Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)

Published: May 7, 2013 doi: 10.3791/50317
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 3, 1
1Institute for Clinical Neurobiology, University of Wuerzburg, 2Department of Synapses - Circuits - Plasticity, Max Planck Institute of Neurobiology, Martinsried, 3Walter Brendel Centre of Experimental Medicine, Ludwig-Maximilians University of Munich

Summary

Hedefli-esteraz bağlı boya yükleme (TED) floresan görüntüleme ile hücre içi kalsiyum deposu dinamiklerinin analizini destekler. Yöntem sentetik düşük afinite Ca yerel maskesinin geliştirir endoplazmik retikulum (ER), bir rekombinant karboksilesteraz hedeflenmesi üs

Abstract

Kalsiyum dinamikleri görselleştirme hücre fizyolojisi kalsiyum rolünü anlamak önemlidir. Kalsiyum dinamikleri incelemek için, sentetik floresan Ca 2 + göstergeleri, popüler olmuştur. Burada TED (= hedef-esteraz bağlı boya yükleme), Ca 2 serbest bırakılması geliştirmek için bir yöntem ortaya koymaktadır + farklı hücre tipleri ER lümeninde göstergesi boyalar. Bugüne kadar, TED hücre hatları, glial hücreler, in vitro ve in nöronlar kullanılmıştır. Vektör yapıları kullanarak ER lümen yüksek bir karboksilesteraz faaliyet hedefleyen etkin, rekombinant üzerinde TED üsleri olduğunu ifade karboksilesterazdan (CES). En son TED vektörleri böylece aynı anda iki-renkli görüntüleme sağlayan kırmızı floresan proteini kaynaşmış CES2 temel bir öğesi içerir. Ilgili ER yapısı kırmızı görünürken ER serbest kalsiyum dinamikleri, tek bir renkte görüntülü. Prosedürün başlangıcında, hücreler bir lentivirüs ile transduse edilmiştir. Daha sonra, enfekte olmuş hücreler,yeniden nihayet canlı hücre görüntüleme sağlamak için lamelleri numaralı seribaşı. Daha sonra, canlı hücrelerin asetoksimetil ester (AM-ester) düşük afinite Ca 2 formu inkübe edilir + göstergeleri, örneğin Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, veya Mag-Fura2-AM. Ca2 + göstergesi ve hidrofilik bir floresan boya / Ca 2 + kompleksi, AM formundan hidrofobik yan zincirler kapalı ER bölmektedir içinde esteraz oluşan ve ER lümeninde tutulur. Boya Yükleme işleminden sonra, hücreler, bir ters konfokal lazer tarama mikroskobu de analiz edilmiştir. Hücreler sürekli Zil benzeri çözümleri ile perfüze ve Acil kalsiyum dinamikleri zaman atlamalı görüntüleme doğrudan görsel vardır. ER kalsiyum deposunun dolum floresan bir artış üreten ise ER kalsiyum açıklaması, ilgi bölgelerinde floresan azalma ile tanımlanır. Son olarak, zaman içinde floresan yoğunluğundaki değişiklik kadar taşınmış / F 0 hesaplama ile belirlenmektedir.

Introduction

ER fizyolojik kalsiyum yanıtları çözmek için, biz ER içine sentetik kalsiyum hassas boyaların yakalama artırmak için yeni bir strateji geliştirdi. Bu yöntem hücre dışı kalsiyum varlığında serbest ER kalsiyum doğrudan, olmayan yıkıcı gerçek zamanlı izleme sağlar.

ER Kalsiyum fonksiyonu ve sinyal

Kalsiyum sinyalleri farklı hücre tipleri, örneğin kas hücreleri, nöronlar ve öğrenme ve hafıza 1,2 sinaptik iletim bir katılımı kas kasılması aracılık gelen glial hücreler ve işlevleri aralığında bulunur. Kalsiyum gen transkripsiyonu, hücre çoğalması, nöronal uyarılabilirliği, hücre ölümü ve olaylar 1-7 sinyalizasyon diğer hücre düzenlenmesinde yer almaktadır, çünkü serbest kalsiyum konsantrasyonunu değişiklikler yüksek bir bilimsel ilgi vardır. Bütün bu hücre içi kalsiyum sinyalleri işlevsel olarak bağlı ve hücre içi kalsiyum katkıda bulunmaktadırmağaza dinamikleri 8-10.

Tüm kalsiyum sinyalleri arasında ortak bir özelliği hücre dışı alan arasında kalsiyum akışını, sitoplazmada ve organeller, özellikle ER ve mitokondri olduğunu. Bu, farklı sinyal bileşenleri tarafından algılanır ve bu organellerin içinde kalsiyum konsantrasyonunda dinamik değişiklikler olur. Genel olarak, 100-800 uM arasındaki ER aralıkları içinde kalsiyum konsantrasyonu, sitoplazmada kalsiyum konsantrasyonu yaklaşık 100 nM, ve hücre dışı ortamda konsantrasyon 1-2 mm civarındadır. Buna göre, sitoplazmada 2,9,10 doğru kalsiyum akışı için yüksek bir kimyasal itici güç vardır.

En yaygın olarak incelenmiştir ER-türevi kalsiyum sinyaller daha sonra fosfolipaz C (PLC), aktive G-protein bağlı reseptörler (GPCR), uyarımı bağlıdır. Da PLC inositol 1,4,5-trisphosphate (IP 3) 1 üretir. Onun rec IP 3 bağlayıcı üzerineeptor (IP 3-Rec, Şekil 1) ER-membran, kalsiyum iyonları ER lümeninde salınır. Tarihsel olarak, ER IP 3-aracılı kalsiyum sürümü ilk - bile dolaylı - Streb ve arkadaşları tarafından asiner pankreatik hücrelerde ölçülen 1.983 11.. Bu yayın, ilk kez önerilen asetilkolin, fosfolipaz C ve IP 3 içeren bir sinyal akışında. Kalsiyum serbest Bu şekilde genellikle IP 3-bağlı kalsiyum sürümü (IiCR) (Şekil 1) olarak adlandırılır. Reseptör tirozin kinazlar, bağlantılar IP 3 yükseklik 12 sonra sinyal ER kalsiyum büyüme faktörleri ve nörotrofik faktörlerin etkisi ile fosfolipaz Cγ arasında kinaza bağımlı aktifleştirme. IiCR ek olarak, kalsiyum yüksekliği riyanodin Re, voltaj-bağımlı kalsiyum kanallarının (Ca V) ve daha sonra kalsiyum ile indüklenen kalsiyum tahliyesinin (CICR) ile, örneğin, iyonotropik kalsiyum girişini aracılık edilebilirreseptör (RYR). IiCR ve CICR fizyolojik mağaza ile çalışan kalsiyum girişi (Soce) ile bağlantılıdır. Soce ER kalsiyum serbest bırakılması için bir sensör STIM (stroma etkileşen molekül), bir işlem içerir. STIM geçici reseptör potansiyel bir kanal (Trp) 13, Orai kalsiyum kanalları 14 ve hatta voltaj kapılı kalsiyum kanalları 15 (Şekil 1) yoluyla hücre-dışı kalsiyum girişini teşvik ettiği gösterilmiştir. ER kalsiyum kaybı dinamik aktif pompalar kalsiyum geri ER içine Sarko-endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA), bir eylem tarafından kurtarılır. Bu thapsigargin gibi ilaçlar ile SERCA Engelleme sitozolik bölmesine ER kalsiyum sürekli bir kaybı tanıttı. Bu ER kalsiyum "kaçak" gibi Sec61 protein kompleksi 16,17 (Şekil 1) olarak ER intramembrane gözenek kompleksleri neden olur.

1998 yılında, Berridge bir model, "bir nöron modeli içinde nöron", hangi yayınlandıh nöronal kalsiyum 5 entegre ER bir ilke fizyolojik rolünü göstermektedir. Bu model nöronal plazma zarı 5 bir hücre içi "görüntü" oluşturan sürekli ER membran sisteminin varlığını dikkate alır. Bu ikili ökaryotik membran sistemi nöronlarda hızlı ve yavaş kalsiyum sinyallerinin zamansal ve mekansal entegrasyonu için temel bir ön koşul olduğu iddia edildi. Aynı nöron farklı dikenler veya dendritler eş zamanlı veya daha sonra da meydana kalsiyum sinyalleri hücrenin soma ya da 5,18 toplanır ER, ile çekirdeğine veriliyor. Daha sonra, bunların toplamı sinyal şelaleden gen transkripsiyonu veya entegrasyon nöron, düzenleme heyecanlanma üzerinde etkileri olabilir. Bu nedenle, ER kalsiyum sinyallerinin birleştirilmesi destekler. Bu kavram için bir ön koşul çeşitli çalışmalar tarafından iddia edilmiştir ve en az somato-d kanıtlanmıştır ki tek bir hücre, içinde ER sürekliliği olanendritic alanları ve kısa bir mesafe aksonal projeksiyonlar 19-21. Uzun aksonal projeksiyonlar içinde ER süreklilik olup olmadığını tartışma meselesidir.

