Summary
Ein neuer Ansatz, der intraokularen Transplantation und konfokale Mikroskopie ermöglicht Längs-, non-invasive Bildgebung in Echtzeit mit Single-Cell Auflösung innerhalb gepfropft Geweben
Abstract
Intravital Imaging hat ein unverzichtbares Werkzeug in der biologischen Forschung entstanden. Bei dem Verfahren wurden viele bildgebende Verfahren entwickelt worden, um verschiedene biologische Prozesse bei Tieren nicht-invasiv zu studieren. Allerdings ist eine große technische Einschränkung in bestehende intravital bildgebenden Verfahren die Unfähigkeit, nicht-invasive, Längs-Bildgebung mit Single-Cell Auflösungsvermögen kombinieren. Wir zeigen hier, wie die Transplantation in der Vorderkammer des Auges, erhebliche Einschränkung bietet eine vielseitige experimentelle Plattform, die nicht-invasive, Längs-Bildgebung mit zellulärer Auflösung in vivo ermöglicht umgeht. Wir zeigen die Transplantation Verfahren in der Maus und bieten repräsentative Ergebnisse mit Hilfe eines Modells mit klinischer Relevanz, nämlich Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Transplantation. Zusätzlich zur Aktivierung direkten Visualisierung in einer Vielzahl von Geweben in die vordere Kammer des Auges transplantiert, bietet dieser Ansatz eine Plattform, um Gerölln Medikamenten indem Langzeit-Follow up und Überwachung im Zielgewebe. Wegen ihrer Vielseitigkeit, Gewebe / Zell-Transplantation in die vordere Kammer des Auges nicht nur Vorteile Transplantationstherapien, erstreckt sie auf andere in vivo-Anwendungen der physiologischen und pathophysiologischen Prozessen wie Signaltransduktion und Krebs oder Autoimmunerkrankung Entwicklung zu studieren.
Introduction
Advances in Intravitalmikroskopie haben physiologischen Erscheinungen nicht vorhergesagt durch in vitro Studien 1 offenbart. Dies unterstreicht die Herausforderung bei der Umsetzung Erkenntnisse durch konventionelle In-vitro-Methoden erhalten in den lebenden Tier. In den letzten zehn Jahren wurde das Sichtbarmachen von Geweben in lebenden Tieren erheblich durch technologische Fortschritte in bildgebenden Verfahren 2, 3, 4, 5, 6 verbessert. Dies hat einen Bedarf für in vivo Bildgebung Ansätze mit mögliches Einsatzgebiet in experimentellen Tiermodellen zu longitudinalen Visualisierung von Zielgeweben nichtinvasiv ermöglichen vorangetrieben.
Bildgebende Verfahren wie Kernspintomographie und Positronen-Emissions-Tomographie oder Biolumineszenz haben nicht-invasive Bildgebung von Organen / Geweben tief innerhalb des Körpers 7-8, 9 aktiviert. Aber diese Techniken nicht erreichen können einzelne Zelle Auflösung aufgrund hoher Hintergrundsignale und niedriger räumlicher Auflösung, trotz der Verwendung of Hochkontrastmaterialien oder gewebespezifische Lumineszenz 4. Dies wurde mit dem Aufkommen der Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Konfokalmikroskopie 10 gerichtet. Zwei-Photonen-Mikroskopie aktiviert intravital Bildgebung zur Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Ereignissen mit beispielloser Details 11, 12. Dies hat zur Charakterisierung von wichtigen biologischen Prozessen in Gesundheit und Krankheit 13, 14, 15, 16 geführt. Während bahnbrechenden intravital bildgebenden Untersuchungen in erster Linie "nachgeahmt" in-vivo-Bedingungen in herausgeschnittene Gewebe (zB Lymphknoten), haben andere Studien invasive Ansätze zur Bild belichtet Zielgewebe verwendet in situ 17, 18, 19, 20, 21. Andere Studien haben auch "Fenster Kammer Modelle" Einschränkungen bei invasiven Konzepten und begrenzte Bildauflösung in vivo 22, 23, 24, 25 zugeordnet zu umgehen verwendet. In dem Fenster Kammer Modell wird eine Kammer mit einem transparenten Fenster chirurgisch in die Haut an verschie implantiertMiete Standorten (dorsal oder Ohr haut, Brustfettpolster, Leber, etc.) auf das Tier (zB Maus, Ratte, Kaninchen). Während dieser Ansatz ermöglicht eindeutig hochauflösenden in vivo Bildgebung erfordert es eine invasive Chirurgie, um die Kammer zu implantieren und ist möglicherweise nicht in der Lage, longitudinalen Bildgebungsstudien über mehrere Wochen oder Monate 22 unterzubringen.
