Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren subsets van precursor B-cellen uit navelstrengbloed. Een voldoende hoeveelheid en kwaliteit van nucleïnezuren kunnen worden geëxtraheerd uit de cellen en gebruikt in daaropvolgende testen gebruik DNA of RNA.
Abstract
Navelstrengbloed is zeer verrijkt voor hematopoietische stamcellen in verschillende afkomst inzet fasen. We hebben een protocol ontwikkeld voor het isoleren precursor B-cellen in vier verschillende stadia van differentiatie. Omdat genen worden uitgedrukt en epigenetische veranderingen optreden in een weefsel-specifieke wijze, is het belangrijk om onderscheid te maken tussen weefsels en celtypen om te kunnen veranderingen in het genoom en de epigenoom die kunnen leiden tot de ontwikkeling van een ziekte. Deze methode kan worden aangepast aan elke type cel in navelstrengbloed in elk stadium van differentiatie.
Deze werkwijze omvat vier hoofdstappen. Eerst worden mononucleaire cellen gescheiden door dichtheidscentrifugatie. Ten tweede worden B-cellen verrijkt met biotine geconjugeerde antilichamen die herkennen en niet B-cellen uit de mononucleaire cellen. Derde van de B-cellen fluorescerend gemerkt met celoppervlakeiwit antilichamen specifiek voor verschillende fasenvan B-celontwikkeling. Tenslotte worden de fluorescent gelabelde cellen gesorteerd en afzonderlijke populaties worden teruggewonnen. De teruggewonnen cellen van voldoende kwantiteit en kwaliteit worden gebruikt in downstream nucleïnezuur assays.
Introduction
Ter identificatie van afwijkingen die aanwezig zijn in ziekte, is van groot belang dat we gezonde weefsels of cellen die overeenkomen met het weefsel of celtype beïnvloed door de ziekte gebruiken. Een reden hiervoor is dat epigenetische variatie onder weefseltypen is verantwoordelijk voor het reguleren van genexpressie en is essentieel voor celdifferentiatie tijdens normale menselijke ontwikkeling 1,2. Een tweede reden is dat afwijkende weefselspecifieke genregulatie kan ernstige gevolgen hebben op de normale ontwikkeling en is bekend bij te dragen aan een veelheid van ziekten waaronder kanker. Derhalve een beter begrip van een ziekte die hematopoietische cellen omvat vereist kennis van gezonde hematopoietische cellen.
De ontwikkeling van hematopoietische cellen in het beenmerg verloopt via een systematische volgorde van gebeurtenissen gekenmerkt door veranderingen in de expressie van celoppervlaktemerkers 3. Studies waarbij volwassen deelnemers hebbenaangetoond dat beenmerg meestal een laag aantal precursor B-cellen 4,5 bevat en dat onderzoeken met pediatrische deelnemers blijkt dat het percentage precursor B-cellen relatief hoog bij individuen jonger dan 5 jaar 6. Navelstrengbloed wordt gebruikt als een bron van hematopoietische stamcellen in de behandeling van bloed aandoeningen en maligniteiten is beschikbaar via navelstrengbloed banken en verrijkt voor onrijpe B en T cellen 7 die de doelcellen van meerdere aandoeningen zoals leukemie en lymfomen.
