Summary
We beschrijven een correlatieve microscopie methode die high-speed 3D levende cellen fluorescerend licht microscopie en hoge-resolutie cryo-electron tomografie combineert. We demonstreren het vermogen van de correlatieve wijze dynamische beeldvorming, kleine HIV-1 deeltjes interactie met gastheer HeLa cellen.
Abstract
Cryo-electron tomography (cryoET) maakt het mogelijk 3D-visualisatie van cellulaire structuren op moleculaire resolutie in een close-to-fysiologische toestand 1. Echter, directe visualisatie van individuele virale complexen in hun gastheer cellulaire omgeving met cryoET 2 is uitdagend, gezien de lage frequentie en de dynamische aard van virale binnenkomst, met name in het geval van HIV-1. Terwijl de time-lapse live cell imaging veel informatie over de vele aspecten van de levenscyclus van HIV-3-07 januari heeft opgeleverd, de resolutie wordt geboden door levende cellen microscopie is beperkt (~ 200 nm). Ons werk is gericht op het ontwikkelen van een correlatie methode die directe visualisatie van de vroege gebeurtenissen van HIV-1 infectie toelaat door het combineren van levende cellen fluorescerend licht microscopie, cryo-fluorescentie microscopie, en cryoET. Op deze wijze kunnen levende cellen en cryo-fluorescente signalen worden gebruikt voor het nauwkeurig geleiden van de bemonstering in cryoET. Bovendien, structurele informatie uit cryoET kunnen be aangevuld met de dynamische functionele data verkregen door middel van live-cell imaging van fluorescent gelabelde doelwit.
In deze video artikel, bieden we gedetailleerde methoden en protocollen voor structurele onderzoek van HIV-1 en gastheer-cel interacties met behulp van 3D correlatieve high-speed Live-cell imaging en hoge-resolutie cryoET structurele analyse. HeLa-cellen geïnfecteerd met HIV-1 deeltjes werden eerst gekenmerkt door confocale microscopie van levende cellen, en het gebied dat dezelfde virale deeltje werd vervolgens geanalyseerd met cryo-electron tomografie voor 3D structurele details. De correlatie tussen de twee reeksen van beeldgegevens, optische beeldvorming en elektronen imaging, werd bereikt met behulp van een zelfgebouwde cryo-fluorescentie lichtmicroscopie podium. De aanpak die hier beschreven zal waardevol zijn, niet alleen voor studie van virus-gastheercel interactie, maar ook voor bredere toepassing in celbiologie, zoals signaaltransductie, receptor membraan handel, en vele andere dynamische cellulaire processen. </ P>
Introduction
Cryo-electron tomography (cryoET) is een krachtige imaging techniek die driedimensionale (3D) visualisatie van cellen en weefsels mogelijk maakt en geeft inzicht in de organisatie van de inheemse organellen en cellulaire structuren op moleculaire resolutie in een dicht-bij fysiologische toestand 1. Echter, de inherent lage contrast van ongekleurde bevroren gehydrateerde monster, gecombineerd met hun stralingsgevoeligheid, bemoeilijkt gebieden plaats binnen een cel lokaliseren en vervolgens uitvoeren van de tilt series succes zonder beschadiging van het doelgebied. Om deze problemen te overwinnen, een correlatieve benadering die licht en elektronenmicroscopie combineert noodzakelijk. Bijzonderheden gemarkeerd door fluorescentielabelling worden geïdentificeerd en gelokaliseerd door fluorescentie microscopie, en vervolgens de coördinaten worden overgedragen aan de elektronenmicroscoop voor het ingaan van hoge resolutie 3D structurele gegevens. Deze correlatieve methode helpt het lokaliseren van de doelgroep eenReas van belang zijn worden aangepakt. Door de beperking van monsterdikte met cryoEM (<300 nm), nog alleen de randgebieden van de cel geschikt voor 3D structuuranalyse door CryoET. Verdere vermindering van de dikte van bevroren gehydrateerd monsters door glasvocht snijden 8 of door cryo-focused ion beam (FIB) frezen 9 zou het vermogen van correlatieve beeldvorming breiden.
