Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

الميكروسكوب المتلازم لتحليل الهيكلية 3D من التفاعلات الدينامية

Published: June 24, 2013 doi: 10.3791/50386
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Structural Biology, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Cell Biology and Physiology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

نحن تصف طريقة المجهر المتلازم الذي يجمع بين السرعة العالية 3D الخلية الحية المجهري ضوء الفلورسنت وعالية الدقة البرد الإلكترون التصوير المقطعي. علينا أن نظهر قدرة أسلوب مترابط عن طريق التصوير الديناميكي، صغيرة HIV-1 جزيئات التفاعل مع خلايا هيلا المضيف.

Abstract

البرد الإلكترون التصوير المقطعي (cryoET) يسمح التصور 3D من الهياكل الخلوية الجزيئية في القرار في حالة إغلاق إلى الفسيولوجية 1. ومع ذلك، والتصور المباشر من المجمعات الفيروسية الفردية في بيئة المضيفة الخلوية مع cryoET يتحدى 2، نظرا لطبيعة نادرة وديناميكية من دخول الفيروس، وخاصة في حالة HIV-1. بينما الوقت الفاصل بين التصوير الخلية الحية قد حقق قدرا كبيرا من المعلومات حول العديد من جوانب دورة حياة HIV-1 3-7، القرار التي يوفرها المجهري الخلية الحية محدودة (~ 200 نانومتر). ويهدف عملنا في تطوير طريقة الارتباط الذي يسمح التصور مباشرة من الأحداث في وقت مبكر من HIV-1 العدوى عن طريق الجمع بين الخلية الحية المجهري ضوء الفلورسنت، المجهري البرد الفلورسنت، وcryoET. في هذه الطريقة، وإشارات الخلية الحية والبرد الفلورسنت يمكن استخدامها لتوجيه بدقة أخذ العينات في cryoET. وعلاوة على ذلك، تم الحصول عليها من المعلومات الهيكلية cryoET يمكن به تستكمل مع البيانات الديناميكية الوظيفية المكتسبة من خلال التصوير الخلية الحية من الفلورسنت الهدف المسمى.

في هذه المقالة الفيديو، ونحن نقدم أساليب وبروتوكولات وإجراءات تفصيلية للتحقيق الهيكلية للHIV-1 والتفاعلات المضيف الخلية باستخدام 3D المتلازم عالية السرعة التصوير الخلية الحية وعالية الدقة cryoET التحليل البنيوي. وتميزت خلايا هيلا المصابين HIV-1 الجسيمات الأولى التي متحد البؤر المجهري الخلية الحية، والمنطقة التي تحتوي على نفس الجسيمات الفيروسية ثم تم تحليلها من قبل البرد الإلكترون التصوير المقطعي للحصول على التفاصيل الهيكلية 3D. وقد تحقق الارتباط بين مجموعتين من البيانات والتصوير، والتصوير الضوئي والتصوير الإلكترون، وذلك باستخدام البرد مضان ضوء المرحلة المجهري محلي الصنع. فإن نهج مفصل هنا تكون ذات قيمة، ليس فقط لدراسة التفاعلات الخلية المضيفة الفيروس، ولكن أيضا لتطبيقات أوسع في بيولوجيا الخلايا، مثل الخلايا مما يشير، والاتجار مستقبلات الغشاء، والعديد من العمليات الخلوية الحيوية الأخرى. </ P>

Introduction

البرد الإلكترون التصوير المقطعي (cryoET) هي تقنية التصوير القوية التي تسمح ثلاثي الأبعاد (3D) التصور من الخلايا والأنسجة، ويقدم نظرة ثاقبة لتنظيم العضيات المحلية والهياكل الخلوية في القرار الجزيئية في وثيقة إلى الحالة الفسيولوجية 1. ومع ذلك، وعلى النقيض منخفضة بطبيعتها من غير ملوثين العينة المجمدة رطب، جنبا إلى جنب مع حساسية للإشعاع، ويجعل من الصعب تحديد المجالات ذات الاهتمام داخل الخلية وأداء لاحقا إلى سلسلة الميل بنجاح دون الإضرار المنطقة المستهدفة. من أجل التغلب على هذه المشاكل، واتباع نهج مترابط يجمع بين الضوء والمجهر الإلكتروني هو ضروري. ويتم تحديد السمات المحددة التي أبرزها وضع العلامات الفلورية وتقع بواسطة المجهر الضوئي مضان، وبعد ذلك يتم نقل الإحداثيات الخاصة بها إلى المجهر الإلكتروني لاقتناء القرار البيانات الهيكلية عالية 3D. هذا الأسلوب المتلازم يساعد تحديد مكان وجود الهدف كانREAS من الفائدة التي يتعين معالجتها. ونظرا لقيود على سماكة العينة مع cryoEM (<300 نانومتر)، حاليا فقط المناطق الطرفية من الخلية هي مناسبة لتحليل الهيكلية 3D بواسطة CryoET. سوف يزيد من تقليل سماكة من العينات المجمدة رطب بواسطة زجاجي باجتزاء 8 أو البرد تركز أيون شعاع (FIB) صفائح 9 توسيع نطاق قدرات التصوير مترابط.

سابقا، كانت تستخدم أساليب المتلازم في المقام الأول إلى تسهيل الحصول على البيانات cryoET لهياكل كبيرة وثابتة 10-13. في هذه الدراسات، تم تنفيذ البرد مراحل لقبول شبكات cryoEM وتناسب وضعها إما المجهر تستقيم أو مجهر مقلوب 10،11،14. على الرغم من التحول شبكات يبدو اضحة إلى حد ما في تصاميمهم، وهناك نقل إضافية الخطوات المتبعة للحصول على الشبكة EM، مما يزيد من فرصة أن الشبكة قد تكون مشوهة، وتلف والملوثة. ونحن في الآونة الأخيرة أظهرت تقدما في التقنيةالمجهر المتلازم الذي يسمح لنا لتصور الأحداث مباشرة الديناميكية التي هي بطبيعتها صعبة لالتقاط الصور، مثل HIV-1 والتفاعلات الخلية المضيفة في المراحل المبكرة من العدوى 15. نحن إنجاز هذا من خلال تصميم وتنفيذ نموذج المجهري البرد على ضوء المرحلة التي تتكيف مع نظام خرطوشة لتقليل الضرر العينة بسبب طريقة تعامل الشبكة، مما يسهل الارتباط. لدينا تصميم متكامل يتضمن حامل خرطوشة العينة، السماح لكلا المجهري البرد الخفيفة والبرد الإلكترون التي يتعين القيام بها، بالتتابع، على نفس صاحب العينة، من دون نقل العينة، وبالتالي تبسيط عملية مترابط. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن أيضا تنفيذ إجراء دقيقة وموثوق بها علاقة باستخدام الخرز اللاتكس فلوري كعلامات إيمانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. هيلا الثقافة خلية على الكربون المغلفة، الذهب EM شبكات الباحث

  1. التفريغ توهج الجانب الكربون من 200 شبكة R2 / 2 Quantifoil الذهب EM مكتشف الشبكة تحت 25 مللي أمبير لمدة 25 ثانية.
  2. معطف الشبكة EM مع فبرونيكتين، التي تطفو عليه، من جانب الكربون أسفل، في الصعود إلى 40 قطرات ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل حل فبرونيكتين، ثم تعقيمها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 2 ساعة في نسيج الثقافة هود.
  3. لوحة خلايا هيلا على الشبكة في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 4 خلية / مل (مجموع ثقافة مل 2) في طبق ثقافة زجاج القاع وتنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2، في DMEM تستكمل مع 4.5 ز / L L-الجلوتامين والجلوكوز، و 10٪ الحرارة المعطل مصل العجل الجنين، 100 وحدة / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، لحوالي 18 ساعة. يصاب خلايا هيلا بعد O / N الثقافة.

2. HIV-1 العدوى وتعيش خلية التصوير

  1. إضافة تعقب خلية فلوري (CMTPX الأحمر، 1 ميكرولتر / 2 مل) في ثقافة زجاج القاعطبق (من الخطوة 1.3)، واحتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، للسماح تصل تتخذ من صبغة الفلورسنت.
  2. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وإضافة 50 ميكرولتر المتوسطة الطازجة قبل تحسنت.
  3. وضع طبق على الدائرة الخلية الحية، عند 37 درجة مئوية، حقل اجتاحت متحد البؤر المجهر الماسح الضوئي. تحديد حقول متعددة (10-15 المناصب) التي تحتوي على 1-3 خلايا / مربع، مع الخلايا بين مرحلتين الانقسام عندما هم الأكثر انتشار التدريجي وشقة (انظر الشكلين 2C و 2D)، منذ cryoEM يتطلب المناطق رقيقة نسبيا من عينة. تخزين هذه المواقف للتصوير المستقبل (الخطوة 2.5).
  4. تصيب الخلايا مع VSV-G الزائفة المكتوبة HIV-1 الجزيئات التي تحتوي على GFP-VPR (نستخدم 40 ميكرولتر من عينة تحتوي على 40 نانوغرام / مل من P24). عند إضافة جزيئات الفيروس في الجزء السفلي من الطبق، نكون حذرين حتى لا تعكر صفو شبكة EM، منذ تم بالفعل تحديد مواقع للتصوير وتخزينها.
  5. مباشرة بعد إضافة virions، وجمع TIلي الفاصل عالية السرعة الصور مبائر 3D، في المواقف المحددة سابقا (من الخطوة 2.3) للدقيقة 20-40.
  6. تم الحصول على الصور متحد البؤر باستخدام MetaMorph وتحليلها من خلال تتبع الجسيمات 3D الآلي لديناميات جسيم واحد باستخدام برنامج Imaris (انظر الشكل 1). وبما أننا ربط السلوك الديناميكي للحيود محدودة HIV-1 الجسيمات مع التركيب الدقيق الخلوية، والوقت الفاصل بين التصوير الخلية الحية وتتبع الجسيمات 3D حاسمة بالنسبة لنتائج. ومع ذلك، لبنية كبيرة وثابتة، فإن صورة مضان بسيط (بدون الخلية الحية) تكون كافية لتحليل مترابط.

3. المجمدة رطب EM تحضير العينة

لتقليل زمن التأخير بين جمع من الصورة متحد البؤر مشاركة والبرد تثبيت للعينة، والاتحاد الدولي للفروسية Vitrobot (أو جهاز التزجيج أخرى) ينبغي الشروع وعلى استعداد ليغرق للتجميد خلال مجموعة من الصور مضان الخلية الحية متحد البؤر.

  1. بدوره على جهاز التزجيج وضبط درجة حرارة مناخها إلى 22 درجة مئوية، والرطوبة الهدف إلى 100٪، في الوقت النشاف إلى 7 ثانية، والانتظار واستنزاف الوقت ل1 ثانية.
  2. وضع صندوق تخزين الشبكة في الغطاس ديوار وإعداد الإيثان السائل البارد. تحميل ديوار على الجهاز التزجيج.
  3. مباشرة بعد متحد البؤر التصوير الخلية الحية (القسم 2)، ضع صحن الثقافة على كتلة النحاس الجليد المبردة وتحويلها إلى غرفة تحضير العينات cryoEM. تحميل الشبكة EM على ملاقط المتخصصة وصمة عار بسرعة بعيدا أي وسيلة إعلامية على الشبكة. تتم النشاف يدويا، مع فلتر ورقة، وبعد ذلك 4 ميكرولتر من 15 نانومتر الذهب حل حبة مختلطة مع 0.2 ميكرون المجهرية الفلورسنت يوضع فورا على الشبكة. وتستخدم حبات الذهب وعلامات إيمانية لمساعدة جمع البيانات تصوير الشعاعي الطبقي والمحاذاة. يتم استخدام المجهرية الفلورسنت لمساعدة ارتباط بين الصور الفلورسنت وcryoEM (انظر الشكلين 2C-2F).
  4. تحميل ملاقط على الجهاز التزجيج وترشد الجهاز صمة عار ويغرق في الإيثان السائل تجميد 16. المعلمات النشاف الأمثل لتحقيق أفضل نتيجة هي: الوقت وصمة عار، 7 ثانية؛ صمة عار أوفست، 0؛ وقت هجرة، 1 ثانية، درجة الحرارة، 22 درجة مئوية، والرطوبة، و 100٪.
  5. نقل الشبكة المجمدة رطب لحامل cryoEM للتصوير cryoET فوري، أو لتخزين النيتروجين السائل ديوار لاستخدامها لاحقا.

4. البرد مضان المجهر الضوئي

مطلوب نظام محلي الصنع، عينة البرد مضان غرفة والمرحلة (الشكل 3) لتنفيذ الخطوات 4،1-4،10. ويمكن الاطلاع على المواصفات التفصيلية ووصف المرحلة في يونيو وآخرون 15.

  1. ملء النيتروجين السائل المضغوط النفس ديوار مع النيتروجين السائل على الأقل 2 ساعة قبل بدء المجهر الضوئي البرد مضان (انظر الشكل 3A).
  2. شن homebuilt البرد وluorescence عينة المرحلة 15 (الشكل 3) على مقلوب ضوء المجهر مضان، مثل أوليمبوس التاسع 71.
  3. ربط مدخل النيتروجين السائل للمرحلة البرد العينة إلى ديوار مضغوطة الذاتي ووضع النيتروجين منفذ حماية تجاوز السائل في وعاء مناسب. ربط خط غاز النيتروجين الجاف لكم وتوضع على العدسة الشيئية للحفاظ على عدسة دافئة وخالية من الصقيع.
  4. وضع منصة كتلة النحاس (السهم الأسود في الشكل 3B) في غرفة البرد مرحلة لتحميل الشبكة عينة مجمدة رطب. يبرد وملء غرفة النحاس للمرحلة البرد مع النيتروجين السائل من خلال خط مدخل من مضغوطة الذاتي ملء ديوار.
  5. عندما تصل إلى مرحلة البرد درجة حرارة النيتروجين السائل (في ~ 4-6 دقيقة)، ونقل مربع تخزين الشبكة (من الخطوة 3.5) إلى مرحلة البرد.
  6. وضع الشبكة عينة مجمدة رطب في خرطوشة عينة EM على كتلة النحاس ومشبك زالتخلص في مكان باستخدام الدائري C (في حالة استخدام خرطوشة المجهر Polara)، أو وضع خاتم من النحاس قبل تبريده على رأس (رأس السهم الأسود في الشكل 3D)، للحفاظ على الشبكة في مكان وأيضا لسهولة استرجاعها من الشبكة بعد التصوير البرد مضان (إذا كان لغير Polara البرد الإلكترون المجهر).
  7. ضع خرطوشة (من الخطوة 4.6) في الدائرة الداخلية للالبرد مرحلة (أبيض رأس السهم في الشكل 3B).
  8. البحث والعثور على جزيئات الفيروس نفسه من البيانات التصوير الخلية الحية. منذ الشبكة EM يحتوي على فهرس، فإنه واضح ومباشر في توطين نفس الجسيمات على الشبكة في كل من الصور الخلية الحية والصور البرد الإزهار.
  9. اكتساب البرد مدينة دبي للإنترنت والصور GFP في المواقف المحددة في إطار البرد حالة باستخدام مجهر الضوء مع العمل الطويل (2،7-4 ملم) عدسة الهدف. خلال التصوير البرد مضان، دوريا فحص مستوى النيتروجين السائل في مرحلة البرد وإعادة ملء ذلك، حسب الحاجة، للحفاظ على مرحلة عينة أدناه -170° C.
  10. عند الانتهاء من البرد مضان التصوير، والعودة بعناية خرطوشة العينة إلى منصة كتلة النحاس وتخزين خرطوشة في النيتروجين السائل ديوار لتحليل cryoET المستقبل مع نظام Polara. في حالة استخدام غير Polara البرد الإلكترون المجهر، وإزالة خاتم من النحاس، استرداد الشبكة عينة، ووضعه في صندوق التخزين الشبكة، وتخزين العينة في النيتروجين السائل ديوار حتى يتم فحص العينة بواسطة cryoET.
  11. لتحليل البيانات، تتداخل المكتسبة البرد مدينة دبي للإنترنت وGFP الصور (من الخطوة 4.9، انظر الشكل 4B) وربط مواقف إشارات GFP في الصورة البرد مضان مع تلك التي حصلنا عليها في سلسلة التصوير الخلية الحية.

5. البرد الإلكترون التصوير المقطعي

  1. تحميل خرطوشة عينة في محطة البرد نقل مجهر الكتروني مجهزة بمدفع انبعاث المجال، مثل Polara G2 المجهر.
  2. الوضع في ظل انخفاض بالجرعات البحث في التكبير من 140X، IDEntify وحفظ الساحات الشبكة المرتبطة بها (من الخطوة 4.11) في ملف المرحلة.
  3. تحت وضع بالجرعات المنخفضة البحث في التكبير من 3،500 X، اضافة الى وجود 100 ميكرون الهدف الفتحة، والبحث وحفظ جميع المواقف ترتبط مع إشارات GFP في ملف المرحلة الثانية.
  4. تحت وضع جرعة التعرض منخفض، والعثور على منطقة فارغة إلى ضبط شدة شعاع لجرعة من 1 أو 2 ه - / م 2 وصقل محور إمالة، وذلك باستخدام وظيفة Y المرحلة، عن طريق حرق بعيدا الجليد في المنطقة الكربون غير مهم مع عدة حبات الذهب.
  5. تحت وضع جرعة منخفضة التركيز، وضبط مسافة التركيز إلى ~ 3 ميكرون وضبط زاوية لمحاذاة اتجاه التركيز لتكون موازية للمحور الميل.
  6. تحت وضع بالجرعات بحث المنخفضة، وأذكر مواقف حفظها (من الخطوة 5.3)، وضبط ارتفاع eucentric العينات والتحقق من مدى الميل للمنطقة من الفائدة. الحصول على صورة الإسقاط مع منخفض جدا الإلكترون الجرعة (~ 1 ه - / أ 2) في 8-10 ميكرون يزيل التباؤر، في المعارضالوضع لدى عودتهم، للتأكد من جزيئات الفيروس المترابطة للالبرد الإلكترون التصوير المقطعي.
  7. التبديل إلى وضع جرعة التركيز المنخفض. في TEM السيارات وظائف القائمة، تسبق ارتفاع eucentric الآلي والتركيز على وظائف في مجال التركيز.
  8. إعداد معلمات للحصول على سلسلة الميل. الشكل 4 لفي هذه الورقة، زوايا الميل تتراوح ± 70 درجة، فوق وتحت 45 درجة مئوية، في 3 ° و 2 ° زيادات الميل، على التوالي، استخدمت، مع 6 ميكرون يزيل التباؤر وحوالي 70 ه - / م 2 الجرعة الإجمالية.
  9. كرر الخطوات من 5.7 و 5.8 لجميع المواقف المحفوظة. دفعة البرمجيات التصوير المقطعي يمكن استخدامها لجمع البيانات الآلي في مواقع متعددة لزيادة الإنتاجية.

6. إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد باستخدام IMOD 17

  1. تفقد سلسلة الخيمة الخام إلى ضبط الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم الكثافة وتحديد ما إذا كان هناك أي عرض سيتم استبعادها نظرا لتحول صورة كبيرة.
  2. بدء eTomo ولوحة مقطعية الإعداد باستخدام نوع المحور، حجم بكسل، وقطره إيمانية، الخ. ثم إنشاء البرامج النصية كوم.
  3. تكوين الإطار الرئيسي بحيث عدة مراحل حساب مقطعية يمكن تعديلها / يتبع في وقت واحد. تعديل المعلمات اللازمة وتنفيذ برامج محددة مطلوبة من قبل كل خطوة من خطوات التجهيز (انظر eTomo البرنامج التعليمي، http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
  4. في المرحلة النهائية، وخلق كومة الانحياز الكامل (مع وجود خطأ المتبقية يعني أقل من 0.6) وإعادة بناء tomograms باستخدام خوارزمية المرجح عودة الإسقاط في IMOD.
  5. دينويسي المجالات المحتملة للاهتمام باستخدام 3D غير الخطية متباين الخواص نشر حافة تعزيز تنفيذ البرنامج في IMOD مع المعلمات المناسبة لتعزيز التباين والوضوح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتوصيف السلوك الديناميكي للجزيئات الفيروس، تم تصوير خلايا هيلا المصابين HIV-1 بواسطة عالية السرعة متحد البؤر المجهري الخلية الحية وحللت تحركات الجسيمات من خلال تتبع الجسيمات الآلي 3D (الشكل 1). لتجنب مرور الوقت من عدة دقائق التي يمكن أن تحدث بين جمع من الماضي متحد البؤر صورة الخلية الحية ويغرق للتجميد (والتي قد تكون طويلة بما فيه الكفاية لانقاص وترتبط جزيئات HIV-1)، وعلى ضوء المرحلة المجهري البرد مضان (الشكل 3 ) تم تصميمها وبناؤها لتصوير العينات المجمدة رطب 15، داخل خراطيش cryoEM، على المجاهر الخفيفة. تمت إضافة منصة كتلة النحاس (الشكل 3B، السهم الأسود) وخاتم من النحاس (الشكل 3D، رأس السهم) للاستخدام مع غير Polara المجاهر الإلكترونية. وقد تحقق الترابط بين متحد البؤر الخلية الحية، المجهر الضوئي البرد مضان، وcryoET باستخدام فهرسة الذهب شبكات Quantifoil و 0.2 و مو ، م حبات اللاتكس فلوري (الشكل 2). أخذت معا، ويوضح الشكل 4 جدوى الإجراء العام للمتقدم المتلازم المجهري الخلية الحية والبرد الإلكترون التصوير المقطعي لتصور fluorescently المسمى HIV-1 جزيئات التفاعل مع خلية هيلا المضيف.

الشكل 1
الشكل 1. الوقت الفاصل بين متحد البؤر التصوير الخلية الحية من 1 فيروس نقص المناعة البشرية الجزيئات في خلايا هيلا. كانت تتبع الجسيمات الفيروسية A أخضر فلوري واحد (أصفر رأس السهم) في 3D مداخن مبائر مع الحد الأدنى الفاصل الزمني بين 3 إطارات. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

d/50386/50386fig2.jpg "/>
الشكل 2. ارتباط بين الصور مضان والصور cryoEM. (A & B) الفرق تدخل التباين (DIC) صور من خلايا هيلا مثقف على Quantifoil الذهب EM مكتشف الشبكة، سجلت مع 2X (أ) و 20X (ب) الأهداف. (ج) كرو صورة ومضان من خلايا هيلا المجمدة رطب (اللون الأحمر للالميتوكوندريا) و 0.2 ميكرومتر الخرز اللاتكس الفلورية (الخضراء)، وسجلت مع البرد المرحلة والعمل الهدف الهواء لمسافات طويلة 40X، مضافين مع صورة مدينة دبي للإنترنت من الخلايا. (د ) قليلة تكبير الصورة cryoEM من المنطقة المقابلة في (ج). (E & F) الارتباط بين الصور مضان وcryoEM باستخدام 0.2 ميكرومتر الخرز اللاتكس فلوري. وحلقت الخرز المقابلة مع نفس اللون. أشرطة النطاق، 200 ميكرون في، 50 ميكرومتر في ب، 25 ميكرون في ج، د E، 5 ميكرون في F.

الشكل (3)
الشكل (3). بناء البرد ضوء المرحلة المجهري. (أ) ديوار مضغوطة الذاتي، مليئة النيتروجين السائل، وتستخدم لتهدئة النحاس مرحلة البرد عينة (السهم الأبيض). (ب) الأعلى، داخل نظرا للمرحلة البرد عينة ، والتي تبين الغرفة الداخلية (أبيض رأس السهم). يتم وضع العينة على شبكة خرطوشة عينة EM، التي تقع في وسط كتلة النحاس (السهم الأسود). مرة واحدة محملة الشبكة العينة، يتم نقل خرطوشة إلى الدائرة الداخلية (أبيض رأس السهم) لالبرد مضان ضوء المجهر. (C & D) خرطوشة عينة قبل (ج) وبعد (د) وضع خاتم من النحاس (أسود رأس السهم ) للحفاظ على الشبكة في مكان للاستخدام مع غير Polara البرد الإلكترون ميكرoscope.

الشكل 4
الشكل 4. CryoET من الجسيمات فلوري واحد منضم إلى نتوء الخلوي للخلية هيلا بواسطة المجهر مترابط. (A & B) صورة DIC سجلت مع مرحلة المجهري البرد الخفيفة (أ) مضافين مع صورة البرد مضان من جزيئات GFP الموسومة (أحمر) (ب) (ج - ه). منخفضة cryoEM الصور جرعة من المنطقة التي تحتوي على الجسيمات الفلورية (حلقت في لوحة B & C) في 140X (ج)، 3،500 X (د) و 27،500 X (ه)، على التوالي . أقحم، موسع للرأي سجلت بعد الاستحواذ على سلسلة الخيمة تصوير الشعاعي الطبقي (و - ح). ثلاثة 4 نانومتر سميكة شرائح تصوير الشعاعي الطبقي مفصولة مسافة 21 نانومتر في اتجاه z. اتصالات بين الجسيمات وهيلا غشاء الخلية هي indicatبقلم السهام في كل من صورة الإسقاط (أقحم في لوحة ه) وشرائح تصوير الشعاعي الطبقي (لوحات F & G). أشرطة النطاق، 10 ميكرومتر في أ و ب، 20 ميكرون في ج، 500 نانومتر في د، و 100 نانومتر في ه - ح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد قدمنا ​​مجموعة واضحة من البروتوكولات لتوفير نهج مترابط متقدمة لتحليل الأحداث الخلوية الديناميكية باستخدام الوقت الفاصل بين متحد البؤر، والتصوير مضان الخلية الحية تليها cryoET. لدينا التطوير المنهجي لربط 3D التصوير الخلية الحية مع عالية الدقة cryoET أمر بالغ الأهمية لتحقيق العديد من المشاكل البيولوجية الصعبة، مثل تصور نادرة، ودينامية (وليس ثابت، كما ذكرت سابقا)، وحيود الجسيمات الفيروسية محدودة وتفاعلها مع الخلايا المضيفة . ويتميز سلوك المكاني والزماني للجزيئات محددة في الخلايا الحية من خلال تحليل الخلية الحية ويتم استكشاف تفاصيل هيكلية من التفاعلات خلية الفيروس في المراحل عدوى محددة. ويستخدم محلية الصنع، والبرد على ضوء المرحلة المجهري لتسهيل علاقة مباشرة بين الصور ضوء مضان من الخلايا الحية والصور التي تم التقاطها بواسطة cryoEM.

وهناك العديد من النقاط الهامة أن نأخذ في الاعتبار فيأجل أن يكون جمع البيانات الأمثل والتحليل. أولا، عند اختيار مواقع متعددة للالوقت الفاصل بين متحد البؤر التصوير الخلية الحية، وينبغي أن تكون المواقف المحددة تقع ضمن نطاق 0.5 ملم من وسط الشبكة EM، منذ حافة الشبكة يتداخل مع مجال الرؤية لاقتناء سلسلة الميل في cryoET. علاوة على ذلك، ينبغي على الخلايا المحددة للتحليل يكون بين مرحلتين الانقسام، عندما هم الأكثر انتشار التدريجي ومسطحة. ولذلك، فإن المناطق رقيقة من الخلايا، وهي متاحة للتحليل cryoET، هي في مرحلتها الأكثر الموسعة. من أجل الحصول على غالبية الخلايا المستزرعة في مرحلة الطور البيني نفسه، دورة الخلية يمكن أن تكون متزامنة باستخدام العلاج ثيميدين ضعف كتل دورة الخلية في المرحلة S-18 في وقت مبكر. الخلايا أفرج عنه من كتلة ثيميدين ثم تتطور بشكل متزامن من خلال المرحلة G2 والإنقسامية.

الثانية، كما ذكر آنفا، ينبغي التقليل من التأخير الزمني بين الإطار الأخير من صورة متحد البؤر والبرد التثبيت من العينة إلىتسمح علاقة مباشرة بكفاءة الكائنات الحيوية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التسطيح وسلامة الشبكة بالغة الأهمية بالنسبة لجميع الإجراءات ويجب المحافظة طوال البروتوكول، لا سيما عندما يتم التعامل مع الشبكات العارية عن المجاهر غير Polara.

وأخيرا، مطلوب الارتباط دقيقة وموثوق بها بين صورة وصورة مضان المجهر الإلكتروني، للعثور على الهدف، لاقتناء ناجحة لاحقة من البيانات cryoET. في صورة الإسقاط، في التكبير المنخفض، والاعتراف شكل واتجاه خلية محددة والعد في بعض الأحيان الثقوب على الشبكة ضرورية لتحديد موقع المنطقة المترابطة في مجال EM. تضاف حبات اللاتكس فلوري إلى نموذج لعلاقة أكثر قوة ودقة. باستخدام الخرز اللاتكس فلوري أو نقاط الكم، والتي هي على حد سواء الفلورسنت والإلكترون الكثيفة، إحداثيات الهدف في صورة مضان يمكن نقلها مباشرة إلى EM لتوطين دقيقة. انها شولد الإشارة إلى أن الطول الموجي الانبعاثات من الخرز اللاتكس فلوري أو نقاط الكم يتم اختيار ليس لديهم تداخل مع الطول الموجي الانبعاثات من الهدف.

لدينا علاقة الحالية التي أنشئت من أجل تحديد المنطقة المستهدفة يحدث خارج المجهر البرد الإلكترون، وبالتالي تنطوي على نقل خطوة عينة إضافية من المجهر الضوئي إلى المجهر الالكتروني. لقد كان يعتقد وهناك طريقة أكثر مباشرة ومباشرة من 19، عن طريق تركيب جهاز التصوير فلوري في المجهر الإلكتروني. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القرار التي يوفرها العمل الهدف الهواء لمسافات طويلة مع NA من 0.6 محدودة (~ 0.6 ميكرون). ودقيقة ودقيقة النانو توطين جزيء واحد في tomograms الخلوية 3D تعزيز إشراك المجهري القرار السوبر لربط البروتينات المسماة الفلورسنت في التركيب الدقيق.

ويتوقع من خلال الجمع بين ر إضافية مزيد من التقدم في المجهر الضوئي المتلازم وcryoETechniques، مثل البرد تركز أيون شعاع (FIB) صفائح و9،20 زجاجي باجتزاء 8 من العينات المجمدة رطب. هذه التقنيات تغلب على القيود المفروضة من سمك العينة، وتوسيع كبير في مجموعة من عينات قابلة للتحليل cryoET، مما يتيح التحقيق من الجسيمات الفيروسية التي قد سافرت داخل عميق للخلايا. من حيث دراسة التفاعلات جسيمات الفيروس مع العوامل الخلية المضيفة، كذلك وضع العلامات مزدوج من البروتين الخلوي محددة و-1 فيروس نقص المناعة البشرية النوى مع لجنة التحقيق مضان رباعي سيستين تنصهر لHIV-1 CA يمكن تسهيل التعرف على المراحل الأولى خاصة من HIV-1 دورة الحياة والعلاقة المكانية والوظيفية من العوامل المضيفة والجسيمات الفيروسية. ونحن نتوقع أن المتلازم 3D التصوير الخلية الحية ومنهجية cryoET للعب أدوار هامة في إشارة دراسة الخلية، والاتجار مستقبلات الغشاء، والعديد من العمليات الخلوية الحيوية الأخرى في بيولوجيا الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر ترافيس يلر ورشة ميكانيكا في قسم بيولوجيا الخلية وعلم وظائف الأعضاء في جامعة بيتسبرغ لبناء المرحلة عينة البرد مضان، تشانغ لو تاو وتشنغ شو في جامعة العلوم والتكنولوجيا في الصين لأسباب تقنية المساعدة، والدكتور تيريزا Brosenitsch لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (GM082251 وGM085043).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA 12-604F
Fibronectin Sigma, St. Louis, MO F1141-1MG HeLa cell culture on EM grids
Cell tracker Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA C34552 Red CMTPX
Protein A gold conjugates Ted Pella, Inc., Redding, CA 15822-1 15 nm diameter
0.2 μm fluorescent microspheres Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA F8811 Yellow-green fluorescent
Heat-inactivated fetal calf bovine serum Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA 10082-139
Penicillin-Streptomycin Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA 15140-122
Glass-bottom culture dish MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Gold quantifoil finder EM grids Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany R2/2 Au NH2 200 mesh
PBS Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA 70011-044
Equipment
Glow-discharge device 100X EMS, Hatfield, PA
Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun FEI, Hillsboro, OR 300 keV
Vitrobot Mark III FEI, Hillsboro, OR
Olympus IX 71 microscope Olympus America Inc., Center Valley, PA LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens
Nikon TiE microscope Nikon Instruments, Melville, NY using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens
Sweptfield confocal microscope Prairie Technologies, Middleton, WI
Tokai Hit live cell chamber Tokyo, Japan
Cryo-fluorescence sample stage Home-made Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. Visualizing cells at the nanoscale. Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).
  2. Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).
  3. McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).
  4. Arhel, N., et al. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes. Nature Methods. 3, 817-824 (2006).
  5. Gousset, K., et al. Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages. PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).
  6. Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
  7. Koch, P., et al. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology. 6, 84 (2009).
  8. Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr. Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).
  9. Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).
  10. Sartori, A., et al. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).
  11. Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).
  12. van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).
  13. Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).
  14. Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells. Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).
  15. Jun, S., et al. Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography. Structure. 19, 1573-1581 (2011).
  16. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).
  17. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
  18. Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).
  19. Agronskaia, A. V., et al. Integrated fluorescence and transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).
  20. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4, 215-217 (2007).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 76، علم الأحياء الجزيئي، علم الأحياء الهيكلي، وعلم الفيروسات، الفيزياء الحيوية، علم الأحياء الخلوي، علم وظائف الأعضاء، الطب، الهندسة الطبية، والعدوى، علم الأحياء الدقيقة، التكنولوجيا والصناعة، الزراعة، العلوم الحياتية (العامة)، المجهري الارتباطي، CryoET، البرد الإلكترون التصوير المقطعي ، متحد البؤر التصوير الخلية الحية، المجهر الضوئي البرد مضان، HIV-1، قفيصة، هيلا الخلية، الخلية، فيروس، المجهري، والتصوير
الميكروسكوب المتلازم لتحليل الهيكلية 3D من التفاعلات الدينامية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, … More

Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, G. A., Watkins, S. C., Zhang, P. Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions. J. Vis. Exp. (76), e50386, doi:10.3791/50386 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter