Summary
Мы описываем корреляционный метод микроскопии, что сочетает в себе высокую скорость 3D живых клеток свете флуоресцентной микроскопии высокого разрешения и крио-электронной томографии. Показана возможность корреляционного метода динамического изображения, небольшие ВИЧ-1 частиц, взаимодействующих с клетками-хозяевами HeLa.
Abstract
Крио-электронной томографии (cryoET) позволяет 3D-визуализации клеточных структур на молекулярном разрешение в близких к физиологическим состоянием 1. Тем не менее, прямой визуализации отдельных вирусных комплексов в их среде клетки-хозяина с cryoET 2 является сложной задачей, в связи с нечастыми и динамичный характер проникновении вируса в клетку, особенно в случае ВИЧ-1. В то время как покадровой живых клеток изображений дало большое количество информации о многих аспектах жизненного цикла ВИЧ-1, 3-7, разрешение предоставляемой живых клеток микроскопии ограничена (~ 200 нм). Наша работа была направлена на разработку корреляционный метод, который позволяет прямой визуализации ранние события инфекции ВИЧ-1 путем объединения живых клеток флуоресцентной микроскопии свет, крио-флуоресцентной микроскопии и cryoET. Таким образом, живых клеток и крио-флуоресцентные сигналы могут быть использованы для точного направления выборки в cryoET. Кроме того, структурная информация, полученная из cryoET можно бэлектронной дополнена динамической функциональной данных, полученных через живые клеток изображений флуоресцентных помечены цели.
В этом видео статье мы подробно методы и протоколы для структурных исследований ВИЧ-1 и клетки-хозяина взаимодействий с использованием 3D корреляционного высокоскоростной живых клеток изображений с высоким разрешением cryoET структурного анализа. HeLa клетки, инфицированные ВИЧ-1 Частицы характеризуют первую помощью конфокальной живых клеток микроскопии и область, содержащую те же вирусные частицы затем анализировали на крио-электронной томографии для 3D структурные детали. Корреляции между двумя наборами данных изображений, оптических изображений и электронных изображений, была достигнута с помощью самодельного крио-флуоресценции световой микроскопии этапе. Подход здесь подробно будет ценен не только для изучения вирус-хозяин взаимодействий клетки, но и для более широкого применения в клеточной биологии, таких как сотовые сигнализации, торговлей мембранным рецептором, и много других динамических клеточных процессов. </ P>
Introduction
Крио-электронной томографии (cryoET) является мощным методом визуализации, которая позволяет трехмерные (3D) визуализации клеток и тканей и дает представление о родной организации органеллы и клеточные структуры на молекулярном разрешение в близких к физиологическим состоянием 1. Тем не менее, по существу низкий контраст неокрашенных замороженных гидратированный образец, в сочетании с их чувствительность к облучению, делает его трудно обнаружить области, представляющие интерес внутри клетки, а затем выполнения наклона серии успешно без повреждения целевой области. Для того чтобы преодолеть эти проблемы, корреляционный подход, который сочетает в себе световой и электронной микроскопии необходимо. Особенности подчеркивается флуоресцентное мечение определены и находятся с помощью флуоресцентной световой микроскопии, а затем их координаты передаются в электронном микроскопе на приобретение высоким разрешением 3D структурных данных. Это корреляционный метод помогает размещения целевыхREAS интереса решать. Из-за ограничений на толщину образца с cryoEM (<300 нм), в настоящее время только периферийных областей клетки подходят для 3D структурного анализа CryoET. Дальнейшее уменьшение толщины замороженных гидратированных образцов стекловидного секционирования по 8 или по крио-сфокусированного ионного пучка (FIB) 9 фрезерных бы расширить возможности корреляционного изображений.
Ранее корреляционного методов использовались в первую очередь для облегчения cryoET сбора данных для крупных и статические структуры 10-13. В этих исследованиях, крио-туров были реализованы принять cryoEM сетей и помещается на любом прямой микроскоп или инвертированный микроскоп 10,11,14. Хотя переключение сетей кажется довольно простым в своих проектах, существуют дополнительные этапы передачи для сетки EM, увеличивая вероятность того, что сетка может быть деформирована, поврежденные и загрязненные. Мы недавно продемонстрировал технический прогресс вкорреляционной микроскопии, которая позволяет нам непосредственно визуализировать динамические события, которые по своей природе трудно уловить, таких как ВИЧ-1 и взаимодействия клетка-хозяин на ранних стадиях инфекции 15. Мы добились этого путем разработки и осуществления Cryo-световой микроскопии предметный столик, который адаптирует системы картриджа, чтобы минимизировать повреждение образца из-за сетки обработки, что облегчает корреляцию. Наш дизайн включает в себя интегрированный держатель картриджа образца, что позволяет как крио-свет и крио-электронной микроскопии должны быть выполнены последовательно, на том же держателе образца, без переноса образца, что позволило бы упростить корреляционного процесса. Кроме того, мы также внедрили точной и надежной корреляции процедуры с использованием флуоресцентных латексных как координатных меток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура клеток HeLa на покрытые углеродом, золото EM Finder сети
- Тлеющего разряда углерода стороне 200 меш R2 / 2 Quantifoil золото EM искатель сетки при 25 мА в течение 25 сек.
- Пальто с сеткой EM фибронектин, путем размещения его, углерода стороной вниз, на 40 мкл капли 50 мкг / мл раствора фибронектина, то вылечить под УФ-светом в течение 2 часов в капюшоне культуры ткани.
- Пластина HeLa клетки на сетку при плотности 2 × 10 4 клеток / мл (всего 2 мл культуры) в стеклянным дном чашки для культивирования и роста клеток при 37 ° С с 5% СО 2, в DMEM дополнена 4,5 г / л L-глутамина и глюкоза, 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки, 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, в течение приблизительно 18 часов. HeLa клетки инфицируют после O / N культуре.
2. Инфекции ВИЧ-1 и Live-ячейки изображения
- Добавить трекер флуоресцентные клетки (красный CMTPX, 1 мкл / 2 мл) в стакан дном культурыблюдо (с шагом 1.3) и инкубировать блюдо при 37 ° С в течение 10 мин, чтобы разрешить до-дубль флуоресцентным красителем.
- Промыть клетки с PBS и добавляют 50 мкл предварительно нагретого свежей средой.
- Место блюдо на живых клеток камере, при 37 ° С, из скользящего Поле конфокальной микроскопии сканера. Выбор нескольких полей (10-15 позиции), которые содержат 1-3 клеток / квадрат, с клетками двух фаз митоза, когда они наиболее размазанной и плоские (см. рис 2с и 2d), так cryoEM требует относительно тонких областей образца. Храните эти позиции для будущих томография (шаг 2.5).
- Infect клеток с VSV-G псевдо-типизированных ВИЧ-1 частиц, содержащих GFP-Vpr (мы используем 40 мкл образца, содержащего 40 нг / мл р24). При добавлении вирусных частиц в нижнюю тарелку, быть осторожным, чтобы не мешать сетки Е.М., поскольку позиции для визуализации уже выбраны и сохранены.
- Сразу после добавления вирионов, собирают тиМне покадровой высокоскоростной 3D конфокальной изображения, на ранее выбранной позиции (с шагом 2,3) в течение 20-40 мин.
- Конфокальной изображения были получены с помощью MetaMorph и проанализированы автоматизированные 3D слежения за частицей единой динамики частиц Imaris использованием программного обеспечения (см. Рисунок 1). Так как мы корреляции между результатами динамического поведения дифракционной ВИЧ-1 частиц с сотовой ультраструктура, покадровой живых клеток изображений и 3D-слежение частицы имеют решающее значение для результатов. Однако для больших и статическую структуру, простой флуоресценции изображение (без живых клеток) будет достаточно для корреляционного анализа.
3. Frozen-гидратированных EM Подготовка образцов
Чтобы свести к минимуму задержку между коллекция последних конфокальной изображения и крио-фиксации образца, Vitrobot FEI (или другого устройства стеклования) должны быть инициированы и подготовлены для погружных замораживания во время сбора флуоресценции конфокальной живых клеток изображений.
- Включите стеклованию устройство и установите ее климат температуры до 22 ° С, целевой влажности до 100%, промокательной время до 7 сек, а подождать и слить время 1 сек.
- Поместите коробку сетки хранения в плунжере Дьюара и подготовить холодной жидкости этана. Установите Дьюара на стеклованию устройства.
- Сразу после конфокальной живых клеток изображений (раздел 2), поместите культуры блюдо на охлажденную льдом медного блока и передать его на cryoEM комнате подготовки образца. Загрузите сетки EM на специализированных пинцет и быстро промокните от всех носителях, на сетке. Блоттинга делается вручную, с помощью фильтровальной бумаги, после чего 4 мкл 15 нм золотых шарик раствор смешан с 0,2 мкм флуоресцентные микросферы немедленно помещали на эту сетку. Золотым бисером используются в качестве координатных меток для помощи томографического сбора данных и выравнивание. Флуоресцентные микросферы используются для оказания помощи корреляции между флуоресцентным и cryoEM изображения (см. рис 2С-2F).
- Загрузите пинцетом на стеклованию устройства и поручить устройство, чтобы уничтожить и окунуться замораживание в жидком этана 16. Блоттинга параметры оптимизированы для достижения наилучшего результата являются: блот время 7 сек; блот смещение, 0; время слива, 1 сек, температура, 22 ° С и влажности 100%.
- Передача замороженных гидратированных сетки cryoEM держатель для немедленной визуализации cryoET или жидким азотом сосуд Дьюара хранения для последующего использования.
4. Крио-флуоресценции световой микроскопии
Самодельный, крио-камеру флуоресценции образца и ступенчатая система (рис. 3), необходимых для выполнения шага 4.1-4.10. Подробные характеристики и описание сцены могут быть найдены в июне и соавт. 15.
- Заполнить самостоятельно под давлением жидким азотом сосуд Дьюара с жидким азотом, по крайней мере, 2 часа перед началом крио-флуоресценции световой микроскопией (см. рисунок 3а).
- Установите самодельных крио-Fluorescence стадии образца 15 (рис. 3) на перевернутой флуоресцентного микроскопа света, таких как Olympus IX 71.
- Подключите вход для жидкости азот крио-предметный столик к самостоятельно под давлением Дьюара и поместить жидкий азот защита от переполнения выход в соответствующий контейнер. Подключите линии сухого газообразного азота в рукаве находится над объективом удалите с объектива теплой и свободной от льда.
- Разместите платформу медного блока (черная стрелка на рисунке 3b) в крио-камеру этапе для загрузки замороженных гидратированных образцов сетки. Охладить и заполнить меди палаты крио-сцене с жидким азотом через входную линию от самостоятельно под давлением заполнения Дьюара.
- Когда крио-стадии достигает температуры жидкого азота (в ~ 4-6 мин), перенесите ящик для хранения сетки (с шагом 3,5) к крио-сцене.
- Поместите замороженные гидратированных образцов сетки в картридж EM образца на медном блоке и клип гизбавиться на месте с помощью С-образного кольца (при использовании картриджа Polara микроскопом), или поместить предварительно охлажденный медное кольцо сверху (черная стрелка на рисунке 3d), чтобы держать сетки на месте, а также для облегчения поиска сетки после крио-флуоресценции (если для не-Polara крио-электронной микроскопии).
- Поместите картридж (с шагом 4,6) во внутренней камере крио-стадии (белый стрелкой на рисунке 3б).
- Ищите и находите тех же частиц вируса из живых клеток данных изображений. Поскольку грид EM имеет индекс, это просто для локализации и той же частицы на сетке в обоих живых клеток изображений и крио-цветения изображений.
- Приобретать крио-DIC и GFP изображений определены позиции под крио-состояние с помощью светового микроскопа с долгим сроком (2.7-4 мм) объективом. Во время крио-флуоресценции, периодически проверять уровень жидкости азота в крио-сцене и пополнить его, по мере необходимости, оставить этот пример этапе ниже -170° C.
- По завершении крио-флуоресценции, осторожно вернуть образец картридж с платформой блок меди и хранения картриджа в жидком азоте Дьюара для будущего анализа cryoET с системой Polara. Если используется не Polara крио-электронной микроскопии, удаляйте медные кольца, получения этих образцов сетки, поместите его в ящик для хранения сетки, и хранить образец в сосуд Дьюара жидким азотом до образца не рассматривается cryoET.
- Для анализа данных, перекрывают приобрел крио-DIC и GFP изображений (с шагом 4,9 см. 4б) и коррелирует позиции GFP сигналы в крио-флуоресценции изображение с результатами, полученными в живых клеток изображений серии.
5. Крио-электронной томографии
- Загрузить образец картридж в крио-передаточную станцию электронного микроскопа оснащен пушкой полевой эмиссией, такие как микроскоп Polara G2.
- При низких доз режим поиска при увеличении 140X, идеntify и сохранить соответствующие квадраты сетки (с шагом 4.11) в стадию файла.
- При низких доз режим поиска при увеличении 3500 X, вставьте 100 мкм апертуры объектива, поиск и сохранить все позиции коррелирует с сигналами GFP во второй файл этапе.
- В условиях низкой дозы режим экспозиции, найти пустую область регулировать интенсивность пучка дозе 1 или 2 e - / 2 результаты наклон оси вращения, с помощью функции этапе у, способны сжигать лед в неважных регионе углерода с несколькими золотым бисером.
- В условиях низкой дозы режима фокусировки, отрегулировать фокусное расстояние до ~ 3 мкм и отрегулируйте угол, чтобы выровнять направление фокуса быть параллельны оси наклона.
- В условиях низкой дозы режиме поиска вызывать сохраненные позиции (с шагом 5,3), регулировать высоту образца eucentric и проверьте диапазон наклона для области интереса. Приобретать проецирования изображения с очень низкими дозами электронов (~ 1 e - / 2) от 8 до 10 мкм расфокусировки, в выставкахЮр режиме, для подтверждения коррелированных частиц вируса для крио-электронной томографии.
- Переключитесь на низкодозной режима фокусировки. В ПЭМ меню автоматической функции, предшествуют автоматизированная eucentric высоты и сосредоточить функции на зоне фокусировки.
- Установите параметры для получения наклона серии. Для рисунке 4 в этой бумаге, углы наклона в пределах ± 70 °, ниже и выше 45 °, на 3 ° и 2 ° наклон шагом, соответственно, были использованы, с 6 мкм расфокусировки и примерно 70 E - / 2 общей дозы.
- Повторите шаги 5.7 и 5.8 для всех сохраненных позиций. Пакетный томографии программное обеспечение может использоваться для автоматического сбора данных на несколько позиций для увеличения пропускной способности.
6. Трехмерная реконструкция использованием УПМ 17
- Проверьте сырой серии наклона для регулировки минимального и максимального значений плотности и определить, есть ли целью исключить из-за большого сдвига изображения.
- Начать eTomo и настройка панели с помощью томограммы типа оси, размер пикселя, доверительное диаметра, и т.д.. Затем создайте COM скрипты.
- Настройка главного окна так, что несколько этапов томограммы вычислений можно регулировать / последующей одновременно. Измените необходимые параметры и выполнить конкретные программы, необходимые для каждого шага обработки (См. eTomo учебнике, http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
- На заключительном этапе, создать полный стек выровнен (со средней остаточной ошибки менее 0,6) и реконструкции томограмм с использованием взвешенного обратного проецирования алгоритма в УПМ.
- Удаляет малые потенциальных областей, представляющих интерес использованием 3D нелинейной анизотропной диффузии выделения контуров программа реализована в УПМ с соответствующими параметрами для повышения контрастности и ясности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы охарактеризовать динамическое поведение вирусные частицы, HeLa, клетки, инфицированные ВИЧ-1, были обследованы на высокоскоростных конфокальной живых клеток микроскопии и движения частиц были проанализированы автоматизированных 3D отслеживания частицы (Рис. 1). Чтобы избежать времени до нескольких минут, которые могут возникнуть между сбором последнего конфокальной живых клеток изображения и погружной замораживания (который может быть достаточно длинным, чтобы проиграть коррелирует ВИЧ-1 частиц), крио-флуоресценцию световой микроскопии этап (рисунок 3 ) был спроектирован и построен для работы с изображениями замороженных гидратированных образцов 15, в cryoEM патронов, на световых микроскопов. Платформа медного блока (рис. 3б, черная стрелка) и медное кольцо (рис. 3, стрелка) был добавлен для использования с не-Polara электронных микроскопов. Корреляция между конфокальной живых клеток, крио-флуоресценции световой микроскопии и cryoET была достигнута с помощью индексированных золота Quantifoil сетей и 0,2 и му ; М флуоресцентных латексных шариков (рис. 2). Взятые вместе, Рисунок 4 демонстрирует возможность общей процедуры для продвинутых корреляционного живых клеток микроскопии и крио-электронной томографии для визуализации флуоресцентно меченых ВИЧ-1 частиц, взаимодействующих с клеткой-хозяином HeLa.
Рисунок 1. Покадровый конфокальной живых клеток изображений ВИЧ-1 частиц в клетках HeLa. Один зеленый флуоресцентный-вирусной частицы (желтая стрелка) был записан в 3D конфокальной складывается с 3 мин интервал времени между кадрами. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
d/50386/50386fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Корреляция между флуоресцентных изображений и cryoEM изображений. (И б) дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображения клеток HeLa культивировали на Quantifoil золото EM искатель сетки, записанный с 2X (а) и 20х (б) цели. (С) Криогенный флуоресценции изображение замороженных гидратированных клетки HeLa (красный цвет для митохондрий) и 0,2 мкм флуоресцентные шарики латекса (зеленый), записанные с крио-стадии и 40X длительный срок цель расстояние воздух, обложен DIC изображение клеток. (г ) Низкая изображение cryoEM увеличение соответствующей области в (с). (е и е) Корреляция между флуоресценцией и cryoEM изображений с использованием 0,2 мкм флуоресцентные шарики латекса. Соответствующие шарики обведены с тем же цветом. Шкала баров, 200 мкм, 50 мкм, б, 25 мкм, C, D е, 5 мкм в ф.
Рисунок 3. Строительство Cryo-световой микроскопии этапе. (А) самостоятельно под давлением сосуд Дьюара, заполненный жидким азотом, используется для охлаждения медных крио-предметный столик (белая стрелка). (Б) сверху, внутри вид на крио-предметный столик , показывающий внутреннюю камеру (белые стрелки). Образец сетки помещается на картридже EM образца, который сидит в центре медного блока (черная стрелка). После загрузки с образцом сетки, картридж передается во внутреннюю камеру (белые стрелки) для крио-флуоресценцию световой микроскопии. (С & г) образца картридж до (с) и после (г) размещение медное кольцо (черная стрелка ), чтобы сохранить место в сетке для использования с не-Polara крио-электронной микрoscope.
Рисунок 4. CryoET одного флуоресцентные частицы, связанной с клеточным выступ клетки HeLa по корреляционной микроскопии. (& B) DIC изображение, записанное с крио-световой микроскопии стадии (а), облицованная с крио-флуоресценции GFP изображение с метками частиц (красный) (б) (- е). Низкая доза cryoEM изображения области, содержащей флуоресцентный частиц (обведено панель б и в) по меньшей 140X (с) 3500 Х (г) и 27500 X (е) соответственно . Вставка, в увеличенном масштабе, записанные после приобретения серии наклона томографические (F - H). Три 4 нм толщиной ломтиками томографических, находящихся на расстоянии от 21 нм в направлении Z. Подключения между частицей и HeLa клеточной мембраны являются индикацииЭд стрелками на обоих проекции изображения (вставка на панели е) и томографическое ломтиками (панели F & G). Шкала баров, 10 мкм & B, 20 мкм в С, 500 нм в д, и 100 нм в E - H.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представили простой набор протоколов для обеспечения передовых корреляционный подход для анализа динамических событий с помощью сотовой покадровой конфокальной, живых клеток флуоресценции последующим cryoET. Наши методологических разработок соотнести 3D Live-ячейки изображения с высоким разрешением cryoET имеет решающее значение для расследования многих сложных биологических проблем, таких как визуализация редко, динамический (не статичны, как сообщалось ранее), а дифракционной вирусных частиц и их взаимодействия с клетками-хозяевами . Пространственные и временные поведения конкретных частиц в живых клетках характеризуется живых клеток анализ и структурные детали вирус-клетка взаимодействия при определенных стадиях инфекции в этих случаях. Домашние, крио-световой микроскопии этап используется для облегчения прямой корреляции между свете флуоресценции изображений из живых клеток и снимки, сделанные cryoEM.
Есть несколько важных моментов, чтобы иметь в виду,Чтобы иметь оптимальную сбора и анализа данных. Во-первых, при выборе нескольких позициях для покадровой конфокальной живых клеток изображений, выбранных местах должно быть в пределах 0,5 мм от центра сетки Е.М., так как край сетки пересекается с полем зрения для наклона серии приобретения в cryoET. Кроме того, клетки, выбранные для анализа должна быть в пределах двух фаз митоза, когда они наиболее размазанной и плоскими. Таким образом, тонкие области клеток, доступных для анализа cryoET, в их самом расширенном этапе. Для того чтобы иметь большинство культивируемых клеток на той же стадии интерфазы клеточного цикла могут быть синхронизированы с помощью двойной обработке тимидина, который блокирует клеточный цикл в начале S-фазе 18. Клетки освобождаются от блока тимидином затем перейти синхронно через G2 и митотической фазы.
Во-вторых, как уже упоминалось ранее, временная задержка между последним кадром конфокальной изображения и крио-фиксации образца должно быть сведено к минимумупозволяют эффективно прямой корреляции динамических объектов. Кроме того, плоскостность и целостность сетки являются критическими для всех процедур и должна быть сохранена в течение протокол, особенно при голой сетки обработаны для не-Polara микроскопов.
Наконец, точные и надежные корреляции между флуоресценции изображение и электронного изображения микроскопию, чтобы найти цель, необходимо для успешного последующего приобретения cryoET данных. В проекции изображения, при небольшом увеличении, признание Форма и направление выбранной ячейки, а иногда подсчет отверстий сетки необходимо, чтобы найти сопоставленную область в электромагнитном поле. Флуоресцентные шарики латекс добавляют к образцу для более надежной и точной корреляции. Используя флуоресцентные шарики латекса или квантовые точки, которые являются люминесцентными лампами и электронно-плотные, координаты цели флуоресценции изображение может быть непосредственно переданы EM для точной локализации. Это зачиститьбы отметить, что длина волны излучения флуоресцентных латексных или квантовые точки выбрано не иметь перекрытия с длиной волны излучения от цели.
Наши текущие корреляции создан для идентификации целевой области происходит вне крио-электронного микроскопа, при этом участием дополнительный этап передачи образца из оптического микроскопа в электронный микроскоп. Более прямой и прямой метод был продуман 19, установив люминесцентные устройство формирования изображения в электронном микроскопе. Кроме того, разрешение предоставляемой длительный срок цель расстояние воздух с ЧА 0,6 ограничено (~ 0,6 мкм). Точный и аккуратный наноразмерные молекулы одного локализации в 3D сотовой томограммы будет дальнейшее вовлечение супер микроскопии разрешение соотнести флуоресцентных меченых белков в ультраструктуре.
Дальнейший прогресс в корреляционной микроскопии cryoET света и, как ожидается, путем объединения дополнительного Techniques, таких как крио-сфокусированного ионного пучка (FIB) фрезерный 9,20 и стекловидного секционирования 8 замороженных гидратированных образцов. Эти методы преодоления ограничений толщины образца, что значительно расширяет диапазон выборок поддающийся для анализа cryoET, что позволяет исследование вирусных частиц, которые путешествовали глубоко внутри клеток. С точки зрения изучения вирусной частицы взаимодействия с клеткой-хозяином факторов, далее двойной маркировки специфических клеточных белков и ВИЧ-1 ядер с тетра-цистеин флуоресценции зонда, слитые с ВИЧ-1 CA могли бы способствовать определению конкретных ранних стадиях ВИЧ-1 жизненного цикла и пространственную и функциональную зависимость факторов хозяина и вирусных частиц. Мы ожидаем, что корреляционная 3D Live-ячейки изображения и cryoET методологии играют важную роль в исследовании клеточной сигнализации, торговлей мембранным рецептором, и много других динамических клеточных процессов в клеточной биологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Трэвис Уилер и механической мастерской на кафедре клеточной биологии и физиологии Университета Питтсбурга для строительства крио-флуоресценции образца этапе Changlu Тао и Чэн Сюй в Университете науки и технологии Китая за техническую помощи, и д-р Тереза Brosenitsch за критическое прочтение рукописи. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья (GM082251 & GM085043).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. | |
References
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. Visualizing cells at the nanoscale. Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).
- McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).
- Arhel, N., et al. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes. Nature Methods. 3, 817-824 (2006).
- Gousset, K., et al. Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages. PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).
- Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
- Koch, P., et al. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology. 6, 84 (2009).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr. Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).
- Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).
- Sartori, A., et al. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).
- Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells. Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).
- Jun, S., et al. Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography. Structure. 19, 1573-1581 (2011).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).
- Agronskaia, A. V., et al. Integrated fluorescence and transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).
- Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4, 215-217 (2007).