ER membran üzerinden ücretsiz kalsiyum akışını ölçmek için Stratejiler

Kalsiyum sinyalleri en sık sitoplazmada 22,23 izlenir. Bu nedenle, kolaylıkla hücre dışı Ca2 + veya 6,24 hücre içi mağazalarından sitozolüne akan olup olmadığını ayırt edilemez. Bu sınırlama üstesinden gelmek için, doğrudan ER kalsiyum görüntüleme için metodolojik stratejiler geliştirilmiştir. Özet olarak, aşağıdaki stratejileri kullanılmıştır:. (1) genetik olarak işlenmiş protein göstergeleri: 25-27 protein tabanlı, düşük afiniteli bir Ca2 + göstergeleri, bir kalsiyum algılama proteini ile kombinasyon halinde biyolüminesans proteini aequorin veya GFP kullanımı ER-hedefli. Bu genetik Ca 2 + göstergeleri (GeCIS) canBir sinyal peptidi yardımıyla ER hedeflenebilir ve aktif bir saklama ve geri çağırma motifi kullanılarak ER tutulur. Cameleon bölünmüş YC7.3ER 29 ve Cameleon D1 30 ve Cameleon ilkesine Ortak ER Ca 2 + göstergeleri baz Cameleon YC4.3 26,28 bulunmaktadır. AM-ester düşük afinite Ca 2 (2) Doğrudan esteraz tabanlı boya yükleme + göstergeleri 31,32. Gösterge boyaların (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM veya Fluo5N-AM)-türevleri AM geçmek bir lipofilik, kalsiyum-duyarsız durumda biyolojik membranlar. Daha sonra, sitoplazmada gibi ER, endojen esterazlar AM-ester grubunun yarılma ve sitoplazmada aktif olan boya belirli bir miktarda arkasında ve ER bırakarak, Ca2 + göstergesi bırakın. Sitozolik kalsiyum konsantrasyonu de de altında kalır Bu nedenle, bu yaklaşım sürece ER yüksek bir kalsiyum konsantrasyonu koşulları altında yararlıdırözellikle karakteristik kalsiyum sinyalleri (düşük mcM örneğin nM) sırasında düşük afinite göstergelerin koruması sınırı,. Plazma zarının geçirgenliği 32 ile birlikte (3) AM ester yükleme., Kalan sitosolik Ca2 + gösterge yapay bir hücre içi tampon içinde bir "hafif" deterjan (örneğin saponin) küçük miktarlarda bulunan plazma membran geçirgenliği ile çıkarılır. Bu nedenle, hücre içi zarlar doğrudan plazma zarında "gözenekler" yoluyla, hücre içi tampon IP 3 ile, örneğin, güdülenebilir. (4) Ca 2 tam hücre konfigürasyonu ve eş zamanlı ölçüm altında sitoplazmada Diyaliz + ER lümeni ve sitosol içinde 32,33. Bir hücre olanlar, düşük afiniteli bir Ca2 + göstergesi (örneğin, Mag-Fura2-ile yüklenir AM,), rasyometrik UV ışık. Daha sonra, bir yama pipet, herhangi bir geri kalan cyt yardımıylaosolic düşük afiniteli bir Ca2 + göstergesi Yüksek afiniteli bir Ca2 + göstergesi (örneğin, Flu-3, görünür ışık) ihtiva eden bir tampon maddesi ile sitoplazmada üzerinden dializ edilir. Bu strateji, sitosolik ve ER türetilen sinyallerin eş zamanlı kayıt sağlar. (5) Hedefli-esteraz bağlı boya yükleme 8,34. Bir karboksilesteraz (CES) ER lümenine hedefleyen ve düşük afinite Ca 2 + göstergelerin AM-ester formunun etkin yakalama için yüksek esteraz aktivite sağlar.

Hedefli-esteraz bağlı boya yükleme (TED)

ER lümen için düşük afinite Ca 2 + göstergelerin hedef artırmak için, TED geliştirilmiştir. TED ekspresyon yapıları ile elde edilir, bir ER hedeflenen fare karboksilesteraz (CES2) (Şekil 2), bir aşırı gerektirir. Yeniden birleştirici bir yapı CES-salgılayan hücrelerin bir kalsiyum AM-ester şekli ile inkübe edilirdicator boya (Fluo5N-AM, Şekil 2). Daha sonra, ER, boya Ca 2 + dönüştürülür duyarlı membran geçirgen Ca2 nedenle ER lümeninde 8 de yüksek bir konsantrasyon olarak, boya tutucu yüksek esteraz ile + göstergesi kompleksi (Fluo5N/Ca 2 +), , 34. Yöntem SERCA 17 abluka sonra örneğin doğrudan "kaçak kanalları", ile metabotropik, purinerjik-veya glutamat reseptörleri 8,34 ile örneğin IiCR-yollardan ER kalsiyum-serbest araştırmak ve ER kalsiyum tükenmesi görselleştirmek için özellikle yararlıdır , 34. Deneyimlerimizi için düşük afinite Ca 2 + göstergesi Fluo5N-AM şu anda TED boya yükleme stratejisi ile kullanmak için mevcut en iyi göstergesidir. Fluo5N-AM, Ca2 + için düşük bir afiniteye sahiptir (ayrışma sabiti Kd ~ 90 uM, Şekil 2), hemen hemen-floresan ile AM-formunda olduğu, ancak calciu üzerine yüksek floresans emisyon içerirm bağlayıcı 8,34. Fluo5N/Ca 2 + kompleksi gibi FITC, Alexa 488 veya eGFP gibi standart boyalar karşılık ~ 490 nm standart bir ışık kaynağı ile heyecanlı olabilir. Sitosolik kalsiyum sinyalleri hemen hemen düşük uM aralığında bir konsantrasyonuna ulaşmak ve bu ancak sitoplazmada Fluo5N 35 tarafından tespit edilir.

TED performansını artırmak için, birkaç rekombinant vektör yapıları (Şekil 3) geliştirilmiştir. Başlangıçta, CES2 kodlama dizisi (RefSeq katılım sayısı NM_145603, CES2c) ve en iyi TED performansa dayalı TED vektörler CES yapıları istikrarlı ifade ile görülmektedir. Yeni TED vektörler kırmızı floresan proteini TagRFP-T2 36 erimiş CES2 temel bir unsuru ifade eder. Bu vektörler hücrelere transduse tespit etmek ve Fluo5N/Ca 2 değişikliklerin normalizasyonu için bir iç kontrol olarak, kızıl flüoresans kullanmak için kullanılabilir olması avantajına sahiptir + floresan. Kırmızı floresan da stimülasyon koşullar altında ER ve ER dinamikleri değişikliklerin yapısal dağılımı görselleştirmek için imkan sunuyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokol, TED hücre hatları, hipokampal, kortikal glial hücreler uygulanır getirmektedir. TED performans iyi TED vektörleri stabil lentiviral vektörler tarafından örneğin, ifade olduğunda. TED yöntemin şematik bir genel görünüşü Şekil 4 'de gösterilmiştir.

1. Çözeltilerin hazırlanması

Aşağıdaki çözümleri başlamadan önce hazırlanmalı ve belirtildiği gibi saklanabilir. Biz genellikle steril cam ve plastik malzeme ve otoklava su kullanın.

