Мы описываем корреляционный метод микроскопии, что сочетает в себе высокую скорость 3D живых клеток свете флуоресцентной микроскопии высокого разрешения и крио-электронной томографии. Показана возможность корреляционного метода динамического изображения, небольшие ВИЧ-1 частиц, взаимодействующих с клетками-хозяевами HeLa.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Корреляционно микроскопии для 3D Структурный анализ динамических взаимодействий
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Крио-электронной томографии (cryoET) позволяет 3D-визуализации клеточных структур на молекулярном разрешение в близких к физиологическим состоянием 1. Тем не менее, прямой визуализации отдельных вирусных комплексов в их среде клетки-хозяина с cryoET 2 является сложной задачей, в связи с нечастыми и динамичный характер проникновении вируса в клетку, особенно в случае ВИЧ-1. В то время как покадровой живых клеток изображений дало большое количество информации о многих аспектах жизненного цикла ВИЧ-1, 3-7, разрешение предоставляемой живых клеток микроскопии ограничена (~ 200 нм). Наша работа была направлена на разработку корреляционный метод, который позволяет прямой визуализации ранние события инфекции ВИЧ-1 путем объединения живых клеток флуоресцентной микроскопии свет, крио-флуоресцентной микроскопии и cryoET. Таким образом, живых клеток и крио-флуоресцентные сигналы могут быть использованы для точного направления выборки в cryoET. Кроме того, структурная информация, полученная из cryoET можно бэлектронной дополнена динамической функциональной данных, полученных через живые клеток изображений флуоресцентных помечены цели.
В этом видео статье мы подробно методы и протоколы для структурных исследований ВИЧ-1 и клетки-хозяина взаимодействий с использованием 3D корреляционного высокоскоростной живых клеток изображений с высоким разрешением cryoET структурного анализа. HeLa клетки, инфицированные ВИЧ-1 Частицы характеризуют первую помощью конфокальной живых клеток микроскопии и область, содержащую те же вирусные частицы затем анализировали на крио-электронной томографии для 3D структурные детали. Корреляции между двумя наборами данных изображений, оптических изображений и электронных изображений, была достигнута с помощью самодельного крио-флуоресценции световой микроскопии этапе. Подход здесь подробно будет ценен не только для изучения вирус-хозяин взаимодействий клетки, но и для более широкого применения в клеточной биологии, таких как сотовые сигнализации, торговлей мембранным рецептором, и много других динамических клеточных процессов. </ P>
Введение
Крио-электронной томографии (cryoET) является мощным методом визуализации, которая позволяет трехмерные (3D) визуализации клеток и тканей и дает представление о родной организации органеллы и клеточные структуры на молекулярном разрешение в близких к физиологическим состоянием 1. Тем не менее, по существу низкий контраст неокрашенных замороженных гидратированный образец, в сочетании с их чувствительность к облучению, делает его трудно обнаружить области, представляющие интерес внутри клетки, а затем выполнения наклона серии успешно без повреждения целевой области. Для того чтобы преодолеть эти проблемы, корреляционный подход, который сочетает в себе светов....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Культура клеток HeLa на покрытые углеродом, золото EM Finder сети
- Тлеющего разряда углерода стороне 200 меш R2 / 2 Quantifoil золото EM искатель сетки при 25 мА в течение 25 сек.
- Пальто с сеткой EM фибронектин, путем размещения его, углерода стороной вниз, на 40 мкл капли 50 мкг / мл раствора фибронектина, то вылечить под УФ-светом в течение 2 часов в капюшоне культуры ткани.
- Пластина HeLa клетки на сетку при плотности 2 × 10 4 клеток / мл (всего 2 мл культуры) в стеклянным дном чашки для культивирования и роста клеток при 37 ° С с 5% СО 2, в DMEM дополнена 4,5 г / л L-глутамина и глюкоза, 10% инактивированной н....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы охарактеризовать динамическое поведение вирусные частицы, HeLa, клетки, инфицированные ВИЧ-1, были обследованы на высокоскоростных конфокальной живых клеток микроскопии и движения частиц были проанализированы автоматизированных 3D отслеживания частицы (Рис. 1). Чтобы избежать времени до нескольких минут, которые могут возникнуть между сбором последнего конфокальной живых клеток изображения и погружной замораживания (который может быть достаточно длинным, чтобы проиграть коррелирует ВИЧ-1 частиц), .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы представили простой набор протоколов для обеспечения передовых корреляционный подход для анализа динамических событий с помощью сотовой покадровой конфокальной, живых клеток флуоресценции последующим cryoET. Наши методологических разработок соотнести 3D Live-ячейки изображения с высоким разрешением cryoET имеет решающее значение для расследования многих сложных биологических проблем, таких как визуализация редко, динамический (не статичны, как сообщалось ранее), а дифракционной вирусных частиц и их взаимодействия с к.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют никакого конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Трэвис Уилер и механической мастерской на кафедре клеточной биологии и физиологии Университета Питтсбурга для строительства крио-флуоресценции образца этапе Changlu Тао и Чэн Сюй в Университете науки и технологии Китая за техническую помощи, и д-р Тереза Brosenitsch за критическое прочтение рукописи. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья (GM082251 & GM085043).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| DMEM 4,5 г/л Глюкоза с L-глутамином | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | Клеточная культура HeLa на электромагнитных сетках |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A золотые конъюгаты | Ted Pella, Inc., Реддинг, Калифорния | 15822-1 | 15 нм диаметр |
| 0,2 мкм; m флуоресцентные микросферы | Invitrogen Corporation, Карлсбад, CA | F8811 | Желто-зеленая флуоресцентная |
| термоинактивированная сыворотка телята крупного рогатого скота | Invitrogen Corporation, Карлсбад, CA | 10082-139 | |
| Пенициллин-стрептомицин | Invitrogen Corporation, Карлсбад, CA | 15140-122 | |
| Чашка для культуры со стеклянным дном | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Искатель золота quantifoil EM решетки | Quantifoil Micro Tools, Jena, Германия | R2/2 Au NH2 200 меш | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Тлеющий разряд прибор 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 электронный микроскоп с полевой эмиссионной пушкой | FEI, Хиллсборо, Орегон | 300 кэВ | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Хиллсборо, Орегон | ||
| Olympus IX 71 микроскоп | Olympus America Inc., Сентер Вэлли, Пенсильвания | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (рабочее расстояние 2.7-4 мм) объектив | |
| Микроскоп Nikon TiE Nikon | Instruments, Мелвилл, Нью-Йорк | с использованием масляного иммерсионного объектива 60X/1.35 NA | |
| Конфокальный микроскоп со стреловидным полем Конфокальный микроскоп со стреловидным полем | Prairie Technologies, Миддлтон, Висконсин | ||
| Токай Хит камера с живыми клетками | Токио, Япония | ||
| Криофлуоресцентная сцена | для образцов Домашняя | сборка Домашняя сборка в механическом цехе, см. ссылку 15 для проектирования. |
Ссылки
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. Visualizing cells at the nanoscale. Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in h....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