Precursor B-cellen in het beenmerg zijn uitgebreid fenotype 8,9 en kan worden gedefinieerd door de aanwezigheid van specifieke celoppervlak markers die kunnen worden gebruikt om deze cellen te sorteren in verschillende subsets. Normale B-celdifferentiatie verloopt via een aantal stadia in het beenmerg beginnen met de eerste pro-B-cellen en afgesloten met onrijpe of naïeve B-cellen. VolgensVan Zelm en collega's 10 worden pro-B-cellen worden gekenmerkt door de aanwezigheid van CD34 en in de overgang naar fase 2 (Pre-BI) CD19 wordt verkregen. Fase 3 (Pre-BII) cellen niet meer uitdrukkelijke CD34 en beginnen te cytoplasmatische IgM uit te drukken. Ten slotte is een belangrijk kenmerk van fase 4 (onrijpe B-cellen) is de uitdrukking van oppervlakte-IgM. De sorteerinrichting strategie beschreven in dit protocol werd eerst beschreven door Caldwell en collega 6 en omvat het gebruik van slechts 3 celoppervlaktemerkers die sterk vermindert de complexiteit en de kosten om celsortering experimenten. In dit werk werd een relatie tussen CD45 en de fasen van B-celdifferentiatie vastgesteld. Zij opgemerkt dat B-cellen in het beenmerg variabele niveaus van expressie van CD45 weer. Specifiek cellen die hoge niveaus van CD45 tot expressie kwam overeen met cellen die oppervlakte IgM uitgedrukt (onrijpe B-cellen), die een gemiddeld niveau van CD45 expressie overeen met cellen die cytopl uitgedruktasmic IgM (pre-BII cellen) en die lage niveaus van CD45 tot expressie overeenkwam met cellen die niet brengen cytoplasmatische IgM (pre-BI cellen). Dit protocol gebruikt de strategie van Caldwell en collega 6 tot subsets van precursor isoleren B-cellen uit navelstrengbloed (figuur 1) die gebruikt kunnen worden in assays die downstream kwaliteit nucleïnezuren zoals de gemethyleerde CpG-eiland recovery assay (MIRA ) 11 en kwantitatieve real time PCR assays. De werkwijze gebruikt een eerste scheiding met magnetische korrels voor alle niet-B cellen uit navelstrengbloed afbreken en vereist kleuring met slechts 3 antilichamen (CD34, CD19 en CD45). De cellen die zijn teruggewonnen vertegenwoordigen 4 stadia van B-cel differentiatie: 1) CD34 +, CD19 + (late pro-B en vroege pre-BI), 2) CD34 -, CD19 +, CD45 laag (late pre-BI); 3) CD34 -, CD19 +, CD45 med (pre-BII) en 4) CD34 -; CD19 +, CD45 high (onrijpe B-cellen).
Protocol
1. Isolatie van mononucleaire cellen uit navelstrengbloed
- Bereid PBS-EDTA 5 ml bovine serum albumine (BSA) stockoplossing aan 95 ml spoelbuffer (1:20 verdunning) buffer-voegen. Degas de buffer en bewaar de buffer op het ijs. BELANGRIJK: Het niet ontgas de buffer kan leiden tot minder dan optimale resultaten bij het isoleren van CD19 + B-cellen, omdat bellen kan de isolatie kolom blokkeren.
- Bereid 50 ml conische buizen voor dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Bepaal het aantal buizen die nodig zijn voor het verwerken van het navelstrengbloed (1 tube kan 8 ml bloed te verwerken) en voeg 15 ml van Ficoll-Paque PLUS aan elke buis.
- Verdun 8 ml van navelstrengbloed met 24 ml DPBS (1X) en voorzichtig het verdunde laag navelstrengbloed mengsel op de Ficoll-Paque PLUS in elk van de 50 ml conische buizen. Niet mengen het bloed en Ficoll-Paque PLUS. BELANGRIJK: Om te voorkomen dat het mengen van het navelstrengbloed en Ficoll-Paque PLUS, houdt u de buis in een hoek van 45 graden enlayer het bloed mengsel langzaam.
- Centrifugeer bij 400 xg gedurende 40 min bij 20 ° C. Mononucleaire cellen (MNC) blijft op de plasma-Ficoll-Paque PLUS-interface dat granulocyten en erytrocyten sediment door hogere dichtheid bij de osmotische druk van Ficoll-Paque PLUS. Label zeven 5 ml rondbodem buizen voor gebruik in deel 3 met het monster ID, datum en de volgende:
| Buis | Label | Doel |
| 1 | Onbevlekt | Ongekleurde cellen voor normalisatie in flowcytometrie |
| 2 | 7AAD | Levensvatbaarheid te bepalen tijdens flowcytometrie |
| 3 | + + + | Bevat de cellen die worden gesorteerd |
| 4 | 34 + | Om CD34 + / CD19 verzamelt +(Late pro-B - vroege pre-BI) cellen |
| 5 | 45 lage | / CD19 + / CD45 laag (pre-BI) cellen - aan CD34 te verzamelen |
| 6 | 45 med | / CD19 + / CD45 med (pre-BII) cellen - aan CD34 te verzamelen |
| 7 | 45 hoog | / CD19 + / CD45 hoog (onrijpe B) cellen - aan CD34 te verzamelen |
Coat buizen 4, 5, 6 en 7 met 2% FBS en plaats alle buizen op ijs.
- Zorgvuldig Zuig de bovenste plasma laag en vermijd contact met de mononucleaire cellaag. Met een 10 ml glazen pipet voorzichtig overdragen mononucleaire cellaag in nieuw 50 ml conische buis. Combineer de mononucleaire cellen uit drie buizen in een 50 ml buis.
- Vul de buis met PBS, en meng bij 300 xg gecentrifugeerd gedurende 10 min bij20 ° C. Zorgvuldig aspireren het supernatans zonder verstoring van de cel pellet. Herhaal 1x. Na de eerste wasbeurt, resuspendeer de pellets en overbrengen naar een 50 ml conische buis.
- Zachtjes resuspenderen de celpellet in 200 ul PBS. Verwijder 1 pi van de celsuspensie toe te voegen aan 1 ml PBS in een 1,5 ml microcentrifugebuis en gereserveerd voor het tellen (tellen cellen nadat het 50 ml celsuspensie in de centrifuge). Vul de buis met PBS en centrifugeer bij 200 xg gedurende 15 min aan bloedplaatjes verwijderen. Volledig verwijderen van de bovenstaande vloeistof zonder de celpellet.
2. Gewijzigd B-cel Isolatie van mononucleaire cellen met behulp van MACS Scheiding
- Resuspendeer de pellet uit stap 1.7 met 160 pi koude (4 ° C) EDTA-PBS buffer.
- Voeg 40 ul B-CLL biotine antilichaam cocktail. Pipetteer goed te mengen en gedurende 10 min incuberen bij 4 ° C.
- Was de cellen - voeg 1 ml koud (4 ° C) EDTA-PBS-buffer per 10 miljoen cellen (cel number bepaald in stap 1.7) en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten. Zuig het volledig supernatant en resuspendeer de celpellet in 320 pi koude (4 ° C) EDTA-PBS buffer.
- Voeg 80 ul anti-biotine microkorrels, goed mengen en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
- Was de cellen - voeg 1 ml koude (4 ° C) EDTA-buffer PBS per 10 miljoen cellen en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten. Resuspenderen tot 100 miljoen cellen in 500 pi koude (4 ° C) EDTA-PBS buffer. Scale buffervolume volgens het aantal cellen.
- Bereid MACS Kolommen en MACS Separators tijdens het centrifugeren (Stap 2.5). Plaats een LS kolom in het magnetische veld van de MACS separator, 3 ml koude (4 ° C) EDTA-PBS buffer op de kolom en laat de buffer te druppelen door de kolom. Gebruik een bakje om de stroom te vangen door. Gooi de doorstroming.
- Een 50 ml conische buis onder de kolom en pipetteer de celsuspensie op de kolom. Laat de niet-gelabelde cellen throug druppelenh de kolom en in de 50 ml conische buis. Belangrijk: Dit zijn de cellen die worden gebruikt voor antilichaam labeling en celsortering. Stel de stroom niet weg door. Om alle cellen van stap 2.5 herstellen, een extra 1 ml koude (4 ° C) EDTA-PBS buffer aan de wanden van de conische buis. Meng voorzichtig pipetteren en de resterende celsuspensie op de kolom. Herhaal 1x. Ga verder met stap 2.8 met de gelabelde cellen verzameld in de conische buis na het passeren door de kolom.
- Vul de conische buis met ongelabelde cellen met PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatans zonder verstoring van de cel pellet. Voeg 200 ul EDTA-buffer PBS en voorzichtig resuspendeer de cellen.
3. Antilichaam Labeling en voorbereiding voor celsortering
- Verstuif 1 pi van de celsuspensie en plaats in de buis met het label "ongekleurd" (Stap 1.4). Voeg 500 ul EDTA-buffer PBS en slaan de buis op ijs.
- Voeg 20pi van elk antilichaam (CD19, CD34 en CD45) per miljoen cellen in de resterende celsuspensie. Meng goed en plaats de buis in het donker gedurende 30 minuten bij RT. CD antilichamen zijn lichtgevoelig, voert u stap 2-4 met de lichten uitgeschakeld.
- Na 30 min incubatie met antilichamen, zuig 40 pi van de celsuspensie en plaats het in de buis met het label "7AAD". Voeg 1 ml PBS in de buis en centrifugeer bij 500 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 ul bindingsbuffer. Voeg 7 pl 7AAD (7-Aminoactinomycin D) en incubeer in het donker gedurende 10 minuten bij RT. Tijdens de 10 minuten incubatie volledig stap 3.4.
- Voeg PBS naar de top van de buis met de overige cellen gelabeld met antistoffen CD. Centrifugeer het buisje bij 500 xg gedurende 3 minuten. Verwijder het supernatant, voeg 500 ul EDTA-buffer PBS en resuspendeer de celpellet. Breng het gehele volume van de celsuspensie in de buis met het label "+ + +". Als u alle van de celsuspensie een herstellendd extra 1 ml EDTA-buffer PBS om de 50 ml conische buis en overbrengen in de buis met het label "+ + +".
- Na incubatie (Stap 3.3), voeg 300 ul bindingsbuffer in 7AAD buis. De "ongekleurde", "7AAD" en "+ + +" samples en "34 +", "45 laag", "med 45" en "45 hoog" buizen klaar voor flowcytometrie.
4. Celsortering Met behulp van de MoFlo XDP Flow Cytometer
- Set-up MoFlo voor het sorteren: Lijn lasers; stabiliseren druppel stroom, het bepalen van daling vertraging.
- Bereid enkele kleur vergoeding controles met behulp van Invitrogen AbC Mouse kraal kit (of iets dergelijks) volgens de instructies van de fabrikant. Run single kleurinstellingen, het aanpassen van de spanningen van fluorescentie-kanalen voor een optimale scheiding van positieve en negatieve populaties. Stel compensatie coëfficiënten en van toepassing gecompenseerd parameter aan collectie protocol. Herstel compensatie coëfficiënten telkens een nieuwe partij antilichaam verkregen.
- Maak protocol waaronder plots zoals getoond in figuur 2.
- Run ongekleurde monster, zet spanning en winst voor voorwaartse en zijwaartse verstrooiing, en identificeren negatieve fluorescentie populaties. Omdat DNA-herstel is het doel van de soort, moet de drempel worden ingesteld laag (≤ 1%), zodat DNA-bevattende puin niet de herstelde monsters verontreinigen. * Zorg ervoor dat de Aerosol Evacuatie System draait te allen tijde die leven van menselijke cellen worden uitgevoerd op de MoFlo.
- Voer een kleine hoeveelheid van de + + + sample (~ 50.000 events) aan de gating strategie (figuur 2). Omdat B-cell progenitors niet scatter identiek aan B-cellen rijpen, backgate de ungated CD19 + / CD34 + populatie op de SSC versus FSC plot te zorgen voor de lymfocytpoort omvat potentiële pro-B-cellen. Van deze steekproef ook de negatieve fluorescentie bevolking voor 7AAD.
- Voer het 7AAD monster naar het levensvatbaarheid te bepalen. Enige soort cellen van een monster met een hoge levensvatbaarheid op deaanvang (≥ 95%) als dode cellen zullen zonder onderscheid vlekken en kan verontreinigen soort populaties.
- Stel soort beslissingen tot vier populaties te verzamelen: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 laag; CD19 + / CD34 - / CD45 med, en CD19 + / CD34 - / CD45 hoog. Neem de lymfocyt en doublet discriminatie poorten in de soort beslissingen van alle bevolkingsgroepen.
- Om klompen te voorkomen in de sorteer-tip, filter + + + monster door een 40 um cel zeef onmiddellijk voor het sorteren en opnieuw filtreer als er een aggregatie optreedt in steekproef tijdens het sorteren.
- Sorteren cellen in verzamelbuizen (Stap 1.4) bekleed met 2% FBS in PBS in een gekoelde of ijs vol buishouder.
- Onmiddellijk na sorteren is voltooid, extraheren DNA.
Representative Results
Tussen monster variatie speelt een rol in het succes van de cel sorteren (tabel 1). De monsters met goede rendementen hebben weinig contaminerende afval (Figuur 3A) en de monsters met slechte succespercentage hoge gehalten aan verontreinigende resten (figuur 3B). Tussen monster variatie kan enigszins worden gecontroleerd als het navelstrengbloed monster werd verzameld binnen 24 uur van verzending (O / N eerste prioriteit).
De stroming gesorteerde cellen van elk precursor B-cel subsets van voldoende kwantiteit en kwaliteit nucleïnezuur isolatie voeren. Het geïsoleerde DNA van hoge kwaliteit en kunnen worden gebruikt in downstream analyses. We gebruiken deze routinematig DNA in MIRA 11 te verrijken voor gemethyleerd DNA (Figuur 4).
| Cord Blood Facility gegevens | Slechte Sorteer | |
| Werken Blood Volume met anticoagulantia (ml) | 110 | 104 |
| White Blood Cells [10 3 / ul] | 8,68 | 11,19 |
| Lymfocyten [10 3 / ul] | 3,88 | 3,76 |
| Lymfocyt (%) | 44,70 | 33,6 |
| Red Blood Cells [10 6 / ul] | 3,65 | 3,05 |
| In-house data | ||
| Aantal cellen na Ficoll-Paque | 206 M | 309 M |
| Aantal cellen na MACS Scheiding | 22 M | 16,5 M |
| Totaal Evenementen Count (MoFlo XDP) | 30,57 M | 19,97 M |
| Levensvatbaarheid (%) | 98,00 | 98,00 |
| Cellen in lymfocytpoort (%) 17,00 | 50,00 | |
| CD19 + / CD34 + | ||
| Totaal aantal cellen | 10959 | 48316 |
| % Van de totale Evenementen | 0,04 | 0,24 |
| Rendement | 88% | 88% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 lage | ||
| Totaal aantal cellen | 16619 | 26941 |
| % Van de totale Evenementen | 0,05 | 0,13 |
| Rendement | 89% | 87% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 med | ||
| Totaal aantal cellen | 469745 | 507540 |
| % Van de totale Evenementen | 1,54 | 2,54 |
| Rendement | 89% | 89% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 hoge | ||
| Totaal aantal cellen | 1896062 | 2047142 |
| % Van de totale Evenementen | 6,2 | 10,25 |
| Rendement | 91% | 90% |
Tabel 1. Vertegenwoordiger cel soort statistieken. Rijen 1-5 zijn tellingen die door het navelstrengbloed faciliteit. De resterende rijen zijn verzameld in ons laboratorium. De arme soort hoge niveaus van puin en een laag percentage cellen in de lymfocytpoort.
FiguAd 1. Stroomschema van procedure. Navelstrengbloed wordt verwerkt en mononucleaire cellen werden geïsoleerd met behulp van Ficoll-Paque plus. Een extra wasstap is opgenomen om verontreinigende bloedplaatjes verwijderen. B-cellen geïsoleerd uit mononucleaire cellen met de MACS humane B-cel isolatiekit (B-CLL). Deze stap maakt gebruik van biotine-geconjugeerde monoklonale antilichamen (CD2, CD4, CD11b, CD36, anti-IgE en CD235a) verwijderen van alle niet-B cellen. De teruggewonnen B-cellen gelabeld met CD19-APC, CD34-PE en CD45-FITC antilichamen vervolgens gesorteerd met de MoFlo XDP flowcytometer om precursor B-cel subsets herstellen: CD19 + / CD34 +, CD19 + / CD34 - / CD45 laag ; CD19 + / CD34 - / CD45 med en CD19 + / CD34 - / CD45 high.
Figuur 2. Gating strategie voor het identificeren en sorteren van popvraagd. Rode pijlen geven de poort die wordt toegepast op alle volgende perceel. R4, R5, R6 en R7 poorten geven gesorteerd populaties. A) Forward vs side scatter plot met verrijkte lymfocyt populatie. R1, lymfocytpoort. B) Lengte vs breedte van voren scatterplot voor het identificeren van individuele cellen versus wambuizen. R2, enkele cel poort. C) CD19-APC positieve cellen vallen in CD34-PE negatieve en positieve populaties. R3, CD19 + / CD34 - poort; R4, CD19 + / CD34 + poort aangeeft gewenste soort populatie d) CD19 + / CD34 - cellen vallen in drie enigszins verschillende CD45-FITC populaties.. R5 en R6, CD19 + / CD34 - / CD45 laag en CD19 + / CD34 - / CD45 med populaties respectievelijk. R7, vanwege de hoge celaantallen in de CD19 + / CD34 - / CD45 hoge populatie, dit soort poort omvat alleeneen deel van de bevolking. Alle cellen van deze populatie niet te worden verzameld voor downstream analyses.
Figuur 3. A) Lage contaminerende puin na kolom verrijking. R1, lymfocytpoort. B) Een hoge mate van besmetting van puin na kolom verrijking.
Figuur 4. Verrijking van gemethyleerd DNA deelverzamelingen van precursor B-cellen. A) gesonificeerd DNA geïsoleerd uit precursor B-cel subsets van hoge kwaliteit. Voor bibliotheekconstructie DNA wordt gesonificeerd tot een gemiddelde van 200-600 bp. Laan 1: 100 bp ladder Promega (catalogus # G2101), Laan 2: Totaal DNA geïsoleerd uit CD19 + / CD34 + cellen; Lane 3: Totale DNA geïsoleerd uit CD19 + - / CD45 laag cellen Lane 4: 100 ng DNA geïsoleerd uit CD19 + / CD34 - / CD45 med cellen Lane 5: 100 ng DNA geïsoleerd uit CD19 + / CD34 - / CD45 hoge cellen. DNA werd gesoniceerd met de Diagenode Bioruptor on High voor een totaal van 9 min (30 sec ON, OFF 30 sec). DNA werd gezuiverd kolom en gevisualiseerd op een 1% agarose gel met SYBR groen nucleïnezuur gel vlek. B) Na MIRA met de ActivMotif MethylCollector Ultra kit, PCR met SLC25A37 (1-6) en APC1 (7-12) wordt uitgevoerd om te bevestigen verrijking van gemethyleerd DNA. 1 en 7: gesonificeerd genomisch DNA (no MIRA) 2 & 8: MIRA-CD19 + / CD34 + DNA, 3 & 9: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 laag DNA; 4 en 10: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 med DNA, 5 & 11: MIRA -CD19 + / CD34 - / CD45 hoge DNA, 6 & 12: Water controle. Hogere versterking van SLC25A37 bevestigt de verrijking van gemethyleerd DNAin de subsets van precursor B-cellen.
Discussion
De factor met de grootste invloed op het succes van het protocol is de aanwezigheid van verontreinigende puin. Als verzoekende bloed van een navelstrengbloed bank is het belangrijk om het bloed zo snel na monstername mogelijk verstuurd. Bovendien moeten, die als lymfocytose bevatten hogere aantallen lymfocyten, maar deze monsters niet voldoende aantallen precursor B-cellen en mag niet worden gebruikt. Om de kans dat een voldoende aantal cellen voor elk van de precursor subsets raden beginnen met ten minste 85 ml van navelstrengbloed verhogen.
Het is belangrijk op te merken dat in tegenstelling tot volwassen perifere bloed scheidingen, wanneer het fractioneren van navelstrengbloed het mononucleaire laag vaak verontreinigd is met rode bloedcellen 12. Dit protocol bevat een extra wasstap aan besmettelijke bloedplaatjes te verwijderen. Protocollen beschrijven mononucleaire scheidingen uit navelstrengbloed wordt voorgesteld om een lysis stap to verwijderen van ongewenste rode bloedcellen. We raden deze stap omdat het produceert vervuilende puin en heeft een negatieve invloed op het succes van de cel soort.
Om het aantal cellen die moeten worden onderscheiden door middel van flowcytometrie moet een B-cel verrijking uit te voeren celsortering. Het protocol door Miltenyi Biotec, dat de B-Cell Isolation Kit (B-CLL) vergezelt, is geoptimaliseerd voor het perifere bloed en adviseert om 10 ul B-CLL biotine antilichaam cocktail per 10 miljoen cellen. Deze stap maakt antistoffen tegen CD2 (T-cellen, NK cellen), CD4 (T-cellen), CD11b (granulocyten, monocyten, macrofagen), CD16 (NK-cellen, macrofagen, mestcellen), CD36 (bloedplaatjes), CD235a (erytroïde cellen) niet-B-cel depletie van het navelstrengbloed. Het is belangrijk beschreven kit en niet B-cel isolatiekit II gebruiken omdat de eerste kit bevat een antilichaam tegen CD43 die aanwezig is op pro-B-cellen. Tijdens onze optimization van dit protocol bleek dat in totaal 40 pl B-CLL biotine antilichaam cocktail voldoende is om een positieve cel soort resultaat. Bovendien vonden we dat het gebruik van slechts 5 ui meer B-CLL biotine antilichaam cocktail nadelige gevolgen voor de cel aard had. Daarom raden we het gebruik 40 ul van B-CLL biotine antilichaam cocktail voor totale mononucleaire cel aantallen tussen 175-250 miljoen. Als beginnend met lagere of hogere aantallen cellen kan het nodig dienovereenkomstig schaal van de reagentia.
Er zijn tal van publicaties waarin de tegenstrijdige markers die kunnen worden gebruikt om onderscheid te subpopulaties van B-cellen. De meeste verschil kan worden verklaard door het feit dat differentiatie een continu proces en dat de aanwezigheid of afwezigheid van celoppervlaktemerkers optreedt in geleidelijke wijze plaats van in een alles of niets wijze. In dit protocol CD34 - / CD19 + en de intensiteit van CD45 + (laag, medium, hoog) expressie werd gebruikt om vooraf BI, pre-BII en onrijpe B-cellen onderscheiden door een verhoging van het niveau van CD45 expressie overeenkomt met de progressie van differentiatie 6. Pro-B-cellen zijn beschreven door sommigen als CD19 + / CD34 + 13 terwijl anderen hebben aangetoond dat pro-B-cellen CD19 - / CD34 + en pre-BI cellen CD19 + / CD34 + 9,10. Op basis van deze verschillen hebben wij aangewezen CD19 + / CD34 + cellen late pro-B cellen / vroege pre-BI cellen. Het is belangrijk op te merken dat deze strategie werd ontwikkeld om subsets van precursor B-cellen die corresponderen met de cellen aangetast door de ziekte acute lymfatische leukemie isoleren. Er zijn echter meerdere sorteren strategieën die kunnen worden gebruikt afhankelijk van de cel subtype plaats.
Antilichaam-fluorochroom combinaties moeten worden gekozen op basis van de mogelijkheden van de beschikbare celsorteerder. Als general regel de helderste fluorochroom in het paneel moet worden gebruikt om de minst bevolkte antigeen en vice versa labelen. Bij het opsporen van dubbele-gekleurde bevolking, vooral bij zeldzame gebeurtenissen zoals deze, doublet discriminatie (figuur 2B) is een uiterst belangrijk onderdeel van de gating strategie. Dit zorgt ervoor dat dubbel positieve gebeurtenissen eengemaakte cellen gekleurd met beide antilichamen en niet slechts twee single-gekleurde cellen gehecht aan elkaar.
Hoge snelheid, 4-weg celsortering creëert per definitie een gecontroleerde aerosol omgeving. Daarom dienen levende menselijke celsortering worden uitgevoerd met grote zorg. Gepubliceerd veiligheid en decontaminatie richtlijnen zijn beschikbaar en moeten worden herzien en ten uitvoer gelegd voordat de soort 14. Goedkeuring van Institutionele bioveiligheid comites of hun equivalenten kan verplicht worden gesteld voorafgaand aan het sorteren. Voor een goede reiniging na sorteren worden bleekmiddel worden toegevoegd aan de afvalcontainer een eindconcentratie van 10%. Similarly moeten alle monsters buis en alle oppervlakken in de ruimte grondig worden gereinigd met vers 10% bleekmiddeloplossing.
Kortom, dit protocol is een strategie voor het verkrijgen van populaties van zeldzame precursor B-cellen en kan worden gewijzigd om een populatie zeldzame in navelstrengbloed waaronder hematopoietische stamcellen en onrijpe T-cellen te isoleren. Onlangs hebben onrijpe B-cellen geïdentificeerd in het perifere bloed van individuen met voortgeschreden HIV 15. Derhalve het nut van deze werkwijze verder dan de studie van bloedkanker. Tenslotte hebben we nog niet uitgevoerd RNA isolatie op de stroming gesorteerde cellen, maar deze methode is aanpasbaar met het voorbehoud dat tijdens celsortering de cellen rechtstreeks moet worden gesorteerd in TRIzol of een gelijkwaardige RNA verenigbare oplossing zoals RLT van de RNeasy kit beschikbaar via Qiagen.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NCI R00 CA132784) naar KT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| LS Column | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Multi Stand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| B-Cell Isolation Kit (B CLL) | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-660 | |
| Fetal Bovine Serum | ATLANTA Biologicals | S11195 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | MIDSCI | SS1500 | |
| BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559763 | |
| DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 | BD Biosciences | 555415 | |
| DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences | 560941 | |
| CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352058 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| PuraFlow Sheath Fluid, 8X | Beckman Coulter | CY30230 | |
| FlowCheck Alignment beads | Beckman Coulter | 6605359 | |
| Ultra Rainbow Alignment beads | Spherotech | URFP-30-2 | |
| ViroSafe Aerosol Evacuation Filter | Beckman Coulter | ML01330 | |
| ABC Mouse bead kit | Invitrogen | A-10344 | |
| 40 μm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Fisher Scientific Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscope | |||
| accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-516 | |
| MoFlo XDP flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| Aerosol Evacuation Unit | Beckman Coulter |
References
- Song, F., et al. Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression. PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).
- Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells. Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).
- Brown, G., et al. The sequential determination model of hematopoiesis. Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).
- Clark, P., et al. Lymphocyte subsets in normal bone marrow. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).
- Loken, M. R., et al. Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development. Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).
- Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. B-cell precursors in normal pediatric bone marrow. American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).
- Tucci, A., et al. Are cord blood B cells functionally mature? Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).
- Ghia, P., et al. Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci. J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).
- Noordzij, J. G., et al. Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children. Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).
- van Zelm, M. C., et al. Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression. J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).
- Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. The MIRA method for DNA methylation analysis. Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).
- Kanof, E. M., et al. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Suppl 19. 7.1.1-7.1.7 (1996).
- LeBien, T. W.
- Schmid, I., et al. International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells. Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).
- Malaspina, A., et al. Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7. PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).