Voorheen werden correlatieve methoden voornamelijk gebruikt om cryoET data acquisitie voor grote en statische constructies 10-13 vergemakkelijken. In deze studies zijn cryo-fasen geïmplementeerd om cryoEM roosters accepteren en passen op ofwel een rechtopstaande microscoop of een omgekeerde microscoop 10,11,14. Hoewel schakelende grids lijkt vrij eenvoudig in hun ontwerpen, zijn er extra stappen die overdracht van de EM rooster, waardoor de kans dat het rooster kan worden vervormd, beschadigd en vervuild. We hebben onlangs aangetoond een technische vooruitgang incorrelatieve microscopie die ons in staat stelt om direct te visualiseren dynamische gebeurtenissen die van nature moeilijk te vangen, zoals HIV-1 en gastheercel interactie in een vroeg stadium van de infectie 15. We bereikte dit door het ontwerpen en implementeren van een cryo-lichtmicroscopie monstertafel dat een cartridge systeem om het monster schade door raster handling minimaliseren aanpast, waardoor het gemakkelijker correlatie. Ons ontwerp omvat een geïntegreerd exemplaar patroonhouder, waardoor beide cryo-licht en cryo-elektronenmicroscopie worden uitgevoerd, achtereenvolgens, op hetzelfde monster houder, zonder monster overdracht, waardoor het stroomlijnen van het correlatieve proces. Daarnaast hebben we eveneens uitgevoerd een nauwkeurige en betrouwbare correlatie procedure met fluorescerende latex kralen als markeerders.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HeLa Cell Culture on Carbon coating, Goud EM Finder Grids
- Gloedlossing de koolstof-kant van een 200-mesh R2 / 2 Quantifoil goud EM finder net onder de 25 mA voor 25 sec.
- De vacht van de EM rooster met fibronectine, door drijven het, carbon-kant naar beneden, op een 40 pi druppel van 50 ug / ml fibronectine oplossing, desinfecteer het dan onder UV-licht voor 2 uur in een weefselkweek kap.
- Plaat HeLa cellen op het rooster op een dichtheid van 2 x 10 4 cellen / ml (totaal 2 ml kweek) in een glazen bodem cultuur schotel en groeien de cellen bij 37 ° C, met 5% CO2, in DMEM aangevuld met 4,5 g / L L-glutamine en glucose, 10% warmte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum, 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, gedurende ongeveer 18 uur. HeLa cellen worden geïnfecteerd na O / N cultuur.
2. HIV-1 infectie en live-cell imaging
- Voeg een fluorescerende cel tracker (Red CMTPX, 1 ui / 2 ml) in de glazen bodem cultuurschotel (uit stap 1.3) en incubeer de schotel bij 37 ° C gedurende 10 min, om up-opbrengst van de fluorescerende kleurstof.
- Was de cellen met PBS en voeg 50 ul voorverwarmde vers medium.
- Zet de schaal op de live-cell kamer, bij 37 ° C, van een bocht beschreven Field confocale microscoop scanner. Selecteer meerdere velden (10-15 posities) die 1-3 cellen / vierkante bevatten, met de cellen tussen twee mitose fasen wanneer ze het meest verspreid-out en platte (zie figuren 2c en 2d), sinds cryoEM vereist relatief dunne gebieden van de monster. Bewaar deze posities voor toekomstige beeldvorming (stap 2.5).
- Infecteren de cellen met VSV-G pseudo-getypeerde HIV-1 deeltjes die GFP-Vpr bevatten (we gebruiken 40 ul van een monster met 40 ng / ml p24). Bij het toevoegen van het virus deeltjes in de bodem van de schaal, voorzichtig zijn om de EM net niet storen, omdat de posities van beeldvormende reeds geselecteerd en opgeslagen.
- Onmiddellijk na toevoeging van virions, verzamelen time-vervallen high-speed 3D confocale beelden, bij de eerder gekozen standen (uit stap 2.3) gedurende 20-40 minuten.
