Summary
Targeted-esterase induzida corante de carregamento (TED) suporta a análise da dinâmica intracelular de cálcio loja por imagens de fluorescência. O método baseia-se na segmentação de uma carboxilesterase recombinante para o retículo endoplasmático (ER), onde se melhora o desmascaramento do local sintético de baixa afinidade Ca
Abstract
Visualização da dinâmica do cálcio é importante para entender o papel do cálcio na fisiologia celular. Para examinar a dinâmica de cálcio, Ca 2 + indicadores fluorescentes sintéticos tornaram-se populares. Aqui demonstramos TED (= targeted-esterase induzida corante de carga), um método para melhorar a libertação de Ca2 + corantes indicadoras no lúmen do ER de diferentes tipos de células. Até à data, o TED foi utilizado em linhas de células, células gliais e neurónios, in vitro. TED sobre bases eficientes, recombinante alvo de uma atividade de alto carboxilesterase para o lúmen ER usando vetores construções que carboxilesterases rápidas (CES). Os últimos vectores TED contendo um elemento de núcleo de CES2 fundida com uma proteína fluorescente vermelha, permitindo assim imagiologia simultânea de duas cores. A dinâmica do cálcio livre na ER são gravadas em uma cor, enquanto a estrutura ER correspondente aparece em vermelho. No início do processo, as células foram transduzidas com um lentivírus. Posteriormente, as células infectadas are semeadas em lamínulas para finalmente permitir imagens de células vivas. Em seguida, as células vivas são incubadas com o éster acetoximetílico (AM-éster) forma de baixa afinidade Ca 2 + indicadores, por exemplo Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, ou Mag-Fura2-AM. A actividade de esterase nos cliva fora do ER cadeias laterais hidrófobas da forma AM do indicador de Ca 2 + e de um corante fluorescente / Ca 2 + complexo hidrófilo é formado e preso no lúmen do ER. Depois de corante de carga, as células foram analisadas num microscópio confocal laser scanning invertido. As células são continuamente perfundido com soluções de Ringer-like e as dinâmicas ER cálcio são diretamente visualizados por imagem time-lapse. Libertação de cálcio a partir do ER é identificado por uma redução na intensidade de fluorescência em regiões de interesse, enquanto que o reenchimento da loja ER cálcio produz um aumento na intensidade de fluorescência. Finalmente, a mudança na intensidade de fluorescência ao longo do tempo é determinada pelo cálculo da Af / F 0.
Introduction
A fim de resolver as respostas fisiológicas de cálcio do ER, desenvolvemos uma nova estratégia para melhorar a retenção de corantes sensíveis cálcio sintéticos para o ER. O método permite o monitoramento em tempo real direto, sem interrupções de livre ER cálcio na presença de cálcio extracelular.
Função e sinalização de cálcio ER
Sinais de cálcio são encontradas em diferentes tipos de células, células musculares, por exemplo, neurónios e células gliais e a sua gama de funções de mediar a contração do músculo a um envolvimento na transmissão sináptica na aprendizagem e na memória 1,2. As alterações na concentração de cálcio livre são de interesse científico porque o cálcio está envolvido na regulação da transcrição de genes, a proliferação celular, a excitabilidade neuronal, morte celular e outros eventos de sinalização celular 1-7. Todos estes sinais de cálcio celulares estão funcionalmente ligados e contribuir para cálcio intracelularloja dinâmica 8-10.
Uma característica comum a todos os sinais de cálcio é o fluxo de cálcio entre o espaço extracelular, o citosol e organelas, principalmente, o ER e mitocôndrias. Isto faz com que as alterações dinâmicas na concentração de cálcio dentro destes organelos, que são detectados pelos diferentes componentes de sinalização. Em geral, a concentração de cálcio em gamas de RE entre 100 a 800 | iM, no citosol da concentração de cálcio é de cerca de 100 nM, e no espaço extracelular, a concentração é de cerca de 1-2 mM. Assim, não existe uma força motriz maior para o fluxo químico cálcio para o citosol 2,9,10.
Os sinais de cálcio ER derivados mais comumente investigados dependem da estimulação dos receptores acoplados à proteína G (GPCR), que, em seguida, activam a fosfolipase C (PLC). PLC em vez produz o inositol 1,4,5-trifosfato (IP 3) 1. Após a ligação de IP 3 à sua conseptor (IP 3-Rec, Figura 1) na ER-membrana, os íons cálcio são liberados a partir do lúmen ER. Historicamente, a liberação de cálcio 3 mediada IP do ER foi o primeiro - mesmo que indiretamente - medido em células pancreáticas acinares por Streb et al, em 1983, 11.. Esta publicação sugeriu pela primeira vez que uma cascata de sinalização que envolvem a acetilcolina, a fosfolipase C e IP3. Esta forma de libertação de cálcio é geralmente denominado libertação de cálcio induzida por IP 3 (IiCR) (Figura 1). Ativação da quinase dependente de fosfolipase Cy por receptores tirosina quinases liga a ação de fatores de crescimento e fatores neurotróficos para ER cálcio sinalização após IP 3 elevação 12. Além IiCR, elevação de cálcio podem ser a entrada de cálcio mediada por receptores ionotrópicos, por exemplo através de canais de cálcio dependentes da voltagem (Ca V), e subsequente libertação de cálcio induzida por cálcio (CICR) por re rianodinaceptors (RyR). IiCR e CICR são fisiologicamente ligado a entrada de cálcio loja operado (SOCE). SOCE inclui a ação do STIM (molécula interagindo estroma), que é um sensor para a liberação ER cálcio. STIM foi mostrada para estimular a entrada de cálcio extracelular através de canais de receptores transientes potenciais (Trp) 13, Orai canais de cálcio de 14 e até mesmo dos canais de cálcio dependentes da voltagem 15 (Figura 1). Perda de ER cálcio é dinamicamente resgatado pela ação do Sarco-retículo endoplasmático cálcio ATPase (SERCA), que ativamente bombas de cálcio de volta para o ER. O bloqueio da SERCA com drogas tais como tapsigargina revela uma perda contínua de cálcio RE para o compartimento citosólico. Este requisito de cálcio "fuga" é causado por ER intramembrane complexos de poros, tais como o complexo de proteína de 16,17 Sec61 (Figura 1).
Em 1998, Berridge publicou um modelo, o "neurônio dentro de um modelo de neurônio", which sugere um papel fisiológico princípio da ER na integração de cálcio neuronal 5. Este modelo considera a existência de um sistema de membrana ER contínuo formando uma "imagem" intracelular da membrana plasmática neuronal 5. Este sistema de membranas eucarióticas binário foi reivindicada a ser um pré-requisito básico para a integração temporal e espacial dos sinais de cálcio rápidas e lentas em neurônios. Sinais de cálcio que ocorrem ou concomitantemente ou posteriormente em diferentes espinhos ou dendritos de um mesmo neurônio são conferidos a soma ou núcleo através da ER, onde se resumem 5,18 da célula. Então, a soma pode ter efeitos sobre a excitabilidade do neurônio, a regulação da transcrição do gene ou a integração de cascatas de sinalização. Assim, o ER suporta a integração de sinais de cálcio. Um pré-requisito para este conceito é a continuidade do ER de uma única célula, o que foi reivindicado em diversos estudos e que foi provado pelo menos para somato-dáreas endritic e curta distância projeções axonais 19-21. Se há continuidade ER dentro projeções axonais longas é uma questão de debate.
Estratégias para medir o fluxo de cálcio livre sobre a membrana ER
Sinais de cálcio são mais frequentemente monitorados no citosol 22,23. Portanto, não pode ser facilmente distinguida se Ca 2 + a fluir para o citosol a partir extracelular ou de reservas intracelulares 6,24. Para superar esta limitação, foram desenvolvidas estratégias metodológicas para a imagem latente de cálcio direto ER. Em resumo, são utilizadas as seguintes estratégias: (1) ER-alvo geneticamente modificadas indicadores de proteína-25-27 de baixa afinidade de Ca 2 + os indicadores baseados Proteína utilizar a proteína bioluminescente aequorina GFP ou em combinação com uma proteína. Sensível ao cálcio. Estes Ca 2 + indicadores geneticamente modificados (Gecis) podeser orientada para o ER, com a ajuda de um péptido de sinal e são activamente mantido no ER e de retenção utilizando um padrão de recuperação. Comum ER Ca 2 + indicadores de base no princípio da Cameleon e são o Cameleon YC4.3 26,28; Cameleon divisão YC7.3ER 29, e Cameleon D1 30. (2) direto carregamento de AM-éster de baixa afinidade Ca 2 tintura baseada em indicadores esterase + 31,32. Dos corantes indicadoras (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM ou Fluo5N-AM) derivativos AM passar o membranas biológicas em um estado de cálcio-insensitive lipofílico. Em seguida, no citosol, bem como no ER, esterases endógenas de clivar o grupo de AM-éster e libertar o indicador de Ca2 +, deixando para trás uma certa quantidade de corante activa no citossol e no ER. Por conseguinte, esta abordagem é útil em condições de uma elevada concentração de cálcio no ER, enquanto a concentração de cálcio citosólico permanece bem inferior ao nível delimite de protecção dos indicadores de baixa afinidade, em particular durante os sinais característicos de cálcio (por exemplo, de baixo nM até uM). (3) Carga AM-éster, em combinação com a permeabilização da membrana do plasma 32. Qualquer citosólica de Ca2 + indicador remanescente é removido por permeabilização da membrana do plasma com quantidades pequenas de um detergente "leve" (por exemplo, saponina) num tampão intracelular artificial. Assim, as membranas intracelulares podem ser estimuladas, por exemplo, com IP 3 intracelular no tampão, directamente através de "poros" da membrana plasmática. (4) Diálise do citosol sob configuração de célula inteira e medições simultâneas de Ca 2 + no lúmen ER e citosol 32,33. Uma célula é carregado pela primeira vez com uma baixa afinidade Ca 2 + indicador (por exemplo, Mag-Fura2- AM, raciométrica, UV-luz). Depois, com a ajuda de uma pipeta de remendo, qualquer cit remanescenteosolic baixa afinidade de Ca 2 + indicador é dialisado para fora do citosol com um tampão contendo um indicador de Ca2 + de elevada afinidade (por exemplo, Fluo-3, luz visível). Esta estratégia permite a gravação simultânea de sinais derivados citosólicas e ER. (5) Targeted-esterase induzida corante de carga de 8,34. Carboxilesterase (CES) está voltado para o lúmen do RE e proporciona uma elevada actividade de esterase de aprisionamento eficaz da forma de AM-éster de baixa afinidade de Ca 2 + indicadores.
Targeted-esterase induzida corante de carregamento (TED)
Para melhorar o direcionamento de baixa afinidade de Ca 2 + indicadores para o lúmen ER, TED foi desenvolvido. TED requer a superexpressão de uma carboxilesterase alvo rato ER (CES2) (Figura 2), o que é conseguido por meio de construções de expressão. As células que expressam uma construção recombinante CES-são incubadas com a forma de AM-éster de cálcio emcorante dicator (Fluo5N-AM, a Figura 2). Em seguida, no ER, o corante é convertido para o Ca2 + sensíveis, a membrana impermeável de Ca 2 + complexo indicador (Fluo5N/Ca 2 +), pela elevada actividade de esterase, aprisionando, por conseguinte, o corante numa concentração elevada no lúmen ER 8 , 34. O método é especialmente útil para investigar ER-libertação de cálcio através dos IiCR-vias, por exemplo por meio de purinérgicos ou receptores de glutamato metabotrópicos, 8,34 e visualizar a depleção de cálcio através da "ER" canais de vazamento, por exemplo, directamente após o bloqueio da 17 SERCA , 34. Para nossa experiência, a baixa afinidade Ca 2 + indicador Fluo5N-AM é atualmente o melhor indicador disponível para usar com a estratégia de carregamento TED corante. Fluo5N-AM tem uma baixa afinidade pelo Ca 2 + (constante de dissociação K D ~ 90 mM, figura 2), é quase não-fluorescente em seu AM-forma, mas oferece emissão de fluorescência de alta sobre calciu8,34 m de ligação. O Fluo5N/Ca 2 + complexo pode ser excitado com uma fonte de luz padrão de ~ 490 nm, o que corresponde a corantes convencionais, tais como FITC, Alexa 488, ou eGFP. Sinais de cálcio citosólico dificilmente atingir uma concentração na gama uM baixo e são, portanto, apenas detectada por Fluo5N no citosol 35.
Para melhorar o desempenho TED, várias construções de vectores recombinantes foram desenvolvidos (Figura 3). Originalmente, os vectores de TED baseados na sequência de codificação de CES2 (RefSeq número de acesso NM_145603, CES2c) e melhor desempenho TED é observado com a expressão estável de CES construtos. Novos vetores TED expressar um elemento central da CES2 fundido à proteína fluorescente vermelha TagRFP-T2 36. Estes vectores possuem a vantagem de que eles podem ser utilizados para identificar as células transduzidas e utilizar a fluorescência vermelha como um controlo interno para a normalização de alterações na Fluo5N/Ca 2 + fluorescência. A fluorescência vermelha também oferece a possibilidade de visualizar a distribuição estrutural do ER e as alterações na dinâmica do ER sob condições de estimulação.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este protocolo apresenta a TED aplicada a linhas de células, neurónios do hipocampo e células da glia corticais. TED desempenho é melhor quando vetores TED são estavelmente expressa, por exemplo, lentivirais. Uma visão geral esquemática do método TED é mostrado na Figura 4.
1. Preparação das soluções
As seguintes soluções devem ser preparadas antes de partida e pode ser armazenado tal como indicado. Nós usamos geralmente vidro esterilizado e material plástico e água esterilizada.
- Prepara-Ringer HEPES (em mM): 125 NaCl, 3 de KCl, 25 de HEPES, 2 de MgSO 4 .7 H 2 O, 2 de CaCl2, 1,25 NaH 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H 2 O.. Isenta de cálcio-Ringer HEPES consiste em (em mM): 127 NaCl, 3 de KCl, 25 de HEPES, 2 de MgSO 4 .7 H 2 O, 1,25 NaH 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H 2 O e 0,1 EGTA.. Sem glicose estas soluções de imagem pode be armazenado a 4 ° C. A quantidade necessária de D-glucose é recém-acrescentado antes da utilização.
- Para a análise TED em neurônios do hipocampo, é recomendável líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF). ACSF é composta por (em mM): 127 NaCl, 23 NaHCO3, 3 de KCl, NaHPO 4 2,5 H 2 O, 25 D-glucose.H 2 O, 2 de CaCl2, 2 de MgCl 2 0,7 H 2 0 em DDH. 2 0.
- Prepara Fluo5N-AM a uma concentração de 5 mM. Para ajudar a solubilização de adicionar 8,9 mL de 20% de Pluronic F-127 (em DMSO, armazenada a temperatura ambiente, protegidos da luz e humidade) e 50 ug de liofilizado Fluo5N-AM. Então solubilizar Fluo5N-AM por meio de um banho de água sonicador durante pelo menos 2 min. Loja alíquotas de 0,5 mL a -20 ° C, protegido da luz e umidade.
- Prepare antagonista e ações agonistas, conforme necessário. Por exemplo: a) 10 mM ATP ou ADP (em H 2 O, a activação de receptores purinérgicos metabotrópicos), b) 10 mM de carbacol em H2O (agonistado receptor muscarínico de acetilcolina), c), 30 mM de ácido ciclopiazônico (CPA) em DMSO (bloqueador do SERCA), d) DHPG 50 mM em PBS (agonista do receptor de glutamato metabotrico do tipo I e para mGluR do mGluR 5), e), 10 mM de Glutamato em H 2 S, f) ionomicina 1 mM em DMSO (ionóforo), g), 5 mM em DMSO, tapsigargina (bloqueador de elevada afinidade do SERCA). Loja de alíquotas a -20 ° C.
- Lentivirais: Este protocolo inclui a utilização de partículas de vector de expressão lentiviral TED. Sua produção e armazenamento não faz parte do presente protocolo. Usamos lentivirais da segunda geração para a transferência de carboxilesterases recombinantes de linhagens celulares, células da glia e os neurónios. Nossas bases do sistema lentivírus no vetor de expressão FUGW 37, e os plasmídeos de empacotamento pCMVΔR8.91 ou psPAX2 eo pseudotipagem plasmídeo pMD2.G 38,39 ATENÇÃO:. Considere-se que o trabalho com recombinantes auto-inativando lentivirais requer o cuidadoconsideração de normas de biossegurança. Em muitos países, esses vetores são classificados como grupo de risco de risco biológico 2. Para mais informações consulte http://www.addgene.org/lentiviral/ .
2. Preparação e infecção viral do mouse neurônios do hipocampo
- Lave lamínulas de vidro em um copo de Petri de 20 cm de diâmetro (100 lamelas por prato) 1x em etanol 70% por aproximadamente 30 min. Finalmente, adicionar etanol a 100% (PA) durante 2 min. Remover o etanol residual e as lamelas secar sob um exaustor estéril.
- Prepare-se dois tipos diferentes de mídia para culturas de neurônios do hipocampo: (a) média neurobasal com B27 01:50, (b) meio cheio: médio neurobasal com B27 01:50, Glutamax 1:100, e N2 suplemento de 1:100. Estéril filtrado a mídia e armazená-los na célula incubadora até o uso.
- Um dia antes da dissecação, as lamelas são preparados colocando em primeiro lugar uma lamela de 10 mm estéreis, em cadapoço de uma placa de cultura de células de 4 poços. Em seguida, cuidadosamente revestimento cada lamela com 80-100 ul de 0,1% de poli-L-lisina e armazenar os pratos numa incubadora durante a noite.
- No dia da dissecção e cultura de células, começam com as lamelas de lavar três vezes com 100 ul de HBSS e transferir 100 ul de meio neurobasal cada lamela. Coloque os pratos em uma incubadora de equilíbrio (por exemplo, durante a dissecção de camundongos).
Dissecação
Realizamos nossos experimentos com ratos, de acordo com as orientações da União Europeia, conforme aprovado pelo nosso cuidado com os animais institucional e comitê de utilização.
- Remover o cérebro total e dissecar o hipocampo bilateralmente.
- Remova cuidadosamente qualquer meninges e tecido diferente do hipocampo e coloque um hipocampo cada um em um tubo de 1,5 ml contendo 450 ul de HBSS. Armazenar o tecido em gelo até um número suficiente de hipocampo foi isolada.
- Adicionar 50 ul de 1% de tripsina (Worthington) a cada tubo e incubar em banho de água a 37 ° C durante 15 min. Agitar os tubos ocasionalmente. Para parar a reacção de digestão, adicionar 50 ul de inibidor de tripsina de de 1% a cada tubo e inverter o tubo várias vezes.
- Transferir todo o tecido de até 5 hipocampos de 15 ml para um tubo Falcon de evitar a transferência de líquido. Adicionar meio B27 (a), para um volume final de 5 ml.
- Triturar o tecido usando um fogo polido Pasteur pipeta de vidro com cuidado pipetando para cima e para baixo CUIDADO:. Evite bolhas de ar!
- Spin com 400 xg durante 3 minutos, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio B27 (a).
- Tritura-se o tecido uma vez com a pipeta de vidro, e, em seguida, duas vezes com a ajuda de uma ponta de filtro de plástico ul 1000. Executar esta como descrito nas etapas 2.9 e 2.10.
- Após a última centrifugação, ressuspender o sedimento celular em 2 ml cheio medium (b), e tritura-se as células com uma ponta de filtro de plástico pi 200. Para separar aglomerados de células restantes a partir da suspensão de uma única célula, vamos aglomerados de células sossegar por 1-2 min.
- Contar as células e calcular o número total de células necessárias para a infecção virai. Para usar imagens TED 25.000 células por 10 milímetros lamela.
- Plating adicional de 25.000 células não transduzidas, como controlo é recomendada neste ponto.
Infecção viral
- Transferência da suspensão de células para a infecção virai em um novo tubo Falcon de 15 ml e centrifugar durante 3 min a 400 x g.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 300 ul de meio (b)
- Adicionar uma quantidade apropriada de partículas de vector de expressão de lentivírus infecciosas TED e deixar o tubo Falcon de repousar à temperatura ambiente durante 10 min.
- Encher o tubo com o meio completo (b) para o volume final necessário para revestimento (100 uL para cada lamela 10 milímetros), aspirar o meio a partir do coverslip e coloque imediatamente 100 mL suspensão celular em cada lamela.
- Coloque os pratos na incubadora até que todas as células se estabeleceram (aproximadamente 2 horas) e preencher cuidadosamente os pratos até que eles contêm 2 ml de meio (b).
- Deixe neurónios crescer durante pelo menos uma semana. Substituir 50% do meio de cada semana.
3. Cultura e Viral-infecção de células gliais corticais mouse
Preparação
- Comece a preparação meio basal glia (mistura 1:1 de DMEM/F12 com 10% de FCS, 5% de HS, 1% de penicilina / estreptomicina, 0,45% de glucose) e revestimento de um frasco de cultura de célula T75 com 4 ml a 0,5 ng / ml Poly -DL-ornitina bromidrato (PORNÔ) (diluído em solução de ácido bórico 150 mM, pH 8,35). Após incubação a 37 ° C durante 2 horas ou durante a noite, lava-frasco de cultura de célula, três vezes com HBSS e adicionar 18 ml de meio basal contendo glia B27 1:50 e 10 ng / ml de EGF. Equilibrar frasco de cultura de célula na incubadora (até 3 horas).
- Realizamos nossos experimentos com ratos, de acordo com as orientações da União Europeia, conforme aprovado pelo nosso cuidado com os animais institucional e comitê de utilização.
- Dissecar o cérebro de um rato P5, P7 e remover o hipocampo e as meninges de ambos os hemisférios, como descrito em 2.5.
- Dissecar o córtex frontal, corte-o em vários pedaços pequenos e coletá-los em um tubo de 1,5 ml contendo HBSS. Armazenar o tubo em gelo e prosseguir para a parte de cultura de células.
A cultura celular
- Transferir todo o tecido a partir do tubo de um tubo de 15 ml Falcon usando uma pipeta de vidro polido fogo.
- Adicionar meio basal até um volume final de 5 ml e tritura-se o tecido diversas vezes, pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de vidro polido fogo. Após centrifugação a 300 xg durante 3 minutos, aspirar o meio, e ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio basal.
- Repita o passo 3.5 duas vezes.
- Após a third centrifugação, ressuspender o sedimento celular em 2 ml de meio basal contendo glia B27 (1:50) e 10 ng / ml de EGF.
- Titruate mais uma vez e transferir a suspensão de célula para o frasco de cultura de célula T75 preparado e deixar crescer as células durante 3-4 dias.
Lavagem das células gliais (após 3-4 dias de cultura):
- Lave as células uma vez com 10 ml PBS e vigorosamente toque ou gentilmente bater o frasco algumas vezes com a mão, segurando-a firmemente com a outra mão. Por este passo os restos celulares e agregados de células são removidas a partir da cultura.
- Aspirar o PBS e adicionar meio fresco contendo basal glia B27 (1:50) e 10 ng / ml de EGF. Além disso cultivar a cultura por 5-7 dias até que as células chegar a 80% de confluência.
Divisão, transdução e semeadura final células gliais:
- Revestimento 10 milímetros lamelas com 100 ul de poli-D-lisina (Solução stock: 0,1%, diluído 1/50 ad 20 ug / ml em PBS ou HBSS) e incubarlos numa incubadora durante a noite. Lavar as lamelas três vezes com HBSS e adicionando 100 ul glia meio basal. Equilibrar as lamelas na incubadora (3 h).
- Lave as células gliais duas vezes com 10 ml de PBS, aspiração do PBS, e adicionar 3 ml de tripsina (TrypLE, não diluída). Trypsinize células por até 1 min ATENÇÃO:. Evite o excesso de tripsinização. Normalmente mais de 80% de todas as células são separadas após 1 min e isso é suficiente para ter vários milhões de células saudáveis.
- Parar a reacção por adição de 10 ml de meio basal glia, a transferência da suspensão de células para um tubo Falcon de 15 ml, de centrifugação a 300 xg durante 3 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio basal glia.
- Novamente, girar e aspirar como descrito no passo 3.15, em seguida, voltar a suspender as células em 5 ml de meio basal Glia.
- Transferir a quantidade necessária de células para um tubo de 1,5 ml. 10 4 4-2x10 células gliais são suficientes para uma lamela de 10 milímetros. Geralmente, a suspensão volUME para transduzir as células de um 4-bem-prato é inferior a 200 ul. Adicionar uma quantidade apropriada de partículas de vector lentiviral TED de expressão para as células e incubar à temperatura ambiente durante 10 min. Em seguida, encher a suspensão com o meio glia basal ao volume de semeadura (100 mL por lamela).
- Semente de 100 uL de células infectadas por lamela e incubar durante cerca de 2 horas, em seguida, adicionar meio basal contendo glia B27 1:50 e 10 ng / ml de EGF até um volume final de 2 ml.
- Para as condições ideais de cultura usam células para experimentos no dia 3-7 após o plaqueamento.
4. Geração e Cultura da Linha celular Reporter
Linhas de células repórter TED foram estabelecidas com base em células HeLa, BHK21, HEK293 e SH-SY5Y. Aqui nós fornecemos o protocolo para as células HeLa, mas o protocolo pode ser transferida para qualquer outra linha celular bem.
Geração de linha estável de células HeLa
- Dividir uma linhagem de células HeLa tipo selvagem e de transferência de 100 mil cells em um volume de 200 ul a um tubo de 1,5 ml.
- Adicionar uma quantidade apropriada de partículas de vector lentiviral TED de expressão para o tubo e incubar a suspensão de células-vírus, durante 10 min à TA. Então as células de semente num volume total de 2 ml de meio (DMEM, 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina) num prato de 30 milímetros e incubar durante 3 dias.
- Após lavagem uma vez com PBS, aspirar meio e adicionar 500 ul de tripsina (TrypLE, 2:03 em PBS). Incubar por aprox. 3 min e, em seguida, parar a reacção por adição de 3 ml de meio. Transferir a suspensão em um tubo de 15 ml Falcon e centrifugar a 400 xg durante 3 min.
- Ressuspender o sedimento celular em 200 ul de meio e novamente infectar as células com as partículas lentiviral, conforme descrito no item 4.2. Em seguida, as células de semente num frasco de cultura T25 células em 10 ml de meio.
- Crescer as células até uma confluência de 60-80% é atingido. Em seguida, dividir a cultura.
Linhas de células repórter TED
- Linhas de células repórter TED pode ser mantered em qualquer meio padrão, por exemplo, meio DMEM contendo 5% ou 10% de FCS e 1% de penicilina / estreptomicina é usado.
- Placa de um número adequado de células em um prato de 4 poços contendo lamelas de 10 mm estéreis (ver acima), por exemplo, de 10.000 a 20.000 células por lamela.
- Cultivar células por pelo menos dois dias antes de os utilizar para o TED imagiologia.
5. Preparação para o exame de imagem ao vivo no microscópio invertido
- Pré-aquecer HEPES-Ringer até à temperatura ambiente e adiciona-D-glucose.
- Pré-aquecer a ACSF (sem Ca 2 + e Mg 2 +), até à temperatura ambiente e adiciona-D-glucose. Arejar a ACSF com carbogen por 5 minutos. Em seguida, adicionar uma solução stock M de CaCl2 e MgCl2 até às concentrações finais de 2 mM de cada um.
- Inicie os microscópios imagens ao vivo e todos os programas de computador.
- Comece perfusão em uma câmara de imagem "dummy" e equilibrar o sistema de tubo.
- Pré-aquecer o aquecedor de solução em linha ea câmara de imagem no estágio do microscópio. Fixe a câmara de imagem em uma inserção de aquecimento.
- Equilibrar o sistema para 32-37 ° C antes de iniciar o procedimento de carregamento corante CUIDADO:. Para evitar fluxo acidental de solução de perfusão no sistema microscópio usamos laços de cabelo em torno dos objetivos e folhas de silicone elastômero (1mm) para proteger o estágio do microscópio.
6. Dye Carregando de qualquer tipo celular
- Ressuspender uma alíquota de Fluo5N-AM (ver 1.3) na solução de imagem pré-aquecido 100 l (HEPES-Ringer ou ACSF).
- Solubilizar Fluo5N-AM na solução de imagem (HEPES-Ringer ou ACSF) num banho de água de ultra-sons durante 90 segundos.
- É um novo 4 - ou uma solução de 24 poços da placa e transferência de 400 ul de imagem pré-aquecido a uma cavidade. Adicionar a solução corante para a mesma bem vir a 500 ul de uma solução a 5 uM.
- Com cuidado, coloque uma lamela com células (eg10-18 mm de diâmetro) no poço, as células para cima.
- Incubar durante um período de tempo apropriado numa incubadora de cultura de células a 37 ° C (entretanto preparar configurações de imagem na fase de microscópio). Vezes corante de carregamento típicos são os neurônios e células gliais 7-15 min e para linhas de células de 10-20 min.
Crucial: tempo de carregamento de corante e concentração do corante dependerá do tipo de célula, a densidade celular, e as necessidades específicas do experimento! Longos tempos de incubação em presença do corante pode prejudicar as células, especialmente os neurónios primários e células gliais primários e isso é fundamental para a capacidade de resposta a estímulos fisiológicos. Vezes longo de incubação (por exemplo, 30 minutos) apenas irá ser útil para ER experiências de localização de cálcio para investigar a distribuição de cálcio ER em pequenas estruturas subcelulares, por exemplo, finos ou espinhas neurites. Em algumas experiências, uma mistura de 1/3 meio de crescimento com a solução de imagem pode ajudar a proteger as células durante Fluo5N-AMcarregamento.
- Instantaneamente, transferir a lamela para outra cultura de células bem contendo solução de imagem (HEPES-Ringer ou ACSF) e começar a montagem das células na câmara de imagem.
7. ER-cálcio imagens de células vivas com um Laser invertido microscópio confocal de varredura
- Use um pincel para aplicar graxa de alto vácuo para a câmara de imagem. O lubrificante é necessário para fixar a lamela para o fundo da câmara de perfusão. Nós usamos câmaras de imagem self-made por 10-12 lamelas mm com um pequeno volume, permitindo altas velocidades de perfusão de até troca de buffer de 15 vezes por minuto. Uma câmara de perfusão comercialmente disponível para 18 milímetros lamelas, podem ser adquiridos a partir de Warner Instruments (RC-49FS). Esta câmara também permite estimulação do campo de neurónios.
- Escolha-se a lamela com as células carregadas com Fluo5N e adicionar uma pequena gota de solução de imagem (50-100 ul) sobre as células para manter as células cobertas com a solução de imagem.Vire a lamela de cabeça para baixo e montar as células na câmara de imagem. Para pressionar a lamela no silício-cola, use um cotonete (por exemplo, Q-tips).
- Limpe tampão residual da parte inferior da lamela de vidro com cotonetes CUIDADO:. Limpe cuidadosamente a umidade residual quando se usa um objetivo-óleo com alta abertura numérica em alta resolução de imagem. Sal residual é melhor removido pela água. Esfregaço acidental de gordura pode ser retirado com acetona ou etanol puro.
- Troca da câmara "dummy" de imagem com a câmara de imagem experimental. Lave as células durante 5-10 min de perfusão contínua.
- Lave as células por 5 - 10 minutos de perfusão contínua.
- Para a seleção da célula utilizar uma quantidade mínima de iluminação laser, altas taxas de varredura (2-4 Hz), um tamanho pequeno de imagem, e um ganho elevado.
- ATENÇÃO: Para a seleção das células Fluo5N-rotulados não usar excesso de iluminação de luz ou direto com epifluorescent luz. Iluminação brilhante da Fluo5N/Ca 2 + complexos provoca a perda completa da fluorescência específica-ER dentro de 2-4 segundos (Figura 5).
- Configure o microscópio de acordo com o experimento planejado. Para orientação, as configurações representativos de imagem com diferentes vectores de TED são dadas na Tabela 1. Para a laser invertido microscopia confocal de varredura, usamos um microscópio Olympus IX81 combinado com um sistema confocal 1000 Fluoview que está equipado com lasers de diodo (473 nm, 15 mW, 559 nm, 20 mW) e um sistema detector espectral.
- No início do documento experiência as células de interesse por X de alta resolução, pilhas de imagens yz.
- Realize x, yt imagem para monitorar a dinâmica de cálcio ER sob as condições experimentais específicas. As configurações típicas para o nosso sistema são listados na Tabela 2.
- Monitorar as alterações no cálcio ER sob perfusão contínua com solução de imagem. Taxas de buffer típicos são exemplarily: (a) lavagem da célula e armazenam-depleção pelo bloco SERCA: 1,5 ml / min, (b), ATP / DHPG estimulação: 3 mL / min.
- Aquisição de imagens digitais, preferencialmente, com 12 bits (4096 valores de cinza). Para imagens em paralelo de Fluo5N/Ca 2 + e RFP, imagens de 8 bits (256 valores de cinza) pode resgatar o seu sistema de estouro de dados.
- Armazenar imagens ao vivo de células de série temporal (x, yt) ou pilhas de imagem 3D (x, yz) (para a distribuição celular de + complexos Fluo5N/Ca 2) em um formato compatível ImageJ (por exemplo, TIFF).
8. Processamento de Imagem e Análise de Dados
- Abra a pilha de imagens no programa ImageJ. Em caso de multicolor imagens, dividir os canais RGB quando perguntado por ImageJ.
- Identifique sua região (s) de interesse (ROI) através de um exame cuidadoso das pilhas de imagens (por exemplo, com a ajuda de uma intensidade em função do tempo parcela)
- Use o plugin Analyzer Time-Series para ler a intensidade média dos pixels em um ROI (F-primas). Depending de propósito, chamar ROIs em torno ou a ER completo ou pequenas regiões do ER, por exemplo ER de dendritos das células de regiões periféricas. Também incluem 1-3 ROI em áreas sem células para subtração de fundo.
- Calcule a média de fluorescência de fundo (F b) através do cálculo do valor de fluorescência média do ROI fundo e subtrair o fundo valor F b dos valores de F-primas para obter o valor roi F.
- Calcular F 0, que é a fluorescência basal das células, através do cálculo do valor médio de dez a 30 valores fluorescentes para cada ROI em estado de repouso.
- Calcule as background-corrigidos alterações relativas na fluorescência por Af / F 0 pela fórmula:
- Mudanças relativas presentes na fluorescênciance como um traço com Af / F 0 para o eixo Y e tempo para o eixo-X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este protocolo fornece uma abordagem sem interrupções para a imagem direta de livre ER cálcio. Baixa afinidade sintético Ca2 + indicadores são libertados e preso no lúmen do ER, com a ajuda de um ER alvo, a actividade da enzima esterase recombinante. Melhoria carregamento dos Ca 2 + indicador de corantes para o lúmen ER permite que uma imagem direta e rápida de dinâmicas armazenam cálcio ER.
Tipos de células para TED
A viabilidade do método tem sido mostrado em linhas celulares HEK293, BHK21 34, 17, HeLa, SH-SY5Y, os astrócitos cultivados 8,40 e neurónios do hipocampo e corticais primárias 8,34,41. Em nossos experimentos, TED funciona bem quando TED construções são estavelmente expressa, preferencialmente por auto-inativando lentivirais 37,39 utilizando um promotor relativamente fraco (por exemplo, o promotor da ubiquitina) 35. Outros, promotores mais fortes estão sob investigação.
Sucesso TED carregamento com Fluo5N oferece uma coloração clara e brilhante do lúmen ER, que é poupado para fora da região nuclear 34,41. No estados de descanso, o Fluo5N/Ca 2 + rótulo complexo representa a localização de cálcio quando ligado por Fluo5N, portanto, representa a distribuição regional de cálcio livre no lúmen ER. Na Figura 6, imagens confocais de Fluo5N/Ca 2 +-complexos e as etiquetas Tag-RFP-T2 de Red-CES2 são mostrados em células HeLa, astrócitos corticais e neurónios do hipocampo. Figura 6C mostra o Ca 2 + complexo indicador fluorescente na célula corpo, bem como neurites de neurónios do hipocampo. Isto permite o exame de Ca 2 + em vez de sinais em processos pequenos (ver também a 34,35).
Alguns experiência é necessária para distinguir o rótulo típico ER de uma etiqueta citosólica que será observado when células são danificadas ou insalubres. Citosólica, esterases endógenas também libertar Fluo5N, o que leva a uma coloração muito brilhante do citossol e no núcleo quando o cálcio é que escapa através da membrana do plasma. Coloração citosólico de Fluo5N/Ca 2 + também é observada quando as células marcadas com TED são tratados com o ionomicina ionóforo, na presença do cálcio extracelular (Figura 7).
Imagem direta da liberação de cálcio a partir da ER
Uma das principais aplicações do TED é a visualização direta de esgotamento loja ER 17,34. Na Figura 8, mostra uma experiência representativa realizada com os neurónios do hipocampo, expressando Vermelho-CES2. Os neurónios com Red-CES2 enriquecer quantidades elevadas de Fluo5N na região perinuclear (setas da figura 8). Quando o bloqueador de SERCA CPA é aplicado por perfusão, uma rápida redução do armazenamento de cálcio ER é observado (Figura 8B). Aqui apresentamos ovalores brutos (eixo y) que são obtidos quando os neurônios são gravadas com 12-bit. As condições de imagem estão listados na Tabela 2. Note-se a enorme variação na densidade média da fluorescência por ROI que é observada quando é aplicado a TED neurónios. Para outros experimentos analisando ER liberação de cálcio nos neurônios utilizando TED, gostaríamos de referir a experiências anteriores, que já haviam sido discutidos em detalhe 8,34,35. Em breve, o TED em neurônios in vitro é usado para visualizar a loja cálcio ER SERCA sensível em grande detalhe por invertido confocal microscopia eletrônica de varredura a laser 8,34 e foi aplicado com sucesso para a imagem rápido (15 Hz) de mGluR1 / 5 induzido IiCR 34.
A Figura 9 mostra uma experiência típica com astrócitos corticais de rato in vitro, estimulado por 200 uM de ATP, através do sistema de perfusão com baixa resolução, utilizando uma objectiva de 20x de água. Após infecção por lentivírus, as células aqui descritas expresso Vermelho-CES2, que é conduzido por um promotor de ubiquitina. Velocidade de digitalização foi ~ 2 Hz e dois canais (Fluo5N/Ca 2 + e proteína de fusão Red-CES2) foram simultaneamente fotografada (em linha). No inicio da experiência as células gliais demonstraram boa infecção com as construções de expressão e de carga com boa Fluo5N-AM. O ROI que foram analisadas estão em destaque na Figura 9A. Um ROI foi criado para medir a fluorescência de fundo (BG), ROI 1-2 medir a fluorescência das células completas, ROI 3 abrange apenas o pronto-socorro da célula e ROI 4 foi desenhado em torno do campo visual completa. Pouco tempo após a estimulação com ATP a fluorescência do Fluo5N/Ca 2 + complexos caiu abruptamente devido à libertação de Ca2 + a partir do ER. Finalmente, o ER é parcialmente enchido novamente com cálcio. Simultaneamente, a fluorescência do RFP diminui continuamente como uma consequência de uma ligeira branqueamento (Figura 9B, painel inferior). Traços representando alterações na fluores intensidade de referência (Figura 9C) apontam para uma desvantagem importante do TED. Em muitas experiências (não todos) quantidades elevadas de Fluo5N-complexos são perdidas durante a estimulação. Como conseqüência, os valores de fluorescência não voltar para o nível de intensidade de fluorescência inicial.
A Figura 10 mostra uma BHK21 CES2 célula infectada em alta resolução, rotulado por Fluo5N/Ca 2 + e estimuladas com ATP. BHK21 células serviu como um sistema de célula de modelo cedo para análise de cálcio ER 31. Note-se que a liberação de cálcio ER e guarde-recarga é visualizado em estruturas finas dos túbulos ER. As estruturas foram fotografadas a uma velocidade baixa (~ 0,2 Hz), com 512 x 512 pixels, Airy uma configuração de disco para o orifício confocal, e com um objectivo de óleo de 63x.
"/>
Figura 1. Visão de ER sinalização de cálcio. Lançamento ER cálcio é causada por canais "vazamento", como o ER intramembrane pore complexo Sec61. Os receptores acoplados à proteína G (GPCR), estimular a produção de IP3, que causa então IP libertação de cálcio induzida por 3 (IiCR). ER libertação de cálcio é detectado pelos complexos STIM e induz a entrada de cálcio loja operado (SOCE) por canais de iões da família Trp e / ou canais de cálcio Orai. Canais de cálcio voltagem-dependentes (Ca V) mediar a liberação de cálcio de cálcio induzida por rápida (CICR) pelos receptores de rianodina (RyR) ou pela interação direta proteína (músculo esquelético) ou interação fisiológica (células do músculo cardíaco, neurônios). A perda de cálcio ER é dinamicamente resgatado pela ação da bomba SERCA (sarcoplasmático-ATPase de cálcio do retículo endoplasmático).
res.jpg "src =" / files/ftp_upload/50317/50317fig2.jpg "/>
Figura 2. Princípio de alvo-esterase induzida corante de carregamento (TED). Superexpressão alvejado de um carboxilesterase fornece uma alta atividade esterase (CES2) no ER. A estearase converte o corante acetoxymethylester Fluo5N-AM a um corante sensível ao cálcio, fluorescente que permanece presa no ER. Fluo5N tem uma baixa afinidade para os iões de cálcio. Portanto, em condições de repouso, fluorescentes Fluo5N/Ca 2 + complexos são preferencialmente formados no ER, em que a concentração de cálcio é superior a cerca de 1.000 vezes mais do que no citosol.
Figura 3. Representante TED construções vetor CES2.: Versão nativa do rato CES2. CES2 OPT 43: A ERpeptídeo sinal foi trocada e agora inclui um intron, enquanto que a retenção motivo ER foi mudado para a retenção KDEL-ER clássica e recuperação motivo de proteínas solúveis em ER. Uma tag myc proporciona um epitopo para a detecção da proteína por imunofluorescência indirecta e análise de Western blot. Red-CES2 8,43: A proteína fluorescente vermelha foi adicionado diretamente atrás do peptídeo sinal aminoterminal. Vermelho LK CES2 43: um ligante glicina-serina foi introduzida para estabelecer uma articulação flexível entre a RFP e o elemento de CES2.
Figura 4. Suspensões das células primárias ou linhagens de células de fluxo de trabalho para a imagem direta de cálcio ER usando TED. São transduzidas com um vírus contendo uma construção de expressão TED. As células são então semeadas em coverslips. Ao utilizar-RFP CES2 construções, as células transduzidas possam ser identificadas utilizando a fluorescência vermelha. Meta-esterase induzida corante de carga é realizada por incubação das células numa solução que contém uma imagem de baixa afinidade de Ca 2 + indicador AM-acoplado, tal como Fluo5N-AM ou mag-Fura2-AM. Imagiologia de cálcio ER é realizada com um microscópio de laser scanning invertido (ver protocolo), ou qualquer outro dispositivo de imagem compatível. Durante a imagem ao vivo as células estão sob perfusão contínua com uma solução de imagem, tais como líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF). A estimulação das células foi realizada, quer por perfusão ou por pressão para ejecção local.
Figura 5. Iluminação epifluorescência forte destrói o rótulo TED Fluo5N específico-ER em poucos segundos. Imagens representativas de um vídeo, fotografada com um microscópio de imagem na posição vertical. Aqui, as células gliais expressing RFP-CES2 foram carregados com Fluo5N-AM. Primeiro, a fluorescência vermelha de uma célula infectada foi revelado com uma câmara CCD. Posteriormente, o sinal + Fluo5N/Ca 2 foi iluminado com uma fonte de luz LED. Uma localização ER claro inicial de Fluo5N/Ca 2 + complexos (setas amarelas) é rapidamente destruída pela forte iluminação com uma fonte de luz LED 470 e uma mudança na distribuição de fluorescência torna-se visível na área nuclear (setas amarelas, 12,46 seg.)
Figura 6. TED carregamento com Fluo5N-AM em diferentes tipos de células do painel superior:. Células HeLa com expressão estável RED-CES2 painel médio:. Astrócitos corticais após a transdução lentiviral com Red-CES2 painel inferior:. Neurônios do hipocampo com RED-CES2 em DIV 8. Todas as células foram cultivadas sobre lamelas e coradas com Fluo5N-AM, como descrito na secção de método. O Fluo5N/Ca 2 + rótulo também representar a localização de cálcio quando obrigado a Fluo5N. Barra de escala de 40 mM.
Figura 7. Corante Fluo5N no citosol se torna visível após o tratamento com ionomicina. Células gliais foram infectadas com Red-CES2, marcado com Fluo5N-AM, e tratou-se com a tapsigargina SERCA-bloqueador para esgotar cálcio ER. Ionomicina induziu um forte influxo de cálcio extracelular. (Painel superior), as células mostram um aumento drástico na Fluo5N/Ca 2 + mediada por fluorescência. (Painel inferior) A intensidade média da imagem de projecção da Fluo5N/Ca 2 + revela uma etiqueta de marcação típico citosólica pelo complexo de cálcio fluorescente seta azul:. Uma célula brilhantemente marcado indica que esta célula tem quantidades elevadas de cálcio in the citosol. Presumivelmente, essa célula é danificada seta Purple:. Células tornam-se brilhantemente marcado no citoplasma sobre ionomicina.
Figura 8. Depleção de cálcio loja ER em neurônios, bloqueando o SERCA. (A) os neurônios do hipocampo (DIV 9) expressa Red-CES2 (A, vermelho) e são rotulados com Fluo5N-AM (A, verde). As setas apontam para duas células analisadas. A imagem (projecção de intensidade máxima) é um elemento recortada de machado, YZ-imagem que foi adquirido no início da experiência. (B), que representam os traços brutos a depleção ER armazenam cálcio, após a perfusão com 30 pM de CPA. Apresentamos 1000 imagens foram tiradas com uma Hz e 12 bits. Os valores brutos de a densidade média de fluorescência por ROI (eixo Y) das duas células são mostradas em Aplotados ao longo do tempo (vermelho e azul traço). Os valores de fundo (traço preto) permanecerá constante. UA = Unidades arbitrárias de valores cinzentos que representam a densidade de fluorescência.
Figura 9. ER liberação de cálcio sobre ATP estimulação das células gliais. Células gliais foram infectados com Red-CES2 e carregado com o Ca 2 + indicador Fluo5N-AM. As células foram estimuladas com 200 uM de ATP por perfusão durante 10 seg. (A) As células da glia que expressam Vermelho-CES2 (meio) são rotulados com Fluo5N-AM (esquerda). O ROIs são realçados. (B) as imagens simples extraídos da seqüência de lapso de tempo. (Painel superior) A intensidade de fluorescência é alta em 0 seg e 71 seg antes de as células reagem. É cai abruptamente (80 seg) e atinge um mínimo de 86 sic, antes de se eleva de novo (160 seg) como o cálcio é bombeado de volta para o ER. (painel inferior), A intensidade de fluorescência da SDP diminui lentamente e continuamente ao longo do tempo devido ao branqueamento. (C) mostra vestígios horárias Af / F 0 valores o ROI indicado em A. A fluorescência, indicando a concentração de cálcio, cai após estimulação ATP e parcialmente se recupera. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 10. Imagiologia de alta resolução da libertação de cálcio induzida por ATP em células BHK21. Células foram carregadas com Fluo5N-AM e fotografada na presença de cálcio extracelular. (A) Série da imagem que mostra a evolução da gripeo5N/Ca 2 fluorescência + derivados durante ATP-estimulação. (B) imagem de projeção de intensidade média indica o ROI apresentado na C. (C) ATP liberação de cálcio induzida e recarga da loja ER cálcio é analisada em pequenas sub-regiões do ER. Os traços representam as alterações na fluorescência.
| Laser de excitação [nm] | Alcance de detecção [nm] |
| TED com construções vetor Red-CES2 | |
| 473 (Fluo5N/Ca 2 +) | 507-545 |
| 559 (Tag-RFP-T2) | > 570 |
| TED com CES2 apenas construções vetor | |
| 473 nm (Fluo5N/Ca 2 +) | > 507 |
Tabela 1. Configurações para o detector espectral.
| Experiência | Depleção ER usando Red-CES2 | A estimulação de neurónios utilizando um constructo CES2 | Alta resolução de imagem espacial, CES2 |
| Objetivo (NA) | 20x de água (0,7) | 20x de água (0,7) | Óleo oil/63x 40x (≥ 1,3) |
| 473 nm Laser | |||
| Poder | 1% | 1% | |
| HV A | 600-780 | 600-780 | 400-780 |
| Ganho B | 0-1% | 1-2% | 0% |
| Compensar | 0 | 0 | 0 |
| 559 nm Laser | |||
| poder | 1% | optioNALC | optionalC |
| HV A | 600-780 | optionalC | optionalC |
| Ganho B | 0-1% | optionalC | optionalC |
| Compensar | 0 | optionalC | optionalC |
| Velocidade de digitalização | 1-2Hz | Correr livre | Correr livre |
| Tamanho da Imagem | 320x320 pixels | 240x240 pixels | 512x512 pixels |
| Digitalização tipo | Em linha | Bidirecional | Nyquistcriterion (2 pixels / elemento) |
| Estimulação | 100-200 uM ATP :5-15 seg; 200-500 uM de glutamato durante 5-15 seg | 100-200 mM Agonist: 5-15 sec | |
| Pinhole | 2-5 discos arejados | 2-5 discos arejados | Um disco arejado |
Tabela 2. Exemplos de configurações de microscópio de acordo com o tipo de experimento A:. HV = corrente do detector fotomultiplicador, B: = ganho de amplificação do sinal de PMT, C: opcional: canal está livre para uso com outros corantes fluorescentes vermelhos (por exemplo, CMX-Ros para visualizar o potencial mitocondrial), ou outras proteínas fluorescentes vermelhas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
As vantagens e desvantagens do método TED foram amplamente discutidas em publicações recentes 34,35. Em comparação com os outros métodos descritos acima, o TED contorna o problema da interrupção e perfundir as células. Além disso, dois aspectos precisam ser enfatizados. O princípio de TED para ER imagem requer cálcio (1.) A expressão de um alvo carboxilesterase activo no lúmen do ER, com a ajuda de TED construções de vectores e (2.) A libertação eficiente e preferencial de baixa afinidade sintéticos AM-ésteres de corantes de cálcio no lúmen do ER.
1. TED vetor constrói
A Figura 3 resume o desenvolvimento de construções de vectores TED. TED foi desenvolvido com base em proteínas da família da CES (EC 3.1.1.1). Estas proteínas são membros residentes no lúmen ER. Para in vitro estuda a administração de proteínas recombinantes CES funciona melhor depois de expressão estável doproteína ou depois da infecção viral com os níveis de expressão moderadas. No momento, não se sabe se outras proteínas com atividade esterase pode substituir as proteínas do SEI para TED imagem. Não é recomendado usar transfecção de vetores TED para análise de cálcio ER dinâmica porque as células são menos sensíveis após o procedimento de transfecção. Proteínas CES precisa adequado direccionamento para o lúmen do ER e isto necessita de um passo de clivagem eficiente do péptido de sinal PS. Além disso, a retenção e a recuperação de proteínas CES na lúmen ER é mediada pela sua motivo KDEL semelhante aminoterminal. Estes mecanismos podem ser saturados quando os níveis elevados de expressão são produzidas por vectores TED após a transfecção transitória. Isto pode causar uma falsa localização dos CES-proteínas e suporta a formação de agregados de proteína.
2. Baixa afinidade Ca 2 + Indicadores de TED
A desvantagem mais importante do TED é provocado pelas limitações de sucessocapazes corantes indicadores para a análise não-disruptiva de ER cálcio. Imagiologia de cálcio ER com TED requer corantes indicadoras com um elevado K D (ou seja, uma baixa afinidade) e uma baixa fluorescência na ausência de cálcio. Baseando-se em nossa experiência Fluo5N-AM funciona melhor, mas este corante indicador não é resistente à água sanitária. A baixa afinidade Ca 2 + indicadores Mag-Fura2-AM (K D ~ 25-50 M) 34 e Mag-Fluo4 (K D ~ 20-25 mm) também foram testados. Ambos os corantes estão bem carregadas nas estruturas do ER por TED, mas o risco de produzir sinais "misturados" com a estimulação da libertação ER é elevado. A "sinal misto" representa o primeiro aumento rápido da fluorescência no citoplasma seguido por diminuição de fluorescência na ER. Para superar essa limitação, as abordagens disruptivas para imagens cálcio ER pode ajudar 32,35. Mag-Fluo4 (K D ~ 20-25 mm) mostra uma etiqueta TED mediada forte de cisternas do Golgi, a qual é menos pronunciado quando Fluo5N-i PMs usado.
Aplicações e Perspectivas
Aqui vamos nos concentrar na análise de varredura a laser inverso confocal de ER cálcio dinâmica com TED. Medições de TED também pode ser adaptada a qualquer sistema confocal padrão ou sistema de campo amplo com a fonte apropriada de excitação (laser, LED, lâmpadas de metal halid, monocromador), filtros e sistema de detecção de fluorescência 6.
TED é especialmente útil nestas células que não expressam a actividade suficiente CES endógena no ER. Observou-se que por exemplo células BHK21 proporcionar suficiente actividade de esterase endógena no ER para libertar os indicadores de baixa afinidade. Nas nossas mãos, este não é o caso com muitas outras linhas de células (HEK293, SH-SY5Y, HeLa, células PC12), células gliais primários e neurónios primários. Aqui, o método TED permite uma bem-sucedida corante não-prejudicial para o ER.
Futuros vetores TED pode ser extensiva a sua aplicação a partir do lúmen ER paraoutros compartimentos subcelulares ou Microdomínios celulares. O princípio do método de TED é independente do corante indicador, e pode, portanto, ser utilizado com o AM-éster de um corante, por exemplo, para a criação da imagem de dinâmica de pH intracelulares. Recentemente, o laboratório de Lucas D. Lavis descrito que a esterase de fígado de porcino recombinante (PLE) CES1 forma um par esterase éster selectiva com cyclopropylester corantes 42. Agentes Cyclopropylester foram identificados como resistentes à hidrólise por esterases endógenas e o desmascaramento selectiva da actividade CES activado molécula específica de células recombinantes de segmentação 42. Será interessante investigar se os indicadores de cálcio baseando-se em que a nova técnica vai melhorar a especificidade alvo subcelular de indicadores sintéticos.
TED funciona melhor em linhas celulares quando as proteínas TED são estavelmente expressa. O estabelecimento de uma coleção com linhas de células TED estáveis seria benéfica.
TED modelos de camundongos transgênicos são também um dos principais objetivo do nosso trabalho e isso vai permitir TED em preparações de tecidos específicos de circuitos neuronais específicos, músculo esquelético, coração, ou preparações do sistema vascular. Este modelo de mouse vai ajudar a transferir a análise da dinâmica de cálcio ER a partir do nível celular ao contexto mais tecido fisiológico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi suportado por concessões do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 ea Friedrich-Baur-Stiftung. Gostaríamos de agradecer Roger Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute Laboratories na Universidade da Califórnia, em San Diego por nos fornecer as Tag-RFP-T2. Nós felizmente reconhecer David Baltimore, do Instituto de Tecnologia da Califórnia em Pasadena, e Didier Trono, da Universidade de Genebra, Genebra, por nos fornecer o lentiviral plasmídeos FUGW e psPAX2/pMD2.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine) | Tocris | 0805 | |
| 5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate | Sigma | A26209-1G | |
| B-27 supplement,50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Carbamoylcholine chloride (Charbachol) | Sigma | C4382-1g | |
| Cyclopiazonic acid (CPA) | Ascent scientific | Asc-300 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM with Glutamax | Invitrogen-Gibco | 31966-047 | |
| Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x | PAA | H15-002 | |
| Fetal calf serum | Invitrogen-Gibco | 10270-106 | |
| Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg | Invitrogen | F14204 | |
| Glutamate | Ascent scientific | Asc-049 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | |
| Ham's F12 nutrients mixture | Invitrogen-Gibco | 21765-029 | |
| Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS | PAA Laboratories | H15-010 | |
| Horse serum | SHD3250YK | Linearis | |
| Ionomycin Ca2+ salt | Ascent scientific | Asc-116 | |
| murine EGF | PreproTech | 315-09 | |
| N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen-Gibco | 21103-049 | |
| Pluronic F127, low UV absorbance,2g | Invitrogen | P6867 | |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN | Sigma | P8638 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Lysin | Sigma | P2636 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005-1mg | |
| TryLE Express | Invitrogen | 12605-028 | |
| Trypsin | Worthington | LS-003707 | |
| Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean) | Sigma | T6522 | |
| Materials | |||
| Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81 | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635) | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector | Olympus | user-specific configuration | |
| Heater controller TC-344B | Warner Instruments | 64-0101 | to control in line solution heater |
| NIH ImageJ software | WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006 | ||
| Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35 | Olympus | N2709100 | |
| Objective: UPLFLN40XO | Olympus | N1478700 | |
| Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15 | Olympus | N1480700 | |
| Perfusion chamber, inverse | custom-made | ||
| Perfusion chamber, RC-49FS | Warner Instruments | W4 64-1709 | |
| Perfusion tube: PT-49 | Warner Instruments | 64-1730 | for perfusion |
| Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels) | Gilson | n.a. | perfusion pump |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | controlled by heater controller |
| Suction tubes: ST3R | Warner Instruments | 64-1407 | for perfusion |
| Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel | Pecon | n.a. | |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).
- Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K.
- Berridge, M. J.
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59, 861-872 (2008).
- Jaepel, J., Blum, R.
- Verkhratsky, A. Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons. Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).
- Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate. Nature. 306, 67-69 (1983).
- Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction. Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).
- Clapham, D. E. TRP channels as cellular sensors. Nature. 426, 517-524 (2003).
- Cahalan, M. D.
- Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. Sensing cellular stress through STIM proteins. Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).
- Erdmann, F., et al. Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum. The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).
- Schäuble, N., et al. BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER. The EMBO Journal. , (2012).
- Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).
- Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).
- Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).
- Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J. Vis. Exp. (23), e1067 (2009).
- Lang, S., Schäuble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms. J. Vis. Exp. (53), e2730 (2011).
- Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. Looking forward to seeing calcium. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).
- Mank, M., Griesbeck, O.
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Montero, M., et al. Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells. The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).
- Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
- Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations. EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).
- Solovyova, N., Verkhratsky, A. Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches. Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).
- Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry. The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).
- Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).
- Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum. 43, Humana Press. (2010).
- Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 5, 545-551 (2008).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
- Zufferey, R., et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).
- Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).
- Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Calcium measurement methods. Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), Humana Press. 147-167 (2010).
- Tian, L., et al. Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).
- Samtleben, S., Blum, R. Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading. , In preparation (2012).
