Summary
Wir beschreiben eine korrelative Mikroskopie-Methode, die High-Speed-3D-Live-cell Fluoreszenzlichtmikroskopie und hochauflösenden Kryo-Elektronen-Tomographie vereint. Wir demonstrieren die Fähigkeit des korrelativen Verfahren durch Abbilden dynamisch kleine HIV-1-Partikeln Interaktion mit dem Host-HeLa-Zellen.
Abstract
Cryo-Elektronen-Tomographie (cryoET) ermöglicht 3D-Visualisierung von zellulären Strukturen auf molekularer Auflösung in einem close-to-physiologischen Zustand 1. Allerdings ist die direkte Visualisierung einzelner viraler Komplexe in ihrem Wirt zellulären Umgebung mit cryoET herausfordernd 2, aufgrund der seltenen und dynamischen Charakter der das Eindringen des Virus, insbesondere im Fall von HIV-1. Während Zeitraffer-Live-Cell-Imaging eine große Menge an Informationen über viele Aspekte des Lebenszyklus von HIV-Januar 03-07 geführt hat, die Auflösung durch Live-Cell-Mikroskopie geleistet wird, ist begrenzt (~ 200 nm). Unsere Arbeit wurde bei der Entwicklung einer Methode, die Korrelation direkte Visualisierung der frühen Ereignisse des HIV-1-Infektion ermöglicht durch die Kombination von lebenden Zellen Fluoreszenzlichtmikroskopie, Kryo-Fluoreszenzmikroskopie und cryoET abzielen. Auf diese Weise kann in lebenden Zellen und Kryo-fluoreszierenden Signale zur genauen Führung der Probenahme in cryoET werden. Darüber hinaus strukturelle Informationen aus cryoET kann b erhaltene mit den dynamischen funktionellen Daten ergänzt gewonnen durch Live-Cell-Imaging von fluoreszierenden markierten Ziel.
In diesem Video-Artikel, bieten wir detaillierte Methoden und Protokolle zur strukturellen Untersuchung von HIV-1-und Host-Zell-Interaktionen mit 3D Korrelat High-Speed Live-Cell-Imaging und hochauflösende cryoET Strukturanalyse. HeLa Zellen, die mit HIV-1-Partikeln infiziert wurden zuerst durch konfokale Mikroskopie lebenden Zellen dadurch, und die Region, die den gleichen viralen Partikel wurde dann durch Kryo-Elektronen-Tomographie zur 3D-Struktur-Details analysiert. Die Korrelation zwischen zwei Sätzen von Bilddaten, optische Bildgebung und Elektronenabbildungseinrichtung, wurde unter Verwendung eines selbst zusammengestellten Kryo-Fluoreszenz-Lichtmikroskopie Stufe. Der Ansatz detailliert hier wertvoll sein wird, nicht nur für die Untersuchung von Virus-Wirt-Zell-Wechselwirkungen, sondern auch für breitere Anwendungen in der Zellbiologie, wie z. B. Zell-Signal-, Membran-Rezeptor-, und viele andere dynamische zelluläre Prozesse. </ P>
Introduction
Cryo-Elektronen-Tomographie (cryoET) ist ein leistungsfähiges bildgebendes Verfahren, das drei-dimensionale (3D) Visualisierung von Zellen und Geweben ermöglicht und Einblicke in die Organisation von nativen Organellen und zellulären Strukturen auf molekularer Auflösung in einem nahe-zu physiologischen Zustand 1. Allerdings macht die inhärent niedrigen Kontrast von ungefärbten tiefgefrorenen Probe mit ihrer Strahlung Empfindlichkeit kombiniert, ist es schwierig, Bereiche von Interesse in einer Zelle zu lokalisieren und anschließend die Durchführung der Kippserie erfolgreich ohne Beschädigung des Zielbereichs. Um diese Probleme zu überwinden, ist ein Ansatz, der korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie kombiniert notwendig. Spezifische Eigenschaften von Fluoreszenz-Markierung hervorgehoben werden identifiziert und lokalisiert durch Fluoreszenz Lichtmikroskopie und dann ihre Koordinaten auf dem Elektronenmikroskop für den Erwerb von hochauflösenden 3D-Strukturdaten übertragen. Diese Methode hilft Korrelat Ortung des Ziels einreas von Interesse angesprochen werden. Durch die Begrenzung auf Probe Dicke mit Kryo-EM (<300 nm), die derzeit nur die peripheren Regionen der Zelle sind geeignet für 3D-Strukturanalyse durch CryoET. Weitere Verringerung der Dicke der tiefgefrorenen Proben durch Glaskörper Schneiden 8 oder durch Kryo-Focused Ion Beam (FIB)-Fräsen 9 erweitern würde die Fähigkeit der korrelativen Bildgebung.
Bisher wurden korrelative Methoden in erster Linie verwendet, um cryoET Datenerfassung für große und statischen Strukturen 10-13 erleichtern. In diesen Studien wurden Kryo-Stufen realisiert, um Kryo-EM-Gittern zu akzeptieren und passen entweder auf einem aufrechten Mikroskop oder einem inversen Mikroskop 10,11,14. Obwohl Umschalten Gitter scheint recht einfach in ihre Konstruktionen gibt es weitere Schritte zur Übertragung des EM Netz beteiligt sind, die Chance zu erhöhen, dass das Gitter verformt werden, beschädigt und verunreinigt. Wir haben vor kurzem gezeigt, einen technischen Fortschritt inkorrelative Mikroskopie, die uns direkt sichtbar dynamische Ereignisse, die von Natur aus schwer zu erfassen, wie z. B. HIV-1-und Host-Zell-Interaktionen in frühen Stadien der Infektion 15 erlaubt. Wir erreichten dies durch die Entwicklung und Implementierung eines Kryo-Lichtmikroskopie Probe Bühne, die eine Cartridge-System, um die Probe Schäden durch Gitter Handhabung minimieren passt, und erleichtert so Korrelation. Unser Design verfügt über einen integrierten Probe Kartuschenhalters, so dass sowohl Kryo-Licht und Kryo-Elektronenmikroskopie durchgeführt, werden nacheinander auf der gleichen Probenhalter, ohne Probe zu übertragen, damit die Straffung des korrelativen Verfahren. Darüber hinaus haben wir auch eine genaue und zuverlässige Korrelation Verfahren unter Verwendung von fluoreszierenden Latex-Kügelchen als Bezugsmarker.
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Protocol
1. HeLa Zellkultur auf Kohlenstoff-beschichteten Gold EM Finder Grids
- Glimmentladung die Kohlenstoff-Seite eines 200-mesh R2 / 2 Quantifoil Gold EM finder Gitter unter 25 mA für 25 sek.
- Bestreichen Sie die EM-Raster mit Fibronektin, von schwimmenden es, Kohlenstoff-Seite nach unten auf ein 40 ul Tröpfchen von 50 ug / ml Fibronektin-Lösung, dann desinfizieren sie unter UV-Licht für 2 Stunden in einer Gewebekultur Kapuze.
- Teller HeLa-Zellen auf das Gitter in einer Dichte von 2 x 10 4 Zellen / ml (insgesamt 2 ml Kultur) in einem Glas-bottom Kulturschale wachsen und die Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2, in DMEM mit 4,5 ergänzt g / L L-Glutamin und Glukose, 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, für ungefähr 18 Stunden. HeLa-Zellen werden nach der O / N-Kultur infiziert.
2. HIV-1-Infektion und Live-Cell-Imaging
- In einer fluoreszierenden Zelle tracker (Red CMTPX, 1 ul / 2 ml) in den Glasboden-KulturSchale (aus Stufe 1.3) und Inkubation die Schale bei 37 ° C für 10 min, damit der Fluoreszenzfarbstoff up-nehmen.
- Waschen Sie die Zellen mit PBS und 50 ul vorgewärmte frisches Medium.
- Die Schale auf den Live-Cell Kammer bei 37 ° C, einer Wischfeld Konfokalscanner Mikroskop. Wählen Sie mehrere Felder (10-15 Positionen), die 1-3 Zellen / square enthalten, die mit den Zellen zwischen zwei Phasen der Mitose, wenn sie am meisten ausgebreiteten und flach (siehe Abbildungen 2c und 2d), da sind Kryo-EM erfordert relativ dünnen Bereiche der Probe. Bewahren Sie diese Positionen für zukünftige Bildgebung (Schritt 2.5).
- Infizieren die Zellen mit VSV-G pseudo-typisierte HIV-1 Partikel, die GFP-Vpr enthalten (wir verwenden 40 ul einer Probe mit 40 ng / ml p24). Beim Hinzufügen der Viruspartikel in den Boden der Schale, vorsichtig zu stören die EM Netz, da die Positionen für die Bildgebung bereits ausgewählt und gespeichert wurden.
- Unmittelbar nach Zugabe von Virionen, sammeln time-verfallen Hochgeschwindigkeits-3D-konfokale Bilder, auf den zuvor ausgewählten Positionen (aus Schritt 2.3) für 20-40 min.
- Konfokale Bilder wurden unter Verwendung MetaMorph und analysiert durch automatisierte 3D particle tracking für einzelne Partikel Dynamik mit Imaris Software (siehe Abbildung 1). Da wir Korrelation des dynamischen Verhaltens von beugungsbegrenzter sind HIV-1 Partikel mit zellulären Ultrastruktur, Zeitraffer-Live-Cell-Imaging und 3D particle tracking sind entscheidend für die Ergebnisse. Jedoch für eine große und statische Struktur, würde eine einfache Fluoreszenzbild (ohne lebende Zellen) ausreichend für die korrelative Analyse.
3. Frozen-hydratisiert EM Probenvorbereitung
Um die Zeitverzögerung zwischen Sammlung der letzten Konfokalbild und Kryo-Fixierung der Probe zu minimieren, sollte die FEI Vitrobot (oder einem anderen Gerät Verglasung) initiiert und vorbereitet für Sprung-Einfrieren während der Sammlung der Fluoreszenz konfokale Live-Cell-Bildern.
- Schalten Sie das Gerät und Verglasung gesetzt sein Klima Temperatur auf 22 ° C, das Ziel Luftfeuchtigkeit bis 100%, das Löschpapier auf 7 sec, und das Warten und Drain auf 1 sek.
- Legen Sie die Grid-Storage-Box in der Kolben Dewar und bereiten kalt flüssigem Ethan. Montieren Sie den Dewar auf die Verglasung Gerät.
- Unmittelbar nach konfokale Live-Cell-Imaging (Abschnitt 2), legen Sie die Kulturschale auf einer eisgekühlten Kupfer Block und überträgt es auf die Kryo-EM Probenvorbereitung Zimmer. Laden Sie die EM Gitter auf den spezialisierten Pinzette und schnell auslöschen entfernt alle Medien in der Startaufstellung. Der Blot wird manuell mit Filterpapier getan, woraufhin 4 ul von 15 nm Gold Bead-Lösung mit 0,2 um fluoreszierende Mikrosphären wird sofort auf dem Gitter platziert gemischt. Die Gold-Kügelchen sind als Bezugsmarker zur tomographischen Datenerhebung und Ausrichtung zu unterstützen. Die fluoreszierende Mikrosphären werden verwendet, um Korrelation zwischen Fluoreszenz-und Kryo-EM-Bilder unterstützen (siehe Abbildungen 2c-2f).
- Legen Sie die Pinzette auf die Verglasung und Gerät anweisen, das Gerät zu tilgen und stürzen Einfrieren in flüssigem Ethan 16. Die Blot-Parameter optimiert, um beste Ergebnis zu erzielen sind: Blot Zeit, 7 sec; Blot Offset, 0; Drain Zeit, 1 sec, Temperatur, 22 ° C und Luftfeuchtigkeit 100%.
- Übertragen der tiefgefrorenen Gitters an eine Kryo-EM-Halter zum sofortigen cryoET Bildgebung oder einer Lagerung in flüssigem Stickstoff Dewar zur späteren Verwendung.
4. Cryo-Fluoreszenz Lichtmikroskopie
Eine selbst gebaute, Kryo-Fluoreszenz Probenraum und Bühne (Abbildung 3), die zur Durchführung Schritte 4,1-4,10. Die detaillierten Spezifikationen und Beschreibung der Stufe kann in Juni et al. 15 gefunden werden.
- Füllen Sie ein selbst unter Druck flüssigem Stickstoff Dewar mit flüssigem Stickstoff mindestens 2 Stunden vor dem Start Kryo-Fluoreszenz Lichtmikroskopie (siehe Abbildung 3a).
- Montieren Sie einen selbstgebauten Kryo-fluorescence Probe Stufe 15 (Abbildung 3) auf einem invertierten Fluoreszenz-Mikroskop, wie ein Olympus IX 71.
- Verbinden Sie den flüssigen Stickstoff Einlass der Kryo-Probe auf die Bühne selbst unter Druck Dewar und platzieren Sie den flüssigen Stickstoff Überlaufschutz Steckdose in einen geeigneten Behälter. Schließen Sie ein trockenes Stickstoffgas Linie mit einer Hülse über dem Objektiv, damit die Linse warm und frostfrei platziert.
- Legen Sie eine Kupfer-Block-Plattform (schwarzer Pfeil in Abb. 3b) in der Kryo-Kammer Bühne für das Laden der tiefgefrorenen Probe Netz. Abkühlen und füllen das Kupfer Kammer des Kryo-Bühne mit flüssigem Stickstoff durch die Zuleitung von der selbst unter Druck Füllung Dewar.
- Wenn die Kryo-Bühne Temperatur von flüssigem Stickstoff (in ~ 4-6 min) erreicht, übertragen Sie die Grid-Storage-Box (aus Schritt 3.5) mit dem Kryo-Bühne.
- Legen Sie die tiefgefrorenen Probe Gitter in der EM Probe Patrone auf dem Kupfer-Block und klemmen Sie den glos in Ort mit einem C-Ring (bei Verwendung eines Mikroskops Polara Kartusche), oder legen Sie eine vorgekühlte Kupfer Ring an der Oberseite (schwarz Pfeilspitze in Abbildung 3d), um das Raster in Position zu halten und auch für einfache Wiederherstellung des Netzes nach Kryo-Fluoreszenz-Bildgebung (wenn für eine nicht-Polara Kryo-Elektronenmikroskop).
- Platzieren der Kassette (aus Schritt 4.6) in den Innenraum des Cryo-Stufe (weiße Pfeilspitze in Fig. 3b).
- Suchen und finden Sie die gleichen Viruspartikeln aus den Live-Cell-Imaging-Daten. Da die EM Grid hat einen Index, ist es einfach zu lokalisieren dasselbe Teilchen auf dem Gitter in beiden Live-Cell-Bilder und Kryo-Blüte Bilder.
- Erwerben Kryo-DIC-und GFP-Bilder an den identifizierten Positionen unter Kryo-Zustand mit einem Lichtmikroskop mit einem langen Arbeitstag (2.7-4 mm) Objektiv. Während der Kryo-Fluoreszenz-Bildgebung, regelmäßig den flüssigen Stickstoff Ebene in der Kryo-Bühne und füllen Sie ihn, falls erforderlich, um die Probe zu Stufe unterhalb -170 halten° C.
- Nach Abschluss der Kryo-Fluoreszenz-Bildgebung, vorsichtig wieder die Probe Patrone zum Kupfer-Block-Plattform und speichern Sie die Patrone in einem Flüssigstickstoff-Dewar für zukünftige cryoET Analyse mit einem Polara System. Bei Verwendung eines nicht-Polara Kryo-Elektronenmikroskop, entfernen Sie den Ring Kupfer, rufen Sie die Probe Gitter, legen Sie sie in einem Grid-Storage-Box, und speichern Sie die Probe in einem Flüssigstickstoff-Dewar bis die Probe durch cryoET untersucht wird.
- Für die Datenanalyse, überlappen die erworbenen Kryo-DIC-und GFP-Bilder (aus Schritt 4.9, siehe Abbildung 4b) und korrelieren die Positionen der GFP-Signale in der Kryo-Fluoreszenz-Bild mit den in der Live-Cell-Imaging-Serie erhalten.
5. Cryo-Elektronen-Tomographie
- Wägegut Patrone in den Cryo-Übergabestation mit einem Elektronenmikroskop mit einer Feldemissionsquelle, wie Polara G2 Mikroskop ausgestattet.
- Unter low-dose-Suchmodus bei einer Vergrößerung von 140X, identify und speichern Sie die zugehörigen Planquadrate (aus Schritt 4.11) in eine Bühne Datei.
- Unter low-dose-Suchmodus bei einer Vergrößerung von 3500 X, legen Sie eine 100 um Objektivapertur, Such-und speichern Sie alle Positionen mit GFP-Signale in einer zweiten Stufe Datei korreliert.
- Unter low-dose-Aufnahme-Modus, finden Sie einen leeren Bereich Strahlintensität zu einer Dosis von 1 oder 2 E einstellen - / Å 2 und verfeinern die Kippachse, über die Bühne y-Funktion, durch die Verbrennung entfernt das Eis in einem unwichtigen Kohlenstoff Region mit mehreren Gold-Kügelchen.
- Unter low-dose-Fokus-Modus, stellen Sie den Fokus auf ~ 3 um und stellen Sie den Winkel, um die Richtung des Fokus auszurichten, dass sie parallel zur Kippachse.
- Unter low-dose-Suchmodus erinnern gespeicherten Positionen (aus Schritt 5.3), passen Sie die Probe euzentrische Höhe und überprüfen Sie den Schwenkbereich für den Bereich von Interesse. Erwerben Sie ein Projektionsbild mit sehr niedrigen Elektronen-Dosis (~ 1 e - / Å 2) bei 8 bis 10 um Unschärfe, in Ausstellungenure-Modus, um die korrelierten Viruspartikel für Kryo-Elektronen-Tomographie bestätigen.
- Wechseln Sie auf die low-dose-Fokus-Modus. In TEM auto Funktionen Menü, stellen Sie dem automatisierten euzentrische Höhe und konzentrieren Funktionen der Schwerpunktsetzung.
- Stellen Sie die Parameter für den Erwerb eines Tilt-Serie. Für Abbildung 4 in diesem Papier, angefangen Neigungswinkel ± 70 °, unterhalb und oberhalb 45 °, bei 3 ° und 2 ° Neigung Schritten jeweils verwendet wurden, mit einem 6 um Unschärfe und etwa 70 e - / Å 2 Gesamtdosis.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.7 und 5.8 für alle gespeicherten Positionen. Batch-Tomographie-Software kann für die automatisierte Datenerfassung auf mehreren Positionen eingesetzt werden, um den Durchsatz zu erhöhen.
6. Dreidimensionale Rekonstruktion mit IMOD 17
- Überprüfen Sie die rohen Kippserie um die minimalen und maximalen Dichte Werte einzustellen und festzustellen, ob es irgendeine Aussicht ausgeschlossen aufgrund der großen Bildvers werden.
- Starten eTomo und Setup Tomogramm Panel mit Achse Typ, Pixelgröße, fiducial Durchmesser, etc. Dann erstellen com Skripte.
- Konfigurieren Sie das Hauptfenster, so dass mehrere Stufen des Tomogramms Berechnung angepasst werden kann / gefolgt gleichzeitig. Ändern Sie die erforderlichen Parameter und führen die spezifischen Programme, die von jedem Verarbeitungsschritt (Siehe eTomo Tutorial benötigt werden http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
- In der letzten Stufe, erstellen Sie eine vollständige ausgerichteten Stapel (mit einer mittleren Restfehler kleiner als 0,6) und zu rekonstruieren Schichtaufnahmen mit einer gewichteten Rückprojektionsalgorithmus in IMOD.
- DeNoise mögliche Bereiche von Interesse mit einem 3D nichtlinearen anisotropen Diffusion Rand Verbesserung Programm in IMOD mit entsprechenden Parametern implementiert, um den Kontrast und die Klarheit zu verbessern.
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Representative Results
Um das dynamische Verhalten der Viruspartikel zu charakterisieren, wurden HeLa-Zellen mit HIV-1 infiziert von High-Speed-konfokale Mikroskopie lebender Zellen abgebildet und die Partikel-Bewegungen wurden durch automatisierte 3D particle tracking analysiert (Abbildung 1). Um die Zeitspanne von mehreren Minuten, die zwischen Sammlung der letzten konfokale Live-Cell-Bild und tauchen Gefrierpunkt (die lang genug, um HIV-1 korreliert Teilchen verlieren), eine Kryo-Fluoreszenz Lichtmikroskopie Bühne (Abbildung 3 auftreten können zu vermeiden ) wurde entworfen und für die Bildgebung tiefgefrorenen Proben 15 gebaut, im Kryo-EM-Patronen, auf Lichtmikroskopen. Ein Kupferblock Plattform (3b, schwarzer Pfeil) und Kupferring (Abbildung 3d, Pfeilspitze) wurde zur Verwendung bei nicht-Polara Elektronenmikroskop aufgenommen. Korrelation zwischen der konfokalen lebenden Zellen, Kryo-Fluoreszenz Lichtmikroskopie und cryoET wurde unter Verwendung indiziert gold Quantifoil Gitter und 0,2 mu & ; M fluoreszierenden Latex-Kügelchen (Abbildung 2). Zusammengenommen zeigt Abbildung 4 die Machbarkeit des gesamten Verfahrens für fortgeschrittene Korrelat lebenden Zellen und Kryo-Elektronen-Tomographie, um fluoreszenzmarkierte HIV-1 Partikel Interaktion mit einer Vielzahl von HeLa-Zellen zu visualisieren.
Abbildung 1. Zeitraffer-konfokale Abbildung lebender Zellen von HIV-1 Partikel in HeLa-Zellen. Eine einzelne grüne fluoreszierende Viruspartikel (gelbe Pfeilspitze) wurde in 3D konfokale Stacks mit einer 3 min Zeitintervall zwischen den Einzelaufnahmen verfolgt. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Abbildung 2. Korrelation zwischen Fluoreszenzbilder und Kryo-EM-Bilder. (A & b) Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Bilder von HeLa-Zellen auf einem Quantifoil Gold EM Sucher Gitter mit 2X (a) und 20X (b) die Ziele aufgezeichnet kultiviert. (C) Cryo -Fluoreszenzbild tiefgefrorenen HeLa-Zellen (rot für Mitochondrien) und 0,2 um fluoreszierenden Latex-Kügelchen (grün), mit einer Kryo-Stufe und einer 40X langem Arbeitsabstand Luftobjektiv mit DIC Bild von Zellen überlagert aufgezeichnet. (d ) Low Vergrößerung Kryo-EM-Bild der entsprechenden Region in (c). (e & f) Zusammenhang zwischen Fluoreszenz-und Kryo-EM-Bilder mit 0,2 um fluoreszierenden Latex-Kügelchen. Entsprechende Perlen werden mit der gleichen Farbe eingekreist. Maßstab Bars, 200 um in a, b 50 um, 25 um in c, d e, f 5 um.
Abbildung 3. Bau von Kryo-Lichtmikroskopie Bühne. (A) Ein selbst unter Druck Dewar mit flüssigem Stickstoff, der zur Kühlung des Kupfer Kryo-Probe Stufe (weißer Pfeil) gefüllt. (B) Top, Innenansicht des Kryo-Probenhalter , welche die innere Kammer (weiß Pfeilspitze). Die Probe wird auf das Gitter EM Probe Patrone, die in der Mitte eines Kupferblock (schwarzer Pfeil) sitzt platziert. Sobald mit der Probe Netz geladen wird, wird die Kassette in die innere Kammer (weißer Pfeil) für übertragene Kryo-Fluoreszenz-Lichtmikroskopie. (C und d) Die Probe Patrone vor (c) und nach (d) Anordnen eines Kupferring (schwarze Pfeilspitze ), um das Raster in Position zu halten für die Verwendung mit nicht-Polara Kryo-Elektronenmikroskopie micrOSCOPE.
Abbildung 4. CryoET eines einzigen fluoreszierenden Teilchen gebunden an das zellulare Vorsprung eines HeLa-Zellen durch korrelative Mikroskopie. (A & b) A DIC Bild mit einer Kryo-Lichtmikroskopie Stufe (a) überlagert mit einem Kryo-Fluoreszenzbild GFP-markierten Teilchen aufgezeichnet (rot) (b) (c - e). Niedrig dosierte Kryo-EM-Bilder von der Region, die eine fluoreszierende Partikel (eingekreist Panel b & c) 140X (c) 3500 X (d) und 27.500 X (e), jeweils . Einschub eine vergrößerte Darstellung nach der Erfassung des tomographischen Kippserie aufgezeichnet (f - h). Drei 4 nm dick tomographischen Scheiben durch einen Abstand von 21 nm in der z-Richtung getrennt. Verbindungen zwischen dem Partikel und HeLa Zellmembran indicated durch Pfeile sowohl in der Projektion Bild (Einschub in Panel e) und tomographischen Scheiben (Platten f & g). Maßstab Bars, 10 um in einer & b, 20 um in c, 500 nm in d und 100 nm in e - h.
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Discussion
Wir haben eine einfache Reihe von Protokollen vorgelegt, um eine erweiterte korrelativen Ansatz zur dynamischen zellulären Ereignissen mit Zeitraffer-konfokale, Live-Zell-Fluoreszenz-Imaging von cryoET gefolgt analysieren zu stellen. Unsere methodische Entwicklung zur 3D-Live-Cell-Imaging mit hochauflösenden cryoET korrelieren ist entscheidend für viele anspruchsvolle biologische Probleme, wie die Visualisierung selten, dynamisch (nicht statisch, wie bereits berichtet) und beugungsbegrenzter viralen Partikel und ihre Wechselwirkungen mit Wirtszellen zu untersuchen . Die räumliche und zeitliche Verhalten bestimmter Partikel in lebende Zellen von lebenden Zellen charakterisiert und die strukturellen Details der Virus-Zell-Wechselwirkungen in den definierten Infektionsstadien erforscht. Eine hausgemachte, Kryo-Lichtmikroskopie Stufe wird verwendet, um direkte Korrelation zwischen Fluoreszenzlicht Bilder von lebenden Zellen und Bilder von Kryo-EM erobert erleichtern.
Es gibt einige wichtige Punkte zu beachten, in haltenUm eine optimale Datenerfassung und-analyse haben. Erstens, wenn Kommissionierung mehrere Positionen für Zeitraffer-konfokale Abbildung lebender Zellen, sollten die ausgewählten Positionen innerhalb von 0,5 mm von der Mitte des EM Grid sein, da die Kante des Gitters stört das Sichtfeld für Kippreihe Übernahme in cryoET. Ferner sollten die Zellen für die Analyse ausgewählt zwischen zwei Phasen der Mitose werden, wenn sie am meisten ausgebreiteten und flach sind. Daher sind die dünnen Bereiche der Zellen, für cryoET Analyse auf ihren am weitesten ausgedehnten Stadium. Um die Mehrzahl der kultivierten Zellen auf der gleichen überkritischen haben, können Zellzyklus synchronisiert mit doppelten Thymidin-Behandlung, die Blöcke Zellzyklus in der frühen S-Phase 18 sein. Zellen aus Thymidin Block freigegeben dann synchron Fortschritt durch G2-und Mitose-Phase.
Zweitens wird, wie bereits erwähnt, sollte die Zeitverzögerung zwischen dem letzten Frame des konfokalen Bild und Kryo-Fixierung der Probe minimiert werdenermöglichen eine effiziente direkte Korrelation dynamischer Objekte. Darüber hinaus sind die Ebenheit und die Integrität des Netzes kritisch für alle Verfahren und muss während des Protokolls beibehalten werden, insbesondere, wenn unbehandeltes Gitter für nicht Polara Mikroskope behandelt werden.
Schließlich wird eine präzise und zuverlässige Korrelation zwischen dem Bild und dem Fluoreszenz-Elektronenmikroskopie Bild, um das Ziel zu finden, für eine erfolgreiche spätere Übernahme von cryoET Daten erforderlich. In einem Projektionsbild bei geringer Vergrößerung, sind die Erkennung der Form und Richtung einer ausgewählten Zelle und manchmal Zählen Löcher auf dem Gitter notwendig, die zueinander in Beziehung stehenden Bereich in der EM-Feld zu lokalisieren. Fluorescent Latexkügelchen werden auf die Probe für eine robuste und genaue Korrelation aufgenommen. Mit fluoreszierenden Latex-Kügelchen oder Quantenpunkte, die sowohl Fluoreszenz und hoher Elektronendichte, können die Koordinaten des Ziels in Fluoreszenzbild direkt EM werden für eine präzise Lokalisierung übertragen. Es Schulterd darauf hingewiesen, dass die Emissionswellenlänge der fluoreszierenden Latex-Kügelchen oder Quantenpunkte gewählt ist nicht auf Überschneidung mit der Emissionswellenlänge des Targets aufweisen.
Unsere aktuellen Korrelation bis zur Identifizierung eines Zielbereich eingestellt findet außerhalb eines Kryo-Elektronenmikroskop, also mit einer zusätzlichen Probe Transfer Schritt von einem optischen Mikroskop mit einem Elektronenmikroskop. Eine direkte und unkomplizierte Methode wurde aus 19 dachte, durch die Installation eines Fluoreszenz-Bildgebung Geräte im Elektronenmikroskop. Darüber hinaus ist die Auflösung durch einen langen Arbeitsabstand Luft Objektiv mit NA von 0,6 ergab begrenzt (~ 0,6 um). Präzise und genaue Lokalisation nanoskaligen einzelnes Molekül in 3D zellulären Schichtaufnahmen weiter beinhalten eine Super Resolution Mikroskopie, um fluoreszenzmarkierte Proteine in der Ultrastruktur korrelieren.
Weitere Fortschritte in Korrelat Lichtmikroskopie und cryoET werden durch die Kombination zusätzliche t erwartetechniques wie Kryo-Focused Ion Beam (FIB) 9,20 Fräsen und Schneiden Glaskörper 8 von tiefgefrorenen Proben. Diese Techniken überwinden die Grenzen der Probendicke, erheblich Erweiterung der Palette von Proben zugänglich für cryoET Analyse, wodurch Untersuchung der viralen Partikel, die tief im Inneren der Zellen gereist. In Bezug auf das Studium der Virus-Partikel-Wechselwirkungen mit Wirtszellfaktoren, weitere Doppel-Markierung von spezifischen zellulären Protein und HIV-1-Kerne mit einem Tetra-Cystein Fluoreszenzsonde fusioniert an HIV-1 CA kann die Identifizierung von bestimmten Anfangsphase des HIV-1 Lebenszyklus und die räumlichen und funktionalen Zusammenhang von Host-Faktoren und Viruspartikel. Wir gehen davon aus das Korrelat 3D-Live-Cell-Imaging und cryoET Methodik eine wichtige Rolle in der Studie Zellkommunikation, Membran-Rezeptor-, und viele andere dynamische zelluläre Prozesse in der Zellbiologie spielen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Travis Wheeler und die Werkstatt am Institut für Zellbiologie und Physiologie, University of Pittsburgh für den Bau des Kryo-Fluoreszenzprobe Bühne Changlu Tao und Cheng Xu an der University of Science and Technology of China danken für die technische Unterstützung und Dr. Teresa Brosenitsch für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (GM082251 & GM085043) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. | |
References
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W.
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).
- McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).
- Arhel, N., et al. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes. Nature Methods. 3, 817-824 (2006).
- Gousset, K., et al. Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages. PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).
- Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
- Koch, P., et al. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology. 6, 84 (2009).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr. Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).
- Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).
- Sartori, A., et al. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).
- Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells. Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).
- Jun, S., et al. Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography. Structure. 19, 1573-1581 (2011).
- Dubochet, J., et al.
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).
- Agronskaia, A. V., et al. Integrated fluorescence and transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).
- Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4, 215-217 (2007).
