरी axonal अनुमानों 19-21. लंबे axonal अनुमानों के भीतर ईआर निरंतरता है कि क्या वहाँ बहस का विषय है.

ईआर झिल्ली से अधिक मुक्त कैल्शियम के प्रवाह को मापने के लिए रणनीतियाँ

कैल्शियम संकेतों सबसे अक्सर साइटोसॉल 22,23 में निगरानी कर रहे हैं. इसलिए, यह आसानी से सीए 2 + कोशिकी से या 6,24 इंट्रासेल्युलर दुकानों से cytosol में बह रही है कि क्या प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है. इस सीमा को पार करने के लिए, प्रत्यक्ष ईआर कैल्शियम इमेजिंग के लिए पद्धति रणनीतियों विकसित किया गया है. सारांश में, निम्नलिखित रणनीति इस्तेमाल कर रहे हैं: (1). अनुवांशिक इंजीनियर प्रोटीन संकेतक 25-27 प्रोटीन आधारित कम आत्मीयता सीए 2 + संकेतक एक कैल्शियम संवेदन प्रोटीन के साथ संयोजन में bioluminescent प्रोटीन aequorin या GFP उपयोग ईआर को निशाना बनाया. इन अनुवांशिक इंजीनियर सीए 2 + संकेतक (GECIs सकते हैं)एक संकेत पेप्टाइड की मदद से ईआर के लिए लक्षित किया और सक्रिय रूप से एक अवधारण और पुनर्प्राप्ति आकृति का उपयोग कर ईआर में रखा जाता है. Cameleon विभाजन YC7.3ER 29, और Cameleon डी 1 30, और Cameleon सिद्धांत पर आम ईआर सीए 2 + संकेतक आधार Cameleon YC4.3 26,28 हैं. AM-एस्टर कम आत्मीयता सीए 2 (2) के प्रत्यक्ष esterase आधारित डाई लोड + संकेतक 31,32. सूचक रंगों के (पत्रिका Fura2-PM, पत्रिका Fluo4-AM या Fluo5N-AM) डेरिवेटिव AM पारित एक lipophilic, कैल्शियम असंवेदनशील राज्य में जैविक झिल्ली. फिर, cytosol में के रूप में अच्छी तरह से ईआर में, अंतर्जात esterases हूँ एस्टर समूह की फोड़ना और cytosol में सक्रिय डाई की एक निश्चित राशि के पीछे और ईआर में छोड़ने, सीए 2 + सूचक जारी है. साइटोसोलिक कैल्शियम एकाग्रता अच्छी तरह से डी नीचे रहता है इसलिए, इस दृष्टिकोण लंबे समय के रूप में ईआर में एक उच्च कैल्शियम एकाग्रता की परिस्थितियों में उपयोगी हैविशेष रूप से विशेषता कैल्शियम संकेतों (कम माइक्रोन के लिए जैसे एनएम) के दौरान कम आत्मीयता संकेतक के tection सीमा,. प्लाज्मा झिल्ली permeabilization के 32 के साथ संयोजन में (3) हूँ एस्टर लोड हो रहा है. कोई शेष साइटोसोलिक सीए 2 + सूचक एक कृत्रिम इंट्रासेल्युलर बफर में एक "मामूली" डिटर्जेंट (जैसे सैपोनिन) की थोड़ी मात्रा के साथ प्लाज्मा झिल्ली permeabilization के द्वारा हटा दिया जाता है. इस प्रकार, intracellular झिल्ली सीधे प्लाज्मा झिल्ली में "pores के माध्यम से", इंट्रासेल्युलर बफर में आई पी 3 के साथ जैसे को प्रेरित किया जा सकता है. (4) 2 सीए के पूरे सेल विन्यास और एक साथ माप के तहत साइटोसॉल की डायलिसिस + ईआर लुमेन और साइटोसॉल 32,33 में. एक सेल पहले एक कम आत्मीयता सीए 2 + सूचक (जैसे पत्रिका Fura2 के साथ भरी हुई है PM,), ratiometric यूवी प्रकाश. बाद में, एक पैच पिपेट, किसी भी शेष CYT की मदद सेosolic कम आत्मीयता सीए 2 + सूचक एक उच्च आत्मीयता सीए 2 + सूचक (जैसे Fluo-3, दृश्य प्रकाश) से युक्त एक बफर के साथ साइटोसॉल के बाहर dialysed है. इस रणनीति साइटोसोलिक और ईआर व्युत्पन्न संकेतों के साथ रिकॉर्डिंग के लिए सक्षम बनाता है. (5) लक्षित-esterase प्रेरित डाई लोड 8,34. एक Carboxylesterase (CES) ईआर के लुमेन के लिए लक्षित और कम आत्मीयता सीए 2 + संकेतकों का हूँ एस्टर रूप से कुशल फँसाने के लिए एक उच्च esterase गतिविधि प्रदान करता है.

लक्षित-esterase प्रेरित डाई लोड हो रहा है (टेड)

ईआर लुमेन को कम आत्मीयता सीए 2 + संकेतक के लक्ष्य में सुधार करने के लिए, टेड विकसित किया गया था. टेड अभिव्यक्ति निर्माणों के माध्यम से हासिल की है, जो एक ईआर लक्षित माउस carboxylesterase (CES2) (चित्रा 2), की overexpression की आवश्यकता है. एक पुनः संयोजक CES-निर्माण व्यक्त कोशिकाओं में कैल्शियम की हूँ एस्टर फार्म के साथ incubated हैंdicator डाई (Fluo5N-PM, चित्रा 2). फिर, ईआर में, डाई 2 सीए में बदल जाती है + संवेदनशील, झिल्ली अभेद्य 2 सीए इसलिए ईआर लुमेन 8 में एक उच्च एकाग्रता में डाई फँसाने उच्च esterase गतिविधि द्वारा + सूचक जटिल (Fluo5N/Ca 2), , 34. विधि SERCA 17 की नाकाबंदी के बाद उदाहरण के लिए सीधे "रिसाव चैनल" के माध्यम metabotropic, purinergic या ग्लूटामेट रिसेप्टर्स 8,34 के माध्यम से उदाहरण के लिए IiCR-रास्ते के माध्यम से ईआर कैल्शियम रिहाई की जांच करने के लिए और ईआर कैल्शियम कमी कल्पना करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है , 34. हमारे अनुभव करने के लिए कम आत्मीयता सीए 2 + सूचक Fluo5N-AM के वर्तमान टेड डाई लोड रणनीति के साथ उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा उपलब्ध सूचक है. Fluo5N-AM सीए 2 + के लिए एक कम संबंध है (हदबंदी निरंतर कश्मीर डी ~ 90 माइक्रोन, चित्रा 2), लगभग गैर फ्लोरोसेंट अपनी बजे से फार्म में है, लेकिन calciu पर उच्च प्रतिदीप्ति उत्सर्जन प्रदान करता हैमीटर बाध्यकारी 8,34. Fluo5N/Ca 2 जटिल ऐसे FITC, एलेक्सा 488, या EGFP के रूप में मानक रंगों से मेल खाती है ~ 490 एनएम का एक मानक प्रकाश स्रोत, के साथ उत्साहित किया जा सकता है. साइटोसोलिक कैल्शियम संकेतों शायद ही कम माइक्रोन रेंज में एक एकाग्रता तक पहुँचने और इसलिए मुश्किल से साइटोसॉल 35 में Fluo5N से पता चला रहे हैं.

टेड प्रदर्शन में सुधार करने के लिए, कई पुनः संयोजक वेक्टर निर्माणों (चित्रा 3) विकसित किए गए. मूलतः, CES2 की कोडिंग अनुक्रम (RefSeq परिग्रहण संख्या NM_145603, CES2c) और सर्वश्रेष्ठ टेड प्रदर्शन के आधार पर टेड वैक्टर CES के निर्माणों के स्थिर अभिव्यक्ति के साथ मनाया जाता है. नई टेड वैक्टर लाल प्रतिदीप्ति प्रोटीन TagRFP-टी 2 36 के लिए जुड़े हुए CES2 का मूल तत्व व्यक्त करते हैं. ये वैक्टर वे कोशिकाओं transduced की पहचान करने और Fluo5N/Ca 2 में परिवर्तन को सामान्य बनाने के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में लाल प्रतिदीप्ति का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि लाभ है + प्रतिदीप्ति. लाल प्रतिदीप्ति भी उत्तेजना परिस्थितियों में ईआर और ईआर गतिशीलता में परिवर्तन की संरचनात्मक वितरण कल्पना करने के लिए संभावना प्रदान करता है.

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Protocol

इस प्रोटोकॉल टेड सेल लाइनों, hippocampal न्यूरॉन्स और cortical glial कोशिकाओं को लागू परिचय. टेड प्रदर्शन सबसे अच्छा टेड वैक्टर स्थिरतापूर्वक lentiviral वैक्टर द्वारा उदाहरण के लिए, व्यक्त कर रहे है. टेड विधि का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्रा 4 में दिखाया गया है.