- Confocale beelden werden verkregen met behulp van MetaMorph en geanalyseerd door geautomatiseerde 3D deeltje volgen voor enkel deeltje dynamiek behulp Imaris software (zie figuur 1). Aangezien we correleren het dynamische gedrag van buigingsbegrensde HIV-1 deeltjes met cellulaire ultrastructuur, time-lapse live cell imaging en 3D deeltjes volgen kritisch zijn voor de resultaten. Voor een grote en statische structuur, een eenvoudige fluorescentiebeeld (zonder levende cellen) zou voldoende correlatieve analyse.
3. Frozen-gehydrateerd EM Monstervoorbereiding
Om de vertraging tussen de verzameling van de laatste confocale afbeelding en cryo-fixatie van het monster te minimaliseren, moet de FEI Vitrobot (of ander apparaat vitrificatie) worden geïnitieerd en voorbereid voor duik-bevriezing tijdens het verzamelen van fluorescentie confocale live cell afbeeldingen.
- Schakel de verglazing apparaat en stel het klimaat temperatuur tot 22 ° C, de doelstelling luchtvochtigheid tot 100%, de blotting tijd om 7 sec, en het wachten en afvoer tijd tot 1 sec.
- Plaats de opbergbox raster in de zuiger dewar en bereiden koude vloeistof ethaan. Monteer de dewar op de verglazing apparaat.
- Onmiddellijk na confocale voor live-cell imaging (hoofdstuk 2), plaats de cultuur schotel op een met ijs gekoelde koperen blok en overbrengen naar het cryoEM monstervoorbereiding kamer. Laad de EM rooster op de gespecialiseerde pincet en snel alle media op de grid weg te deppen. De blotting gebeurt handmatig, met filtreerpapier, waarna 4 pl van 15 nm goud kraal oplossing gemengd met 0,2 um wordt fluorescerende microsferen direct op het rooster. De gouden kralen worden gebruikt als ijkmarkeringen om tomografische gegevens verzamelen en uitlijning hulp. De fluorescente microsferen worden gebruikt om de correlatie tussen tl en cryoEM afbeeldingen steun (zie figuur 2c-2f).
- Laad de pincet op de verglazing apparaat en instrueren het apparaat te wissen en storten bevriezen in vloeibare ethaan 16. De blotting parameters geoptimaliseerd om het beste resultaat te bereiken zijn: vlek tijd, 7 sec; vlek offset, 0; drain tijd, 1 sec, temperatuur, 22 ° C, en de luchtvochtigheid, 100%.
- Breng de bevroren-gehydrateerd grid naar een cryoEM houder voor onmiddellijke cryoET beeldvorming, of een vloeibare stikstof opslag dewar voor later gebruik.
4. Cryo-fluorescentie lichtmicroscopie
Een zelfgebouwde, cryo-fluorescentie monsterkamer en fase-systeem (figuur 3) is nodig voor het uitvoeren van de stappen 4,1-4,10. De gedetailleerde specificaties en de beschrijving van de fase kan worden gevonden in juni et al.. 15.
- Vul een zelf-druk vloeibare stikstof Dewar met vloeibare stikstof ten minste 2 uur voor aanvang van cryo-fluorescentie microscopie (zie figuur 3a).
- Monteer een zelfbouw cryo-fluorescence monstertafel 15 (figuur 3) op een omgekeerde fluorescentie lichtmicroscoop, zoals een Olympus IX 71.
- Sluit de vloeibare stikstof inlaat van de cryo-monster etappe naar de zelf-druk Dewar en plaats de stikstof overloopbeveiliging afvoer vloeistof in een geschikte container. Sluit een droog stikstofgas lijn naar een huls geplaatst over de doelstelling om de lens aan warme en vorstvrij te houden.
- Plaats een koperen blok platform (zwarte pijl in figuur 3b) in de cryo-fasekamer voor het laden van de bevroren-gehydrateerde monster raster. Afkoelen en vul de koperen kamer van de cryo-podium met vloeibare stikstof door de inlaat lijn van de self-druk vullen dewarvat.
- Wanneer de cryo-podium temperatuur van vloeibare stikstof (in ~ 4-6 min) bereikt, dragen de opbergbox raster (uit stap 3.5) naar de cryo-podium.
- Plaats de bevroren-gehydrateerde monster rooster in de EM specimen cartridge op de koperen blok en clip de gontdoen in plaats met behulp van een C-ring (bij gebruik van een Polara microscoop cartridge), of plaats een pre-gekoelde koperen ring op de top (zwarte pijlpunt in figuur 3d), om het rooster op zijn plaats voor het gemakkelijk terugvinden van het net te houden en ook na cryo-fluorescentie beeldvorming (indien een niet-Polara cryo-elektronenmicroscoop).
- Plaats de cartridge (uit stap 4.6) in de binnenkamer van de cryo-podium (witte pijl in figuur 3b).
- Zoek en vind op dezelfde virusdeeltjes uit de live-cell imaging data. Aangezien EM kap heeft een index, is het eenvoudig om hetzelfde deeltje op het rooster zowel levende cellen beelden en cryo-bloei beelden lokaliseren.
- Acquire cryo-DIC en GFP beelden op de geïdentificeerde posities onder cryo-toestand met behulp van een lichtmicroscoop met een lang werkende (2,7-4 mm) objectief. Tijdens de cryo-fluorescentie beeldvorming, periodiek de vloeibare stikstof niveau in de cryo-podium en vul het, zo nodig, aan het monster podium houden onder de -170° C.
- Na voltooiing van cryo-fluorescentie beeldvorming, zorgvuldig het model cartridge terug te keren naar de koperen blok platform en bewaar de cartridge in een vloeibare stikstof Dewar voor toekomstige cryoET analyse met een Polara systeem. Bij gebruik van een niet-Polara cryo-elektronenmicroscoop, verwijder de koperen ring, halen het monster rooster, plaats het in een rooster opbergdoos, en het monster op te slaan in een vloeibare stikstof Dewar totdat het monster wordt onderzocht door cryoET.
- Voor data-analyse, overlappen de verworven cryo-DIC en GFP beelden (uit stap 4.9, zie figuur 4b) en correleren van de posities van de GFP-signalen in de cryo-fluorescentie afbeelding met die verkregen in de live-cell imaging-serie.
5. Cryo-electron tomografie
- Plaats het monster patroon in de cryo-overslagstation van een elektronenmicroscoop uitgerust met een veldemissiebron, zoals Polara G2 microscoop.
- Onder lage dosis-zoekmodus bij een vergroting van 140X, identify en sla de bijbehorende rooster vierkanten (van stap 4.11) in een podium bestand.
- Onder lage dosis-zoekmodus bij een vergroting van 3500 X, plaatst u een 100 um objectieve diafragma, zoek en alle posities gecorreleerd met GFP signalen om in een tweede fase bestand op te slaan.
- Onder lage dosis-belichting, vinden een leeg gebied aan lichtintensiteit aan te passen aan een dosis van 1 of 2 e - / Å 2 en verfijnen van de tilt-as, met behulp van het podium y-functie, door het wegbranden van het ijs in een onbelangrijke carbon regio met verscheidene gouden kralen.
- Onder lage dosis-focus modus, om de scherpstelafstand tot ~ 3 micrometer en de hoek aan te passen aan de richting van de focus lijn parallel aan de kantelas te zijn.
- Onder lage dosis-zoekmodus, herinneren opgeslagen posities (uit stap 5.3), past het model eucentrische hoogte en controleer de tilt bereik van het gebied van belang. Verwerven afbeelding een projectie met zeer lage elektron-dosis (~ 1 e - / Å 2) op 8 tot 10 micrometer defocus, in expoure-modus, om de gecorreleerde virusdeeltjes te bevestigen voor cryo-electron tomografie.
- Schakel over naar de lage-dosis-scherpstelling. In TEM menu automatische functies, vooraf aan de geautomatiseerde eucentrische hoogte en richten functies op het focusgebied.
- Stel de parameters voor het verwerven van een tilt-serie. Voor figuur 4 in dit document, kantelhoeken variërend ± 70 °, onder en boven 45 °, bij 3 ° en tilt stappen van 2 °, respectievelijk, werden gebruikt, met een 6 micrometer defocus en ongeveer 70 e - / Å 2 totale dosis.
- Herhaal de stappen 5.7 en 5.8 voor alle opgeslagen posities. Batch tomografie software kan worden gebruikt voor automatische gegevensverzameling op meerdere posities van de doorvoer te verhogen.
6. Driedimensionale reconstructie met behulp IMOD 17
- Inspecteer de ruwe tilt-serie om de minimale en maximale densiteit waarden aan te passen en te bepalen of er een te worden uitgesloten vanwege grote afbeelding shift.
- Start eTomo en setup tomogram paneel met astype, pixelgrootte, de vaste diameter, enz. Maak vervolgens com scripts.
- Configureert het hoofdvenster zodanig dat verschillende stadia van de tomogram berekening kan worden aangepast / gelijktijdig gevolgd. Wijzig de nodige parameters en uitvoeren van de specifieke programma's die nodig zijn door elke bewerkingsstap (zie eTomo tutorial http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
- In de laatste fase, maak een volledige lijn stack (met een gemiddelde resterende fout minder dan 0,6) en het reconstrueren tomograms behulp van een gewogen back-projectie algoritme in IMOD.
- DeNoise potentiële aandachtsgebieden behulp van een 3D-lineaire anisotrope diffusie rand versterken programma geïmplementeerd in IMOD met de juiste parameters om het contrast en de helderheid te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om het dynamische gedrag van de virusdeeltjes karakteriseren, werden HeLa-cellen geïnfecteerd met HIV-1 afgebeeld door high-speed confocale microscopie levende cellen en deeltjes bewegingen werden geanalyseerd door geautomatiseerde 3D deeltjes volgen (figuur 1). Om de tijdspanne van enkele minuten die kunnen optreden tussen de verzameling van de laatste afbeelding confocale live cell en duik-invriezen (die lang genoeg is om gecorreleerd HIV-1 deeltjes verliezen kan zijn), een cryo-fluorescentie microscopie fase (figuur 3 te vermijden ) werd ontworpen en gebouwd voor de beeldvorming bevroren gehydrateerd monsters 15, binnen cryoEM cartridges, op licht microscopen. Een koperen blok platform (figuur 3b, zwarte pijl) en koperen ring (figuur 3d, pijlpunt) werd toegevoegd voor gebruik met niet-Polara elektronenmicroscopen. Correlatie tussen de confocale live cell, cryo-fluorescentie licht microscopie, en cryoET werd bereikt met behulp geïndexeerd goud Quantifoil grids en 0.2 & mu ; M fluorescerende latex korrels (figuur 2). Tezamen Figuur 4 toont de haalbaarheid van de algemene procedure voor geavanceerde correlatieve levende cellen microscopie en cryo-electron tomografie fluorescent gelabelde HIV-1 deeltjes interactie samen met HeLa visualiseren.
Figuur 1. Time-lapse confocale voor live-cell imaging van HIV-1 deeltjes in HeLa-cellen. Een enkele groene-tl virusdeeltje (gele pijl) werd bijgehouden in 3D confocale stacks met een 3 min. tijdsinterval tussen frames. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
d/50386/50386fig2.jpg "/>
Figuur 2. Correlatie tussen fluorescentie beelden en cryoEM afbeeldingen. (A & b) Differentieel interferentie contrast (DIC) beelden van HeLa-cellen gekweekt op een Quantifoil gouden EM finder rooster, opgenomen met een 2X (a) en 20X (b) doelstellingen. (C) Cryo -fluorescentie beeld van bevroren gehydrateerd HeLa-cellen (rode kleur voor mitochondria) en 0,2 micrometer fluorescerende latex bolletjes (groen), opgenomen met een cryo-podium en een 40X lange werkafstand objectief lucht, bedekt met een DIC beeld van cellen. (d ) cryoEM afbeelding Lage vergroting van het overeenkomstige gebied in (c). (e & f) Correlatie tussen fluorescentie en cryoEM beelden met behulp van 0,2 micrometer fluorescerende latex bolletjes. Overeenkomstige kralen zijn omcirkeld met dezelfde kleur. Schaalbalken, 200 urn in een, 50 um in b, 25 pm in c, d e, 5 micrometer in f.
Figuur 3. Bouw van cryo-lichtmicroscopie podium. (A) Een zelf-druk Dewar, gevuld met vloeibare stikstof, gebruikt om de koper cryo-sample fase (witte pijl) afkoelen. (B) Top, binnenkant van de cryo-monstertafel , waarin de binnenste kamer (witte pijlpunt). Het monster rooster geplaatst op het model EM cartridge, die zit in het midden van een koperen blok (zwarte pijl). Eenmaal geladen met het monster rooster, wordt het patroon overgebracht naar de binnenste kamer (witte pijlpunt) voor cryo-fluorescentie lichtmicroscopie. (C & d) Het monster cartridge voor (c) en na (d) het plaatsen van een koperen ring (zwarte pijlpunt ) om het rooster op zijn plaats te houden voor gebruik met niet-Polara cryo-electron microscope.
Figuur 4. CryoET van een enkel fluorescerend deeltje naar de cellulaire uitstulping van een HeLa cel gebonden door correlatieve microscopie. (A & b) Een DIC beeld dat met een cryo-lichtmicroscopie fase (a) wordt bedekt met een cryo-fluorescentie beeld van GFP-gelabelde deeltjes (rood) (b) (c - e). lage dosis cryoEM beelden van het gebied dat een fluorescerend deeltje (omcirkeld in panel b en c) en 140X (c), 3500 X (d) en 27,500 X (e), respectievelijk . Bijvoegsel, een vergroot aanzicht geconstateerd na overname van de tomografische tilt series (f - h). Drie 4 nm dikke tomografische plakken op een afstand van 21 nm in de z-richting. Verbindingen tussen het deeltje en HeLa celmembraan zijn Aanwijsed door pijlen zowel de projectie afbeelding (inzet in panel e) en tomografische plakken (panelen f & g) in. Schaalbalken, 10 micrometer in a & b, 20 urn in c, 500 nm in d, en 100 nm in e - h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben een eenvoudige set protocollen gepresenteerd aan een geavanceerde correlatieve benadering te analyseren dynamische cellulaire gebeurtenissen met behulp van time-lapse confocale, levende cellen fluorescentie beeldvorming gevolgd door cryoET bieden. De methodologische ontwikkeling 3D levende cellen beeldvorming met hoge resolutie cryoET correleren is cruciaal voor vele uitdagende biologische problemen, zoals zeldzame visualiseren, dynamische (niet statisch, zoals eerder vermeld), en diffractie beperkte virale deeltjes en hun interacties met gastheercellen onderzoeken . De ruimtelijke en temporele gedrag van bepaalde deeltjes in levende cellen wordt gekenmerkt door levende cellen analyse en de structurele details van het virus-cel interacties op de gedefinieerde infectie stadia worden verkend. Een zelfgemaakte, cryo-lichtmicroscopie fase wordt gebruikt om directe correlatie tussen fluorescentie licht beelden van levende cellen en beelden die door cryoEM vergemakkelijken.
Er zijn een aantal belangrijke punten in gedachten te houden inOm een optimale gegevensverzameling en-analyse hebben. Ten eerste, bij het afhalen meerdere posities voor time-lapse confocale live cell imaging, moet de geselecteerde posities binnen 0,5 mm van het centrum van de EM rooster, omdat de rand van het rooster interfereert met het gezichtsveld voor tilt-series verwerving cryoET. Voorts moet de voor analyse cellen tussen twee fasen mitose, wanneer ze het meest uitgespreide en plat. Daarom is de dunne delen van cellen, beschikbaar voor cryoET analyse, zijn op hun meest uitgebreide fase. Om de meerderheid van gekweekte cellen in hetzelfde interfase stadium kan celcyclus worden gesynchroniseerd met dubbele thymidine behandeling die blokkeert celcyclus in de vroege S-fase 18. Cellen bevrijd van thymidine blok dan de voortgang synchroon door G2-en mitotische fase.
Ten tweede, zoals eerder vermeld, de tijd tussen het laatste frame van confocale beeld en cryo-fixatie van het monster moet worden geminimaliseerdtoelaten efficiënte directe correlatie van dynamische objecten. Bovendien, de vlakheid en de integriteit van het net zijn cruciaal voor alle procedures en moeten gedurende de gehele protocol, met name wanneer bare roosters worden behandeld voor niet-Polara microscopen.
Tenslotte is nauwkeurige en betrouwbare correlatie tussen de de elektronen microscopie afbeelding, om het doel te vinden, fluorescentiebeeld en die nodig zijn voor een succesvolle latere aankoop van cryoET gegevens. Beeld een uitsteeksel bij een lage vergroting, het herkennen van de vorm en richting van een geselecteerde cel en soms tellen gaten in het rooster zijn noodzakelijk om de gecorreleerde regio het EM veld vinden. Fluorescerende latex korrels worden toegevoegd aan het monster voor een meer robuuste en nauwkeurige correlatie. Met behulp van fluorescerende latex kralen of Quantum dots, die zowel fluorescerend en elektron-dichte, kunnen de coördinaten van het doel in fluorescentie afbeelding direct worden overgedragen aan EM voor een precieze lokalisatie. Het Should gewezen dat de emissiegolflengte van fluorescerende latex kralen of Quantum dots wordt gekozen geen overlap hebben met de emissiegolflengte van het doel.
Onze huidige correlatie opgezet ter bepaling van een doelgebied plaatsvindt buiten een cryo-elektronenmicroscoop, wat betekent dat een extra monster transferstap van een optische microscoop van een elektronenmicroscoop. Een meer directe en eenvoudige methode is uitgedacht 19, door het installeren van een fluorescent imaging apparaat in de elektronenmicroscoop. Bovendien, de door een lange werkafstand doelstelling lucht met NA van 0,6 resolutie beperkt (~ 0,6 pm). Precies en accuraat nanoschaal enkel molecuul lokalisatie in 3D cellulaire tomograms zal nog meer te betrekken super resolutie microscopie om fluorescerende gelabelde eiwitten correleren in de ultrastructuur.
Verdere vooruitgang in correlatieve lichtmicroscopie en cryoET worden verwacht door het combineren van extra techniques, zoals cryo-focused ion beam (FIB) frezen 9,20 en het glasvocht snijden 8 van bevroren gehydrateerd exemplaren. Deze technieken overwinnen van de beperkingen van de dikte t, sterk uitbreiden van het aantal monsters vatbaar voor cryoET analyse, waardoor onderzoek van virale deeltjes die diep in de cellen gereisd. Wat de studie van virusdeeltje interacties met gastheercel factoren, verdere dubbele etikettering van specifieke cellulaire eiwitten en HIV-1 kernen met een tetra-Cysteine fluorescentieprobe gefuseerd aan HIV-1 CA kan de bepaling van specifieke vroege stadia van de vergemakkelijking HIV-1 levenscyclus en de ruimtelijke en functionele relatie van gastheer factoren en virale deeltjes. We anticiperen op de correlatieve 3D live cell imaging en cryoET methodologie om belangrijke rollen in studie cell signaling, membraanreceptor mensenhandel, en vele andere dynamische cellulaire processen in de celbiologie spelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Travis Wheeler en de werkplaats aan de afdeling Celbiologie en Fysiologie, Universiteit van Pittsburgh bedanken voor de bouw van de cryo-fluorescentie monstertafel, Changlu Tao en Cheng Xu aan de Universiteit van Wetenschap en Technologie van China voor technische bijstand, en Dr Teresa Brosenitsch voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (GM082251 & GM085043).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. | |
References
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W.
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).
- McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).
- Arhel, N., et al. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes. Nature Methods. 3, 817-824 (2006).
- Gousset, K., et al. Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages. PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).
- Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
- Koch, P., et al. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology. 6, 84 (2009).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr. Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).
- Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).
- Sartori, A., et al. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).
- Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells. Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).
- Jun, S., et al. Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography. Structure. 19, 1573-1581 (2011).
- Dubochet, J., et al.
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).
- Agronskaia, A. V., et al. Integrated fluorescence and transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).
- Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4, 215-217 (2007).