Es wurde kürzlich gezeigt, dass die Kombination von hoher Auflösung konfokale Mikroskopie mit einem minimal-invasiven Eingriff, nämlich Transplantation in die vordere Kammer des Auges (ACE) eine "natürliche Körper Fenster" als eine leistungsfähige und vielseitige in vivo Bildgebung Plattform 26, 27. Transplantation in das ACE hat sich in den letzten Jahrzehnten eingesetzt, um biologische Aspekte einer Vielzahl von Geweben 28, 29, 30 zu studieren, und seine jüngsten Kombination mit hochauflösenden bildgebenden aktiviert das Studium der Physiologie der Langerhans-Inseln mit Einzel-Zell-Auflösung nicht invasiv und längs <sup> 26, 27. Dieser Ansatz wurde verwendet, um Autoimmunreaktionen bei der Entwicklung von Typ 1 Diabetes im Tiermodell (unveröffentlichte Daten) zu studieren. Es wurde auch verwendet, um Bauchspeicheldrüsenkrebs Entwicklung zu studieren, sowie in Studien der Nierenfunktion durch Transplantation in die ACE Pankreas Knospen oder einzelne Nierenglomeruli bzw. (unveröffentlichte Daten). Ein kürzlich veröffentlichter Bericht über diesen Ansatz weiter demonstriert seine Anwendung auf Immunantwort nach Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Transplantation 31 studieren. Wichtig ist, dass diese Studie zeigte, dass die Transplantation in die vordere Kammer des Auges stellt eine natürliche Körper Fenster ausführen: (1) Längs-, nicht-invasiven Darstellung von transplantierten Geweben in vivo, (2) in vivo cytolabeling um zelluläre Phänotyp und Lebensfähigkeit in beurteilen situ, (3) Echtzeit-Tracking von infiltrierenden Immunzellen in das Zielgewebe, und (4) lokale Intervention durch topische Anwendung oder intraokularen Injektion.
Hier D Wiremonstrate wie Transplantation in die vordere Kammer des Auges unter Verwendung Pankreasinseln durchzuführen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Das folgende Verfahren unter dem Stereoskop wird in 2 Schritten durchgeführt wird, beinhaltet der erste Schritt das Laden der Inseln in die Kanüle und der zweite Schritt ist die tatsächliche Transplantation in das ACE. Alle Verfahren an Tieren durchgeführt wurden durch die institutionelle Pflege der Tiere und die Nutzung Ausschuss (IACUC) der University of Miami zugelassen.
Ein. Lädt Islets in Kanüle für Transplantation
- Center die Inseln in Kulturschale durch Drehen der Schüssel in Verengung Kreisen.
- Trennen Sie die Kanüle aus dem "Reservoir" und legen Sie die Kanüle und Verbindungsschlauch auf eine saubere Oberfläche. Der Behälter kann aus einem 300 ul Einweg-Kunststoff-Pipettenspitze werden ohne Filter (Abbildung 1a).
- Bündig Luftblasen aus dem Reservoir zu kontinuierlichen Strom von Inseln sicherzustellen beim Ansaugen in das Reservoir. Spülen des Reservoirs durch Vorantreiben der Freisprech-motorisierten Spritze Treiber mit dem Fußpedal getan(Abbildung 1b, c). Damit wird auch Platz in der Spritze, um eine Aspiration der Inseln in den Vorratsbehälter (mit steriler Lösung wie Kochsalzlösung, PBS oder Kulturmedien vorbelastet) zu ermöglichen.
- Vorsichtig absaugen gewünschten Menge von Inseln in das Reservoir. Inseln werden zu wirbeln neigen, da sie das Reservoir und geben bleiben gemeinsam auf dem Boden. Aspiration wird durch Rückwärtsfahrt den motorisierten Spritze Treiber mit dem Fußpedal getan.
- Schließen Sie die Kanüle in den Behälter über den Verbindungsschlauch.
- Platzieren Sie die Kanülenspitze wieder in der Kulturschale und bündig die Inseln aus dem Reservoir in den Schlauch dann in die Kanüle. Sicherstellen, dass die Inseln zusammen bleiben, wie Sie-back füllen den Schlauch / Kanüle sanft "schnippen" (Tapping) den Schlauch (Abbildung 1d). Stoppen entweder vor oder nach allen Luftblasen vor der Inseln sind die Kanüle gespült. Wenn nicht sicher, stoppen, wie Inseln auf der Rückseite des Kanüle eingeben, wie die restliche LuftBlasen vor der Inseln kann verhindern, Reflux (Rückfluss) von Inseln aus der ACE. Über Nacht zu zerstreuen.
- In diesem Stadium sind Sie bereit, um die Inseln in der ACE (siehe nächste Schritte) zu injizieren.
2. Inseltransplantation in die Vorderkammer des Auges
- Positionieren Sie den narkotisierten Maus an einem warmen Pad unter Stereoskop.
- Legen Sie die Schnauze der Maus in Narkose "Maske" mit Sauerstoff / Isofluran-Narkose Maschine. Die Maske ist aus einer 1 ml Einweg-Kunststoff-Pipettenspitze (ohne Filter) und mit der Narkose Schlauch durch das schmale Ende (Abbildung 2a, b).
- Vorsichtig einfahren Augenlider des Auges transplantiert mit dem Zeigefinger und Daumen der freien Hand und "Pop" das Auge für eine bessere Belichtung und einfachen Zugang (Abbildung 2c) werden. Dies erfordert einige Übung, um ohne Behinderung Atmung der Maus durch übermäßigen Druck auf die perfekteHalses oder Blockierung des Blutflusses zum Kopf.
- Verwendung eines wegwerfbaren Insulinspritze (29 - 31G) als Skalpell sorgfältig dringen nur die Spitze in der Hornhaut und einen einzigen seitlichen Schnitt. Machen den Einschnitt in der Mitte zwischen dem Scheitelpunkt der Hornhaut und Limbus zum Rückfluss der Inselchen während der Injektion aus der ACE (Abbildung 2 d) zu minimieren.
- Schieben Sie die Kanüle (vorinstalliert mit Inseln) durch den Einschnitt.
- Langsam auszuwerfen Inselchen aus der Kanüle und hinterlegen sie auf der Iris. Um islet Reflux aufgrund übermäßigen Druckaufbau in der ACE zu vermeiden, werfen Sie die Inseln in kurzen Schüben in möglichst wenig Volumen (s) wie möglich in den Quadranten gegenüber dem Einschnitt. Dies kann weiter durch Verdichten Inselchen im Schlauch beim Laden der Kanüle (siehe Schritt 1,6) sichergestellt werden.
- Langsam einfahren Kanüle aus der ACE. Dies ist ein kritischer Schritt, vor allem, wenn ein großes Volumen von Inseln als Insel Rückfluß durch Druck injiziert wurdedass sich im Inneren des ACE unvermeidlich sein. Zu beseitigen / minimieren Insel Reflux, drehen Sie ihn die Kanüle während im Inneren des ACE Überdruck durch den Einschnitt um die Kanüle freizugeben. Auf Anzeichen von Reflux, wie Sie die Kanüle zurückziehen und, falls erforderlich, bis der Druck nachlässt warten, bevor vollständig Zurückziehen der Kanüle aus dem ACE versuchen.
- Spülen Sie den transplantierten Auge mit sterilem PBS oder Kochsalzlösung.
- Injizieren Buprenorphin zur postoperativen Analgesie (0,05 bis 0,1 mg / kg, subkutan) für die ersten 48 Stunden.
- Bewerben Erythromycin Augenheilkunde antibiotische Salbe auf die transplantierten Auge sofort nach der Transplantation.
- Legen Sie das Tier wieder in einer vorgewärmten Käfig aus der Narkose ermöglichen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Es gibt ein paar Parameter, die eine "gute" Transplantation zu definieren. Eine gute Transplantation ist eine, die läuft ohne Blutungen bei dem Schnitt wie in dem Video zu sehen. Blutungen verhindert / durch Eindringen nur die Spitze des Skalpells (Nadel) in die ACE (Abb. 3a) minimiert. Dies wird auch dazu beitragen, Kontakt und Punktion der Iris. Es wird auch dafür sorgen, einen kleinen Einschnitt, die sehr gut heilen, ohne dass Trübungen der Hornhaut im Laufe der Zeit (Abbildung 3c, d). Ein weiterer wichtiger Aspekt für eine erfolgreiche Transplantation in der Lage sein, die gesamte gewünschte Menge an Inselzellen ohne Verlust durch Rückfluss aus dem ACE transplantieren. Wie im Protokoll Schritt 1.6 erwähnt, kann dies durch Ausstoßen der Inselchen im geringstmöglichen Umfang und, falls anwendbar, minimiert werden, unter Verwendung von Luftblasen, um den Einschnitt abzudichten beim vollständigen Einfahren der Kanüle aus der ACE (3b). Darüber hinaus liefert die i slets auf der Oberseite der Blende zwischen der Kante der Pupille und dem Limbus positioniert die Inseln in einer Stelle sehr zugänglich für die in vivo-Bildgebung (Abbildung 3d). Aus praktischer Sicht, mit den Inseln in dieser Zwischenstellung der Blende reduziert die Dicke der bildgebenden Z-Stapel erforderlichen vollständigen Inseln (Abbildung 4) überspannen. Dies ist besonders wichtig bei der konfokalen Fluoreszenz / Zwei-Photonen in vivo-Bildgebung, wo eine kleinere Z-Stapel ermöglicht eine bessere Verwertung besonderer Fluoreszenzsignale in tieferen Abschnitten des abgebildeten Gewebes mit besseren xy und z Auflösungen durch weniger Streulicht vom Gewebe. Außerdem dickeren z-Stacks erfordern längere Erfassungszeit, was die Wahrscheinlichkeit instrumentelle oder tierischen Drift erhöht, insbesondere bei in-vivo-Bildgebung.
ftp_upload/50466/50466fig1highres.jpg "/>
Abbildung 1. Fotos von unseren Transplantation Gerät einschließlich aller Teile. (A) Glasspritze mit Schlauch, Reservoir, und die Kanüle montiert. (B) Motorisierte Spritze-Treiber mit Spritze. Montiert (c) Dual Fußpedal, um die motorisierten Spritzenpumpe zu betreiben. Drücken Sie entweder Pedal treibt den Kolben der Spritze nach hinten (Aspiration) oder vorwärts (Auswurf). (D) Close-up der Kanüle und Verbindungsschlauch mit den Inseln an der Rückseite der Kanüle verpackt. Diese Konfiguration ermöglicht die Lieferung der Inseln in die vordere Kammer des Auges in einem minimalen Volumen bis zum Rückfluss und Verlust von Inseln zu verringern.
Abbildung 2. Darstellung der transplantatiüber das Verfahren in die Vorderkammer des Auges (ACE). (a) Foto der Maus Narkosemaske. (b) Nahaufnahme der Anästhesie Maske einer 1 ml Einweg-Kunststoff-Pipettenspitze ohne Filter. Mehrere Bohrungen wurden in der Spitze vorgenommen, damit Vermischung von Sauerstoff mit Isofluran vor Erreichen der Maus. (C) Close-up zeigt das Auge ausgesetzt für einen besseren Zugang transplantiert werden sehen. Das Auge wird durch Dehnen der Haut des Kopfes mit dem Daumen und Zeigefinger ausgesetzt. (D) Schematische Darstellung des Verfahrens Transplantation Hervorhebung der Lage des Schnittes in der Mitte zwischen dem Scheitelpunkt der Hornhaut und dem Limbus. Die Kanüle wird durch den Einschnitt, um die Inseln in die ACE liefern eingefügt. Inseln sind auf der Oberseite der Blende, wo sie abgeschieden einprägen.
Abbildung 3. Repräsentative Bilder von "guten" Transplantation Hervorhebung kritischen Schritte bei der Sicherstellung erfolgreichen Ergebnissen. (A) Serie von Bildern zeigt, wie weit die Spitze des Skalpells (Nadel) in die Hornhaut gedrückt wird, während dem Schnitt. Durch einen kleinen Schnitt ohne Blutung gemacht. Der Schnitt ist etwas größer als die Kanüle. (B) Serien von Bildern, wobei Inselzellen aus der Kanüle auf der Oberseite der Irisblende ausgeworfen wird, während unter Verwendung von Luftblasen zum Rückfluss zu verhindern. Beachten Sie, wie "verbogen" die Kanüle durch Brechung einmal Licht innerhalb der ACE erscheint. (C) Repräsentative Bild eines transplantierten Auge Hervorhebung der Klarheit des ACE sofort nach der Transplantation. (D) der Serie von Bildern des selben Auge auf dem angegebenen erworbenen postoperativen Tag (POD) Hervorhebung der bevorzugten Lage der Inseln für die in vivo imaGing und wie gut verheilt und lokalisiert der Schnitt und die Klarheit der Hornhaut nach 6 Wochen nach der Transplantation.
Abbildung 4. Repräsentative Fluoreszenz konfokalen Bild einer Langerhans-Insel in der Vorderkammer des Auges Maus (ACE) Hervorhebung der Vorteile der Inselzellen Position auf der Iris und der Möglichkeit, einzelne Zellen bei der in vivo-Bildgebung beheben transplantiert (a) maximale Vorsprung (2. - D-Ansicht) eines z-Stapels von einer Insel (umrissen mit gepunktete Linie) oben auf der Iris eines C57BL / 6 transgenen Maus, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimiert in aktivierten und Gedächtnis-T-Zellen 32. Das Bild wurde 5 Tage nach der Transplantation wo einige infiltrierenden T-Zellen (grün) in der Iris umgebenden islet detektiert erworben wurden. Das Inselchen und Iris wurden durch Laser-Rückstreuung oder rDurchbiegung (grau). (b) Dreidimensionale (3-D) Ansichten der gleichen Insel Hervorhebung der Vorteile der Anzeige / Imaging Winkel, um den Z-Stapel Dicke zu reduzieren, um die ganze Insel Volumen und umgebende Struktur und Immunzellen zu erwerben. Beachte die xyz-Achsen zur Drehung des Bildes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Murine Pankreasinseln wurden isoliert unter Verwendung Kollagenaseverdau durch Reinigung auf Dichtegradienten gefolgt, wie zuvor beschrieben 33. Isolierten Inseln wurden über Nacht vor der Transplantation gezüchtet. Obwohl dies nicht erforderlich sein kann, wird empfohlen, damit die Inseln aus dem Isolierungsverfahren erholen. Dies ist entscheidend, wenn die Transplantation in diabetischen Empfängern durchgeführt wird, wie es der Transplantation zu überleben / robust Inseln gewährleistet.
Transplantation wird unter allgemeiner Anästhesie mit Sauerstoff / Isofluran Mischung (1.5-3%) Einatmen wirksam durchgeführt. Alternative Inhalation oder Injektion Anästhetika (zB Ketamin) können verwendet werden. Wenn Injektionsanästhesie verwendet wird, überspringen Sie Schritt 2,2 im Protokoll. Stellen die narkotisierten Tier mit einer Wärmequelle, um Hypothermie während des Verfahrens zu vermeiden. In einigen Mäusen, ist es möglich, um Blutgefäße zu brechen, wenn dem Schnitt in der Regel avaskulären cornea. Zum Beispiel neigt die Hornhaut des Nacktmäusen zu vaskularisiert zu sein, zu vermeiden, wenn vaskularisierten Bereichen möglich. Verwenden Sie eine neue Spritze pro Schnitt. Vermeiden Punktion der Iris mit der Nadel, wenn dem Schnitt. Verhindern des Kontakts mit der Iris kann weiter durch zugewandten abgeschrägten Seite der Nadelspitze in Richtung der Blende sichergestellt werden. Nicht trocken / absaugen Kammerwasser, nachdem Sie den Schnitt. Es ist einfacher, um die Kanüle durch den Einschnitt in einem "nassen" Hornhaut eindringen; ein paar Tropfen von sterilem PBS oder Kulturmedien zur Hornhaut, wenn nötig.