1. समाधान की तैयारी

निम्न समाधानों को शुरू करने से पहले तैयार किया जाना चाहिए और संकेत के रूप में जमा किया जा सकता है. हम आम तौर पर निष्फल कांच और प्लास्टिक सामग्री और autoclaved पानी का उपयोग करें.

  1. 125 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 4 MgSO .7 एच 2 ओ, 2 2 CaCl, 1.25 2 4 पीओ नाह एच 2 ओ, 10 glucose.H 2 ओ:. HEPES-घंटी (मिमी) तैयार करें 127 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 4 MgSO .7 एच 2 ओ, 1.25 नाह 2 पीओ 4 एच 2 ओ, 10 glucose.H 2 हे और 0.1 EGTA: कैल्शियम से मुक्त HEPES-घंटी (मिमी) के होते हैं.. ग्लूकोज के बिना इन इमेजिंग समाधान कर सकते हैं ख4 में संग्रहीत ई डिग्री सेल्सियस डी ग्लूकोज के लिए आवश्यक राशि हौसले से उपयोग करने से पहले जोड़ा जाता है.
  2. Hippocampal न्यूरॉन्स में टेड विश्लेषण के लिए, कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) की सिफारिश की है. ACSF (मिमी) से बना है: 127 NaCl, 23 3 NaHCO, 3 KCl, 2.5 NaHPO 4 एच 2 ओ, 25 डी glucose.H 2 हे, 2 2 CaCl, 2 2 MgCl .7 एच 2 DDH में 0. 2 0.
  3. तैयार 5 मिमी की एक एकाग्रता के लिए Fluo5N-AM. Solubilization lyophilized Fluo5N-AM की 50 ग्राम से 20% Pluronic एफ 127 (DMSO में, नमी और प्रकाश से सुरक्षित है, कमरे के तापमान पर संग्रहीत) के 8.9 μl जोड़ने में मदद करने के लिए. तो कम से कम 2 मिनट के लिए एक पानी में स्नान sonicator के माध्यम से Fluo5N-AM solubilize. स्टोर aliquots ए -20 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 μl, प्रकाश और नमी से बचाया.
  4. जरूरत के रूप में प्रतिपक्षी और एगोनिस्ट शेयरों की तैयारी. उदाहरण के लिए: एच 2 ओ (एगोनिस्ट में एक) 10 मिमी एटीपी या ADP (एच 2 ओ, purinergic रिसेप्टर्स की metabotropic सक्रियण में), ख) 10 मिमी carbacholमुस्कारिनिक acetylcholine रिसेप्टर), ग) DMSO में 30 मिमी cyclopiazonic एसिड (सीपीए) (SERCA के अवरोधक), घ) पीबीएस में 50mm DHPG (mGluR मैं और mGluR 5 metabotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर agonist), ई) एच में 10 मिमी ग्लूटामेट की DMSO में 2 हे, च) DMSO के (ionophore), ग्राम में 1 मिमी ionomycin) 5 मिमी thapsigargin (SERCA की उच्च आत्मीयता अवरोधक). -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots
  5. Lentiviral वैक्टर: इस प्रोटोकॉल lentiviral टेड अभिव्यक्ति वेक्टर कणों का उपयोग भी शामिल है. उनके उत्पादन और भंडारण इस प्रोटोकॉल का हिस्सा नहीं है. हम सेल लाइनों, glial कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के लिए पुनः संयोजक Carboxylesterases के हस्तांतरण के लिए दूसरी पीढ़ी के lentiviral वैक्टर का उपयोग करें. अभिव्यक्ति वेक्टर FUGW 37, और पैकेजिंग प्लास्मिड pCMVΔR8.91 या psPAX2 और pMD2.G 38,39 प्लाज्मिड छद्मरूप पर हमारी lentiviral प्रणाली अड्डों चेतावनी:. पुनः संयोजक स्वयं निष्क्रिय lentiviral वैक्टर के साथ काम सावधान की आवश्यकता है पर विचारजैव सुरक्षा दिशा निर्देशों का ध्यान. कई देशों में, इन वैक्टर biohazard जोखिम समूह 2 के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं. उल्लेख करने के लिए और अधिक जानकारी के लिए http://www.addgene.org/lentiviral/ .

2. तैयारी और माउस hippocampal न्यूरॉन्स के वायरल संक्रमण

  1. लगभग 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में 20 सेमी व्यास (पकवान प्रति 100 coverslips) 1x एक गिलास पेट्री डिश में कांच coverslips धो लें. अंत में, 2 मिनट के लिए 100% इथेनॉल (देहात) जोड़ें. अवशिष्ट इथेनॉल निकालें और एक बाँझ हुड के तहत coverslips सूखी.
  2. B27 1:50 साथ neurobasal मध्यम, Glutamax 1:100, और N2 पूरक 1:100:, (ख) पूरा मध्यम B27 के 01:50 के साथ (एक) neurobasal मध्यम: हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन संस्कृतियों के लिए मीडिया के दो अलग अलग प्रकार तैयार करें. बाँझ छानना मीडिया और उपयोग करें जब तक सेल इनक्यूबेटर में उन्हें दुकान.
  3. विच्छेदन के लिए पहले एक दिन, coverslips के पहले प्रत्येक में एक बाँझ 10 मिमी coverslip रखकर तैयार हैंअच्छी तरह से एक 4 अच्छी तरह से सेल संस्कृति पकवान की. बाद में, ध्यान से कोट प्रत्येक 80-100 μl 0.1% पाली एल lysine साथ coverslip और रात में एक मशीन में बर्तन की दुकान है.
  4. विच्छेदन और सेल संस्कृति के दिन में, 100 μl HBSS के साथ coverslips तीन बार धोने के साथ शुरू और प्रत्येक coverslip के लिए 100 μl neurobasal मध्यम हस्तांतरण. संतुलन के लिए एक मशीन (चूहों के विच्छेदन के दौरान जैसे) में बर्तन रखें.

विच्छेदन

हम के रूप में हमारे संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित यूरोपीय संघ के दिशा निर्देशों के अनुसार चूहों के साथ अपने प्रयोगों प्रदर्शन.

  1. कुल मस्तिष्क निकालें और हिप्पोकाम्पी द्विपक्षीय काटना.
  2. ध्यान से किसी भी तानिका और हिप्पोकैम्पस और जगह के अलावा अन्य ऊतक एक हिप्पोकैम्पस 450 μl HBSS युक्त एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक को हटा दें. हिप्पोकाम्पी के लिए पर्याप्त संख्या में पृथक किया गया है जब तक बर्फ पर ऊतक स्टोर.
<पी वर्ग = "jove_step"> सेल संस्कृति

  1. प्रत्येक ट्यूब 50 μl 1% trypsin (वर्थिंगटन) जोड़ें और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में उन्हें सेते हैं. कभी कभी ट्यूबों हिलाएँ. पाचन प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, प्रत्येक ट्यूब से 50 μl 1% trypsin अवरोध करनेवाला जोड़ने और ट्यूब कई बार पलटना.
  2. हिप्पोकाम्पी तरल के हस्तांतरण से परहेज एक 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब से 5 तक की सभी ऊतक स्थानांतरण. 5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा B27 मध्यम (एक) जोड़ें.
  3. ध्यान से नीचे pipetting और से एक आग पॉलिश पाश्चर कांच पिपेट का उपयोग ऊतक Triturate चेतावनी:. हवाई बुलबुले से बचें!
  4. 3 मिनट के लिए 400 XG साथ स्पिन, सतह पर तैरनेवाला aspirate और 5 मिलीलीटर B27 मध्यम (एक) में सेल गोली resuspend.
  5. एक 1000 μl प्लास्टिक फिल्टर टिप की मदद से दो बार तो कांच विंदुक के साथ एक बार फिर से ऊतक Triturate, और. कदम के रूप में 2.9 और 2.10 में वर्णित इस कार्य करें.
  6. पिछले Centrifugation के बाद, 2 मिलीलीटर पूर्ण mediu में सेल गोली resuspendएक 200 μl प्लास्टिक फिल्टर टिप के साथ कोशिकाओं मीटर (ख) और triturate. एकल कक्ष निलंबन से बचे हुए सेल clumps को अलग करने के लिए, सेल clumps 1-2 मिनट के लिए बसने करते हैं.
  7. कक्षों की गणना और वायरल संक्रमण के लिए आवश्यक कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना. टेड इमेजिंग के लिए 10 मिमी coverslip प्रति 25,000 कोशिकाओं का उपयोग करें.
  8. एक नियंत्रण के रूप में चढ़ाना अतिरिक्त 25,000 गैर transduced कोशिकाओं को इस बिंदु पर की सिफारिश की है.

वायरल संक्रमण

  1. एक ताजा 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब और 400 x जी पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में वायरल संक्रमण के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण.
  2. तैरनेवाला Aspirate और 300 μl मध्यम में कोशिकाओं resuspend (ख)
  3. संक्रामक lentiviral टेड अभिव्यक्ति वेक्टर कणों का एक उचित मात्रा में जोड़ें और बाज़ ट्यूब 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े हो जाओ.
  4. चढ़ाना (प्रत्येक 10 मिमी coverslip के लिए 100 μl) के लिए आवश्यक अंतिम मात्रा को पूरा मध्यम (ख) के साथ ट्यूब भरें, cov से मध्यम aspirateerslip, और तुरंत प्रत्येक coverslip पर 100 μl सेल निलंबन जगह है.
  5. सभी कोशिकाओं नीचे बसे (लगभग 2 घंटा) और वे 2 मिलीलीटर मध्यम (ख) होते हैं जब तक ध्यान से बर्तन को भरने जब तक इनक्यूबेटर में बर्तन रखें.
  6. न्यूरॉन्स कम से कम एक सप्ताह के लिए हो जाना. हर हफ्ते माध्यम के 50% बदलें.

3. माउस Cortical glial कोशिकाओं की संस्कृति और वायरल संक्रमण

तैयारी

  1. 4 मिलीलीटर 0.5 एनजी / एमएल पाली साथ एक T75 सेल संस्कृति फ्लास्क के बेसल glia माध्यम (10% FCS के साथ DMEM/F12 की 1:1 मिश्रण, 5% एच एस, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.45% ग्लूकोज) और कोटिंग तैयारी द्वारा शुरू -डीएल ओर्निथिन hydrobromide (पोर्न) (150 मिमी बोरिक एसिड समाधान, पीएच 8.35 में पतला). 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद या रात में, HBSS के साथ सेल संस्कृति फ्लास्क तीन बार धोना और B27 1:50 और 10 एनजी / एमएल EGF युक्त 18 मिलीलीटर बेसल glia मध्यम जोड़ें. इनक्यूबेटर में सेल संस्कृति फ्लास्क (3 घंटा) संतुलित.
<पी वर्ग = "jove_step"> विच्छेदन

  1. हम के रूप में हमारे संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित यूरोपीय संघ के दिशा निर्देशों के अनुसार चूहों के साथ अपने प्रयोगों प्रदर्शन.
  2. एक पी 5-P7 माउस के मस्तिष्क काटना और 2.5 में वर्णित के रूप में दोनों गोलार्द्धों से हिप्पोकैम्पस और तानिका हटा दें.
  3. ललाट प्रांतस्था काटना, कई छोटे टुकड़ों में काट और HBSS युक्त एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में उन्हें इकट्ठा. बर्फ पर ट्यूब की दुकान और सेल संस्कृति हिस्सा करने के लिए आगे बढ़ें.

सेल संस्कृति

  1. ट्यूब से एक आग पॉलिश कांच विंदुक का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब सभी ऊतक स्थानांतरण.
  2. 5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा बेसल मध्यम जोड़ें और एक आग पॉलिश कांच विंदुक के साथ नीचे कई बार pipetting और से ऊतक triturate. 3 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation के बाद, मध्यम aspirate, और 5 मिलीग्राम बेसल मध्यम में सेल गोली resuspend.
  3. दो बार 3.5 कदम दोहराएँ.
  4. थी के बादतीसरी अपकेन्द्रण, B27 (1:50) और 10 एनजी / एमएल EGF युक्त 2 मिलीलीटर बेसल glia मध्यम में सेल गोली resuspend.
  5. एक बार फिर से Titruate और तैयार T75 सेल संस्कृति फ्लास्क सेल निलंबन हस्तांतरण और कोशिकाओं को 3-4 दिनों के लिए बढ़ता है.

Glial कोशिकाओं (संस्कृति में 3-4 दिनों के बाद) की धुलाई:

  1. 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें और दूसरे हाथ में कसकर पकड़ जबकि सख्ती, नल या धीरे अपने हाथ से कुप्पी के लिए कई बार मारा. इस कदम सेल मलबे और सेल समूहों द्वारा संस्कृति से हटा रहे हैं.
  2. पीबीएस Aspirate और B27 (1:50) और 10 एनजी / एमएल EGF युक्त ताजा बेसल glia मध्यम जोड़ें. कोशिकाओं के 80% confluency तक पहुंचने तक आगे 5-7 दिनों के लिए संस्कृति खेती.

बंटवारे, पारगमन और glial कोशिकाओं के अंतिम बोने:

  1. 100 μl पाली डी lysine के साथ कोट 10 मिमी coverslips: और सेते (स्टॉक समाधान 0.1%, 1/50 विज्ञापन 20 माइक्रोग्राम / पीबीएस या HBSS में मिलीलीटर पतला)उन्हें रात में एक मशीन में. HBSS के साथ coverslips तीन बार धोएं और 100 μl बेसल glia मध्यम जोड़ें. इनक्यूबेटर में coverslips (3 घंटा) संतुलित.
  2. 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ दो बार glial कोशिकाओं को धो लें, पीबीएस महाप्राण (व्यंजन), और 3 मिलीग्राम trypsin (TrypLE, undiluted) जोड़ें. ऊपर 1 मिनट के लिए कोशिकाओं Trypsinize चेतावनी:. से अधिक trypsinization से बचें. सभी कोशिकाओं की सामान्य रूप से 80% से अधिक 1 मिनट के बाद अलग और यह स्वस्थ कोशिकाओं के कई लाख है करने के लिए पर्याप्त है.
  3. 10 मिलीलीटर बेसल glia मध्यम जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो, 3 मिनट के लिए 300 XG पर एक 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब, अपकेंद्रित्र सेल निलंबन हस्तांतरण. तैरनेवाला Aspirate और 5 मिलीग्राम बेसल glia मध्यम में सेल गोली resuspend.
  4. फिर, स्पिन और के रूप में कदम 3.15 में वर्णित महाप्राण, तो 5 मिलीलीटर बेसल Glia मध्यम में कोशिकाओं resuspend.
  5. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं की संख्या स्थानांतरण. 10 4-2x10 4 glial कोशिकाओं एक 10 मिमी coverslip के लिए पर्याप्त हैं. आमतौर पर, निलंबन वॉल4 अच्छी तरह से पकवान कम से कम 200 μl है एक के लिए कोशिकाओं transduce को Ume. कोशिकाओं को lentiviral टेड अभिव्यक्ति वेक्टर कणों का एक उचित मात्रा में जोड़ें और 10 मिनट के लिए आरटी पर उन्हें सेते हैं. फिर बोने की मात्रा (coverslip प्रति 100 μl) को बेसल glia माध्यम से निलंबन को भरने.
  6. लगभग 2 घंटे के लिए coverslip और सेते प्रति संक्रमित कोशिकाओं का बीज 100 μl, तो 2 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा B27 1:50 और 10 एनजी / एमएल EGF युक्त बेसल glia मध्यम जोड़ें.
  7. चढ़ाना के बाद दिन 3-7 पर प्रयोगों के लिए कोशिकाओं का उपयोग आदर्श संस्कृति स्थितियों के लिए.

4. रिपोर्टर सेल लाइन की पीढ़ी और संस्कृति

टेड संवाददाता सेल लाइनों हेला, BHK21, HEK293 और एसएच SY5Y के आधार पर स्थापित किए गए थे. यहाँ हम HELA कोशिकाओं के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, लेकिन प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से किसी भी अन्य सेल लाइन को हस्तांतरित किया जा सकता है.

स्थिर हेला सेल लाइन का सृजन

  1. एक जंगली प्रकार हेला सेल लाइन और हस्तांतरण 100,000 ग भाजितएक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 200 μl की एक मात्रा में Ells.
  2. ट्यूब को lentiviral टेड अभिव्यक्ति वेक्टर कणों का एक उचित मात्रा में जोड़ें और आरटी पर 10 मिनट के लिए सेल वायरस निलंबन सेते हैं. फिर 3 दिनों के लिए एक 30 मिमी पकवान और सेते में 2 मिलीलीटर मध्यम की कुल मात्रा (DMEM, 10% एफसीएस, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) में बीज कोशिकाओं.
  3. पीबीएस के साथ एक बार धोने के बाद, मध्यम aspirate और 500 μl trypsin (TrypLE, पीबीएस में 02:03) जोड़ें. लगभग लिए सेते हैं. फिर 3 मिनट और 3 मिलीलीटर मध्यम जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो. 3 मिनट के लिए 400 XG पर एक 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब और अपकेंद्रित्र में निलंबन स्थानांतरण.
  4. 200 μl मध्यम में सेल गोली Resuspend और 4.2 में वर्णित के रूप में फिर से lentiviral कणों के साथ कोशिकाओं को संक्रमित. फिर, 10 मिलीलीटर मध्यम में एक T25 सेल संस्कृति फ्लास्क में बीज कोशिकाओं.
  5. 60-80% की एक confluency तक पहुँच जाता है जब तक कोशिकाओं को विकसित. फिर संस्कृति विभाजित.

टेड संवाददाता सेल लाइनों

  1. टेड संवाददाता सेल लाइनों को बनाए रखने जा सकता हैकिसी भी मानक मध्यम, जैसे DMEM के 5% या 10% FCS और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त एड में प्रयोग किया जाता है.
  2. बाँझ 10 मिमी coverslips (ऊपर देखें), उदा coverslip प्रति 10,000 से 20,000 कोशिकाओं से युक्त एक 4 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं की प्लेट एक उपयुक्त संख्या.
  3. टेड इमेजिंग के लिए उन्हें प्रयोग करने से पहले कम से कम दो दिनों के लिए कोशिकाओं को विकसित.

5. एक औंधा माइक्रोस्कोप पर लाइव इमेजिंग प्रक्रिया के लिए तैयारी

    1. Prewarm कमरे के तापमान को HEPES-घंटी और डी ग्लूकोज जोड़ें.
    2. Prewarm ACSF (2 सीए बिना + और ​​2 मिलीग्राम +) कमरे के तापमान को और डी ग्लूकोज जोड़ें. 5 मिनट के लिए carbogen साथ ACSF Aerate. फिर 2 मिमी प्रत्येक के अंतिम सांद्रता 2 CaCl और 2 MgCl के 1 एम स्टॉक समाधान जोड़ने.
  2. रहते इमेजिंग माइक्रोस्कोप और सभी कंप्यूटर प्रोग्राम प्रारंभ करें.
  3. एक "डमी" इमेजिंग कक्ष पर छिड़काव आरंभ और ट्यूब प्रणाली संतुलित करना.
  4. खुर्दबीन मंच में इनलाइन समाधान हीटर और इमेजिंग कक्ष Prewarm. एक हीटिंग डालने में इमेजिंग कक्ष को ठीक करें.
  5. आप डाई लोडिंग प्रक्रिया शुरू डिग्री सेल्सियस से पहले 32-37 के लिए प्रणाली संतुलित चेतावनी:. हम खुर्दबीन मंच की रक्षा करने के उद्देश्यों और elastomeric सिलिकॉन शीट (1 मिमी) के आसपास बाल संबंधों का उपयोग माइक्रोस्कोप प्रणाली में छिड़काव समाधान के आकस्मिक प्रवाह से बचने के लिए.

6. सेल प्रकार किसी की डाई लोड हो रहा है

  1. 100 μl prewarmed इमेजिंग समाधान (HEPES-घंटी या ACSF) में Fluo5N-AM के 1 विभाज्य (1.3 देखें) Resuspend.
  2. Solubilize 90 सेकंड के लिए एक पानी में स्नान sonicator में इमेजिंग समाधान (HEPES-घंटी या ACSF) में Fluo5N-AM.
  3. या अच्छी तरह से एक के लिए 24 अच्छी तरह से थाली और हस्तांतरण 400 μl prewarmed इमेजिंग समाधान - एक ताजा 4 का उपयोग करें. एक 5 माइक्रोन समाधान के 500 μl में आने के लिए अच्छी तरह से एक ही करने के लिए डाई समाधान जोड़ें.
  4. कोशिकाओं (उदाहरण के साथ एक coverslip ध्यान जगहकुएं में व्यास में 10-18 मिमी), ऊपर का सामना करना पड़ कोशिकाओं.
  5. 37 पर एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में समय का एक उचित अवधि के लिए सेते डिग्री सेल्सियस (इस बीच खुर्दबीन मंच पर इमेजिंग सेटिंग्स तैयार). विशिष्ट डाई लोडिंग बार 10-20 मिनट न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं 7-15 मिनट के लिए और सेल लाइनों के लिए कर रहे हैं.

महत्वपूर्ण: डाई लोडिंग समय और एकाग्रता डाई सेल प्रकार, सेल घनत्व, और प्रयोग विशिष्ट जरूरतों पर निर्भर करती है! डाई की उपस्थिति में लंबी ऊष्मायन बार, कोशिकाओं को नुकसान विशेष रूप से प्राथमिक न्यूरॉन्स और प्राथमिक glial कोशिकाओं और यह शारीरिक उत्तेजनाओं को जवाबदेही के लिए महत्वपूर्ण है हो सकता है. लंबी ऊष्मायन समय (उदाहरण के लिए 30 मिनट) केवल छोटे subcellular संरचनाओं, जैसे ठीक neurites या कांटा में ईआर कैल्शियम के वितरण की जांच के लिए ईआर कैल्शियम स्थानीयकरण प्रयोगों के लिए उपयोगी हो जाएगा. कुछ प्रयोगों में, इमेजिंग समाधान के साथ 1/3 मध्यम विकास का एक मिश्रण Fluo5N-AM के दौरान कोशिकाओं की रक्षा करने में मदद मिल सकती हैलोड हो रहा है.

  1. तुरन्त, अच्छी तरह इमेजिंग समाधान युक्त एक और सेल संस्कृति (HEPES-घंटी या ACSF) को coverslip के हस्तांतरण और इमेजिंग कक्ष में कोशिकाओं बढ़ते शुरू.

7. Confocal खुर्दबीन स्कैनिंग एक उल्टे लेजर के साथ ईआर कैल्शियम लाइव सेल इमेजिंग

  1. एक इमेजिंग चैम्बर के लिए उच्च वैक्यूम तेल लागू करने के लिए एक पेंट ब्रश का प्रयोग करें. तेल छिड़काव चैम्बर के तल पर coverslip के fixate करने की जरूरत है. हम इस प्रकार प्रति मिनट 15 गुना बफर विनिमय तक की उच्च छिड़काव गति की अनुमति, एक छोटी मात्रा के साथ 10-12 मिमी coverslips के लिए स्वयं बनाया इमेजिंग कक्षों का उपयोग करें. 18 मिमी coverslips के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छिड़काव चैम्बर, वार्नर उपकरणों (आर सी 49FS) से खरीदा जा सकता है. इस कक्ष भी न्यूरॉन्स के क्षेत्र उत्तेजना सक्षम बनाता है.
  2. Fluo5N लोड कोशिकाओं के साथ coverslip उठाओ और इमेजिंग समाधान के साथ कवर कोशिकाओं रखने की कोशिकाओं पर इमेजिंग समाधान (50-100 μl) की एक छोटी सी बूंद जोड़ें.उल्टा coverslip के मुड़ें और इमेजिंग कक्ष में कोशिकाओं माउंट. सिलिकॉन गोंद में coverslip प्रेस करने के लिए, (उदाहरण के लिए क्यू नुस्खे) एक कपास कली का उपयोग करें.
  3. रुई से कांच coverslip के नीचे से दूर अवशिष्ट बफर साफ कर लें चेतावनी:. उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक तेल उद्देश्य का उपयोग करते समय सावधानी से दूर अवशिष्ट नमी को पोंछ. अवशिष्ट नमक सबसे अच्छा पानी से निकाल दिया जाता है. तेल की दुर्घटना धब्बा एसीटोन या शुद्ध इथेनॉल के साथ हटाया जा सकता है.
  4. प्रयोगात्मक इमेजिंग चैम्बर के साथ एक्सचेंज "डमी" इमेजिंग कक्ष. निरंतर छिड़काव से 5-10 मिनट के लिए कोशिकाओं को धो लें.
  5. 5 के लिए कोशिकाओं को धो - 10 मिनट निरंतर छिड़काव द्वारा.
  6. सेल के चयन के लिए लेजर रोशनी, उच्च दर स्कैन (2-4 हर्ट्ज), एक छोटी सी छवि आकार, और एक उच्च लाभ की एक न्यूनतम राशि का उपयोग करें.
  7. चेतावनी: Fluo5N लेबल कोशिकाओं के चयन के लिए epifluorescen साथ प्रकाश या प्रत्यक्ष रोशनी का अधिक उपयोग नहीं करतेटी प्रकाश. Fluo5N/Ca 2 की तेज रोशनी + परिसरों 2-4 सेकंड (चित्रा 5) के भीतर ईआर विशिष्ट प्रतिदीप्ति का पूरा नुकसान का कारण बनता है.
  8. नियोजित प्रयोग के अनुसार माइक्रोस्कोप सेट करें. उन्मुखीकरण के लिए, विभिन्न टेड वैक्टर के साथ इमेजिंग के लिए प्रतिनिधि सेटिंग 1 टेबल में दिए गए हैं. और एक वर्णक्रमीय डिटेक्टर सिस्टम, confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग उल्टे लेजर के लिए, हम लेजर डायोड (559 एनएम, 20 मेगावाट 473 एनएम, 15 मेगावाट) के साथ सुसज्जित है कि एक FluoView 1000 confocal प्रणाली के साथ संयुक्त एक ओलिंप IX81 माइक्रोस्कोप का उपयोग करें.
  9. प्रयोग दस्तावेज़ की शुरुआत में उच्च संकल्प एक्स, yz छवि के ढेर से ब्याज की कोशिकाओं.
  10. विशिष्ट प्रयोगात्मक परिस्थितियों में ईआर कैल्शियम गतिशीलता की निगरानी के लिए एक्स, yt इमेजिंग प्रदर्शन करना. हमारे सिस्टम के लिए विशिष्ट सेटिंग्स 2 तालिका में सूचीबद्ध हैं.
  11. इमेजिंग समाधान के साथ निरंतर छिड़काव के तहत ईआर कैल्शियम में परिवर्तन की निगरानी. ठेठ बफर विनिमय दरों ई कर रहे हैंxemplarily: (क) SERCA ब्लॉक द्वारा सेल धोने और दुकान कमी: 1.5 मिलीग्राम / मिनट, (ख) एटीपी / DHPG उत्तेजना: 3 मिलीग्राम / मिनट.
  12. 12 बिट (4096 ग्रे मान) के साथ रियायत के तौर पर डिजिटल छवियों मोल. Fluo5N/Ca 2 के समानांतर इमेजिंग के लिए + और ​​आरएफपी, 8 बिट छवियों (256 ग्रे मान) डेटा अतिप्रवाह से अपने सिस्टम बचाव हो सकता है.
  13. एक ImageJ संगत प्रारूप (उदाहरण के लिए झगड़ा) में सेल समय श्रृंखला छवियों (एक्स, YT) या 3 डी छवि के ढेर (एक्स, yz) (Fluo5N/Ca 2 परिसरों के सेलुलर वितरण के लिए) रहते स्टोर.

8. छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण

  1. ImageJ कार्यक्रम में छवि ढेर खोलें. ImageJ से जब पूछा बहुरंगा इमेजिंग के मामले में, आरजीबी चैनलों विभाजित.
  2. (उदाहरण के लिए एक तीव्रता बनाम समय की साजिश की मदद से) छवि के ढेर के एक सावधान परीक्षा द्वारा ब्याज (आरओआई) के अपने क्षेत्र (ओं) को पहचानें
  3. एक आरओआई में औसत पिक्सेल तीव्रता (एफ रॉ) बाहर पढ़ने के लिए समय सीरीज विश्लेषक प्लगइन का उपयोग करें. Dependinउद्देश्य पर जी, पूरा ईआर या परिधीय सेल क्षेत्रों की dendrites के ईआर उदा ईआर के छोटे क्षेत्रों या तो चारों ओर ROIs आकर्षित. इसके अलावा पृष्ठभूमि घटाव के लिए कोशिकाओं के बिना क्षेत्रों में 1-3 रॉय शामिल हैं.
  4. पृष्ठभूमि रॉय का मतलब प्रतिदीप्ति मूल्य की गणना की औसत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (एफ ख) की गणना और एफ रॉय मूल्य प्राप्त करने के लिए एफ कच्चे मूल्यों से पृष्ठभूमि मूल्य एफ ख घटाना.
  5. एक आराम की स्थिति में प्रत्येक रॉय के लिए दस से 30 फ्लोरोसेंट मूल्यों का मतलब मूल्य की गणना के द्वारा कोशिकाओं के बेसल प्रतिदीप्ति है जो एफ 0, गणना.
  6. सूत्र ने ΔF / एफ 0 से प्रतिदीप्ति में पृष्ठभूमि को सही रिश्तेदार परिवर्तन की गणना:

1 समीकरण

  1. में मौजूद रिश्तेदार परिवर्तन प्रतिदीप्तिशाफ़्ट और एक्स अक्ष के लिए समय के लिए ΔF / एफ 0 के साथ एक का पता लगाने के रूप में nce.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल मुक्त ईआर कैल्शियम की प्रत्यक्ष इमेजिंग के लिए एक गैर विघटनकारी दृष्टिकोण प्रदान करता है. कम आत्मीयता सिंथेटिक सीए 2 + संकेतक जारी किया और लक्षित एक ईआर की मदद, पुनः संयोजक esterase एंजाइम गतिविधि के साथ ईआर लुमेन में फंस रहे हैं. ईआर लुमेन के लिए सीए 2 + सूचक रंगों की बेहतर लदान ईआर कैल्शियम दुकान गतिशीलता का एक सीधा और तेज इमेजिंग सक्षम बनाता है.

टेड के लिए सेल प्रकार

विधि की व्यवहार्यता सेल लाइनों BHK21, HEK293 34, हेला 17, एसएच SY5Y, सुसंस्कृत astrocytes 8,40 और प्राथमिक hippocampal और cortical न्यूरॉन्स 8,34,41 में दिखाया गया है. हमारे प्रयोगों में, टेड एक अपेक्षाकृत कमजोर प्रमोटर (जैसे ubiquitin प्रमोटर) 35 ​​का उपयोग कर स्वयं निष्क्रिय lentiviral वैक्टर 37,39 से रियायत के तौर पर, अच्छी तरह से टेड ​​निर्माणों स्थिरतापूर्वक व्यक्त कर रहे हैं काम करता है. अन्य, मजबूत प्रमोटरों जांच के अधीन हैं.

Fluo5N साथ सफल टेड लोड परमाणु क्षेत्र 34,41 से बाहर बख्शा है जो ईआर लुमेन के एक स्पष्ट और चमकदार धुंधला प्रदान करता है. आराम राज्यों में, Fluo5N/Ca 2 जटिल लेबल इसलिए, यह ईआर लुमेन में मुक्त कैल्शियम के क्षेत्रीय वितरण का प्रतिनिधित्व करता है, Fluo5N से बंधे जब कैल्शियम का स्थानीयकरण का प्रतिनिधित्व करता है. चित्रा 6 में, Fluo5N/Ca 2 के confocal छवियों + परिसरों और लाल CES2 का टैग आरएफपी-टी 2 लेबल HELA कोशिकाओं, cortical astrocytes और hippocampal न्यूरॉन्स में दिखाए जाते हैं. चित्रा 6C सेल में फ्लोरोसेंट सीए 2 + सूचक परिसर से पता चलता है शरीर के साथ ही hippocampal न्यूरॉन्स की neurites. इस बल्कि छोटे प्रक्रियाओं में + संकेतों (भी 34,35 देखें) 2 सीए की परीक्षा में सक्षम बनाता है.

कुछ अनुभव whe मनाया जाएगा कि एक साइटोसोलिक लेबल से ठेठ ईआर लेबल भेद करने की जरूरत हैएन कोशिकाओं के क्षतिग्रस्त या अस्वस्थ रहे हैं. साइटोसोलिक, अंतर्जात esterases भी cytosol और कैल्शियम प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से लीक कर रहा है जब नाभिक का एक बहुत ही उज्ज्वल धुंधला की ओर जाता है जो Fluo5N, जारी है. Fluo5N/Ca 2 की साइटोसोलिक धुंधला + टेड लेबल कोशिकाओं कोशिकी कैल्शियम की उपस्थिति में ionophore ionomycin, चित्रा (7) के साथ व्यवहार कर रहे हैं जब भी मनाया जाता है.

ईआर से कैल्शियम रिहाई के प्रत्यक्ष इमेजिंग

टेड के एक प्रमुख आवेदन ईआर दुकान कमी 17,34 के प्रत्यक्ष दृश्य है. 8 चित्रा में, हम लाल CES2 व्यक्त hippocampal न्यूरॉन्स के साथ प्रदर्शन एक प्रतिनिधि प्रयोग दिखा. लाल CES2 साथ न्यूरॉन्स perinuclear क्षेत्र में Fluo5N की उच्च मात्रा (8 चित्रा में तीर) को समृद्ध. SERCA अवरोधक सीपीए छिड़काव द्वारा लागू किया जाता है, ईआर कैल्शियम की दुकान की एक तेजी से कमी (चित्रा 8B) मनाया जाता है. यहां हम पेशन्यूरॉन्स 12 बिट के साथ imaged हैं जब प्राप्त कर रहे हैं कि कच्चे मान (y-अक्ष). इमेजिंग शर्तों 2 तालिका में सूचीबद्ध हैं. टेड न्यूरॉन्स के लिए लागू किया जाता है जब मनाया जाता है कि रॉय प्रति मतलब प्रतिदीप्ति घनत्व में भारी बदलाव को नोट करें. टेड का उपयोग कर न्यूरॉन्स में ईआर कैल्शियम रिहाई का विश्लेषण अन्य प्रयोगों के लिए, हम पहले से ही विस्तार 8,34,35 में चर्चा की गई थी, जो पहले के प्रयोगों का उल्लेख करना चाहते हैं. संक्षेप में, इन विट्रो में न्यूरॉन्स में टेड उल्टे लेजर confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी 8,34 द्वारा महान विस्तार में SERCA के प्रति संवेदनशील ईआर कैल्शियम दुकान कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है और सफलतापूर्वक IiCR 34 प्रेरित mGluR1 / 5 के तेज इमेजिंग (15 हर्ट्ज) के लिए आवेदन किया था.