  1. 125 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 MgSO 4 .7 H 2 O, 2 CaCl 2, 1.25 2 PO 4 NaH H 2 O, 10 glucose.H 2 O:. HEPES-Ringer (mM) hazırlayın 127 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 MgSO 4 .7 H 2 O, 1.25 NaH 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H 2 O ve 0.1 EGTA: Kalsiyum-ücretsiz HEPES-Ringer (mM) oluşur.. Glikoz olmadan bu görüntüleme çözümleri b olabilir4 saklanan E ° C D-glikoz gerekli miktarda taze kullanımdan önce ilave edilir.
  2. Hipokampal nöronlarda TED analizi için, yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) önerilir. ACSF (mM olarak) oluşmaktadır: 127 NaCl, 23 NaHCO3, 3 KCI, 2.5 NaHPO 4H 2, O, 25 D-glucose.H 2, O, 2 CaCl2, MgCl2 2 .7 H 2 GKD 0. 2 0.
  3. Hazırlama 5 mM bir konsantrasyona kadar Fluo5N-AM. Çözündürme liyofilize Fluo5N-AM, 50 mg,% 20, Pluronic F-127 (DMSO içinde, nem ve ışıktan korunan, oda sıcaklığında) 8.9 ul ekleyin yardımcı olmak için. Daha sonra en az 2 dakika süreyle su banyosunda sonikatör ile Fluo5N-AM çözünür. Mağaza alikotları à -20 ° C'de 0.5 ul, ışık ve nemden korunmalıdır.
  4. Gerektiğinde antagonistinin ve agonisti stokları hazırlayın. Örneğin: H 2 O (agonist a), 10 mM ATP ve ADP (2 H, O, purinerjik reseptörlerin metabotropik aktivasyonu), b), 10 mM karbakolmuskarinik asetilkolin reseptörü) ve c), DMSO içinde 30 mM siklopiazonik asit (CPA) (SERCA arasında bloke edicileri), d), PBS içinde 50 mM DHPG (mGluR I mGluR ve 5 için, metabotropik glutamat reseptör agonisti), e) H, 10 mM Glutamatın DMSO içinde 2 O, F), DMSO (iyonofor), g, 1 mM ionomycin), 5 mM thapsigargin (SERCA yüksek afinite engelleyici). -20 ° C de saklayınız alikotları
  5. Lentiviral vektörleri: Bu protokol lentiviral TED ifade vektörü parçacıklarının kullanımını içerir. Onların üretim ve depolama bu protokolün bir parçası değildir. Bu hücre hatları, gliyal hücreleri ve nöronların rekombinant karboksilesteraz'lann transferini ikinci nesil lentiviral vektörleri kullanarak. Ifade vektörü FUGW 37, ve ambalaj plazmid pCMVΔR8.91 veya psPAX2 ve pMD2.G 38,39 plazmid pseudotyping bizim lentiviral sistemi üsleri DİKKAT:. Rekombinant kendini inaktive lentiviral vektörler ile iş dikkatli gerektirir düşününbiyogüvenlik kurallar dikkate. Birçok ülkede, bu vektörler biyolojik tehlike risk grubu 2 olarak sınıflandırılır. Bakın daha fazla bilgi için http://www.addgene.org/lentiviral/ .

2. Hazırlık ve Fare Hipokampal nöronlar Viral Enfeksiyon

  1. Yaklaşık olarak 30 dakika için% 70 etanol içinde 20 cm çapında (tabak başına 100 lamelleri), 1x bir cam petri kabı cam lamelleri yıkayın. Son olarak, 2 dakika boyunca% 100 etanol (PA) ekleyin. Artık etanol çıkarın ve steril bir başlık altında lamelleri kurulayın.
  2. B27 01:50 ile neurobasal orta, Glutamax 1:100, ve N2 ek 1:100:, (b) tam orta B27 01:50 ile (a) neurobasal orta: hipokampal nöron kültürleri için medyanın iki farklı hazırlayın. Steril süzüntü medya ve kullanıma kadar hücre inkübatör saklayın.
  3. Önce diseksiyon bir gün, lamelleri önce her bir steril 10 mm lamel koyarak hazırlanırde bir 4-kuyulu hücre kültürü çanağı. Daha sonra, dikkatli bir şekilde her bir kat 80-100 ul% 0.1 Poli-L-lisin ile lamel ve gece boyunca bir inkübatöre yemekler saklayın.
  4. Diseksiyon ve hücre kültürü gününde, 100 ul HBSS ile lamelleri üç kez yıkama ile başlar ve her lamel 100 ul neurobasal orta aktarın. Dengeleme için bir kuluçka (farelerin diseksiyonu sırasında örneğin) içine yemekleri yerleştirin.

Teşrih

Biz kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylanmış Avrupa Birliği kurallarına uygun olarak fareler ile deneyler.

  1. Toplam beyin çıkarın ve hippocampi bilateral incelemek.
  2. Dikkatlice zarları ve hipokampus ve yer dışında doku bir hipokampus 450 ul HBSS içeren 1.5 ml tüp her çıkarın. Hipokampi yeterli sayıda izole edilmiş kadar buz üzerinde doku saklayın.
<p class = "jove_step"> Hücre kültürü

  1. Her tüpe 50 ul% 1 tripsin (Worthington) ekleyin ve 15 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde inkübe bunları. Bazen tüpleri çalkalayın. Sindirim reaksiyonu durdurmak için her bir tüp, 50 ul% 1 tripsin inhibitörü ekleyin ve tüp birkaç kez ters çevirin.
  2. Hippocampi sıvı transferi kaçınarak bir 15 ml şahin tüp 5 kadar her doku transferi. 5 ml'lik bir hacme B27-ortam (a) ekleyin.
  3. Dikkatli bir şekilde aşağı yukarı pipetleme ve bir yangın cilalı Pasteur cam pipet kullanarak doku Karışım DİKKAT:. Hava kabarcıkları kaçının!
  4. 3 dakika boyunca 400 x g ile dönüş, süpernatan aspire ve 5 ml B27-ortam (a) 'da hücre pelletini.
  5. , 1000 ul plastik filtre yardımı ile iki kez daha sonra cam pipet ile bir kez daha doku Karışım, vb. Gibi adımları 2.9 ve 2.10 'da açıklanan bu gerçekleştirin.
  6. Son santrifüj işleminden sonra, 2 ml tam Mediu'nun olarak hücre pelletini200 ul plastik filtre ucu hücreleri m (b) ve çiğnemek. Tek hücre süspansiyonu kalan hücre kümeleri ayırmak için, hücre kümeleri 1-2 dakika yerleşmek izin.
  7. Hücre sayımı ve viral enfeksiyon için gerekli hücrelerin toplam sayısını hesaplamak. TED görüntüleme için 10 mm lamel başına 25.000 hücreleri kullanır.
  8. Bir kontrol olarak kaplama ek 25.000 olmayan transduced hücreleri bu noktada tavsiye edilir.

Viral Enfeksiyon

  1. Yeni bir 15 ml Falcon tüpü ve 400 x g de 3 dakika boyunca santrifüj içine viral enfeksiyon için hücre süspansiyonu aktarın.
  2. Süpernatan aspire ve 300 ul ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri (B)
  3. Bulaşıcı lentiviral TED ekspresyon vektörü taneciklerin, uygun bir miktarda eklenir ve Falcon tüpü 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilir.
  4. Kaplama (her biri 10 mm lamel boyunca 100 ul) için gerekli olan son hacim olması için tam bir ortam (b) ile tüp doldurun yüzeyleri bulunan ortamı aspireerslip ve hemen her lamel üzerine 100 ul hücre süspansiyonu yerleştirin.
  5. Tüm hücreleri yerleşti (yaklaşık 2 saat) ve 2 ml orta (b) içeren kadar dikkatli yemekleri doldurmak kadar inkübatör içine yemekleri yerleştirin.
  6. Nöronlar, en az bir hafta süreyle büyümesine izin. Her hafta, orta% 50 değiştirin.

3. Fare Kortikal glial hücre kültürü ve viral enfeksiyonu

Hazırlık

  1. 4 ml 0,5 ng / ml 'poli T75 hücre kültürü şişesi, bazal glia ortamı (% 10 FCS ile DMEM/F12 1:1 karışımı,% 5 HS,% 1 penisilin / streptomisin,% 0.45 glukoz) ve kaplama hazırlayarak başlayın -DL-ornitin hidrobromür (PORN) (150 mM borik asit solüsyonu, pH değeri 8.35 ile seyreltilir). 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübasyondan sonra, gece boyunca, HBSS ile hücre kültürü şişesi üç defa yıkamak ve B27 01:50 ve 10 ng / ml EGF içeren 18 ml bazal glia orta ekleyin. Inkübatör hücre kültürü şişesi (en fazla 3 saat) dengelenmesi.
<p class = "jove_step"> Diseksiyon

  1. Biz kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylanmış Avrupa Birliği kurallarına uygun olarak fareler ile deneyler.
  2. Bir P5-P7 fare beyin incelemek ve 2.5 açıklandığı gibi her iki yarımkürede gelen hipokampus ve meninks çıkarın.
  3. Frontal korteks incelemek, birkaç küçük parçalar halinde kesilmiş ve HBSS içeren 1.5 ml tüp bunları toplamak. Buz tüpü saklayın ve hücre kültürü kısmına geçin.

Hücre kültürü

  1. Tüpünden yangın parlatılmış cam pipet kullanarak 15 ml şahin tüp tüm doku aktarın.
  2. 5 ml son hacim bazal orta ekleyin ve bir yangın parlatılmış cam pipet ile aşağı birkaç kez pipetleme ve ile doku çiğnemek. 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj işleminden sonra, ortam aspire edilmiş ve 5 mL bazal ortamı içinde hücre pelletini.
  3. Iki kez 3.5 adımı tekrarlayın.
  4. Thi sonraRd santrifüj, B27 (1:50) ve 10 ng / ml, EGF içeren 2 ml bazal ortam içinde glia hücre pelletini.
  5. Bir kez daha Titruate ve hazırlanan T75 hücre kültürü şişesine hücre süspansiyonu transfer ve hücreler 3-4 gün süreyle büyümesine izin.

