Summary
Burada göbek kordon kanı habercisi alt B-hücreleri izole etmek için bir protokol açıklar. Nükleik asitlerin yeterli bir miktarı ve kalitesi hücrelerinden çıkarılır ve DNA ya da RNA kullanılarak daha sonraki deneylerde kullanılabilir.
Abstract
Göbek kordon kanı çok farklı soy bağlılığı aşamalarında hematopoetik progenitör hücreler için zenginleştirilmiştir. Biz B-hücrelerinin farklılaşma dört farklı aşamalarında öncüsü izole etmek için bir protokol geliştirmiştir. Genlerin ifade ve epigenetik değişiklikler bir doku belirli bir şekilde meydana Çünkü, bu genomu ve hastalığın gelişmesine yol açabilir epigenom değişiklikler tespit edebilmek amacıyla doku ve hücre tipleri arasında ayrım önemlidir. Bu yöntem, ayırt herhangi bir aşamasında, göbek kordonu kanı hücre içinde mevcut herhangi bir tür için adapte edilebilir.
Bu yöntem, 4 temel aşamalarını kapsamaktadır. İlk olarak, mononükleer hücreler yoğunluk santrifüj ile ayrılır. İkinci olarak, B-hücreleri mononükleer hücrelerden non-B-hücreleri tanımak ve çıkarmak biyotin konjuge antikor kullanılarak zenginleştirilmiştir. Üçüncü olarak, B-hücrelerinin fluoresan ayrı aşamalara spesifik hücre yüzeyi proteini antikorları ile etiketlenmiştirB hücre gelişimi. Son olarak, floresan işaretli hücrelerin sıralanır ve bireysel nüfus geri kazanılır. Geri kazanılan hücreler aşağı nükleik asit tahlillerde kullanılmak için yeterli miktar ve kalitede.
Introduction
Hastalık mevcut olan sapmaları tespit etmek amacıyla, sağlıklı dokuların ya da hastalıktan etkilenen doku ya da hücre tipine karşılık gelen hücreleri kullanılan son derece önemlidir. Bunun bir nedeni, doku tipleri arasındaki epigenetik varyasyon gen ekspresyonu düzenleyen sorumludur ve normal insan gelişiminin 1,2 sırasında hücresel farklılaşma için kritik olmasıdır. İkinci nedeni aberran doku spesifik gen regülasyonu normal gelişim korkunç sonuçlara neden olabilir ve kanser gibi hastalık durumları çok sayıda katkıda bilinir. Bu nedenle, hematopoietik hücreler içeren bir hastalık daha iyi anlaşılması sağlıklı hematopoietik hücrelerin bilinmesini gerektirir.
Hücre yüzeyi ekspresyonu değişiklikleri ile karakterize edilen olayların sistematik bir düzen vasıtasıyla kemik iliği hematopoetik gelir hücrelerin gelişimi 3 markers. Yetişkin katılımcılar ile ilgili çalışmalar varPediatrik katılımcılar içeren çalışmalar prekürsör B-hücrelerinin yüzdesinin az 5 yaş 6 bireyler nispeten yüksek olduğunu göstermiştir iken; kemik iliği genellikle B-hücrelerinin 4,5 habercisi olarak düşük sayıda içerdiğini göstermiştir. Umbilikal kordon kanı, kan ile ilgili bozukluklar ve maligniteler tedavisinde hematopoietik kök hücre kaynağı olarak kullanılan kordon kanı bankalarının aracılığı ile kolay ulaşılabilir ve hedef lösemi olmak üzere birçok hastalıkların hücre ve olan immatür B ve T hücreleri 7 zenginleştirilmiştir edilir lenfomalar.
Kemik iliği içinde Prekürsör B-hücrelerinin yaygın olarak 8,9 phenotyped edilmiştir ve ayrı alt bu hücrelerin sıralamak için kullanılan spesifik hücre yüzey işaretleyicileri arasında bulunması ile tanımlanır. Normal B-hücre farklılaşması erken pro-B hücreleri ile başlayan ve olgunlaşmamış ya da naif B hücrelerinin sonuçlanan kemik iliğinde aşamalarında bir dizi ilerler. Görevan Zelm ve meslektaşları 10, pro-B hücreleri CD34 varlığı ve evre 2 geçiş (Pre-BI) olarak CD19 kazanılır karakterizedir. 3. Aşama (Ön BII) hücreler artık CD34 ekspres ve sitoplazmik IgM ifade etmeye başlayacak. Nihayet, evre 4 bir belirleyici özelliği (B hücreleri immatür) yüzey IgM ifadesidir. Bu protokolü açıklanan sıralama stratejisi ilk Caldwell ve arkadaşlarının 6 tarafından tanımlanan ve büyük ölçüde karmaşıklığı ve hücre sıralama deneyler gerçekleştirme maliyetini düşürür sadece 3 hücre yüzey belirteçlerinin kullanımını içerir edildi. Onların çalışmasında, CD45 arasında bir ilişki ve B-hücre farklılaşması aşamaları kurulmuştur. Bunlar kemik iliği, B-hücreleri CD45 ekspresyonu değişken düzeyleri görüntülemek görülmektedir. Özel olarak, yüksek düzeyde CD45 hücrelerinin yüzeyinde ifade edilen IgM ifade hücreleri (B-hücreleri olgunlaşmamış) karşılık olarak, CD45, orta derecede ifade edilen, bu cytopl ifade hücreler denkasmic IgM (pre-BII hücreleri), ve CD45 düşük seviyelerde ifade olanların (pre-BI hücreleri) sitoplazmik IgM ifade vermedi hücreleri karşılık geldi. Bu protokol, örneğin metil-, CpG adası iyileşme testi gibi, yüksek kaliteli nükleik asit gerektiren alt-metodlarda kullanılan göbek bağı kanı (Şekil 1), B-hücrelerinin (MIRA haberci alt kümeleri izole etmek için Caldwell ve arkadaşları tarafından geliştirilen 6 strateji kullanır ) 11 ve kantitatif gerçek zamanlı PCR. Yöntemi göbek kordon kanı dışındaki tüm B hücreleri tüketmek için manyetik boncuklar kullanarak ilk ayrılık istihdam ediyor ve sadece 3 antikorlar (CD34, CD19 ve CD45) ile boyanarak gerektirir. Kurtarıldı hücreleri B-hücre farklılaşması 4 aşamaları temsil: 1) CD34 +, CD19 + (geç pro-B ve pre-BI erken); 2) CD34 -; CD19 +, CD45 düşük (geç ön-BI); 3) CD34 -; CD19 +, CD45 med (pre-BII) ve 4) CD34 -; CD19 +; CD45 yüksek (immatür B hücreleri).
Protocol
1. Kordon Kanı gelen Mononükleer Hücreleri İzolasyon
- EDTA-PBS 95 ml durulama tamponu (1:20 seyreltme) 5 ml sığır serum albumini (BSA) stok solüsyonu tampon ekleyin hazırlayın. Degas tampon ve buz üzerinde arabellek tutmak ÖNEMLİ:. Degas uyulmaması CD19 izole ederken tampon optimum sonuçlar daha az neden olabilir + kabarcıklar yalıtım sütun engelleyebilir B-hücreleri çünkü.
- Yoğunluk gradiyenti santrifüj için 50 ml konik tüpler hazırlayın. Kordon kanı işleme için gerekli tüp sayısı (1 tüp 8 ml kan işleyebilir) belirleyin ve her tüpe Ficoll-Paque PLUS 15 ml ekleyin.
- 24 ml DPBS (1X) ve dikkatli bir tabaka 50 ml konik tüpler her Ficoll-Paque PLUS üstüne seyreltilmiş kordon kanı karışımı ile kordon kanı 8 ml seyreltin. Kan ve Ficoll-Paque PLUS karıştırmayınız ÖNEMLİ:. Kordon kanı ve Ficoll-Paque PLUS karışmalarını önlemek için, 45 derecelik bir açıyla tüp tutun vetabaka kan karışım yavaşça.
- 20 ° C'de 40 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin Mononükleer hücreler (MNC) kalacaktır plazma Ficoll-Paque PLUS arayüzü Ficoll-Paque PLUS ozmotik basınç daha yüksek yoğunluğu nedeniyle sediman granülosit ve eritrosit oysa. Örnek kimliği, tarihi ve aşağıdaki ile Bölüm 3 kullanılmak üzere Etiket yedi 5 ml yuvarlak tabanlı tüpler:
| Tüp | Etiket | Amaç |
| 1 | Renksiz | Akım sitometri sırasında normalleşmesi için boyanmamış hücreler |
| 2 | 7AAD | Flow sitometri esnasında canlılığını belirlemek için |
| 3 | + + + | Sıralanır hücreleri içerir |
| 4 | 34 + | CD34 + / CD19 toplamak için +(Geç pro-B - erken pre-BI) hücreler |
| 5 | Düşük 45 | / CD19 düşük + / CD45 (pre-BI) hücreleri - CD34 toplamak için |
| 6 | 45 med | / CD19 + / CD45 med (pre-BII) hücreleri - CD34 toplamak için |
| 7 | Yüksek 45 | / CD19 + / CD45 yüksek (immatür B) hücreleri - CD34 toplamak için |
Coat boruları 4, 5, 6, 7 ve% 2 FBS ile ve buz üzerinde her tüpleri.
- Dikkatle üst plazma tabakası aspire ve mononükleer hücre tabakası ile temasından kaçının. 10 ml'lik cam pipet kullanarak dikkatlice yeni bir 50 ml konik tüp mononükleer hücre tabakası aktarın. Tek bir 50 ml tüp içine birlikte üç tüpler mononükleer hücreleri birleştirin.
- PBS ile tüp doldurun, 10 dakika boyunca 300 xg'de hafifçe karıştırın ve santrifüj20 ° C. Hücre pelletini bozmadan süpernatant dikkatlice aspire. 1x tekrarlayın. İlk yıkama sonra, pelet tekrar süspansiyon haline getirin ve tek bir 50 ml'lik konik tüpe aktarılır.
- Yavaşça PBS içinde 200 ul hücre pelet tekrar süspansiyon. , Hücre süspansiyonu 1 ul çıkarın 1,5 ml mikrosantrifüj tüp PBS 1 ml ekleyin ve (santrifüj 50 ml hücre süspansiyonu yerleştirdikten sonra hücreleri saymak) sayım için kenara koyun. PBS ile tüp doldurun ve trombositleri uzaklaştırmak için 15 dakika için 200 x g'da santrifüjlenir. Hücre pelletini bozmadan tamamen Süpernatantı.
2. MACS Ayrılması Mononükleer Hücreler Modifiye B hücre izolasyonu
- 160 ul soğuk (4 ° C) EDTA-PBS tampon ile adım 1.7 'den pelet yeniden süspanse edin.
- 40 ul B KLL biotin antikor kokteyli ekleyin. 4 ° C'de karıştırın ve 10 dakika için inkübe pipet
- Yıkayın hücrelerini - 1 ml soğuk (4 ° C) EDTA-PBS tampon milyon başına 10 hücreleri (hücre nu eklemekmber adım 1.7) belirlenen ve 10 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj. Tamamen süpernatan aspire ve daha sonra 320 ul soğuk (4 ° C) EDTA-PBS tampon içinde tekrar süspansiyon hücre peleti.
- 80 ul anti-biotin mikro-küreler ekleme, 4 ° C'de karıştırın ve 15 dakika için inkübe
- Yıkayın hücrelerini - 1 ml soğuk 10 dakika boyunca 300 xg'de (4 ° C) EDTA-PBS tampon milyon hücre başına 10 ve santrifüj ekleyin. Soğuk 500 ul (4 ° C) EDTA-PBS tamponu içinde 100 milyon hücre kadar tekrar. Hücre sayısına göre Ölçeği tampon hacmi.
- Santrifüj (Adım 2.5) sırasında MACS Sütunlar ve MACS Ayırıcılar hazırlayın. MACS ayırıcı bir manyetik alan içinde bir LS sütun yerleştirin, 3 ml soğuk (4 ° C) EDTA-PBS tampon sütun üzerine eklemek ve tampon sütunu boyunca damla izin verir. Aracılığıyla akış yakalamak için bir kap kullanın. Aracılığıyla akış atın.
- Sütununun altındaki bir 50 ml konik boru yerleştirin ve sütun üzerine hücre süspansiyonu pipetle. Etiketsiz hücreleri Throug damla izin verh kolon ve 50 ml konik bir tüp içine. Önemli: Bu antikor etiketleme ve hücre sıralama için kullanılacak olan hücrelerdir. Aracılığıyla akış atmayın. Adım 2,5 hücrelerin tümü kurtarmak için, konik boru duvarları ile soğuk (4 ° C) EDTA-PBS tampon ilave bir 1 ml ekleyin. İyice karıştırın ve sütun üzerine, geri kalan hücre süspansiyonu pipetle. 1x tekrarlayın. Sütun geçtikten sonra konik tüp toplanan etiketsiz hücreleri kullanılarak 2.8 adıma geçin.
- 10 dakika boyunca 300 xg'de PBS ve santrifüj ile etiketsiz hücreleri içeren konik tüp doldurun. Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. EDTA-PBS 200 ul ekleyin ve hafifçe hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin.
3. Hücre Ayırma için antikor Etiketleme ve Hazırlık
- (Adım 1.4) "lekesiz" etiketli tüpe hücre süspansiyonu ve yerin 1 ul aspire. 500 ul EDTA-PBS tamponu ekleyin ve buz üzerinde tüp saklayın.
- 20 EkleKalan hücre süspansiyonu içine milyon hücre başına her bir antikorun ul (CD19, CD34 ve CD45). İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika süreyle karanlıkta tüpü yerleştirin. Işıklar kapalı CD antikorlar 2-4 ışığa duyarlı, tam adımlardır.
- Antikor ile inkübasyon 30 dakika sonra, hücre süspansiyonu, 40 ul aspire ve "7AAD" etiketli tüp içine yerleştirin. 2 dakika süreyle 500 xg'de boru ve santrifüj içine 1 ml PBS ekleyin. Süpernatantı ve bağlayıcı tampon içinde 100 ul hücre tekrar süspansiyon. 7AAD 7 ul (7-Aminoactinomycin D) eklenir ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karanlıkta inkübe edilir. 10 dakika inkübasyon tam adım 3.4 sırasında.
- CD antikorlar ile etiketlenmiş kalan hücreler içeren tüpün üst PBS ekleyin. 3 dakika boyunca 500 xg'de tüp santrifüjleyin. Süpernatantı, 500 ul EDTA-PBS tamponu ekleyin ve hücre pelet tekrar süspansiyon haline getirin. "+ + +" Etiketli tüpe hücre süspansiyonu tüm hacmi aktarın. Hücre süspansiyonu bir bütün kurtarmak için"+ + +" etiketli tüpe 50 ml konik tüp ve transfer için dd ek 1 ml EDTA-PBS tamponu.
- Inkübasyondan sonra (Adım 3.3), 7AAD tüpüne 300 ul bağlayıcı tampon eklemek. "Lekesiz", "7AAD" ve "+ + +" örnekleri ve "34 +", "45 düşük" "45 med" ve "45 yüksek" tüpleri Akım sitometri için hazırız.
4. MoFlo XDP Akış Sitometresi kullanma Hücre Ayırma
- Sıralama için Set-up MoFlo: lazerler hizalayın; damlacık akışı stabilize; damla gecikme belirler.
- Üreticinin talimatlarına göre Invitrogen ABC Fare boncuk seti (veya benzeri) kullanarak tek renk telafisi denetimleri hazırlayın. Pozitif ve negatif popülasyonları optimum ayrılması için floresans kanallarının voltaj ayarlayarak, tek renk kontrolleri çalıştırın. Kompanzasyon katsayılarını ayarlayın ve telafi parametre koleksiyonu protokolü uygulanır. Kompanzasyon katsayılarını antikor yeni bir sürü elde edilir her seferinde yeniden kurmak.
- Şekil 2'de gösterildiği gibi çizer dahil protokol oluşturur.
- , Boyanmamış örnek Çalıştır gerilim ve ileri ve yan dağılım için kazancı ayarlayın ve negatif floresan popülasyonları tanımlamak. DNA kurtarma tür hedefi olduğundan, eşik DNA içeren enkaz kurtarıldı örnekleri kontamine etmez (≤ 1%) düşük şekilde ayarlanmış olmalıdır. * Aerosol Tahliye Sistemi insan hücrelerinde MoFlo üzerinde yürütülüyor yaşamak her zaman çalıştığından emin olun.
- Yolluk stratejisi (Şekil 2) ayarlamak için + + + örnek (~ 50.000 olay) küçük bir kısım çalıştırın. B-hücre progenitörlerinin B-hücrelerinin olgunlaşması için aynı dağılım yok Çünkü, lenfosit kapısı potansiyeli Pro-B hücreleri içeren sağlamak için SSC vs FSC arsa üzerine + / CD34 + nüfus ungated CD19 backgate. Bu örnekten de 7AAD için negatif floresans nüfus ayarlayın.
- Örnek canlılığı belirlemek için 7AAD örnek çalıştırın. Yüksek canlılığı ile örnek sadece tür hücrelerölü hücreler olarak başından (≥% 95) gelişigüzel leke olacaktır ve sıralama nüfus kirletebilir.
- Dört nüfus toplamak tür kararlar ayarlayın: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 düşük; CD19 + / CD34 - / CD45 med ve CD19 + / CD34 - yüksek / CD45. Tüm nüfus tür kararlarında lenfosit ve çiftleri ayrımcılık kapıları ekleyin.
- Sıralama ucu takunya önlemek için, filtre + + hemen sıralama ve herhangi bir kümeleme sıralama sırasında örnek oluşursa yeniden filtresi önce 40 mikron hücre süzgecinden + örnek.
- Bir soğutmalı veya buz dolu bir tüp tutucu PBS içinde% 2 FBS ile kaplı toplama tüpleri (Adım 1.4) içine hücreleri sıralayın.
- Sıralama tamamlandıktan hemen sonra, DNA ayıklayın.
Representative Results
Örnek arası varyasyon hücre tür (Tablo 1) başarısında bir rol oynar. Iyi başarı oranları ile örnekleri kontamine enkaz düşük seviyelerde (Şekil 3A) sahip ve düşük başarı oranları ile örneklerin kontamine enkaz yüksek düzeyde (Şekil 3B) var. Kordon kanı örneği gönderi 24 saat (O / N öncelikli) bünyesinde toplandı eğer numune arasındaki varyasyon biraz kontrol edilebilir.
Her prekürsör B-hücre alt gelen akış sıralanmış hücreleri yeterli miktar ve nükleik asit izolasyonu gerçekleştirmek kalitede. Izole edilen DNA, yüksek kaliteli ve aşağı analizlerinde kullanılabilir. Biz rutin denatüre DNA (Şekil 4) için zenginleştirmek MIRA 11 bu DNA kullanır.
| Kordon Kanı Tesis Veri | Kötü sırala | |
| Antikoagülan Çalışma Kan Hacmi (ml) | 110 | 104 |
| Beyaz Kan Hücreleri [10 3 / ul] | 8.68 | 11.19 |
| Lenfositler [10 3 / ul] | 3.88 | 3.76 |
| Lenfosit (%) | 44.70 | 33.6 |
| Kırmızı Kan Hücreleri [10 6 / ul] | 3.65 | 3.05 |
| In-house Veri | ||
| Ficoll-Paque sonra Hücre Sayısı | 206 M | 309 M |
| MACS Ayrılık sonrası Hücre Sayısı | 22 M | 16,5 M |
| Toplam Etkinlik Sayısı (MoFlo XDP) | 30.57 M | 19,97 M |
| Canlılığı (%) | 98.00 | 98.00 |
| Lenfosit Gate Hücreleri (%) 17.00 | 50.00 | |
| CD19 + / CD34 + | ||
| Toplam Hücre Sayısı | 10959 | 48316 |
| Toplam Etkinlik% | 0.04 | 0.24 |
| Verim | 88% | 88% |
| CD19 + / CD34 - düşük / CD45 | ||
| Toplam Hücre Sayısı | 16619 | 26941 |
| Toplam Etkinlik% | 0.05 | 0.13 |
| Verim | 89% | 87% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 med | ||
| Toplam Hücre Sayısı | 469745 | 507540 |
| Toplam Etkinlik% | 1.54 | 2.54 |
| Verim | 89% | 89% |
| CD19 + / CD34 - yüksek / CD45 | ||
| Toplam Hücre Sayısı | 1896062 | 2047142 |
| Toplam Etkinlik% | 6.2 | 10.25 |
| Verim | 91% | % 90 |
Tablo 1. Örnek hücre sıralama istatistikleri. Satırlar 1-5 kordon kanı tesisi tarafından sağlanan sayıları vardır. Kalan satırların laboratuar toplanan veriler vardır. Yoksul çeşit enkaz yüksek düzeyleri ve lenfosit kapısı hücrelerin düşük bir oranda yer.
Figu1 yeniden. Prosedürün Akış şeması. Göbek kordon kanı işlenir ve mononükleer hücreler Ficoll-Paque plus kullanılarak izole edilmiştir. Ek bir yıkama adımından kirletici trombositleri uzaklaştırmak için eklenmiştir. B-hücreleri MACS insan B-hücresi izolasyon kiti (B-CLL) kullanılarak mononükleer hücreler izole edilmiştir. Bu adım, tüm non-B hücreleri çıkarmak için (CD2, CD4, CD11b, CD36, anti-IgE ve CD235a) biotin-konjuge monoklonal antikorlar kullanır. Kurtarılan B-hücreleri daha sonra prekürsör B-hücre alt kurtarmak için MoFlo XDP akış sitometresi kullanılarak sıralanır CD19-APC, CD34-PE ve CD45-FITC antikorlar ile etiketlenir: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 düşük ; CD19 + / CD34 - / CD45 med ve CD19 + / CD34 - yüksek / CD45.
Şekil 2. Pop belirleme ve sıralama için gating stratejisiulations. Kırmızı oklar sonraki arsa uygulanır kapısı gösterir. R4, R5, R6 ve R7'nin kapıları kriteri popülasyonları göstermektedir. A) ileri vs zenginleştirilmiş lenfosit popülasyonu yan dağılım gösteren bir arsa. R1, lenfosit kapısı. B) Yükseklik vs tek hücre karşısında çiftler belirlenmesi için forward scatter plot genişliği. R2, tek bir hücre kapısı. C) CD19-APC pozitif hücreler CD34-PE pozitif ve negatif popülasyonları içine düşmek. R3, CD19 + / CD34 - kapısı; R4, CD19 + / CD34 + kapı belirten istenen tür nüfus d) CD19 + / CD34 - hücreleri üç biraz farklı CD45-FITC nüfus girer.. R5 ve R6, CD19 + / CD34 + / - düşük CD45 ve CD19 + / CD34 + / - CD45 med popülasyonları, sırasıyla. R7, çünkü CD19 + / CD34 yüksek hücre sayıları arasında - yüksek nüfus / CD45, bu tür kapı sadece kapsarnüfusun bir bölümü. Bu nüfusun tüm hücreler aşağı analizler için toplanan gerekmez.
Şekil 3 a.) Sütun zenginleştirme sonrası enkaz kirletici Düşük seviyede. R1, lenfosit kapısı. B) sütununda zenginleştirme sonrası enkaz kirletici düzeylerini yüksek.
Şekil 4. Prekürsör B-hücrelerinin kümelerine denatüre DNA Zenginleştirme. Prekürsör B-hücre alt grupları izole) sonicated DNA yüksek kalitede. Kütüphane yapımı DNA için 200-600 bp bir ortalama sonicated edilir. Lane 1: Promega 100 bp ladder (katalog # G2101); Lane 2: izole Toplam DNA CD19 gelen + / CD34 + hücreleri; Lane 3: CD19 izole Toplam DNA + - / CD45 düşük hücrelerin; Lane 4: CD19 + / CD34 izole 100 ng DNA - / CD45 med hücreleri; Lane 5: CD19 + / CD34 izole 100 ng DNA - / CD45 yüksek hücreler. DNA 9 dk (; 30 sn OFF 30 sn) toplam on High Diagenode Bioruptor kullanılarak sonike edildi. DNA sütun saflaştırılmış ve SYBR yeşil nükleik asit jel leke ile% 1 agaroz jel üzerinde görselleştirilebilir. B) MIRA ActivMotif MethylCollector Ultra kiti, SLC25A37 ile PCR (1-6) ve APC1 (7-12) kullandıktan sonra onaylamak için yapılır denatüre DNA zenginleştirme. 1 & 7: sonicated genomik DNA (hayır MIRA); 2 ve 8: MIRA-CD19 + / CD34 + DNA; 3 ve 9: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 düşük DNA; 4 & 10: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 med DNA; 5 & 11: MIRA -CD19 + / CD34 - / CD45 yüksek DNA; 6 ve 12: Su kontrolü. SLC25A37 daha yüksek amplifikasyon metil DNA zenginleştirme teyitprekürsör B-hücrelerinin alt gruplarında.
Discussion
Protokolün başarısı üzerinde en büyük etkiye sahip faktör enkaz kirletici varlığıdır. Bir kordon kanı bankası kanı isteyen varsa bu kanın en kısa sürede toplama sonra mümkün sevk olması önemlidir. Buna ek olarak, lenfositoz olarak sınıflandırılan örnekleri lenfositlerin yüksek sayılar içeren, ancak bu örnekler prekürsör B-hücrelerinin yeterli sayıda yoktur ve kullanılmamalıdır. Biz kordon kanı en az 85 ml ile başlayan tavsiye habercisi altkümelerini her hücrelerin yeterli sayıda elde etme olasılığını artırmak için.
Bu yetişkin periferik kan ayrımları aksine, göbek kordonu kanı fractionating zaman mononükleer katmanı çoğunlukla kırmızı kan hücreleri 12 ile kontamine olduğuna dikkat etmek önemlidir. Bu protokol, kontamine trombositleri uzaklaştırmak için ilave bir yıkama aşamasını içerir. Kordon kanı mononükleer ayrımları anlatan Protokoller lizis adım t dahil öneririzİstenmeyen kırmızı hücreleri çıkarmak o. Kontaminasyonu enkaz üretir ve hücrenin tür başarısı üzerinde olumsuz bir etkisi vardır, çünkü biz bu adımı önermiyoruz.
Akış sitometrisi ile ayırt edilmesi gereken hücrelerin sayısını azaltmak için, bu önceki hücre sıralama için, bir B-hücresi zenginleştirme gerçekleştirmek için gereklidir. B-Hücre İzolasyon Kiti (B KLL) eşlik Miltenyi Biotec, tarafından sağlanan protokolü periferik kan için optimize edilmiş ve 10 milyon hücre başına 10 ul B KLL biotin antikor kokteyli kullanılmasını önerir edilmiştir. , CD4 (T hücreleri), CD11b (granülositler, monositler, makrofajlar), CD16 (NK hücreleri, makrofajlar, mast hücreleri), CD36 (trombosit), CD235a (eritroid hücreler); Bu adım, CD2 (NK hücreleri, T hücreleri) karşı antikorlar kullanan göbek kordon kanı olmayan B hücreleri tüketmek. Bu, eski kit pro-B hücreleri üzerinde mevcut olan CD43 karşı bir antikor içerir, çünkü tarif edilen kit olup, B-hücre izolasyon kiti II kullanımı için çok önemlidir. Bizim op sırasındaBu protokolün timization, biz B KLL biotin antikor kokteyli 40 ul toplam bir pozitif hücre sıralama sonucu üretmek için yeterli olduğunu buldular. Ayrıca biz B KLL biotin antikor kokteyli az 5 olarak ul fazla kullanarak hücre sıralama üzerinde olumsuz etkileri olduğunu bulmuşlardır. Bu nedenle, biz çok 175-250000000 arasındaki toplam mononükleer hücre numaraları için B KLL biotin antikor kokteyli 40 ul kullanmanızı öneririz. Hücrelerin daha düşük ya da daha yüksek sayılar ile başlangıç durumunda buna uygun reaktifler büyütmek için gerekli olabilir.
B-hücre alt-popülasyonları ayırmak için kullanılabilecek belirteçler anlatan sayısız çelişkili yayınlar vardır. Tutarsızlık çoğu farklılaşma devam eden bir işlem olup hücre yüzey işaretleyicileri arasında varlığında veya yokluğunda tedrici bir şekilde yerine bir bütün ya da hiç bir şekilde meydana geldiği gerçeği ile açıklanabilir. / CD19 + ve CD45 + (yoğunluk düzeyini - Bu protokol CD34düşük), yüksek, orta ifade farklılaşma 6 ilerlemesini tekabül eden CD45 ekspresyonunun seviyesinde bir artış ile ön-BI, önceden II ve olgunlaşmamış B hücreleri ayırmak için kullanılmıştır. Pro-B hücreleri CD19 Bazılarına göre tarif edilmiştir + / CD34 + 13 diğerleri pro-B hücreleri CD19 olduğunu göstermiştir iken - / CD34 + ve pre-BI hücreler CD19 + / CD34 + 9,10 vardır. Bu farklar dayanarak biz geç pro-B hücreleri / erken pre-BI hücreleri CD19 + / CD34 + hücrelerin tayin etmişler. Bu stratejinin öncüsü hastalık akut lenfoblastik lösemi etkilenen hücrelere karşılık B hücrelerinin alt yalıtmak için geliştirilen dikkat etmek önemlidir. Bununla birlikte, ilgi hücre alt tipi bağlı olarak kullanılabilecektir birden fazla ayırma stratejiler vardır.
Antikor-florokrom kombinasyonları kullanılabilir hücre sıralayıcı yeteneklerine göre seçilmelidir. Bir cins olarakl kural, sizin panelinde parlak florokrom en kalabalık antijen ve tersi etiketlemek için kullanılmalıdır. Özellikle çift-lekeli nüfus, bu gibi nadir olaylar belirlenmesinde, çifti ayrımcılık (Şekil 2B) yolluk stratejisinin hayati önem taşımaktadır. Bu, çift pozitif olayların antikorlar ve birbirlerine yapışık değil, sadece iki tek-boyanan hücreleri hem lekeli gerçekten tek hücre olmasını sağlar.
Yüksek hız, 4-yönlü hücre sıralama mutlaka kontrollü bir aerosol ortam oluşturur. Bu nedenle, canlı insan hücre sıralama büyük bir dikkatle yapılmalıdır. Yayınlandı emniyet ve dekontaminasyon kuralları mevcuttur ve sıralama 14 önce incelenir ve uygulamaya konulmalıdır. Kurumsal Biyogüvenlik Komiteleri veya eşdeğerleri gelen Onay sıralama öncesinde gerekli olabilir. Sıralama sonra uygun arındırma için, çamaşır suyu% 10 oranında bir nihai konsantrasyon için çöp bidonu ilave edilmelidir. Similarly, tüm örnekler boru şeklinde, hem de hemen alan bütün yüzeyleri tamamen yeni hazırlanmış bir% 10 çamaşır suyu solüsyonu ile arındırılır olmalıdır.
Özetle, bu protokol prekürsör B-hücrelerinin nadir nüfus elde etmek için bir strateji sağlar ve hematopoetik kök hücreleri ve T hücreleri immatür dahil kordon kanında bulunan herhangi nadir nüfusa yalıtmak için modifiye edilebilir. Son zamanlarda, immatür B hücreleri ilerlemiş HIV 15 bireylerin periferik kan tespit edilmiştir. Bu nedenle, bu yöntemin yarar kan kanseri çalışma ötesine uzanır. Son olarak, henüz akış sıralanmış hücreleri üzerinde gerçekleştirilen RNA izolasyon değil, ancak, bu yöntem, hücre sırasında hücreler RNeasy kiti trizol ya da bu gibi RLT eşdeğer bir RNA uyumlu bir çözelti içine doğrudan sıralanması sıralamak uyarı ile uyumlu olmalıdır Qiagen aracılığıyla kullanılabilir.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Bu çalışma KT Ulusal Sağlık Enstitüleri (NCI R00 CA132784) tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| LS Column | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Multi Stand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| B-Cell Isolation Kit (B CLL) | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-660 | |
| Fetal Bovine Serum | ATLANTA Biologicals | S11195 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | MIDSCI | SS1500 | |
| BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559763 | |
| DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 | BD Biosciences | 555415 | |
| DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences | 560941 | |
| CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352058 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| PuraFlow Sheath Fluid, 8X | Beckman Coulter | CY30230 | |
| FlowCheck Alignment beads | Beckman Coulter | 6605359 | |
| Ultra Rainbow Alignment beads | Spherotech | URFP-30-2 | |
| ViroSafe Aerosol Evacuation Filter | Beckman Coulter | ML01330 | |
| ABC Mouse bead kit | Invitrogen | A-10344 | |
| 40 μm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Fisher Scientific Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscope | |||
| accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-516 | |
| MoFlo XDP flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| Aerosol Evacuation Unit | Beckman Coulter |
References
- Song, F., et al. Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression. PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).
- Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells. Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).
- Brown, G., et al. The sequential determination model of hematopoiesis. Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).
- Clark, P., et al. Lymphocyte subsets in normal bone marrow. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).
- Loken, M. R., et al. Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development. Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).
- Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. B-cell precursors in normal pediatric bone marrow. American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).
- Tucci, A., et al. Are cord blood B cells functionally mature? Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).
- Ghia, P., et al. Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci. J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).
- Noordzij, J. G., et al. Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children. Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).
- van Zelm, M. C., et al. Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression. J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).
- Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. The MIRA method for DNA methylation analysis. Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).
- Kanof, E. M., et al. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Suppl 19. 7.1.1-7.1.7 (1996).
- LeBien, T. W.
- Schmid, I., et al. International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells. Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).
- Malaspina, A., et al. Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7. PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).