9 चित्रा एक 20x पानी उद्देश्य का उपयोग कम संकल्प पर छिड़काव प्रणाली के माध्यम से एटीपी 200 माइक्रोन से प्रेरित इन विट्रो में माउस कॉर्टिकल astrocytes के साथ एक ठेठ प्रयोग से पता चलता है. Lentiviral संक्रमण के बाद, यहाँ दिखाया कोशिकाओं व्यक्त लालएक ubiquitin प्रमोटर द्वारा संचालित है जो CES2,. गति स्कैनिंग ~ 2 हर्ट्ज और दोनों चैनलों (Fluo5N/Ca 2 + और ​​लाल CES2 संलयन प्रोटीन) एक साथ (लाइन में) imaged किया गया था. प्रयोग की शुरुआत में glial कोशिकाओं अभिव्यक्ति निर्माणों और Fluo5N-AM के साथ अच्छा लदान के साथ अच्छा संक्रमण से पता चला है. विश्लेषण किया गया है कि ROIs 9A चित्रा में डाला जाता है. एक रॉय प्रतिदीप्ति (बड़ी), रॉय 1-2 पूरा कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति उपाय पृष्ठभूमि को मापने के लिए निर्धारित किया गया था, रॉय 3 सेल और रॉय 4 पूरा दृश्य क्षेत्र के चारों ओर खींचा था की सिर्फ ईआर को शामिल किया गया. फौरन Fluo5N/Ca 2 की एटीपी प्रतिदीप्ति साथ उत्तेजना के बाद + परिसरों अचानक नीचे ईआर से + रिहाई 2 सीए की वजह से गिरा दिया. अंत में, ईआर आंशिक रूप से फिर से कैल्शियम के साथ refilled है. इसके साथ ही, आरएफपी के प्रतिदीप्ति लगातार विरंजन मामूली का एक परिणाम (9B चित्रा, कम पैनल) के रूप में कम हो जाती है. Fluoresc में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व निशान खिलाडि़यों तीव्रता (चित्रा 9C) टेड का एक महत्वपूर्ण नुकसान को इंगित. कई (सभी नहीं) प्रयोगों में Fluo5N-परिसरों की उच्च मात्रा में उत्तेजना के दौरान खो रहे हैं. एक परिणाम के रूप में, प्रतिदीप्ति मूल्यों प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता के स्तर पर वापस नहीं आते हैं.

चित्रा 10 Fluo5N/Ca 2 + द्वारा लेबल और एटीपी के साथ प्रेरित उच्च संकल्प में एक CES2 संक्रमित BHK21 सेल, पता चलता है. BHK21 कोशिकाओं ईआर कैल्शियम विश्लेषण 31 के लिए एक प्रारंभिक मॉडल सेल प्रणाली के रूप में कार्य किया. ईआर कैल्शियम रिहाई और दुकान refilling ईआर नलिकाओं के ठीक संरचनाओं में कल्पना की है कि ध्यान दें. संरचनाओं 512 x 512 पिक्सेल, कोंफोकल पिनहोल के लिए हवादार डिस्क 1 सेटिंग, के साथ और एक 63x तेल उद्देश्य के साथ, धीमी गति (~ 0.2 हर्ट्ज) पर imaged किया गया था.

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चित्रा 1. ईआर संकेत कैल्शियम का अवलोकन. ईआर कैल्शियम रिहाई ऐसे Sec61 जटिल ईआर intramembrane ताकना के रूप में "लीक" चैनलों के कारण होता है. जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCR) तो आईपी 3 प्रेरित कैल्शियम रिहाई (IiCR) का कारण बनता है जो आईपी 3 उत्पादन को प्रोत्साहित. ईआर कैल्शियम रिहाई STIM परिसरों से लगा और टीआरपी परिवार और / या उरई कैल्शियम चैनल के आयन चैनल से दुकान संचालित कैल्शियम प्रविष्टि (SOCE) को प्रेरित करता है. वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल (सीए वी) ryanodine रिसेप्टर्स (RyR) द्वारा या तो प्रत्यक्ष प्रोटीन बातचीत (कंकाल की मांसपेशी) या शारीरिक बातचीत (हृदय की मांसपेशी कोशिकाओं, न्यूरॉन्स) द्वारा तेजी से कैल्शियम प्रेरित कैल्शियम रिहाई (CiCR) मध्यस्थता. ईआर कैल्शियम की कमी गतिशील SERCA पंप (sarcoplasmic-जालिका कैल्शियम ATPase) की कार्रवाई से बचाया है.

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चित्रा 2. लक्षित esterase प्रेरित डाई लोड हो रहा है (टेड) का सिद्धांत. एक carboxylesterase की लक्षित overexpression ईआर में एक उच्च esterase गतिविधि (CES2) प्रदान करता है. esterase ईआर में फंस बनी हुई है कि एक कैल्शियम के प्रति संवेदनशील, फ्लोरोसेंट डाई करने Fluo5N-AM acetoxymethylester डाई धर्मान्तरित. Fluo5N कैल्शियम आयनों के लिए एक कम संबंध है. इसलिए, आराम की शर्तों के तहत, फ्लोरोसेंट Fluo5N/Ca 2 परिसरों को प्राथमिकता कैल्शियम एकाग्रता cytosol में से लगभग 1,000 गुना अधिक है, जहां ईआर में बनते हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रतिनिधि टेड वेक्टर निर्माणों CES2.: माउस CES2 के मूल संस्करण. CES2 ऑप्ट 43: ईआरसंकेत पेप्टाइड विमर्श और ईआर प्रतिधारण आकृति शास्त्रीय KDEL-ईआर प्रतिधारण और घुलनशील ईआर प्रोटीन की बहाली के मूल भाव को बदल दिया गया था, जबकि अब, एक intron शामिल किया गया था. एक Myc टैग अप्रत्यक्ष immunofluorescence लेबलिंग और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक मिलान प्रदान करता है. लाल CES2 8,43: एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन सीधे aminoterminal संकेत पेप्टाइड पीछे जोड़ा गया है. लाल लालकृष्ण CES2 43: एक ग्लाइसिन-सेरीन लिंकर आरएफपी और CES2 तत्व के बीच एक लचीला काज स्थापित करने के लिए शुरू किया गया है.

चित्रा 4
4 चित्रा. टेड का उपयोग करते हुए प्रत्यक्ष ईआर कैल्शियम इमेजिंग के लिए प्रवाह काम करते हैं. प्राथमिक कोशिकाओं या सेल लाइनों की सेल निलंबन एक टेड अभिव्यक्ति निर्माण युक्त एक वायरस के साथ transduced रहे हैं. कोशिकाओं तो coversli पर वरीयता प्राप्त हैंपी एस. आरएफपी-CES2 निर्माणों का उपयोग करते हैं, कोशिकाओं लाल प्रतिदीप्ति का उपयोग कर पहचाना जा सकता है transduced. लक्ष्य esterase प्रेरित डाई लोड हो रहा है ऐसे Fluo5N-AM या पत्रिका Fura2-AM के रूप में एक बजे से मिलकर कम आत्मीयता सीए 2 + सूचक, जिसमें एक इमेजिंग समाधान में कोशिकाओं incubating द्वारा किया जाता है. ईआर कैल्शियम इमेजिंग एक औंधा लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (प्रोटोकॉल देखें) या किसी अन्य संगत इमेजिंग डिवाइस के साथ किया जाता है. रहते इमेजिंग के दौरान कोशिकाओं को इस तरह के कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) के रूप में एक इमेजिंग समाधान के साथ निरंतर छिड़काव के तहत कर रहे हैं. सेल उत्तेजना या तो छिड़काव द्वारा या दबाव इंजेक्शन स्थानीय द्वारा किया जाता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. मजबूत epifluorescence रोशनी सेकंड के भीतर ईआर विशिष्ट Fluo5N टेड लेबल नष्ट कर देता है. एक ईमानदार इमेजिंग खुर्दबीन के साथ imaged एक वीडियो से छवियों प्रतिनिधि,. इधर, glial कोशिकाओं exprआरएफपी-CES2 essing Fluo5N-AM के साथ भरी हुई थी. सबसे पहले एक संक्रमित कोशिका की लाल प्रतिदीप्ति एक सीसीडी कैमरे से पता चला था. बाद में, Fluo5N/Ca 2 संकेत एक एलईडी प्रकाश स्रोत के साथ प्रकाशित किया गया था. Fluo5N/Ca 2 की प्रारंभिक स्पष्ट ईआर स्थानीयकरण + परिसरों (पीले तीर) तेजी से एक 470 एलईडी प्रकाश स्रोत और प्रतिदीप्ति वितरण में बदलाव (पीले तीर, 12.46 सेकंड) परमाणु क्षेत्र में दिखाई हो जाता है के साथ मजबूत रोशनी से नष्ट हो जाता है.

चित्रा 6
6 चित्रा. साथ टेड लोडिंग विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में Fluo5N-AM ऊपरी पैनल:. स्थिर लाल CES2 अभिव्यक्ति के साथ HELA कोशिकाओं मध्य पैनल:. लाल CES2 साथ lentiviral पारगमन के बाद कॉर्टिकल astrocytes के निचले पैनल:. DIV 8 बजे लाल CES2 साथ hippocampal न्यूरॉन्स. सभी कोशिकाओं coverslips पर सुसंस्कृत और Fluo5 साथ दाग रहे थेएन AM रूप में विधि अनुभाग में वर्णित है. Fluo5N करने के लिए बाध्य है जब Fluo5N/Ca 2 + लेबल भी कैल्शियम का स्थानीयकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं. स्केल बार 40 माइक्रोन.