Glial hücrelerde (kültür 3-4 gün sonra) Yıkama:

  1. 10 ml PBS ile bir kez hücreleri yıkayın ve diğer elinizde sıkı tutarken şiddetle, dokunun veya hafifçe elinizle şişeyi birkaç kez vurdu. Bu adım, hücre artıkları ve hücre kümeleri ile kültür kaldırılır.
  2. PBS aspire ve B27 (1:50) ve 10 ng / ml EGF içeren taze bazal glia orta ekleyin. Hücrelerin% 80 confluency ulaşana kadar daha 5-7 gün boyunca kültür yetiştirmek.

Yarma, iletimi ve glial hücre son tohumlama:

  1. 100 ul Poly-D-lisin ile kat 10 mm lamelleri: ve inkübe (stok çözeltisi 0.1,% 1/50 AD 20 ug / PBS veya HBSS içinde seyreltilmiş mi)onları gece boyunca bir inkübatör. HBSS ile lamelleri üç kez yıkayın ve 100 ul bazal glia orta ekleyin. Inkübatör lamelleri (3 saat) dengelenmesi.
  2. 10 ml PBS ile iki kere yıkayın glial hücreler, PBS aspire ve 3 ml tripsin (TrypLE, seyreltilmemiş) ilave edin. Kadar 1 dakika için hücreleri Trypsinize DİKKAT:. Aşırı trypsinization kaçının. Tüm hücreler, normal olarak% 80'den fazla 1 dakika sonra ayrılmış ve sağlıklı hücrelerin birkaç milyon için yeterlidir edilir.
  3. 10 mi bazal glia orta ekleyerek reaksiyonu durdurun, 3 dakika boyunca 300 x g'de 15 ml'lik bir Falcon tüpüne, santrifüj için hücre süspansiyonu aktarın. Süpernatan aspire edin ve 5 ml bazal ortam içinde glia hücre pelletini.
  4. Yine, spin ve gibi adım 3.15 açıklandığı aspire, sonra 5 ml bazal Glia orta hücreleri tekrar süspansiyon.
  5. 1.5 ml'lik bir tüp hücreleri gerekli sayıda aktarın. 10 4-2x10 4 glial hücreler bir 10 mm lamel için yeterlidir. Genellikle, süspansiyon vol4-iyi çanak az 200 ul biri için hücreleri uyum sağlamak UME. Hücrelere lentiviral TED ifade vektörü parçacıkları, uygun bir miktarda eklenir ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe. Daha sonra ekim hacmi (lamel başına 100 ul) için bazal glia orta süspansiyon doldurmak.
  6. Yaklaşık 2 saat boyunca inkübe edilir ve lamel başına enfekte olmuş hücreleri Tohum 100 ul ve ardından 2 ml 'lik bir son hacme kadar B27 01:50 ve 10 ng / ml EGF içeren bazal glia orta ekleyin.
  7. Kaplama gün sonra 3-7 deneyler için hücreleri kullanmak ideal bir kültür koşulları için.

4. Muhabir Hücre Hattı Üretimi ve Kültür

TED raportör HeLa hücre hatları, BHK21, HEK293 ve SH-SY5Y temelinde oluşturulmuştur. Burada HeLa hücreleri için protokol sağlar, ancak protokol yanı sıra başka bir hücre hattı ile transfer edilebilir.

Stabil HeLa hücre hattı üretimi

  1. Bir vahşi tip HeLa hücre hattı ve transfer 100,000 C Bölünmüş1.5 ml'lik bir tüp, 200 ul bir hacim içinde arşın.
  2. Tüpe lentiviral TED ifade vektörü parçacıkları, uygun bir miktarda ilave edin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hücre virüs süspansiyonu inkübe edin. Daha sonra 3 gün boyunca 30 mm'lik bir çanak ve inkübe içinde 2 ml ortam içine bir toplam hacmi (DMEM,% 10 FCS,% 1 penisilin / streptomisin) içinde tohum hücreleri.
  3. Bir kez PBS ile yıkandıktan sonra, ortam aspire ve 500 ul tripsin (TrypLE, PBS içinde 2:3) ile ekleyin. Yaklaşık inkübe edin. Daha sonra 3 dakika 3 ml ortamı ekleyerek reaksiyonu durdurun. 3 dakika 400 x g'de 15 ml şahin tüp ve santrifüj içine süspansiyonu aktarın.
  4. 200 ul ortam içinde hücre pelletini ve 4.2 'de tarif edildiği gibi yeniden lentiviral parçacıkları ile hücreleri enfekte. Daha sonra, 10 mL ortam içinde bir T25 hücre kültürü şişesi içinde tohum hücreleri.
  5. % 60-80 bir katışma ulaşılana kadar hücrelerin büyümesine. Daha sonra kültür bölünmüş.

TED raportör hücre hatları

  1. TED muhabiri hücre hatları korumak olabilirherhangi bir standart ortam, örneğin DMEM,% 5 veya% 10 FCS ve% 1 penisilin / streptomisin içeren ed kullanılır.
  2. Steril 10 mm lamelleri (yukarıya bakınız), örneğin lamel başına 10.000 ile 20.000 hücreleri içeren 4-iyi çanak hücre plaka uygun sayıda.
  3. TED görüntüleme için kullanmadan önce en az iki gün boyunca hücreleri büyütün.

5. Bir Ters Mikroskop de Canlı Görüntüleme Prosedürü Hazırlık

    1. Ön ısıtılması, oda sıcaklığına kadar HEPES Ringer ve D-glikoz eklenmektedir.
    2. Prewarm ACSF (Ca2 + olmadan ve Mg2 +), oda sıcaklığına kadar, ve D-glikoz eklenmektedir. 5 dakika karbojen ile ACSF havalandırır. Daha sonra, 2 mM her son konsantrasyonlara CaCI2 ve MgCl2, 1 M stok çözelti ekleyin.
  2. Canlı görüntüleme mikroskoplar ve tüm bilgisayar programları başlatın.
  3. Bir "kukla" görüntüleme odasının üzerine perfüzyon başlatın ve tüp sistemi denge.
  4. Mikroskop aşamasında satır içi çözüm ısıtıcı ve görüntüleme odası Prewarm. Bir ısıtma elemanı olarak görüntüleme odasına düzeltmek.
  5. Eğer boya yükleme işlemi başlamadan ° C önce 32-37 için sistem dengelenmesi DİKKAT:. Biz mikroskop sahne korumak için amaç ve elastomerik silikon levhalar (1 mm) etrafında saç bağları kullanmak mikroskop sisteme perfüzyon çözüm yanlışlıkla akışını önlemek için.

6. Hücre Tipi Ya bir boya Yükleniyor

  1. 100 ul prewarmed görüntüleme çözümü (HEPES-Ringer veya ACSF) olarak Fluo5N-AM 1 kısım (1.3) süspanse edin.
  2. Çözünürleştirilir 90 saniye boyunca bir su banyosunda sonikatör görüntüleme çözeltisi (HEPES Ringer veya ACSF) içerisinde Fluo5N-AM.
  3. Ya da iyi birine 24 plaka ve transfer 400 ul önceden ısıtılmış görüntüleme çözümü - yeni 4 kullanın. 5 mcM çözüm 500 ul gelmek için de aynı için boya çözeltisi ekleyin.
  4. Hücreler (örneğin, bir lamel ile dikkatli bir şekilde yerleştirmekKuyudaki çapı 10-18 mm), yukarı bakacak hücreleri.
  5. 37 bir hücre kültürü inkübatör zaman uygun bir süre boyunca inkübe ° C (Bu arada mikroskop aşamasında görüntüleme ayarları hazırlamak). Tipik bir boya yükleme kez 10-20 dakika nöronlar ve glial hücreler 7-15 dakika süreyle ve hücre hatları içindir.

ÖNEMLİ: Boya-yükleme süresi ve konsantrasyon boya hücre tipi, hücre yoğunluğu ve deney-özel ihtiyaçlarına bağlıdır! Boya varlığında uzun inkübasyon süreleri, hücrelere zarar özellikle birincil nöronları ve primer gliyal hücreleri ve bu fizyolojik uyaranlara yanıt için kritik olabilir. Uzun inkübasyon sürelerinde (örneğin 30 dakika) sadece küçük hücre içi yapılar, örneğin ince neurites veya dikenler içinde ER kalsiyum dağılımını araştırmak için ER kalsiyum lokalizasyonu deneyler için faydalı olacaktır. Bazı deneylerde, görüntüleme çözeltisi ile 1/3 büyüme ortamı karışımı Fluo5N-AM sırasında hücrelerin korunmasına yardımcı olabiliryükleme.

  1. Anında, iyi görüntüleme çözümü içeren başka bir hücre kültürü (HEPES-Ringer veya ACSF) için lamel aktarmak ve görüntüleme odasına hücreleri montaj başlar.

7. Konfokal Mikroskop Tarama bir Ters Lazer ile ER-kalsiyum Canlı Hücre Görüntüleme

  1. Bir görüntüleme odasına yüksek vakum gres uygulamak için bir fırça kullanın. Gres perfüzyon odasının alt üzerine lamel sabitleşmek için gereklidir. Böylece dakikada 15 kat tampon değişimi kadar yüksek perfüzyon hızı sağlayan, küçük bir hacmi ile 10-12 mm lamelleri için kendi kendini yetiştirmiş görüntüleme odaları kullanın. 18 mm lamelleri için bir ticari perfüzyon odası, Warner araçlar (RC-49FS) satın alınabilir. Bu bölme, ayrıca nöronların alan uyarımı sağlar.
  2. Fluo5N-yüklü hücreler ile lamel almak ve görüntüleme çözeltisi ile kaplı hücreler tutmak için hücrelerin üzerine görüntüleme çözeltisi (50-100 ul), küçük bir damla ilave edin.Ters lamel çevirin ve görüntüleme odasına hücreleri monte edin. Silikon yapıştırıcı içine lamel basın, (örneğin, Q-ipuçları) bir pamuklu çubuk kullanın.
  3. Pamuk tomurcukları ile cam lamel altından uzak kalan tampon silin DİKKAT:. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için yüksek sayısal açıklık ile bir yağ-objektif kullanırken dikkatli uzak kalan nem silin. Artık tuz iyi su tarafından kaldırılır. Gres yanlışlıkla smear aseton veya saf etanol ile kaldırılabilir.
  4. Deneysel görüntüleme odası ile değişim "kukla" görüntüleme odası. Sürekli perfüzyon ile 5-10 dakika için hücreler yıkayın.
  5. 5 için hücreleri yıkayın - 10 dakika sürekli perfüzyon ile.
  6. Hücre seçimi için lazer aydınlatma, yüksek tarama hızları (2-4 Hz), küçük bir görüntü boyutu ve yüksek kazanç az miktarda kullanın.
  7. DİKKAT: Fluo5N-işaretli hücrelerin seçimi için epifluorescen ile ışık veya aydınlatma aşan kullanmayınt ışık. Fluo5N/Ca 2 Parlak aydınlatma + kompleksleri 2-4 saniye (Şekil 5) içinde ER-özel floresan tam kaybına neden olur.
  8. Planlanan deney göre mikroskop ayarlayın. Yönü, farklı TED vektörlerle görüntüleme için Örnek ayarları Tablo 1 'de verilmiştir. Ve spektral dedektör sistemi; konfokal mikroskobu ters lazer için, diyot lazer (559 nm, 20 mW 473 nm, 15 mW) ile donatılmış bir Fluoview 1.000 konfokal sistemi ile birlikte bir Olympus IX81 mikroskop kullanın.
  9. Deney belgenin başında yüksek çözünürlüklü x, yz görüntü yığınlarının tarafından ilgi hücreleri.
  10. Özel deneysel koşullar altında ER kalsiyum dinamikleri izlemek için x, yt görüntüleme gerçekleştirin. Sistemimiz tipik ayarları, Tablo 2'de listelenmiştir.
  11. Görüntüleme çözümü ile sürekli perfüzyon altında ER kalsiyum değişiklikleri izlemek. Tipik tampon döviz kurları e vardırxemplarily: (a) SERCA bloğu tarafından hücre yıkama ve mağaza tükenmesi: 1.5 ml / dakika, (b) ATP / DHPG stimülasyon: 3 ml / dakika.
  12. 12-bit (4096 gri değerleri) ile tercihen dijital görüntüler elde. Fluo5N/Ca 2 paralel görüntüleme için + ve TTT, 8-bit görüntüler (256 gri değerleri) veri taşması karşı sisteminizi kurtarmak olabilir.
  13. Bir ImageJ uyumlu formatı (örneğin tiff) hücre zaman serisi görüntüleri (x, yt) veya 3D görüntü yığınlarının (x, yz) (Fluo5N/Ca 2 + komplekslerinin hücresel dağıtımı için) canlı saklayın.

8. Görüntü İşleme ve Veri Analizi

  1. ImageJ programında görüntü yığını açın. ImageJ tarafından sorulduğunda çok renkli görüntüleme durumunda, RGB kanalları bölünmüş.
  2. (Örneğin bir yoğunluk vs zamanlı arsa yardımıyla) görüntü yığınlarının dikkatli bir muayene ile ilgi (ROI) sizin bölge (ler) tespit
  3. Bir yatırım getirisi ortalama piksel yoğunluğu (F ham) okumak için Zaman Serisi Analyzer eklentisi kullanın. Dependinbilerek g, tam ER veya periferik hücre bölgelerin dendritlerin ER örneğin ER küçük bölgeler ya etrafında ROI çizin. Ayrıca arka plan çıkarma için hücreleri olmadan alanlarda 1-3 ROI içerir.
  4. Arka ROI ortalama floresan değeri hesaplayarak ortalama eşiğe (F b) hesaplayın ve F roi değeri elde etmek için F ham değerlerden arka plan değeri F b çıkarın.
  5. Bir dinlenme durumunda her yatırım getirisi için on 30 floresan değerlerinin ortalama değeri hesaplayarak hücrelerin bazal floresan olan F 0,, hesaplayın.
  6. Formülle mesafe kadar taşınmış / F 0 ile floresan arka plan-düzeltilmiş göreceli değişiklikler hesaplayın:

Denklem 1

  1. Mevcut göreceli değişiklikler floresanY ekseni ve X ekseni için süre mesafe kadar taşınmış / F 0 ile bir iz olarak nce.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokol ücretsiz ER kalsiyum doğrudan görüntüleme için olmayan bir yıkıcı bir yaklaşım sağlar. Düşük afiniteli sentetik Ca 2 + göstergeleri yayımlanan ve hedeflenen bir ER yardımıyla, rekombinant esteraz enzim aktivitesi ile ER lümen içinde sıkışıp kalırlar. ER lümen için Ca 2 + göstergesi boyaların Geliştirilmiş yükleme ER kalsiyum deposu dinamikleri doğrudan ve hızlı görüntüleme sağlar.

TED için hücre tipleri

Yöntemin etkinliği hücre hatları BHK21, HEK293 34, HeLa 17, SH-SY5Y, kültürlü astrositler 8,40 ve primer hipokampal, kortikal nöronlar 8,34,41 gösterilmiştir. Deneylerde, TED nispeten zayıf organizatörü (örneğin ubikuitin organizatörü) 35 kullanarak kendini inaktive lentiviral vektörler 37,39 ile tercihen, iyi TED yapıları stabil ifade çalışır. Diğer, daha güçlü destekçileri araştırılmaktadır.

Fluo5N ile başarılı TED yükleme nükleer bölgenin 34,41 dışında bağışladı ER lümen, bir net ve parlak boyama sunmaktadır. Dinlenme devletler de, Fluo5N/Ca 2 + kompleksi etiket dolayısıyla, bu ER lümeninde serbest kalsiyum bölgesel dağılımı temsil, Fluo5N bağlı kalsiyum lokalizasyonu temsil eder. Şekil 6'da, Fluo5N/Ca 2 konfokal fotoğraf +-kompleksleri ve kırmızı CES2 etiketinin RFP-T2, etiketler, HeLa hücreleri, kortikal astrositler ve hipokampal nöronlar gösterilmiştir. Şekil 6C, hücreye floresan Ca2 + karmaşık gösterge ortaya koymaktadır vücut yanı sıra hipokampal nöronların neurites. Bu daha küçük süreçlerde + sinyalleri (34,35 bakınız) Ca2 incelenmesi sağlar.

Bazı hastalarda whe gözlenecektir sitozolik bir etiketten tipik ER etiket ayırt etmek için gerekenn hücreleri hasarlı veya sağlıksız vardır. Sitozolik, endojen esteraz de sitoplazmada ve kalsiyum plazma zarından sızıntı çekirdeğin çok parlak boyama yol açar Fluo5N, bırakın. Fluo5N/Ca 2 Sitozolik boyama + TED-işaretli hücrelerin hücre dışı kalsiyum iyonofor mevcudiyetinde ionomycin, (Şekil 7) ile muamele edildikleri zaman görülmektedir.

