Summary
Nós descrevemos um método de microscopia correlativa que combina alta velocidade de microscopia de luz fluorescente de células vivas 3D de alta resolução tomografia crio-eletrônico. Nós demonstrar a capacidade do método dinâmico de imagem por correlativo, as pequenas partículas de HIV-1 que interagem com células HeLa hospedeiras.
Abstract
Tomografia crio-eletrônico (cryoET) permite a visualização em 3D de estruturas celulares com resolução molecular em um estado próximo do fisiológico 1. No entanto, a visualização directa de complexos virais individuais no seu ambiente celular do hospedeiro com cryoET é um desafio 2, devido à natureza pouco frequentes e dinâmica de entrada viral, especialmente no caso do VIH-1. Enquanto lapso de tempo de imagem de células vivas produziu uma grande quantidade de informações sobre muitos aspectos do ciclo de HIV-janeiro 03-07 de vida, a resolução oferecida por microscopia de células vivas é limitado (~ 200 nm). Nosso trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um método de correlação que permite a visualização direta dos eventos iniciais da infecção pelo HIV-1 pela combinação de microscopia de luz fluorescente de células vivas, crio-microscopia fluorescente e cryoET. Deste modo, os sinais vivo de células e crio-fluorescente pode ser utilizada para orientar a amostragem de precisão cryoET. Além disso, a informação estrutural obtida a partir de cryoET pode be complementado com os dados funcionais dinâmicos adquirida através de imagens ao vivo de células de alvo marcado fluorescente.
Neste artigo de vídeo, nós fornecemos métodos detalhados e protocolos para investigação estrutural do HIV-1 e interações célula hospedeira usando imagens ao vivo de células em 3D correlativo de alta velocidade e análise estrutural cryoET de alta resolução. As células HeLa infectadas com o HIV-1 partículas foram caracterizadas pela primeira vez por microscopia confocal em células vivas, e a região contendo a mesma partícula viral foi então analisado por tomografia crio-electrónica para detalhes estruturais 3D. A correlação entre dois conjuntos de dados de imagem, de imagem óptica e eletrônica de imagem, foi realizada através de microscopia de luz fase crio-fluorescência construídos em casa. A abordagem aqui pormenorizadas serão úteis não só para o estudo das interacções das células do vírus-hospedeiro, mas também para várias aplicações em biologia celular, tais como sinalização, o tráfico de receptor de membrana da célula, e em muitos outros processos celulares dinâmicas. </ P>
Introduction
Tomografia crio-eletrônico (cryoET) é uma técnica de imagem poderosa que permite a visualização tridimensional (3D) de células e tecidos e fornece insights sobre a organização de organelas nativas e estruturas celulares com resolução molecular em um de perto o estado fisiológico 1. No entanto, a natureza inerentemente não corado de baixo contraste amostra congelada-hidratado, combinada com a sua sensibilidade à radiação, torna difícil localizar áreas de interesse dentro de uma célula e, subsequentemente, realizar a série de inclinação com êxito, sem danificar a zona alvo. A fim de superar estes problemas, uma abordagem que combina correlativo microscopia óptica e electrónica é necessária. Especificidades destacadas por meio de rotulagem fluorescente são identificados e localizado por microscopia de fluorescência de luz, e, em seguida, as suas coordenadas são transferidos para o microscópio electrónico de aquisição de dados estruturais de alta resolução em 3D. Este método correlativo ajuda para localizar o alvo de umreas de interesse a serem abordados. Devido à limitação da espessura da amostra com cryoEM (<300 nm), actualmente apenas as regiões periféricas da célula são adequadas para análise estrutural por CryoET 3D. Reduzindo ainda mais a espessura das amostras congeladas hidratadas por vítreo secção 8 ou crio-concentrado feixe de íons (FIB) moagem 9 iria expandir a capacidade de imagem correlativa.
Anteriormente, os métodos correlatos foram utilizados principalmente para facilitar a aquisição de dados cryoET para grandes e estática das estruturas 10-13. Nestes estudos, crio etapas foram implementadas para aceitar grades cryoEM e caber em cada um microscópio vertical ou um microscópio invertido 10,11,14. Embora a mudança grades parece bastante simples em seus projetos, há adicional de transferência etapas envolvidas para a grade de EM, aumentando a chance de que a grade pode ser deformada, danificada e contaminada. Recentemente, demonstrou um avanço técnico emmicroscopia correlativa que nos permite visualizar diretamente os eventos dinâmicos que são, por natureza, difícil de capturar, como o HIV-1 e as interações da célula hospedeira em estágios iniciais da infecção 15. Conseguimos isso através da concepção e implementação de um estágio da amostra crio-microscopia de luz que adapta um sistema de cartucho para minimizar os danos espécime devido ao manuseio da rede, facilitando assim a correlação. Nosso projeto inclui um suporte integrado cartucho espécime, permitindo que tanto crio-microscopia de luz e crio-eletrônico a ser realizado, em seqüência, no mesmo suporte da amostra, sem transferência de amostras, agilizando assim o processo correlato. Além disso, também implementado um procedimento de correlação exacta e fiável utilizando esferas de látex fluorescentes como marcadores fiduciais.
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Protocol
1. Cultura de células HeLa em revestido de carbono, EM Localizador Grids ouro
- Descarga luminescente do lado de carbono de um R2 de 200 mesh / 2 Quantifoil ouro EM localizador grade com menos de 25 mA para 25 seg.
- Brasão da grade EM com fibronectina, flutuando-lo, do lado do carbono para baixo, em uma gota de 40 mL de 50 mg / ml solução fibronectina, em seguida, desinfectá-lo sob a luz UV por 2 horas em uma capa de cultura de tecidos.
- As células HeLa placa na grade a uma densidade de 2 x 4 10 células / ml (total de 2 ml de cultura) em uma placa de cultura de vidro de fundo e crescer as células a 37 ° C, com 5% de CO2, em DMEM suplementado com 4,5 g / L de L-glutamina e glicose, 10% de soro inactivado pelo calor fetal de vitelo, 100 unidades / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina, por aproximadamente 18 horas. As células HeLa são infectadas após S / N cultura.
2. HIV-1 e infecção de células imagens ao vivo
- Adicionar um rastreador celular fluorescente (CMTPX Red, 1 ml / 2 ml) para a cultura com fundo de vidroprato (a partir do passo 1.3) e incubar o prato a 37 ° C durante 10 minutos, para permitir a absorção dos do corante fluorescente.
- Lavar as células com PBS e adicionar 50 ul de meio fresco pré-aquecido.
- Coloque o prato sobre a câmara da célula viva, a 37 ° C, de um campo varrido microscópio confocal scanner. Selecione vários campos (10-15 posições) que contêm 1-3 células / quadrados, com as células entre duas fases de mitose quando eles estão mais espalhada e plana (ver Figuras 2C e 2D), pois requer cryoEM regiões relativamente finas do amostra. Guarde estas posições para a imagem futura (passo 2.5).
- Infectar as células com VSV-G pseudo tipados HIV-1 que contêm partículas de GFP-Vpr (usamos 40 uL de uma amostra contendo 40 ng / ml de p24). Quando a adição das partículas de vírus na parte inferior do prato, ter o cuidado de não perturbar a grade EM, uma vez que as posições para a imagiologia já foram seleccionados e armazenados.
- Imediatamente após a adição de viriões, recolher time-lapse de alta velocidade imagens confocal 3D, nas posições previamente selecionadas (a partir do passo 2.3) para 20-40 min.
- Imagens confocal foram adquiridos usando MetaMorph e analisados pelo rastreamento de partículas 3D automatizado para a dinâmica de partículas individuais, utilizando software Imaris (veja a Figura 1). Uma vez que estamos relacionando o comportamento dinâmico de difração limitada HIV-1 com partículas ultra celular, time-lapse de imagens ao vivo de células e de rastreamento de partículas 3D são fundamentais para os resultados. No entanto, para uma estrutura grande e estática, uma imagem de fluorescência simples (sem células viva) seria suficiente para a análise correlativos.
3. Frozen-hidratado EM Preparação de Amostras
Para minimizar o atraso de tempo entre a colheita da última imagem confocal e crio-fixação da amostra, a FEI Vitrobot (ou outro dispositivo de vitrificação) deve ser iniciado e preparado para imersão de congelamento durante a recolha de imagens ao vivo de células de fluorescência confocal.
- Ligue o dispositivo de vitrificação e definir a sua temperatura ambiente até 22 ° C, a humidade alvo de 100%, o tempo de blotting para 7 seg, e o tempo de espera e tempo para drenar um seg.
- Coloque a caixa de armazenamento da rede no êmbolo Dewar e preparar etano líquido frio. Monte o Dewar para o dispositivo vitrificação.
- Imediatamente após imagens de células ao vivo confocal (seção 2), coloque o prato de cultura em um bloco de cobre resfriado e transferi-lo para a sala de preparação de amostras cryoEM. Coloque a grade de EM para a pinça especializados e rapidamente apagar afastado todos os meios de comunicação sobre a grade. O mata-borrão é feito manualmente, com papel de filtro, após o que 4 ul de solução de 15 nm de ouro grânulo misturado com microesferas fluorescentes de 0,2 um é imediatamente colocada na grelha. As contas de ouro são utilizados como marcadores fiduciais para auxiliar a recolha de dados tomográficos e alinhamento. As microesferas fluorescentes são usadas para ajudar correlação entre as imagens fluorescentes e cryoEM (Veja Figuras 2c-2F).
- Coloque as pinças para o dispositivo de vitrificação e instruir o dispositivo para apagar e mergulhar congelamento em etano líquido 16. Os parâmetros optimizados blotting para alcançar o melhor resultado são: tempo blot, 7 seg; blot deslocamento, 0; tempo de drenagem, 1 s, a temperatura de 22 ° C, e humidade de 100%.
- Transferir a grade congelado-hidratado a um detentor cryoEM para imagiologia cryoET imediata, ou para um armazenamento de azoto líquido para posterior utilização do dewar.
4. Cryo-fluorescência Microscopia de Luz
Um sistema de home-built, câmara de amostra crio-fluorescência e fase (Figura 3) é necessária para levar a cabo os passos 4,1-4,10. As especificações detalhadas e descrição da fase pode ser encontrada em junho et al. 15.
- Encha um líquido auto-pressurizado nitrogênio Dewar com nitrogênio líquido, pelo menos 2 horas antes de começar a microscopia de luz crio-fluorescência (ver Figura 3A).
- Montar uma homebuilt crio-ffase de amostra luorescence 15 (Figura 3) num microscópio de fluorescência invertida de luz, tal como uma Olympus IX 71.
- Ligação a entrada de azoto líquido da fase de crio-amostra ao Dewar auto-pressurizado e colocar a tomada de protecção de sobrecarga de azoto líquido para um recipiente adequado. Conecte uma linha de gás nitrogênio seco a uma luva colocada sobre a lente objetiva manter a lente quente e livre de geada.
- Depositar uma plataforma de bloco de cobre (seta preta na Figura 3b) para a câmara de-fase de crio para o carregamento da grelha amostra congelada-hidratado. Esfriar e encha a câmara de estágio crio cobre com nitrogênio líquido através da linha de entrada da auto-pressurizado Dewar enchimento.
- Quando o estágio crio atinge a temperatura de nitrogênio líquido (em ~ 4-6 min), a transferência de caixa de armazenamento da rede (a partir do passo 3.5) para o estágio crio.
- Coloque a grade de amostra congelada hidratado no cartucho espécime EM sobre o bloco de cobre e clipe da glivrar no local usando um anel C (se estiver usando um cartucho de microscópio Polara), ou colocar um anel de cobre pré-arrefecido na parte superior (seta preta na figura 3d), para manter a grade no lugar e também para facilitar a recuperação da rede após imagem crio-fluorescência (se, por um não-Polara microscópio crio-eletrônico).
- Coloque o cartucho (a partir do passo 4.6) na câmara interior do crio-fase (seta branca na Figura 3b).
- Procurar e encontrar as mesmas partículas virais a partir dos dados de imagem em células vivas. Desde a grade EM tem um índice, é fácil de localizar a mesma partícula no grid em ambas as imagens de células ao vivo e imagens de crio-florescence.
- Adquirir crio-DIC e imagens GFP nas posições identificadas de acordo com crio-condição, utilizando um microscópio de luz com um longo trabalho (2,7-4 mm) lente objetiva. Durante a imagem crio-fluorescência, verificar periodicamente o nível de nitrogênio líquido no estágio crio e recarregá-lo, se necessário, para manter a fase de amostra abaixo -170° C.
- Após a conclusão da imagiologia crio-fluorescência, cuidadosamente devolver o cartucho de amostra até a plataforma de bloco de cobre e armazenar o cartucho num vaso Dewar de azoto líquido para análise futura cryoET com um sistema Polara. Se estiver usando um não-Polara microscópio crio-eletrônico, retire o anel de cobre, recuperar a malha amostral, coloque-o em uma caixa de armazenamento de rede, e armazenar a amostra em nitrogênio líquido Dewar até que a amostra é analisada por cryoET.
- Para a análise de dados, se sobrepõem os crio-DIC e GFP imagens obtidas a partir do passo (4.9, ver figura 4b) e correlacionar as posições dos sinais de GFP na imagem crio-fluorescência com aqueles obtidos na série de imagens ao vivo de células.
5. Cryo-elétron Tomografia
- Coloque o cartucho de amostra para a estação de um microscópio eletrônico equipado com uma arma de emissão de campo, como Polara G2 microscópio crio-transferência.
- Em modo de baixa-dose-pesquisa com uma ampliação de 140X, identify e salvar as quadrículas associadas (a partir do passo 4.11) em um arquivo de palco.
- Sob o modo de baixa dose busca em uma ampliação de 3.500 X, insira um 100 mM objetivo abertura, busca e salvar todos os cargos correlacionados com sinais GFP em um segundo arquivo de palco.
- Sob o modo de baixa dose de exposição, encontrar uma área em branco para ajustar a intensidade do feixe a uma dose de 1 ou 2 e - / a 2 e refinar o eixo de inclinação, usando a função y palco, pela queima de longe o gelo em uma região de carbono sem importância com várias contas de ouro.
- No modo de baixa dose de focagem, ajuste a distância focal para ~ 3 mM e ajustar o ângulo de alinhamento da direcção do foco a ser paralelo ao eixo de inclinação.
- Sob o modo de baixa dose-pesquisa, lembre-se posições salvas (a partir do passo 5.3), ajuste a altura eucentric amostra e verificar a faixa de inclinação para a área de interesse. Adquirir uma imagem de projeção com muito baixa dose de elétrons (~ 1 e - / a 2) entre 8 e 10 um desfocagem, em exposiçõesmodo ure, para confirmar as partículas do vírus correlatos para tomografia crio-eletrônico.
- Mude para o modo de baixa dose-foco. No menu de funções de auto TEM, preceder a altura eucentric automatizada e concentrar funções na área do foco.
- Configurar os parâmetros para a aquisição de uma série de inclinação. Para Figura 4 neste artigo, ângulos de inclinação variando ± 70 °, abaixo e acima de 45 °, a 3 ° e 2 ° de inclinação incrementos, respectivamente, foram utilizados, com 6 um desfocar e aproximadamente 70 e - / uma dose de 2 total.
- Repita os passos 5.7 e 5.8 para todos os cargos salvos. Batch tomografia software pode ser utilizado para a recolha automática de dados em múltiplas posições para aumentar o rendimento.
6. Reconstrução tridimensional usando IMOD 17
- Inspecione a série tilt-prima para ajustar os valores mínimos e máximos de densidade e determinar se há qualquer ponto de vista a ser excluído devido à mudança de imagem grande.
- Comece eTomo e painel tomogram configuração usando o tipo de eixo, tamanho do pixel, diâmetro fiducial, etc. Em seguida, crie pt scripts.
- Configurar o intervalo principal de tal forma que várias fases do cálculo tomogram pode ser ajustado / seguido simultaneamente. Modificar os parâmetros necessários e executar os programas específicos que são exigidos por cada etapa de processamento (Veja eTomo tutorial, http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
- Na fase final, criar uma pilha alinhada completo (com uma média de erro residual inferior a 0,6) e reconstruir tomografias utilizando um algoritmo de projecção de trás ponderada em IMOD.
- DeNoise áreas potenciais de interesse utilizando um programa de reforço da borda de difusão anisotrópica não linear implementado em 3D IMOD com parâmetros apropriados para aumentar o contraste e clareza.
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Representative Results
Para caracterizar o comportamento dinâmico das partículas de vírus, as células HeLa infectadas com o HIV-1 foram visualizados por meio de microscopia confocal de células vivo de alta velocidade e os movimentos das partículas foram analisadas por rastreamento automatizado de partículas 3D (Figura 1). Para evitar que o lapso de tempo de vários minutos, que pode ocorrer entre a colheita da última imagem ao vivo de células confocal e de imersão de congelação (o que pode ser suficiente para perder correlacionados partículas de HIV-1), uma fase de luz de crio-microscopia de fluorescência (Figura 3 ) foi projetado e construído por imagens amostras congeladas hidratadas 15, dentro de cartuchos cryoEM, em microscopia de luz. A plataforma bloco de cobre (Figura 3-B, seta preta) e anel de cobre (Figura 3d, seta) foi adicionado para uso com não-Polara microscópios eletrônicos. Correlação entre a célula ao vivo, crio-microscopia de luz de fluorescência confocal, e cryoET foi conseguido usando indexados ouro grades Quantifoil e 0,2 e mu ; M fluorescentes pérolas de látex (Figura 2). Tomados em conjunto, Figura 4 demonstra a viabilidade do procedimento geral de microscopia de células vivas correlativo avançada e tomografia crio-eletrônico para visualizar fluorescente etiquetado HIV-1 partículas que interagem com uma célula HeLa host.
Figura 1. Time-lapse de imagens de células ao vivo confocal de partículas de HIV-1 em células HeLa. Uma única partícula viral verde-fluorescente (seta amarela) foi rastreado em 3D pilhas confocal com um intervalo de tempo de 3 min entre frames. Clique aqui para ver a figura maior .
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Figura 2. Correlação entre as imagens de fluorescência e as imagens cryoEM. (A & b), imagens de contraste de interferência diferencial (DIC), de células HeLa cultivadas sobre um Quantifoil ouro EM localizador de grade, gravado com um 2X (a) 20x e (b). Objectivos (c) Crio image-fluorescência das células HeLa frozen-hidratado (cor vermelha para as mitocôndrias) e 0,2 m esferas de látex fluorescentes (verde), gravadas com uma fase crio e uma longa distância de trabalho objetiva ar 40X, coberta com uma imagem DIC de células. (d ) imagem cryoEM ampliação baixa da região correspondente no (c). (E e F) Correlação entre imagens de fluorescência e cryoEM usando esferas de látex de 0,2 um fluorescentes. Contas correspondentes são circulou com a mesma cor. Barras de escala, a 200 m de um, a 50 m de b, 25 m de c, d e, a 5 m de f.
Figura 3. Construção de palco crio-microscopia de luz. (A) A Dewar auto-pressurizado, cheio de nitrogênio líquido, usado para resfriar o palco crio-amostra de cobre (seta branca). (B) superior, dentro de vista do palco crio-amostra , que mostra a câmara interior (seta branca). A grade de amostra é colocada sobre o cartucho de espécime do EM, que fica no centro de um bloco de cobre (seta preta). Depois de carregado com a grade de amostra, o cartucho é transferido para a câmara interior (seta branca) para a crio-luz por microscopia de fluorescência. (C & d) O cartucho de amostra antes (c) e depois (d) a colocação de um anel de cobre (ponta de seta preta ) para manter a grade no lugar para usar com os não-Polara crio-eletrônico microscope.
Figura 4. CryoET de uma única partícula fluorescente ligado à saliência celular de uma célula HeLa por microscopia correlativos. (A & b) Uma imagem DIC gravado com uma fase de microscopia de luz de crio-(a), sobreposto com uma imagem de crio-fluorescência de partículas GFP (vermelho) (b) (c - E). imagens cryoEM dose baixa da região contendo uma partícula fluorescente (circulado no painel b & c) a 140X (c), 3500 X (d) e 27500 X (e), respectivamente . Inserir, uma vista ampliada registada após a aquisição da série de inclinação tomográfico (f - h). Três 4 nm de espessura tomográficos fatias separadas por uma distância de 21 nm, em direcção z. As ligações entre as partículas e membrana de células HeLa são indied por setas tanto a imagem de projeção (inserida no painel e) e cortes tomográficos (painéis f & g) em. Barras de escala, 10 m de a & b, 20 m de c, d em 500 nm e 100 nm de e - h.
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Discussion
Nós apresentamos um conjunto simples de protocolos para fornecer uma abordagem correlativa avançada para analisar eventos celulares dinâmicos usando time-lapse imagens de fluorescência confocal, em células vivas seguido por cryoET. Nosso desenvolvimento metodológico para correlacionar a imagem ao vivo de células em 3D com alta resolução cryoET é fundamental para investigar muitos problemas biológicos desafiadoras, tais como a visualização, dinâmico (não estático, como relatado anteriormente), e difração limitada partículas virais raras e suas interações com células hospedeiras . O comportamento espacial e temporal das partículas específicas em células vivas é caracterizada pela análise de células vivas e os detalhes estruturais de interações célula-vírus nas fases de infecção definidos são exploradas. A, palco caseiro crio-microscopia de luz é usada para facilitar a correlação direta entre imagens de luz de fluorescência de células vivas e imagens captadas por cryoEM.
Há vários pontos importantes para se manter em mentePara que a coleta de dados ideal e análise. Em primeiro lugar, quando se escolhe para múltiplas posições de lapso de tempo de imagem de células vivas confocal, as posições seleccionadas devem ser de 0,5 mm a partir do centro da rede de EM, uma vez que o bordo da grelha interfere com o campo de visão para aquisição em série, em inclinação cryoET. Além disso, as células seleccionadas para análise deve estar entre duas fases de mitose, quando eles são mais espalhada e plana. Por conseguinte, as regiões finas de células disponíveis para a análise cryoET, estão na sua fase mais prolongada. A fim de ter a maioria das células cultivadas na mesma fase de interfase, o ciclo celular pode ser sincronizado com o tratamento duplo do ciclo celular que timidina blocos no início da fase S 18. Células liberados bloco timidina em seguida, avançar de forma síncrona por fase G2 e mitose.
Em segundo lugar, tal como mencionado anteriormente, o atraso de tempo entre o último quadro de imagem confocal e crio-fixação da amostra deve ser minimizada parapermitir eficiente correlação direta de objetos dinâmicos. Além disso, o nivelamento e a integridade da grelha são críticos para todos os procedimentos e deve ser mantida ao longo do protocolo, particularmente quando grades nus são tratadas para microscópios não Polara.
Finalmente, é necessária correlação precisa e confiável entre o a imagem de microscopia eletrônica, para encontrar o alvo, imagem e fluorescência para o sucesso posterior aquisição de dados cryoET. Em uma projecção de imagem, a uma ampliação baixa, o reconhecimento da forma e direcção de uma célula seleccionada e, por vezes, da contagem dos orifícios da grelha são necessárias para localizar a região correlacionado no campo EM. Esferas de látex fluorescentes são adicionados à amostra para uma correlação mais precisa e robusta. Usando esferas de látex fluorescentes ou pontos quânticos, que são tanto fluorescente e elétron-densos, as coordenadas do alvo imagem de fluorescência in pode ser transferido diretamente para EM para uma localização precisa. É should-se notar que o comprimento de onda de emissão de esferas de látex fluorescentes ou de pontos quânticos é escolhido para não ter sobreposição com o comprimento de onda de emissão do alvo.
Nosso atual correlação criada para identificar uma área-alvo ocorre fora de um microscópio crio-eletrônico, envolvendo, portanto, um passo adicional de transferência das amostras de um microscópio óptico de um microscópio eletrônico. Um método mais direto e simples foi pensado 19, através da instalação de um aparelho de imagem fluorescente dentro do microscópio eletrônico. Além disso, a resolução proporcionada por uma longa distância ar objectivo trabalhar com NA de 0,6 é limitada (~ 0,6 mm). Preciso e exato em nanoescala única molécula de localização em celulares tomografias 3D vai envolver mais de microscopia de super resolução para correlacionar proteínas marcadas fluorescentes na ultra-estrutura.
Outros avanços em microscopia de luz e correlativo cryoET são esperadas pela combinação de t adicionaisechniques, como crio-feixe de íons focalizado (FIB) moagem 9,20 e vítreo secção 8 das amostras congeladas hidratadas. Estas técnicas de ultrapassar as limitações da espessura da amostra, expandindo a gama de amostras para análise passíveis cryoET, permitindo, assim, a investigação de partículas virais que tenham viajado profundamente dentro das células. Em termos do estudo de interacções entre partículas de vírus com factores de células hospedeiras, ainda mais a dupla marcação de proteínas celulares específicas e os núcleos de HIV-1 com uma sonda fluorescente de tetra-cisteína fundida com o HIV-1 CA poderia facilitar a identificação de determinadas fases iniciais da ciclo de vida e a relação espacial e funcional dos factores do hospedeiro e as partículas virais de HIV-1. Prevemos a imagem 3D correlativo ao vivo de células e metodologia cryoET a desempenhar papéis importantes na sinalização de estudo de células, tráfico de receptor de membrana, e muitos outros processos celulares dinâmicos em biologia celular.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Travis Wheeler ea loja de máquina do Departamento de Biologia Celular e Fisiologia da Universidade de Pittsburgh para a construção do palco amostra crio-fluorescência, Changlu e Tao Cheng Xu, da Universidade de Ciência e Tecnologia da China para técnico assistência, e Dr. Teresa Brosenitsch para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (GM082251 & GM085043).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. | |
References
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W.
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).
- McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).
- Arhel, N., et al. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes. Nature Methods. 3, 817-824 (2006).
- Gousset, K., et al. Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages. PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).
- Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
- Koch, P., et al. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology. 6, 84 (2009).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr. Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).
- Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).
- Sartori, A., et al. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).
- Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells. Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).
- Jun, S., et al. Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography. Structure. 19, 1573-1581 (2011).
- Dubochet, J., et al.
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).
- Agronskaia, A. V., et al. Integrated fluorescence and transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).
- Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4, 215-217 (2007).