7 चित्रा
चित्रा 7. Cytosol में Fluo5N डाई ionomycin उपचार के बाद दिखाई हो जाता है. Glial कोशिकाओं, लाल CES2 से संक्रमित Fluo5N-AM के साथ लेबल, और ईआर कैल्शियम ख़ाली SERCA ब्लॉकर thapsigargin के साथ इलाज किया गया. Ionomycin उपचार कोशिकी कैल्शियम की एक मजबूत बाढ़ प्रेरित किया. (ऊपरी पैनल) कक्ष + मध्यस्थता प्रतिदीप्ति Fluo5N/Ca 2 में भारी वृद्धि दिखा. (लोअर पैनल) Fluo5N/Ca 2 की औसत तीव्रता प्रक्षेपण छवि + लेबल फ्लोरोसेंट कैल्शियम परिसर से एक ठेठ साइटोसोलिक लेबलिंग से पता चलता है ब्लू तीर:. एक चमकीले लेबल सेल इस सेल वीं में कैल्शियम की उच्च मात्रा है कि इंगित करता हैई साइटोसॉल. मुमकिन है, इस सेल क्षतिग्रस्त है बैंगनी तीर:. प्रकोष्ठों चमकते ionomycin उपचार पर cytosol में लेबल हो जाते हैं.

8 चित्रा
चित्रा 8. SERCA अवरुद्ध करके न्यूरॉन्स में ईआर कैल्शियम दुकान कमी. (ए) hippocampal न्यूरॉन्स (DIV 9) एक्सप्रेस लाल CES2 (ए, लाल) और Fluo5N-PM (ए, हरा) के साथ लेबल रहे हैं. तीर दो विश्लेषण कोशिकाओं को इंगित. छवि (अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण) कुल्हाड़ी, प्रयोग की शुरुआत में अधिग्रहण कर लिया था कि yz छवि के एक फसली तत्व है. (बी) 30 माइक्रोन सीपीए के साथ छिड़काव के बाद ईआर कैल्शियम दुकान कमी का प्रतिनिधित्व कच्चे निशान. यहां 1,000 छवियों 1 हर्ट्ज और 12 बिट के साथ ले जाया गया. दो कोशिकाओं के रॉय प्रति मतलब प्रतिदीप्ति घनत्व के कच्चे मूल्यों (शाफ़्ट) कर रहे हैं एक में दिखायासमय (लाल और नीले रंग का पता लगाने) पर साजिश रची. पृष्ठभूमि मूल्यों (काला ट्रेस) स्थिर रहेगा. प्रतिदीप्ति घनत्व का प्रतिनिधित्व ग्रे मूल्यों की ए.यू. = मनमाना इकाइयों.

9 चित्रा
9 चित्रा. Glial कोशिकाओं की एटीपी उत्तेजना पर ईआर कैल्शियम रिहाई. Glial कोशिकाओं लाल CES2 से संक्रमित और सीए 2 + सूचक Fluo5N-AM के साथ भरी हुई थी. कोशिकाओं के 10 सेकंड के लिए छिड़काव के माध्यम से एटीपी 200 माइक्रोन से प्रेरित थे. (ए) लाल CES2 (मध्य) व्यक्त Glial कोशिकाओं Fluo5N-PM (बाएं) के साथ लेबल रहे हैं. ROIs डाला जाता है. कोशिकाओं प्रतिक्रिया से पहले (बी) समय चूक अनुक्रम. (ऊपरी पैनल) प्रतिदीप्ति तीव्रता से निकाले एकल चित्रों 0 सेकंड और 71 सेकंड में उच्च है. यह अचानक बूँदें (80 सेकंड) और 86 से कम एक न्यूनतम पहुँचताग, यह कैल्शियम के रूप में (160 सेकंड) फिर से बढ़ जाता है से पहले ईआर में वापस पंप है. (कम पैनल) आरएफपी के प्रतिदीप्ति तीव्रता विरंजन के कारण समय के साथ धीरे धीरे और लगातार कम हो जाती है. (सी) समय निशान ΔF / के लिए एफ 0 मूल्यों दिखा ROIs कैल्शियम एकाग्रता का संकेत है, प्रतिदीप्ति ए में संकेत दिया, एटीपी उत्तेजना के बाद नीचे चला जाता है और आंशिक रूप से ठीक हो जाए. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 10
10 चित्रा. BHK21 कोशिकाओं में एटीपी प्रेरित कैल्शियम रिहाई के उच्च संकल्प इमेजिंग. प्रकोष्ठों Fluo5N-AM के साथ भरी हुई है और बाह्य कैल्शियम की उपस्थिति में imaged थे. फ्लू में परिवर्तन दिखा (ए) छवि श्रृंखलाo5N/Ca 2 एटीपी उत्तेजना के दौरान प्रतिदीप्ति + निकाली गई. (बी) औसत तीव्रता प्रक्षेपण छवि (सी) एटीपी प्रेरित कैल्शियम रिहाई और ईआर कैल्शियम की दुकान के refilling ईआर के छोटे उपक्षेत्र में विश्लेषण किया है सी. में दिखाया ROIs इंगित करता है. निशान प्रतिदीप्ति में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करते हैं.

उत्तेजना लेजर [एनएम] पता लगाने रेंज [एनएम]
लाल CES2 वेक्टर निर्माणों के साथ टेड
473 (Fluo5N/Ca 2) 507-545
559 (टैग आरएफपी-टी 2) > 570
CES2 केवल वेक्टर निर्माणों के साथ टेड
473 एनएम (Fluo5N/Ca 2) > 507

तालिका 1. वर्णक्रमीय डिटेक्टर के लिए सेटिंग्स.

प्रयोग एक लाल CES2 उपयोग कर ईआर कमी एक CES2 निर्माण का उपयोग कर न्यूरॉन्स की उत्तेजना उच्च स्थानिक संकल्प इमेजिंग, CES2
उद्देश्य (एनए) 20x पानी (0.7) 20x पानी (0.7) 40x oil/63x तेल (≥ 1,3)
473 एनएम लेजर
बिजली 1% 1%
एचवी एक 600-780 600-780 400-780
बी लाभ 0-1% 1-2% 0%
ओफ़्सेट 0 0 0
559 एनएम लेजर
बिजली 1% OPTIOnalC optionalC
एचवी एक 600-780 optionalC optionalC
बी लाभ 0-1% optionalC optionalC
ओफ़्सेट 0 optionalC optionalC
गति स्कैनिंग 1 2Hz नि: शुल्क रन नि: शुल्क रन
चित्र आकार 320x320 पिक्सेल 240x240 पिक्सेल 512x512 पिक्सेल
प्रकार स्कैन लाइन में द्विदिशिक Nyquistcriterion (2 पिक्सल / तत्व)
उत्तेजना 100-200 माइक्रोन एटीपी :5-15 सेकंड, 5-15 सेकंड के लिए 200-500 माइक्रोन ग्लूटामेट 100-200 माइक्रोन Agonist: 5-15 सेकंड
पिनहोल 2-5 हवादार डिस्क 2-5 हवादार डिस्क 1 हवादार डिस्क

तालिका 2. प्रयोग के प्रकार के अनुसार माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के उदाहरण एक:. एचवी = फोटोमल्टीप्लायर डिटेक्टर, बी के लिए वर्तमान: लाभ = पी एम टी संकेत, सी के प्रवर्धन: वैकल्पिक: चैनल अन्य लाल फ्लोरोसेंट रंगों के साथ प्रयोग के लिए स्वतंत्र है (उदाहरण के लिए CMX-रोस मितोचोन्द्रिअल संभावित) या अन्य लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन दृश्यमान करने के लिए.

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Discussion

टेड विधि के फायदे और नुकसान के हाल के प्रकाशनों 34,35 में बड़े पैमाने पर चर्चा की गई है. ऊपर वर्णित अन्य तरीकों की तुलना में, टेड कोशिकाओं में खलल न डालें और perfusing की समस्या circumvents. इसके अलावा, दो पहलुओं पर जोर दिया जाने की जरूरत है. ईआर कैल्शियम इमेजिंग के लिए टेड के सिद्धांत टेड वेक्टर निर्माणों की मदद और की कम आत्मीयता सिंथेटिक हूँ एस्टर की (2.) कुशल और तरजीही रिलीज के साथ ईआर लुमेन में एक सक्रिय carboxylesterase की (1.) लक्षित अभिव्यक्ति की आवश्यकता ईआर लुमेन में कैल्शियम रंजक.

1. टेड वेक्टर निर्माणों

चित्रा 3 टेड वेक्टर निर्माणों के विकास का सार. टेड CES के परिवार प्रोटीन (ईसी 3.1.1.1) के आधार पर विकसित किया गया था. ये प्रोटीन ईआर लुमेन में सदस्यों निवास कर रहे हैं. इन विट्रो में लिए CES में प्रोटीन की पुनः संयोजक प्रशासन की स्थिर अभिव्यक्ति के बाद सबसे अच्छा काम करता है पढ़ाईप्रोटीन या मध्यम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ वायरल संक्रमण के बाद. वर्तमान में, यह esterase गतिविधि के साथ अन्य प्रोटीन टेड इमेजिंग के लिए CES में प्रोटीन की जगह ले सकता है अज्ञात है. यह कोशिकाओं अभिकर्मक प्रक्रिया के बाद कम जिम्मेदार हैं क्योंकि गतिशील ईआर कैल्शियम विश्लेषण के लिए टेड वैक्टर क्षणिक अभिकर्मक के इस्तेमाल की सिफारिश नहीं है. CES के प्रोटीन उचित ईआर लुमेन को लक्षित और इस कदम ईआर संकेत पेप्टाइड का एक कारगर दरार की जरूरत की जरूरत है. इसके अलावा, प्रतिधारण और ईआर लुमेन में CES प्रोटीन की बहाली उनके aminoterminal KDEL जैसी आकृति द्वारा मध्यस्थता है. उच्च अभिव्यक्ति के स्तर क्षणिक अभिकर्मक के बाद टेड वैक्टर द्वारा उत्पादित कर रहे हैं जब ये तंत्र संतृप्त किया जा सकता है. यह हो सकता है CES के प्रोटीन के एक झूठे स्थानीयकरण का कारण बनता है और प्रोटीन समुच्चय के गठन का समर्थन करता है.

2. कम आत्मीयता सीए 2 + टेड के लिए संकेतक

टेड का सबसे महत्वपूर्ण दोष यह है कि लाभ की सीमाओं के कारण होता हैईआर कैल्शियम की गैर विघटनकारी विश्लेषण के लिए सक्षम सूचक रंजक. टेड के साथ ईआर कैल्शियम इमेजिंग एक उच्च कश्मीर डी (एक कम आत्मीयता अर्थ) और कैल्शियम के अभाव में एक कम रोशनी के साथ सूचक रंगों की आवश्यकता है. हमारे अनुभव Fluo5N-AM के आधार पर सबसे अच्छा काम करता है, लेकिन इस सूचक डाई ब्लीच प्रतिरोधी नहीं है. कम आत्मीयता सीए 2 + संकेतक सदस्यता Fura2-(ए. कश्मीर डी ~ 25-50 माइक्रोन) 34 और सदस्यता Fluo4 (कश्मीर डी ~ 20-25 माइक्रोन) भी परीक्षण किया गया. दोनों रंगों में अच्छी तरह से टेड द्वारा ईआर संरचनाओं में लोड, लेकिन ईआर रिहाई की उत्तेजना पर "मिश्रित संकेतों" उत्पादन का खतरा अधिक होता है. एक "मिश्रित संकेत" पहले ईआर में रोशनी की कमी के बाद cytosol में रोशनी की एक तेजी से वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है. इस सीमा को पार करने के लिए, ईआर कैल्शियम इमेजिंग के लिए विघटनकारी दृष्टिकोण 32,35 मदद मिल सकती है. सदस्यता Fluo4 (कश्मीर डी ~ 20-25 माइक्रोन) Fluo5N-AM जब कम स्पष्ट है जो Golgi cisternae के एक मजबूत टेड की मध्यस्थता लेबल, से पता चलता है कि मैंप्रयोग किया जाता है.

अनुप्रयोगों और परिप्रेक्ष्य

यहाँ हम टेड के साथ ईआर कैल्शियम गतिशील के confocal विश्लेषण स्कैनिंग उलटा लेजर पर ध्यान देते हैं. टेड माप भी उचित उत्तेजना स्रोत (लेजर, एलईडी, धातु Halid लैंप, monochromator), फिल्टर और प्रतिदीप्ति पहचान प्रणाली 6 के साथ किसी भी मानक confocal प्रणाली या व्यापक क्षेत्र प्रणाली के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

टेड ईआर में पर्याप्त अंतर्जात CES गतिविधि व्यक्त नहीं करते कि उन कोशिकाओं में विशेष रूप से उपयोगी है. हम जैसे BHK21 कोशिकाओं कम आत्मीयता संकेतक रिलीज करने के लिए ईआर में पर्याप्त अंतर्जात esterase गतिविधि प्रदान कि मनाया. हमारे हाथ में, यह कई अन्य सेल लाइनों (HEK293, एसएच SY5Y, हेला, PC12), प्राथमिक glia, और प्राथमिक न्यूरॉन्स के साथ ऐसा नहीं है. इधर, टेड विधि ईआर के लिए एक सफल गैर विघटनकारी डाई लोड सक्षम बनाता है.

भविष्य टेड वैक्टर को ईआर लुमेन से किस हद तक अपने आवेदन कर सकते हैंअन्य subcellular डिब्बों या सेलुलर microdomains. टेड विधि का सिद्धांत सूचक डाई से स्वतंत्र है, और इसलिए intracellular पीएच गतिशीलता की इमेजिंग के लिए उदाहरण के लिए किसी भी डाई हूँ एस्टर, के साथ प्रयोग किया जा सकता है. हाल ही में, ल्यूक डी. Lavis की प्रयोगशाला पुनः संयोजक सुअर जिगर esterase (लोक) CES1 cyclopropylester रंजक 42 के साथ एक चयनात्मक esterase-एस्टर जोड़ी है कि रूपों का वर्णन किया. Cyclopropylester एजेंटों अंतर्जात esterases और 42 को लक्षित पुनः संयोजक CES गतिविधि सक्षम सेल विशिष्ट अणु से चयनात्मक अनमास्किंग द्वारा हाइड्रोलिसिस के लिए प्रतिरोधी होना पाया गया है. ऐसा लगता है कि नई तकनीक पर आधारित कैल्शियम संकेतक सिंथेटिक संकेतक के subcellular को लक्षित विशिष्टता में सुधार होगा कि क्या जांच करने के लिए दिलचस्प हो जाएगा.

टेड प्रोटीन स्थिरतापूर्वक व्यक्त कर रहे हैं जब टेड सेल लाइनों में सबसे अच्छा काम करता है. स्थिर टेड सेल लाइनों के साथ एक संग्रह की स्थापना फायदेमंद होगा.

ट्रांसजेनिक टेड माउस मॉडल भी एक प्रमुख हमारे काम का उद्देश्य है और इस विशिष्ट neuronal सर्किट, कंकाल की मांसपेशी, दिल, या नाड़ी तंत्र की तैयारी से विशिष्ट ऊतक तैयारी में टेड सक्षम हो जाएगा रहे हैं. इस माउस मॉडल अधिक शारीरिक ऊतक संदर्भ के लिए सेलुलर स्तर से ईआर कैल्शियम गतिशीलता के विश्लेषण के हस्तांतरण में मदद मिलेगी.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 और फ्रेडरिक Baur-Stiftung का अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है. हम टैग आरएफपी-टी 2 के साथ हमें प्रदान करने के लिए कैलिफोर्निया, सैन डिएगो के विश्वविद्यालय में रोजर वाई Tsien, हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट प्रयोगशालाओं को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम शुक्र हमें lentiviral प्लास्मिडों FUGW उपलब्ध कराने, और psPAX2/pMD2.G के लिए डेविड बाल्टीमोर, कैलिफोर्निया प्रौद्योगिकी संस्थान, पासाडेना, और डिडिएर Trono, जिनेवा, जिनेवा, विश्वविद्यालय को स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine) Tocris 0805
5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate Sigma A26209-1G
B-27 supplement,50x Invitrogen 17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol) Sigma C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA) Ascent scientific Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma D2650
DMEM with Glutamax Invitrogen-Gibco 31966-047
Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x PAA H15-002
Fetal calf serum Invitrogen-Gibco 10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg Invitrogen F14204
Glutamate Ascent scientific Asc-049
Glutamax Invitrogen 35050-038
Ham's F12 nutrients mixture Invitrogen-Gibco 21765-029
Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS PAA Laboratories H15-010
Horse serum SHD3250YK Linearis
Ionomycin Ca2+ salt Ascent scientific Asc-116
murine EGF PreproTech 315-09
N2 supplement 100x Invitrogen 17502-048
Neurobasal medium Invitrogen-Gibco 21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g Invitrogen P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN Sigma P8638
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
Poly-L-Lysin Sigma P2636
Thapsigargin Calbiochem 586005-1mg
TryLE Express Invitrogen 12605-028
Trypsin Worthington LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean) Sigma T6522
Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81 Olympus user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635) Olympus user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector Olympus user-specific configuration
Heater controller TC-344B Warner Instruments 64-0101 to control in line solution heater
NIH ImageJ software WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35 Olympus N2709100
Objective: UPLFLN40XO Olympus N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15 Olympus N1480700
Perfusion chamber, inverse custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS Warner Instruments W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49 Warner Instruments 64-1730 for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels) Gilson n.a. perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B Warner Instruments 64-0102 controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R Warner Instruments 64-1407 for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel Pecon n.a.

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References

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लक्षित-esterase साथ ईआर कैल्शियम की प्रत्यक्ष इमेजिंग प्रेरित डाई लोड हो रहा है (टेड)
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Samtleben, S., Jaepel, J., Fecher, C., Andreska, T., Rehberg, M., Blum, R. Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED). J. Vis. Exp. (75), e50317, doi:10.3791/50317 (2013).

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