ER kalsiyum serbest doğrudan görüntüleme

TED biri önemli uygulama ER mağaza tükenmesi 17,34 direkt görselleştirme olduğunu. Şekil 8, biz Kırmızı-CES2 ifade, hipokampal nöronlar ile yapılan bir temsilci deney göstermektedir. Kırmızı-CES2 ile nöronlar perinükleer bölgede Fluo5N yüksek miktarda (Şekil 8'de oklar) zenginleştirmek. SERCA engelleyici EBM perfüzyon ile uygulandığı zaman, ER kalsiyum mağaza bir hızla tükenmesi (Şekil 8B) görülmektedir. Burada mevcutnöronlar 12-bit ile görüntülü zaman elde edilen ham değerleri (y-ekseni). Görüntüleme koşulları Tablo 2'de listelenmiştir. TED nöronlara uygulandığında görülmektedir ROI başına ortalama floresan yoğunluğunda büyük değişim unutmayın. TED kullanarak nöronlarda ER kalsiyum serbest analiz diğer deneyler için, biz zaten ayrıntılı 8,34,35 olarak ele olmuştu önceki deneylerde, başvurmak istiyorum. Kısacası, in vitro nöronlarda TED ters konfokal lazer tarama mikroskobu 8,34 ile çok detaylı olarak SERCA duyarlı ER kalsiyum deposu görselleştirmek için kullanılan ve başarılı IiCR 34 neden mGluR1 / 5 hızlı görüntüleme (15 Hz) uygulandı.

Şekil 9, 20x objektif kullanılarak su düşük çözünürlükte perfüzyon sistemi ile 200 uM ATP ile uyarılan vitro fare kortikal astrositler ile tipik bir deney gösterilmiştir. Lentiviral enfeksiyon sonra, burada gösterilen hücreleri ifade Kırmızı-Bir ubikuitin promotörü tarafından sürülür CES2. Tarama hızı ~ 2 Hz ve her iki kanal (Fluo5N/Ca 2 + ve Kırmızı-CES2 füzyon proteini) aynı anda (paralel olarak) görüntülendi oldu. Deneyin başında, glial hücreler ekspresyon yapıları ve Fluo5N-AM ile iyi bir yükleme ile iyi enfeksiyonu gösterdi. Analiz edildi ROI 9A Şekil vurgulanır. Bir ROI floresan (bg), ROI 1-2 tam hücrelerinin floresan ölçmek arka ölçmek için kuruldu, ROI 3 hücre ve yatırım getirisi 4 tam görme alanı etrafında çizilmiş sadece ER kapsar. Kısa bir süre Fluo5N/Ca 2 ATP floresan ile uyarılması sonrası + kompleksleri aniden aşağı ER + serbest Ca 2 nedeniyle düştü. Son olarak, ER kısmen tekrar kalsiyum ile doldurulur. Aynı zamanda, RFP floresan beyazlatma sürekli hafif bir sonucu olarak (Şekil 9B, alt panel) azalır. Fluoresc değişiklikleri temsil İzleri ence yoğunluğu (Şekil 9C) TED önemli bir dezavantaj gelin. Birçok (hepsi değil) deneylerde Fluo5N-komplekslerinin yüksek miktarda uyarılması sırasında kaybolur. Sonuç olarak, floresan değerleri başlangıç ​​floresan seviyesine geri gelmiyor.

Şekil 10 Fluo5N/Ca 2 + etiketli ve ATP ile uyarılan yüksek çözünürlükte bir CES2-enfekte BHK21 hücre, gösterir. BHK21 hücreleri ER kalsiyum analizi 31 için erken modeli hücre sistemi olarak görev yaptı. ER kalsiyum serbest ve mağaza-dolum ER tübüller ince yapılarda görüntülenmiştir unutmayın. Yapılar 512 x 512 piksel, konfokal iğne deliği için Airy diski 1 ayarı ile ve bir 63x petrol amacı ile, yavaş hız (~ 0.2 Hz) görüntülü olmuştu.

"/>
Şekil 1. ER kalsiyum sinyal Bakış. ER kalsiyum sürümü gibi Sec61 karmaşık ER intramembrane gözenek olarak "kaçak" kanalları neden olur. G-protein bağlı reseptörler (GPCR) sonra IP 3-bağlı kalsiyum sürümü (IiCR) neden IP 3 üretim, teşvik. ER kalsiyum serbest STIM kompleksleri tarafından hissedilen ve Trp aile ve / veya Orai kalsiyum kanallarının iyon kanalları ile depo-kontrollü kalsiyum girişi (Soce) neden olduğu. Voltaj bağımlı kalsiyum kanalları (Ca V) riyanodin reseptörleri (RYR) tarafından ya doğrudan protein etkileşim (iskelet kası) veya fizyolojik etkileşim (kalp kası hücreleri, nöronlar) tarafından hızlı kalsiyum kaynaklı kalsiyum sürümü (CICR) aracılık. ER kalsiyum kaybı dinamik SERCA pompası (sarkoplazmik-endoplazmik retikulum kalsiyum ATPase) hareketi ile kurtarılır.

res.jpg "src =" / files/ftp_upload/50317/50317fig2.jpg "/>
Şekil 2. Hedef-esteraz bağlı boya yükleme (TED) ilkesi. Bir karboksilesteraz Hedefli aşırı ER yüksek esteraz aktivite (CES2) sağlar. Esteraz ER sıkışıp kalan kalsiyum duyarlı, floresan boya için Fluo5N-AM acetoxymethylester boya dönüştürür. Fluo5N kalsiyum iyonlarına karşı düşük bir afiniteye sahiptir. Bu nedenle, dinlenme koşulları altında, floresan Fluo5N/Ca 2 + kompleksi, tercihen kalsiyum konsantrasyonu sitoplazmada göre yaklaşık 1000 kat daha fazla olduğu durumlarda, ER oluşturulmaktadır.

Şekil 3,
Şekil 3,. Temsilcisi TED vektör yapıları CES2.: Fare CES2 yerli versiyonu. CES2 OPT 43: ERsinyal peptid değiştirilir ve ER tutma motifi klasik KDEL-ER tutma ve çözünür ER protein alma motifi olarak değiştirilmiştir ise şimdi, bir intron içerir edildi. Myc etiket indirek immunofloresan etiketleme ve Western blot analizi ile protein tespiti için bir epitop içerir. Kırmızı-CES2 8,43: Bir kırmızı floresan proteini düz aminoterminal sinyal peptid arkasında eklendi. Kırmızı LK CES2 43: A glisin-serin bağlayıcı RFP ve CES2 elemanı arasında esnek bir menteşe kurmak için getirilmiştir.

Şekil 4,
Şekil 4. TED kullanılarak direk olarak ER kalsiyum görüntüleme için iş akışı. Primer hücreler veya hücre hatları Hücre süspansiyonları, TED ifade yapıyı içeren bir virüs ile transduse edilmiştir. Hücreler daha sonra coversli üzerine ekilirps. TTT-CES2 yapıları kullanılarak, hücreler, kızıl flüoresans kullanılarak tespit edilebilir transduse. Hedef esteraz bağlı boya yükleme gibi Fluo5N-AM veya Mag-Fura2-AM ile bir AM-birleştiğinde düşük afiniteli bir Ca2 + gösterge ihtiva eden bir çözelti içinde görüntüleme hücreleri inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. ER kalsiyum görüntüleme ters bir lazer tarama mikroskobu (protokol) veya başka bir uyumlu görüntüleme cihazı ile yapılır. Canlı görüntüleme sırasında hücreler gibi yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) gibi bir görüntüleme çözeltisi ile sürekli perfüzyon altındadır. Hücre uyarma ya da perfüzyon ya da basınç-ejeksiyon yerel tarafından gerçekleştirilir.

Şekil 5,
Şekil 5,. Güçlü Epifloresans aydınlatma saniye içinde ER-özel Fluo5N TED etiket yok. Dik bir görüntüleme mikroskobu ile görüntülenmiş bir video Temsilcisi görüntüleri,. Burada, glial hücrelerde ifadeTTT-CES2 essing Fluo5N-AM ile yüklendi. İlk enfekte hücrenin kırmızı floresan bir CCD kamera ile ortaya çıktı. Daha sonra, Fluo5N/Ca 2 + sinyal bir LED ışık kaynağı ile aydınlatılmış oldu. Fluo5N/Ca 2 bir ilk açık ER lokalizasyonu + kompleksleri (sarı oklar) hızla 470 LED ışık kaynağı ve floresan dağıtım bir kayma (sarı oklar, 12.46 sn) nükleer alanda görünür hale güçlü aydınlatma tarafından yok edilir.

Şekil 6,
6 Şekil. Ile TED yükleme farklı hücre tiplerinde Fluo5N-AM Üst panel:. Stabil KIRMIZI-CES2 ifade ile HeLa hücreleri Orta paneli:. Kırmızı-CES2 ile lentiviral transdüksiyon sonra kortikal astrositler Alt Panel:. SAYI 8 KIRMIZI-CES2 ile hipokampal nöronlar. Tüm hücreler kültürlendi ve tekrar lamelleri Fluo5 ile boyandıK-AM gibi yöntem bölümünde tarif edildiği. Fluo5N bağlı zaman Fluo5N/Ca 2 + etiket aynı zamanda kalsiyum lokalizasyonu temsil eder. Ölçek çubuğu 40 mikron.

Şekil 7
Şekil 7. Sitoplazmasında Fluo5N boya ionomycin tedaviden sonra görünür hale gelir. Glial hücreler, Kırmızı-CES2 ile enfekte Fluo5N-AM ile etiketli ve ER kalsiyum tüketmek için SERCA-bloker thapsigargin ile tedavi edildi. Ionomycin tedavi dışı kalsiyum güçlü akını bağlı. (Üst panel) Hücreler + aracılı floresan Fluo5N/Ca 2 ciddi bir artış göstermektedir. (Alt panel) Fluo5N/Ca 2 ortalama yoğunluğu projeksiyon görüntü +-etiket floresan kalsiyum kompleksi tarafından tipik bir sitozolik etiketleme ortaya Mavi ok:. Bir parlak etiketli hücre bu hücre th kalsiyum yüksek miktarda sahip olduğunu gösterire sitoplazmada. Muhtemelen, bu hücre zarar görmüş Mor ok:. Hücreler parlak ionomycin tedavi üzerine sitoplazmada etiketli olur.

Şekil 8,
Şekil 8. SERCA engelleyerek nöronlarda ER kalsiyum deposu tükenmesi. (A) Hipokampal nöronlar (DIV 9) ekspres Kırmızı-CES2 (A, kırmızı) ve Fluo5N-AM (A, yeşil) ile etiketlenir. Oklar iki analiz hücrelere etmektedir. Görüntü (maksimum yoğunluk projeksiyonu) balta, deney başında satın alınan yz-görüntünün kırpılmış bir unsurdur. (B) 30 mcM CPA ile perfüzyon sonra ER kalsiyum deposu tükenmesi temsil Ham izleri. Burada 1000 resim 1 Hz ve 12-bit ile alınmıştır. İki hücre ROI başına ortalama floresan yoğunluğu ham değerleri (Y ekseni) Var gösterilenzaman (kırmızı ve mavi iz) üzerinde çizilen. Arka plan değerleri (siyah iz) sabit kalır. Floresan yoğunluğu temsil eden gri değerlerin AU = keyfi birimleri.

Şekil 9,
9 Şekil. Glial hücrelerin ATP uyarılması üzerine ER kalsiyum serbest. Glial hücreler Kırmızı-CES2 ile enfekte ve Ca 2 + göstergesi Fluo5N-AM ile yüklendi. Hücreler 10 saniye perfüzyon ile ATP 200 mcM ile uyarıldı. (A) Kırmızı-CES2 (orta) ifade Glial hücreler Fluo5N-AM (solda) ile etiketlenir. ROI vurgulanır. Hücreleri tepki önce (B) geçen zaman dizisi. (Üst panel) floresan çıkarılan Tek resimleri 0 sn ve 71 sn yüksektir. Bu aniden düşer (80 sn) ve 86 se de en az ulaşırc, bu kalsiyum gibi (160 sn) tekrar yükselir önce ER geri pompalanır. (alt panel) RFP'nin Floresan yoğunluğu ağartma nedeniyle zaman içinde yavaş yavaş ve sürekli olarak azalır. (C) Zaman izleri mesafe kadar taşınmış / F 0 değerleri gösteren ROI kalsiyum konsantrasyonu gösteren, floresan A'da belirtilen, ATP stimülasyon sonra aşağı düşer ve kısmen kurtarır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 10
10 Şekil. BHK21 hücreleri ATP'ye bağlı kalsiyum tahliyesinin yüksek çözünürlüklü görüntü. Hücreler Fluo5N-AM yüklendi ve hücre dışı kalsiyum mevcudiyetinde görüntülendi. Grip değişiklikleri gösteren (A) Görüntü serio5N/Ca 2 ATP-stimülasyon sırasında floresan + kaynaklı. (B) Ortalama yoğunluk projeksiyon görüntü (C) ATP bağlı kalsiyum serbest bırakılması ve ER kalsiyum deposunun dolum ER küçük alt bölgeler incelendiğinde C gösterilen ROI gösterir. Izleri floresan değişiklikleri temsil eder.

Tahrik olma lazer [nm] Algılama aralığı [nm]
Kırmızı-CES2 vektör yapıları ile TED
473 (Fluo5N/Ca 2 +) 507-545
559 (Tag-RFP-T2) > 570
CES2 sadece vektör yapıları ile TED
473 nm (Fluo5N/Ca 2 +) > 507

Tablo 1. Spektral dedektör ayarları.

Deney Kırmızı-CES2 kullanarak ER tükenmesi Bir CES2 yapı kullanılarak nöronların uyarılması Yüksek uzaysal çözünürlüklü görüntüleme, CES2
Amaç (NA) 20x su (0.7) 20x su (0.7) 40x oil/63x yağı (≥ 1,3)
473 nm Lazer
Güç % 1 % 1
HV A 600-780 600-780 400-780
B Kazanç 0-1% % 1-2 0%
Dengelemek 0 0 0
559 nm Lazer
güç % 1 OptioNALC optionalC
HV A 600-780 optionalC optionalC
B Kazanç 0-1% optionalC optionalC
Dengelemek 0 optionalC optionalC
Tarama hızı 1-2Hz Ücretsiz çalışma Ücretsiz çalışma
Fotoğraf boyutu 320x320 piksel 240x240 piksel 512x512 piksel
Tipi Tarama Doğrultusunda Çift yönlü Nyquistcriterion (2 piksel / elemanı)
Uyarım 100-200 mcM ATP :5-15 sn; 5-15 saniye 200-500 mcM glutamat 100-200 mcM Agonist: 5-15 sn
Iğne deliği 2-5 havadar diskler 2-5 havadar diskler 1 havadar disk

Tablo 2'de. Deney türüne göre mikroskop ayar örnekleri C:. HV = photomultiplier dedektör, B akım: kazancı = PMT sinyal, C amplifikasyon: isteğe bağlı: Kanal diğer kırmızı floresan boyalar ile kullanım için ücretsizdir (örneğin CMX-Ros mitokondriyal potansiyel) ya da diğer kırmızı floresan proteinleri görselleştirmek için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TED yöntemin avantajları ve dezavantajları son yayınları 34,35 yaygın olarak tartışılmıştır. Yukarıda tarif edilen diğer yöntemleri ile karşılaştırıldığında, TED hücreleri bozan ve perfüze problemini önlediği. Ayrıca, iki açıdan vurgulanması gerekir. ER kalsiyum görüntüleme için TED prensibi TED vektör yapıları yardımıyla ve düşük afiniteli bir sentetik AM-esterlerin (2). Verimli ve tercihli serbest bırakılması ile ER lümeninde aktif karboksilesteraz bölgesinin (1). Hedeflenen ifade gerektirir ER lümen kalsiyum boyalar.

1. TED vektör oluşturur

Şekil 3, TED vektör yapıları gelişimini göstermektedir. TED CES ailesi proteinleri (EC 3.1.1.1) temelinde geliştirilmiştir. Bu proteinler ER lümeninde üyeleri ikamet eden. In vitro CES proteinlerin rekombinant idaresi ve kararlı sentezlenmesi, ardından en uygun çalışmalarya da orta derecede protein ekspresyon seviyeleri ile viral enfeksiyon sonrası. Şu anda, esteraz aktivite ile diğer proteinler TED görüntüleme için CES proteinleri değiştirebilirsiniz bilinmemektedir. Bu hücreler transfeksiyon işlem sonrası daha az duyarlı olduğu için dinamik ER kalsiyum analizi için TED vektörlerin geçici transfeksiyon kullanılması tavsiye edilmez. CES proteinler uygun ER lümen hedefleyen ve bu adımı ER sinyal peptid etkin bir bölünme ihtiyacı duyar. Buna ek olarak, saklama ve ER lümeninde CES proteinlerin alma kendi aminoterminal KDEL benzeri motifi tarafından aracılık edilir. Yüksek ekspresyon düzeyleri geçici transfeksiyondan sonra TED vektörleri ile üretildiği zaman Bu mekanizmalar, doymuş olabilir. Bu olabilir CES-proteinlerin yanlış bir yerelleştirme neden olur ve protein agrega oluşumunu destekler.

2. Düşük afiniteli Ca 2 + TED Göstergeleri

TED en önemli dezavantajı boşuna sınırlamaları neden olurER kalsiyum olmayan yıkıcı analiz için mümkün göstergesi boyalar. TED ER kalsiyum görüntüleme yüksek bir Kd (düşük afiniteli bir anlam) ve kalsiyum yokluğunda düşük bir floresan ile göstergesi boyalar gerektirmektedir. Deneyimlerimiz Fluo5N-AM oturtmakta en iyi çalışır, ancak bu gösterge boya çamaşır suyu dayanıklı değildir. Düşük afinite Ca 2 + göstergeleri Mag-Fura2-AM (K D ~ 25-50 mcM) 34 ve Mag-Fluo4 (K D ~ 20-25 mcM) da test edildi. Her iki boyalar iyi TED tarafından ER yapılarına yüklenen, ama ER serbest uyarılması üzerine "karışık sinyaller" üretme riski yüksektir vardır. Bir "karışık sinyal" ilk ER floresan azalma takip sitoplazmasında floresan hızlı bir artışı temsil etmektedir. Bu sınırlama üstesinden gelmek için, ER kalsiyum görüntüleme için yıkıcı yaklaşımlar 32,35 yardımcı olabilir. Mag-Fluo4 (K D ~ 20-25 mcM) Fluo5N-AM daha az belirgindir Golgi sisternaları güçlü bir TED-aracılı etiket, gösterir is kullanılır.

Uygulamalar ve Perspektifler

Burada TED ER kalsiyum dinamik konfokal analizi tarama ters lazer odaklanmak. TED ölçümleri de uygun uyarım kaynağı (lazer, LED, metal halid lambalar, monokromatör), filtre ve floresans saptama sistemi 6 ile herhangi bir standart konfokal sistemi veya geniş alan sisteme adapte edilebilir.

TED ER yeterli endojen CES aktivitesinin olmayan bu hücrelerde özellikle yararlıdır. Biz örneğin BHK21 hücreleri düşük afinite göstergeleri serbest bırakmak için ER yeterli endojen esteraz aktivite sağladığı gözlenmiştir. Bizim ellerde, bu diğer birçok hücre hatları (HEK293, SH-SY5Y, HeLa, PC12), birincil glia ve primer nöronlar ile durum böyle değil. Burada, TED yöntem ER başarılı olmayan yıkıcı boya yükleme sağlar.

Gelecek TED vektörler için ER lümen gelen ölçüde uygulama olabilirdiğer hücre içi bölmeler veya cep microdomains. TED metodun prensibi işaret boya bağımsızdır ve bu nedenle hücre içi pH dinamiklerinin görüntülenmesi için, örneğin bir boyanın AM-ester ile kullanılabilir. Son zamanlarda, Luke D. Lavis laboratuvar rekombinant domuz karaciğer esteraz (PLE) CES1 cyclopropylester boyalar 42 ile bir seçici esteraz-ester çift oluşturduğunu anlattı. Cyclopropylester ajanlar endojen esterazlar ve 42 hedef rekombinant CES etkinliği etkinleştirilmiş hücre özel molekülü tarafından seçici maskesinin hidrolize dayanıklı olduğu bulunmuştur. Bu kadar yeni bir teknik dayalı kalsiyum göstergeleri sentetik göstergelerin hücre içi hedef özgünlüğü artıracak olup olmadığını araştırmak ilginç olacaktır.

TED proteinler stabil ifade edildiğinde TED hücre hatlarında iyi çalışır. Istikrarlı TED hücre hatları ile bir koleksiyon kurulması yararlı olacaktır.

Transgenik TED fare modelleri de büyük bir çalışmamızın amacı ve bu özel nöronal devreleri, iskelet kası, kalp, ya da damar sistemi hazırlıkları belirli doku hazırlıkları TED sağlayacak bulunmaktadır. Bu fare modeli daha fizyolojik doku bağlama hücresel seviyesinden ER kalsiyum dinamiklerinin analizi aktarmak için yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 ve Friedrich-Baur-Stiftung hibe tarafından desteklenmiştir. Biz Tag-TTT-T2 bize sağlamak için Kaliforniya, San Diego Üniversitesi'nde Roger Y. Tsien, Howard Hughes Tıp Enstitüsü Laboratuvarları teşekkür etmek istiyorum. Biz çok şükür ki bize lentiviral plazmid FUGW sağlayan ve psPAX2/pMD2.G için David Baltimore, California Institute of Technology, Pasadena, ve Didier Trono, Cenevre, Cenevre, Üniversitesi kabul.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine) Tocris 0805
5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate Sigma A26209-1G
B-27 supplement,50x Invitrogen 17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol) Sigma C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA) Ascent scientific Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma D2650
DMEM with Glutamax Invitrogen-Gibco 31966-047
Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x PAA H15-002
Fetal calf serum Invitrogen-Gibco 10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg Invitrogen F14204
Glutamate Ascent scientific Asc-049
Glutamax Invitrogen 35050-038
Ham's F12 nutrients mixture Invitrogen-Gibco 21765-029
Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS PAA Laboratories H15-010
Horse serum SHD3250YK Linearis
Ionomycin Ca2+ salt Ascent scientific Asc-116
murine EGF PreproTech 315-09
N2 supplement 100x Invitrogen 17502-048
Neurobasal medium Invitrogen-Gibco 21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g Invitrogen P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN Sigma P8638
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
Poly-L-Lysin Sigma P2636
Thapsigargin Calbiochem 586005-1mg
TryLE Express Invitrogen 12605-028
Trypsin Worthington LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean) Sigma T6522
Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81 Olympus user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635) Olympus user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector Olympus user-specific configuration
Heater controller TC-344B Warner Instruments 64-0101 to control in line solution heater
NIH ImageJ software WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35 Olympus N2709100
Objective: UPLFLN40XO Olympus N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15 Olympus N1480700
Perfusion chamber, inverse custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS Warner Instruments W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49 Warner Instruments 64-1730 for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels) Gilson n.a. perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B Warner Instruments 64-0102 controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R Warner Instruments 64-1407 for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel Pecon n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).
  2. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).
  3. Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
  4. Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. Local calcium signaling in neurons. Neuron. 40, 331-346 (2003).
  5. Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21, 13-26 (1998).
  6. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73, 862-885 (2012).
  7. Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59, 861-872 (2008).
  8. Jaepel, J., Blum, R. Capturing ER calcium dynamics. European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).
  9. Verkhratsky, A. Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons. Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).
  10. Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).
  11. Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate. Nature. 306, 67-69 (1983).
  12. Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction. Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).
  13. Clapham, D. E. TRP channels as cellular sensors. Nature. 426, 517-524 (2003).
  14. Cahalan, M. D. STIMulating store-operated Ca(2+) entry. Nature Cell Biology. 11, 669-677 (2009).
  15. Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. Sensing cellular stress through STIM proteins. Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).
  16. Erdmann, F., et al. Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum. The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).
  17. Schäuble, N., et al. BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER. The EMBO Journal. , (2012).
  18. Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).
  19. Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).
  20. Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).
  21. Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).
  22. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J. Vis. Exp. (23), e1067 (2009).
  23. Lang, S., Schäuble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms. J. Vis. Exp. (53), e2730 (2011).
  24. Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. Looking forward to seeing calcium. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).
  25. Mank, M., Griesbeck, O. Genetically encoded calcium indicators. Chemical Reviews. 108, 1550-1564 (2008).
  26. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  27. Montero, M., et al. Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells. The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).
  28. Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
  29. Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations. EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).
  30. Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).
  31. Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).
  32. Solovyova, N., Verkhratsky, A. Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches. Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).
  33. Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry. The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).
  34. Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).
  35. Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum. 43, Humana Press. (2010).
  36. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 5, 545-551 (2008).
  37. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
  38. Zufferey, R., et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).
  39. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).
  40. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).
  41. Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Calcium measurement methods. Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), Humana Press. 147-167 (2010).
  42. Tian, L., et al. Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).
  43. Samtleben, S., Blum, R. Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading. , In preparation (2012).

Tags

Hücresel Biyoloji Sayı 75 Nörobiyoloji Nörobilim Moleküler Biyoloji Biyokimya Biyomedikal Mühendisliği Biyomühendislik Viroloji Tıp Anatomi Fizyoloji Cerrahi endoplazmik retikulum ER Kalsiyum Sinyali kalsiyum deposu kalsiyum görüntüleme kalsiyum göstergesi metabotropik sinyalizasyon ca Nöronlar hücreler fare hayvan modeli hücre kültürü hedeflenen esteraz bağlı boya yükleme görüntüleme
Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samtleben, S., Jaepel, J., Fecher,… More

Samtleben, S., Jaepel, J., Fecher, C., Andreska, T., Rehberg, M., Blum, R. Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED). J. Vis. Exp. (75), e50317, doi:10.3791/50317 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter