Summary
Vi beskriver en modsvarende mikroskopi metode, der kombinerer high-speed 3D live-cell lysstofrør mikroskopi og høj opløsning cryo-elektron tomografi. Vi demonstrerer evne til korrelativ metode imaging dynamisk, små HIV-1 partikler vekselvirker med værts HeLa-celler.
Abstract
Cryo-elektron tomografi (cryoET) giver mulighed for 3D-visualisering af cellulære strukturer på molekylært opløsning i et tæt-på-fysiologiske tilstand 1. Imidlertid er direkte visualisering af individuelle virale komplekser i deres vært cellulære miljø med cryoET udfordrende 2, på grund af den sjældne og dynamiske karakter af viral indgang, især i tilfælde af HIV-1. Mens time-lapse live-cell imaging har givet en hel del oplysninger om mange aspekter af livscyklus af HIV-1 3-7 opløsningen ydes af live-cell mikroskopi er begrænset (~ 200 nm). Vores arbejde var rettet mod at udvikle en korrelation metode, der tillader direkte visualisering af tidlige begivenheder i HIV-1 infektion ved at kombinere live-cell fluorescerende lysmikroskopi, cryo-fluorescerende mikroskopi og cryoET. På denne måde, kan levende celle og cryo-fluorescerende signaler anvendes til præcist at styre prøvetagning i cryoET. Desuden strukturel information opnået fra cryoET kan be suppleret med de dynamiske funktionelle data opnået gennem live-cell imaging af fluorescerende mærkede mål.
I denne video artiklen, giver vi detaljerede metoder og protokoller for strukturel undersøgelse af HIV-1 og host-celle interaktioner ved hjælp af 3D-correlative high-speed live-cell imaging og høj opløsning cryoET strukturel analyse. HeLa-celler inficeret med HIV-1-partikler blev karakteriseret først ved konfokal live-cell mikroskopi, og regionen indeholdende det samme virale partikel blev derefter analyseret ved cryo-elektron tomografi til 3D strukturelle detaljer. Sammenhængen mellem to sæt af billeddata, optisk billeddannelse og elektronmikroskopi billeddannelse, blev opnået ved hjælp af en hjemme-bygget cryo-fluorescens lysmikroskopi scenen. Den fremgangsmåde beskrevet her, vil være værdifuld, ikke kun for undersøgelse af virus-vært-celle interaktioner, men også for bredere anvendelser inden for cellebiologi, såsom celle signalering, membran-receptor handel, og mange andre dynamiske cellulære processer. </ P>
Introduction
Cryo-elektron tomografi (cryoET) er en kraftfuld imaging teknik, der giver tre-dimensionelle (3D) visualisering af celler og væv og giver indsigt i tilrettelæggelsen af indfødte organeller og cellulære strukturer på molekylært opløsning i et tæt-på fysiologiske tilstand 1. Men den iboende lav kontrast af ufarvet frosne hydreret prøve, kombineret med deres stråling følsomhed, gør det vanskeligt at lokalisere områder af interesse inde i en celle og derefter udføre tilt serien succes uden at beskadige målområdet. For at overvinde disse problemer, en modsvarende tilgang, der kombinerer lys og elektronmikroskopi er nødvendig. Særlige forhold fremhæves af fluorescerende mærkning identificeres og lokaliseres ved fluorescens lysmikroskopi, og så deres koordinater overføres til elektronmikroskop for erhvervelse af høj opløsning 3D strukturelle data. Denne korrelativ metode hjælper lokalisere målet enreas af interesse at blive behandlet. På grund af den begrænsning prøvetykkelse med cryoEM (<300 nm), som i øjeblikket kun de perifere områder af cellen er egnet til 3D strukturel analyse af CryoET. Yderligere at reducere tykkelsen af frosset-hydratiserede prøver ved glasagtige sektionering 8 eller ved kryo-fokuseret ionstråle (FIB) fræsning 9 ville udvide evnen til korrelationstabet billeddannelse.
Tidligere blev korrelationsmaalinger metoder primært brugt til at lette cryoET dataopsamling til store og statiske konstruktioner 10-13. I disse undersøgelser har cryo faser er gennemført for at acceptere cryoEM net og passe på enten en opretstående mikroskop eller et inverteret mikroskop 10,11,14. Selvom skifte net forekommer temmelig ligetil i deres designs, der er yderligere overførsel trin involveret i EM nettet, øger chancen for, at nettet kan blive deformeret, beskadiget og forurenet. Vi har for nylig demonstreret et teknisk fremskridt ikorrelativ mikroskopi, der giver os mulighed for direkte at visualisere dynamiske begivenheder, som af natur svært at fange, såsom HIV-1 og vært celle interaktioner på tidlige stadier af infektionen 15.. Vi udført dette ved at designe og gennemføre en cryo-lysmikroskopi prøve fase, tilpasser en patron system til at minimere modellen skader som følge af grid håndtering, hvilket letter korrelation. Vores design omfatter en integreret eksemplar patron holder, så både cryo-lys og cryo-elektronmikroskopi, der skal udføres, sekventielt på samme prøveholder uden prøve overførsel, og dermed effektivisere korrelativ proces. Derudover har vi implementeret en præcis og pålidelig korrelation procedure ved hjælp fluorescerende latexperler som Referencemærkernes markører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. HeLa Cell Culture på Carbon-belagt, guld EM Finder Grids
- Glimudladning carbon-siden af en 200-mesh R2 / 2 Quantifoil guld EM finderen gitter under 25 mA for 25 sek.
- Coat EM nettet med fibronectin, ved at flyde det carbon-side ned på en 40 ul dråbe af 50 ug / ml fibronektin løsning, så desinficere det under UV-lys i 2 timer i en vævskultur hætte.
- Plate HeLa-celler på elnettet med en tæthed på 2 x 10 4 celler / ml (i alt 2 ml kultur) i et glas-bund dyrkningsskål og dyrker cellerne ved 37 ° C med 5% CO 2, i DMEM suppleret med 4,5 g / L L-glutamin og glucose, 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum, 100 enheder / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin, til cirka 18 timer. HeLa-celler er smittet efter at O / N kultur.
2.. HIV-1 infektion og live-cell imaging
- Tilføj en fluorescerende celle tracker (Red CMTPX, 1 gl / 2 ml) i glasbund kulturskålen (fra trin 1.3) og inkuber skålen ved 37 ° C i 10 min, for at tillade op-tage af fluorescerende farvestof.
- Vask cellerne med PBS, og der tilsættes 50 pi forvarmet frisk medium.
- Sæt fadet på live-cell kammer ved 37 ° C, i et slagvolumen Field Confocal scanner mikroskop. Vælg flere felter (10-15 positioner), som indeholder 1-3 celler / kvadrat, med celler mellem to mitosen faser, når de er mest spread out og flad (se figur 2c og 2d), da cryoEM kræver relativt tynde områder af prøve. Opbevar disse holdninger til fremtidig imaging (trin 2.5).
- Inficere cellerne med VSV-G pseudo-maskinskrevne HIV-1-partikler, der indeholder GFP-Vpr (vi bruger 40 pi af en prøve indeholdende 40 ng / ml p24). Ved tilsætning af viruspartikler i bunden af skålen, være omhyggelig med at ikke forstyrre EM nettet, da positionerne for billeddannelse allerede er blevet udvalgt og opbevaret.
- Umiddelbart efter tilsætning af virioner, indsamle time-bortfalder high-speed 3D konfokal billeder, på de tidligere valgte positioner (fra trin 2.3) for 20-40 min.
- Konfokal billeder blev erhvervet ved hjælp MetaMorph og analyseret ved automatiseret 3D partikel sporing for enlige partikeldynamik hjælp Imaris software (Se figur 1). Da vi korrelere dynamiske opførsel diffraktionsbegrænset HIV-1 partikler med cellulære ultrastruktur, time-lapse live-cell imaging og 3D-partikel sporing er afgørende for resultaterne. Men for en stor og statisk struktur, ville en simpel fluorescensbillede (uden live-cell) være tilstrækkelig til korrelative analyse.
3.. Frosne hydreret EM Prøveforberedelse
For at minimere den tid, forsinkelsen mellem indsamlingen af sidste konfokal billede og cryo-fiksering af prøven bør FEI Vitrobot (eller anden forglasning enhed) iværksættes og forberedt til dyk-frysning under indsamling af fluorescens konfokal live-cell billeder.
- Tænd forglasning, og indstil dens klima temperatur til 22 ° C, målet luftfugtighed på 100%, blotting tid til 7 sek, og ventetiden og dræne tid til 1 sek.
- Placer gitter opbevaringsboks i stemplet Dewar og forberede kold væske ethan. Monter Dewar på forglasning enheden.
- Umiddelbart efter konfokal live-cell imaging (afsnit 2), placer dyrkningsskålen på en isafkølet kobber blok og overføre den til cryoEM prøveforberedelse værelse. Indlæse EM tavlen de specialiserede pincet og hurtigt skamplet væk ethvert medie på nettet. Den blotting sker manuelt, med filtrerpapir, hvorefter 4 pi 15 nm guld perle løsning blandet med 0,2 um fluorescerende mikrosfærer straks placeres på risten. Guldet perler bruges som referencemærker markører til at hjælpe tomografisk dataindsamling og tilpasning. Den fluorescerende mikrosfærer bruges til at støtte sammenhængen mellem lysstofrør og cryoEM billeder (se figur 2c-2f).
- Indlæse pincet på forglasning enheden og instruere enheden til Dup og kaste fryse i flydende ethan 16. De blotting parametre optimeret til at opnå det bedste resultat, er: blot tid, 7 sek blot offset, 0, drain tid, 1 sek temperatur, 22 ° C, og luftfugtigheden, 100%.
- Overfør frosne hydreret nettet til en cryoEM holder til øjeblikkelig cryoET billeddannelse, eller til en flydende nitrogen opbevaring Dewar til senere brug.
4.. Cryo-fluorescens lysmikroskopi
Et hjem-bygget, cryo-fluorescens proevekammerets trins system (figur 3) er forpligtet til at udføre trin 4,1-4,10. De detaljerede specifikationer og beskrivelse af scenen kan findes i juni et al. 15..
- Fyld en selvstændig tryksat flydende nitrogen Dewar med flydende nitrogen i mindst 2 timer før cryo-fluorescens lysmikroskopi (se figur 3a).
- Monter en hjemmebygget cryo-fluorescence prøve trin 15 (figur 3) på en inverteret fluorescens lysmikroskop, såsom et Olympus IX 71.
- Forbind flydende nitrogen indløb af cryo-prøven etape til den selv-tryksatte Dewar og placere flydende nitrogen overløbsbeskyttelse stikkontakt til en passende beholder. Tilslut en tør nitrogengas linje til en muffe placeres over objektivlinsen at holde linsen varm og frostfrit.
- Placer en kobber blok platform (sorte pil i figur 3b) i cryo-scenen kammer til ilægning af frosne hydrerede prøve nettet. Køl ned og fylde kobber kammer cryo-scenen med flydende nitrogen gennem indløbet linje fra den selv-tryk påfyldning Dewar.
- Når cryo-scenen når flydende nitrogen temperatur (i ~ 4-6 min), overføre gitter opbevaringsboks (fra trin 3.5) til cryo-scenen.
- Placer den frosne-hydrerede prøve gitter i EM prøven patron på kobber blok og klip gslippe på plads ved hjælp af en C-ring (hvis du bruger en Polara mikroskop patron), eller placere en forhånds-afkølet kobber ring på toppen (black pilespids i figur 3d), for at holde gitteret på plads, og også for nem hentning af nettet efter cryo-fluorescensimagografi (hvis der for et ikke-Polara cryo-elektron mikroskop).
- Placer patronen (fra trin 4.6) i det indre kammer i cryo-scenen (hvid pilespids i figur 3b).
- Søg og finde de samme viruspartikler fra live-cell imaging data. Eftersom EM gitteret har et indeks, er det ligetil at lokalisere den samme partikel på nettet i både levende celle billeder og cryo-fluorescens billeder.
- Anskaf cryo-DIC og GFP billeder på de identificerede positioner som led cryo-tilstand ved hjælp af et lysmikroskop med en lang arbejdsdag (2,7-4 mm) objektiv. Under den cryo-fluorescens billeddannelse, regelmæssigt kontrollere den flydende kvælstof niveau i cryo-scenen og påfylde det, efter behov, for at holde prøven scenen under -170° C.
- Ved afslutningen af cryo-fluorescens billeddannelse, vende forsigtigt prøven patronen til kobber blok platform og gemme patronen i en flydende nitrogen Dewar til fremtidig cryoET analyse med Polara system. Hvis du bruger en ikke-Polara cryo-elektron mikroskop, fjerne kobber ring, hente prøven gitteret, skal det placeres i et gitter opbevaringskasse, og opbevar modellen i et flydende nitrogen Dewar indtil prøven undersøges af cryoET.
- Til dataanalyse, de erhvervede cryo-DIC og GFP billeder overlapper (fra trin 4.9, se figur 4b), og korrelere positionerne af GFP signaler i cryo-fluorescens billede med dem, der opnås i live-cell imaging-serien.
5.. Cryo-elektron tomografi
- Indlæse prøven patronen ind i cryo-transfer station af en elektron mikroskop udstyret med en feltemission pistol, såsom Polara G2 mikroskop.
- Under lavdosis-search tilstand ved en forstørrelse på 140X, identify og gemme de tilhørende netkvadrater (fra trin 4.11) i en scene-fil.
- Under lavdosis-search tilstand ved en forstørrelse på 3.500 X, skal du indsætte en 100 um objektiv blænde, søge og gemme alle de holdninger korreleret med GFP-signaler ind i en anden fase fil.
- Under lavdosis-eksponering, find et tomt område for at justere strålen intensitet til en dosis på 1 eller 2 e - / A 2 og forfine tilt aksen, ved hjælp af scenen y-funktionen, ved at brænde væk isen i en ligegyldig carbon region med flere guld perler.
- Under lavdosis-fokusindstilling, justere fokus afstand til ~ 3 m og justere vinklen for at justere retningen af fokus være parallel med tilt-aksen.
- Under lavdosis-search-mode, gemte positioner huske (fra trin 5.3), juster prøven eucentric højde og kontrollere tilt område for område af interesse. Anskaf en projektion billede med meget lave elektron-dosis (~ 1 e - / A 2) ved 8 til 10 um ude af fokus, i udstillingerure mode at bekræfte korrelerede viruspartikler for cryo-elektron tomografi.
- Skift til lavdosis-fokusering. I TEM auto-funktioner i menuen forud for automatiserede eucentric højde og fokusere funktioner på fokusområde.
- Opsætning af parametre for at erhverve en tilt-serie. For figur 4 i dette papir, der spænder hældningsvinkler ± 70 °, under og over 45 °, ved 3 ° og 2 ° tilt intervaller henholdsvis blev brugt, med en 6 um Defocus og cirka 70 e - / A 2 total dosis.
- Gentag trin 5.7 og 5.8 for alle de gemte positioner. Batch tomografi software kan bruges til automatisk dataindsamling på flere positioner for at øge gennemløbet.
6.. Tre-dimensionel Genopbygning hjælp israelske forsvarsminister 17
- Efterse rå tilt-serien til at justere minimum og maksimum tæthed værdier, og afgøre, om der er nogen at være udelukket på grund af stort billede skift.
- Start eTomo og opsætning tomogram panelet ved hjælp akse type pixelstørrelse, fiducial diameter osv. Derefter oprette com scripts.
- Konfigurer hovedvinduet sådan, at flere faser af tomogram beregning kan justeres / følges samtidigt. Rediger de nødvendige parametre og udføre de specifikke programmer, der kræves af hver enkelt procestrin (Se eTomo tutorial, http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
- På den afsluttende fase, oprette et komplet linie stak (med en gennemsnitlig residualfejl mindre end 0,6) og genopbygge tomogrammer hjælp af en vægtet back-projektion algoritme i israelske forsvarsminister.
- Denoise potentielle områder af interesse ved hjælp af en 3D-lineær anisotropisk diffusion kant styrke program implementeret i israelske forsvarsminister med passende parametre for at forbedre kontrast og klarhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At karakterisere den dynamiske opførsel af viruspartikler blev HeLa-celler inficeret med HIV-1 afbildet af high-speed konfokal live-cell mikroskopi og partikel bevægelser blev analyseret ved automatiseret 3D partikel sporing (Figur 1). For at undgå tidsforløb på flere minutter, der kan opstå mellem indsamling af den sidste konfokal live-cell billede og styrte-frysning (som kan være lang nok til at tabe korreleret HIV-1-partikler), en cryo-fluorescens lysmikroskopi fase (Figur 3 ) blev konstrueret og fremstillet til billeddannelse frosne hydreret prøver 15, inden cryoEM patroner på lys mikroskoper. En kobber blok platform (figur 3b, sort pil) og kobber ring (figur 3d, pilespids) blev tilsat til brug med ikke-Polara elektronmikroskoper. Korrelation mellem konfokal live-cell, cryo-fluorescens lysmikroskopi og cryoET blev opnået ved hjælp indekseret guld Quantifoil net og 0,2 & mu , M fluorescerende latexperler (figur 2). Tilsammen Figur 4 viser gennemførligheden af den samlede procedure for avanceret korrelative live-cell mikroskopi og cryo-elektron tomografi at visualisere fluorescensmærkede HIV-1-partikler interagerer med en vært HeLa celle.
Figur 1. Time-lapse konfokal live-cell imaging af HIV-1 partikler i HeLa-celler. En enkelt grøn-fluorescerende viral partikel (gul pilespids) blev sporet i 3D konfokal stakke med en 3 min tidsintervallet mellem frames. Klik her for at se større figur .
d/50386/50386fig2.jpg "/>
Figur 2. Korrelation mellem fluorescens billeder og cryoEM billeder. (A & b) Differential interferens kontrast (DIC) billeder af HeLa-celler dyrket på en Quantifoil guld EM finderen nettet, optaget med et 2X (a) og 20x (b) målsætninger. (C) Cryo -fluorescens billede af frosne hydreret HeLa-celler (rød farve for mitokondrier), og 0,2 um fluorescerende latexperler (grøn), som er optaget med en cryo-scene og en 40X lang arbejdsafstand luft mål overlejret med en DIC billede af celler. (d ) Lavt forstørrelse cryoEM billede af den tilsvarende region i (c). (e & f) Sammenhæng mellem fluorescens og cryoEM billeder ved hjælp af 0,2 um fluorescerende latexperler. Tilsvarende perler cirkel med samme farve. Skalapanelerne, 200 um i et, 50 um i b, 25 um i c, d e, 5 um i f..
Figur 3. Konstruktion af cryo-lysmikroskopi fase. (A) En selvstændig tryksat Dewar, fyldt med flydende nitrogen, der anvendes til at nedkøle kobber cryo-prøve etape (hvid pil). (B) Øverste set indefra af cryo-prøven fase , der viser det indre kammer (hvid pilespids). Prøven gitter placeres på EM modellen patron, som sidder i midten af en kobber blok (sort pil). Når indlæst med prøven gitteret Patronen er overført til det indre kammer (hvid pilespids) til cryo-fluorescens lysmikroskopi. (C & d) Prøven patron før (c) og efter (d) anbringe en kobberring (sort pilespids ) for at holde nettet i stedet for at bruge med ikke-Polara cryo-elektron microscope.
Figur 4.. CryoET af en enkelt fluorescerende partikel bundet til den cellulære fremspring af en HeLa celle ved korrelative mikroskopi. (A & b) En DIC billede optaget med et cryo-lysmikroskopi trin (a) belagt med en cryo-fluorescens billede af GFP-mærkede partikler (rød) (b) (c - e). Lav dosis cryoEM billeder i regionen, der indeholder en fluorescerende partikel (cirkel i panel b & c) ved 140X (c), 3.500 X (d), og 27.500 X (e), henholdsvis . Inset, en forstørret afbildning konstateret efter erhvervelse af tomografiske tilt serien (f - h). Tre 4 nm tykke tomografiske skiver adskilt af en afstand på 21 nm i z-retningen. Forbindelser mellem partikel og HeLa cellemembran er indicated med pile i begge fremskrivningen billedet (indsat i panel e), og tomografiske skiver (paneler f & g). Skalapanelerne, 10 um i et & b, 20 um i C, 500 nm i D, og 100 nm i e - h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har fremlagt en enkel sæt af protokoller til at levere en avanceret korrelativ tilgang til at analysere dynamiske cellulære begivenheder ved hjælp af time-lapse konfokal, live-cell fluorescensimagografi efterfulgt af cryoET. Vores metodeudvikling at korrelere 3D live-cell imaging med høj opløsning cryoET er kritisk at undersøge mange udfordrende biologiske problemer, såsom visualisering sjældne, dynamiske (ikke statisk, som tidligere rapporteret) og diffraktion begrænsede virale partikler og deres vekselvirkninger med værtsceller . Den rumlige og tidslige opførsel af specifikke partikler i levende celler er karakteriseret ved live-cell analyse og de strukturelle detaljer i virus-celle interaktioner de definerede infektion etaper udforskes. En hjemmelavet, cryo-lysmikroskopi fase bruges til at lette den direkte sammenhæng mellem fluorescenslys billeder fra levende celler og billeder taget af cryoEM.
Der er flere vigtige punkter at huske på iFor at have optimal dataindsamling og-analyse. Først, når plukke flere positioner for time-lapse konfokal live-cell imaging bør de udvalgte positioner være inden for 0,5 mm fra midten af EM nettet, da kanten af nettet forstyrrer synsfeltet for tilt-series opkøb i cryoET. Endvidere bør cellerne udvalgt til analyse være mellem to mitosen faser, når de er mest spread ud og fladt. Derfor, de tynde områder af celler, til rådighed for cryoET analyse, er på deres mest udvidede fase. For at få størstedelen af dyrkede celler på samme interfase stadium kan cellecyklus synkroniseres med dobbelt thymidin behandling, der blokerer cellecyklus på den tidlige S-fase 18. Celler frigivet fra thymidin blok derefter videre synkront gennem G2-og mitotiske fase.
For det andet, som tidligere nævnt, bør tidsrummet mellem den sidste ramme i konfokal billede og cryo-fiksering af prøven blive minimeret tilmuliggøre en effektiv direkte korrelation af dynamiske objekter. Desuden er fladhed og integritet af nettet kritisk for alle procedurer og skal opretholdes i hele protokollen, især når nøgne net håndteres for ikke-Polara mikroskoper.
Endelig er præcis og pålidelig sammenhæng mellem fluorescensbillede og elektronmikroskopi billede, for at finde målet, der kræves for en vellykket efterfølgende erhvervelse af cryoET data. I en fremskrivning billede, ved en lav forstørrelse anerkendelsen af form og retning af en markeret celle og sommetider regner huller på gitteret er nødvendige for at lokalisere korrelerede region i EM felt. Fluorescerende latexperler sættes til prøven til en mere robust og nøjagtig korrelation. Brug fluorescerende latexperler eller Quantum prikker, som er både fluorescerende og elektron-tæt, kan koordinaterne for målet i fluorescensbillede overføres direkte til EM for en præcis lokalisering. Det skulle popped bemærkes, at emissionsbølgelængden af fluorescerende latexperler eller quantum dots er valgt ikke at have overlapning med emissionsbølgelængden af målet.
Vores nuværende korrelation sat op til at identificere et målområde finder sted uden for en cryo-elektron mikroskop, hvilket indebærer en ekstra prøve transfer skridtet fra et optisk mikroskop til et elektronmikroskop. En mere direkte og enkel metode er blevet udtænkt 19, ved at installere en fluorescerende imagografiapparat i elektronmikroskop. Desuden er den opløsning gives ved en lang arbejdsdag afstand luft mål med NA 0,6 begrænset (~ 0,6 um). Præcis og nøjagtig nanoskala enkelt molekyle lokalisering i 3D cellulære tomogrammer vil yderligere indebære super opløsning mikroskopi at korrelere fluorescerende mærkede proteiner i ultrastrukturen.
Yderligere fremskridt i korrelativ lysmikroskopi og cryoET forventes ved at kombinere yderligere techniques såsom cryo-fokuserede ion beam (FIB) fræsning 9,20 og glaslegemet sektionering 8 frosne hydreret prøver. Disse teknikker overvinde begrænsningerne ved prøven tykkelse, i høj grad udvide udvalget af prøver medgørlige til cryoET analyse, således at undersøgelse af virale partikler, der har rejst dybt inde i cellerne. Med hensyn til undersøgelsen af virus partikel vekselvirkninger med værtscellens faktorer, yderligere dobbelt mærkning af specifik cellulær protein og HIV-1 kerner med en tetra-cystein fluorescensprobemolekyle fusioneret til HIV-1 CA kunne fremme identifikation af særlige tidlige faser af HIV-1 livscyklus og den rumlige og funktionelle forhold af værtfaktorer og virale partikler. Vi forventer, at correlative 3D live-cell imaging og cryoET metode til at spille vigtige roller i studie cellesignalering, membran receptor handel, og mange andre dynamiske cellulære processer i cellebiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Travis Wheeler og maskinværksted på Institut for Cellebiologi og Fysiologi, University of Pittsburgh for opførelsen af cryo-fluorescens prøve scenen, Changlu Tao og Cheng Xu ved University of Science and Technology i Kina til teknisk assistance, og Dr. Teresa Brosenitsch for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (GM082251 & GM085043).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. | |
References
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W.
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).
- McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).
- Arhel, N., et al. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes. Nature Methods. 3, 817-824 (2006).
- Gousset, K., et al. Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages. PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).
- Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
- Koch, P., et al. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology. 6, 84 (2009).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr. Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).
- Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).
- Sartori, A., et al. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).
- Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells. Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).
- Jun, S., et al. Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography. Structure. 19, 1573-1581 (2011).
- Dubochet, J., et al.
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).
- Agronskaia, A. V., et al. Integrated fluorescence and transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).
- Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4, 215-217 (2007).