Postoperative Analgesie durch Injizieren subkutan Buprenorphin (0,05-0,1 mg / kg) oder bevorzugte analgetische (en) für die ersten 48 h erhalten werden. In Schritt 2,9 betreuen wir Analgesie unmittelbar nach dem Verfahren, wie das Tier ist bereits tief unter Vollnarkose. Wenn gewünscht, kann jedoch Schritt 2,9 nach Schritt 2,2 im Protokoll durchgeführt werden, mit oder ohne Lokalanästhetikum auf das Auge (konsultieren Sie Ihre lokalenIACUC oder Tierarzt). Alternative ophthalmische Antibiotika können ebenfalls verwendet werden.
Hier haben wir eine custom-built Mikroinjektionsvorrichtung über ein Fußpedal betrieben, um die 100 ul KPG Spritze absaugen (Last) zu fahren und werfen die Inseln aus der Kanüle in das ACE (Abbildung 1). Dies kann mit jedem 100 ul gasdichte KPG Spritze mit einer Schraube-Kolbendosierpumpe, die manuell bedient werden kann zum Absaugen / Auswerfen der Inseln ersetzt werden, dies wird jedoch wahrscheinlich benötigen die Hilfe einer anderen Person bedienen. In beiden Fällen, wenn auch nicht erforderlich, wir empfehlen Vorspannung des zusammengesetzten Spritze, Schläuche, Behälter und mit einer sterilen Lösung (Kochsalzlösung, PBS oder Kulturmedien) an glatten Ansaugen und Ausstoßen der Inseln zu gewährleisten. Dies ist besonders wichtig, wenn / falls die verpackten Inseln verstopfen die Kanüle.
Wir in der Regel führen unsere Transplantationen unter sauberen Bedingungen in einem Biosicherheit cabinet ohne Risiko von Infektionen. Alle verwendeten Lösungen, Spritzen, Kanülen, Schläuchen, und Gaze sind autoklaviert oder Gas sterilisiert. Während wir können nicht feststellen, voller Sterilität wegen der Handkontakt mit der Maus während des Verfahrens haben wir keine Probleme mit Inselzellen Kontamination nach den oben empfohlenen Schritte.
Wir haben gezeigt, hier, wie Sie Pankreasinseln in die ACE Transplantation zur Bildgebung in denen weniger Inselchen benötigt, um zu transplantieren sind. In dem Fall, Diabetes Umkehr im Empfängertier gewünscht ist, muss eine größere Menge von Inseln zu transplantierenden 26, 27.. Während die Transplantation Vorgehensweise ist identisch zu dem, was wir hier zeigte, sollte besonderes Augenmerk auf die Schritte 2,6 und 2,7 im Protokoll zum Verlust des transplantierten Inseln durch Rückfluss zu vermeiden bezahlt werden.
Einmal gemeistert, kann dies Transplantation Verfahren in ~ 5 min per Maus durchgeführt werden. Diese Technik kann verwendet werden, um eine Vielzahl von tissu transplantieren werdenes in die vordere Kammer des Auges. Wie oben erwähnt, haben wir Nierenglomeruli sowie Embryonalgewebe (Pankreas Knospen) an Pankreas-Entwicklung in der Vorderkammer des Auges in vivo zu untersuchen transplantiert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
PO.B. ist einer der Gründer des Biotech-Unternehmens Biocrine, die gehen, um die Vorderkammer des Auges als kommerzielles Service-Plattform zu verwenden. AC ist auf dem Patent zum Schutz dieser Technologie.
Acknowledgments
Wir erkennen Drs. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier und Daniel Nyqvist für fruchtbare Diskussionen. Wir danken auch Eleut Hernandez und Diego Espinosa-Heidmann für die technische Unterstützung und Mike Valdes und Margaret Formoso um Hilfe mit Videoaufnahme. Byron Maldonado erfasst, bearbeitet und produziert das fertige Video. Unterstützung der Forschung wurde von der Diabetes Research Institute Foundation (vorausgesetzt www.DiabetesResearch.org ), der NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 MHA; NIH RO3DK075487 zum AC; U01DK089538 um PO.B.). Weitere wissenschaftliche Unterstützung PO.B wurde durch Mittel aus dem Karolinska Institutet, dem schwedischen Research Council, dem schwedischen Diabetes Foundation, Familie Erling Persson-Stiftung, der Familie Knut and Alice Wallenberg Foundation, der Skandia Insurance Company Ltd VIBRANT vorgesehen ( FP7-228.933-2), Strategic Research Program in Diabetes am Karolinska Inst.itutet der Novo Nordisk Stiftung und der Berth von Kantzow Stiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
References
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
- Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O. Non-invasive in vivo imaging of pancreatic ?-cell function and survival - a perspective. Acta Physiol. (Oxf). , (2011).
- Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE Trans Biomed. Eng. 57 (10), 2576-2578 (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat. Methods. 7, 603-614 (2010).
- Aswathy, R. G., Yoshida, Y., Maekawa, T., Kumar, D. S. Near-infrared quantum dots for deep tissue imaging. Anal. Bioanal Chem. 397 (4), 1417-1435 (2010).
- Ghoroghchian, P. P., Therien, M. J., Hammer, D. A. In vivo fluorescence imaging: a personal perspective. Wiley Interdiscip Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 1 (2), 156-167 (2009).
- Prescher, A., Mory, C., Martin, M., Fiedler, M., Uhlmann, D. Effect of FTY720 treatment on postischemic pancreatic microhemodynamics. Transplant Proc. 42 (10), 3984-3985 (2010).
- Leblond, F., Davis, S., Valdés, P., Pogue, B. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. J. Photochem. Photobiol. B. 98 (1), 77-94 (2010).
- Toso, C., Vallee, J. P., Morel, P., Ris, F., Demuylder-Mischler, S., Lepetit-Coiffe, M., et al. Clinical magnetic resonance imaging of pancreatic islet grafts after iron nanoparticle labeling. Am. J. Transplant. 8 (3), 701-706 (2008).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J. Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
- Denk, W., Delaney, K. R., Gelperin, A., Kleinfeld, D., Strowbridge, B. W., Tank, D. W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J. Neurosci. Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Khorshidi, M. A., Vanherberghen, B., Kowalewski, J. M., Garrod, K. R., Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H., et al. Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro. Integr. Biol. (Camb). 3 (7), 770-778 (2011).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D., Parker, I. Immunoimaging: studying immune system dynamics using two-photon microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top99 (2011).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat. Med. , (2011).
- Fan, Z., Spencer, J., Lu, Y., Pitsillides, C., Singh, G., Kim, P., et al. In vivo tracking of 'color-coded' effector, natural and induced regulatory T cells in the allograft response. Nat. Med. 16 (6), 718-722 (2010).
- Sabek, O., Gaber, M. W., Wilson, C. M., Zawaski, J. A., Fraga, D. W., Gaber, O. Imaging of human islet vascularization using a dorsal window model. Transplant Proc. 42 (6), 2112-2114 (2010).
- Coppieters, K., Martinic, M. M., Kiosses, W. B., Amirian, N., von Herrath, M. A novel technique for the in vivo imaging of autoimmune diabetes development in the pancreas by two-photon microscopy. PLoS One. 5 (12), e15732 (2010).
- Martinic, M. M., von Herrath, M. G. Real-time imaging of the pancreas during development of diabetes. Immunol Rev. 221, 200-213 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678 (2008).
- Palmer, G. M., Fontanella, A. N., Shan, S., Hanna, G., Zhang, G., Fraser, C. L., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent. 6 (9), 1355-1366 (2011).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Taylor, M. The response of capillary endothelium to changes in intravascular pressure, as seen in the rabbit's ear chamber. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 31 (5), 533-543 (1953).
- Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvasc. Res. 65 (2), 109-117 (2003).
- Speier, S., Nyqvist, D., Cabrera, O., Yu, J., Molano, R. D., Pileggi, A., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat. Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Speier, S., Nyqvist, D., Kohler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nat. Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Falck, B. Site of production of oestrogen in the ovary of the rat. Nature. 184, Suppl 14. 1082 (1959).
- Bickford-Wimer, P., Granholm, A. C., Bygdeman, M., Hoffer, B., Olson, L., Seiger, A., et al. Human fetal cerebellar and cortical tissue transplanted to the anterior eye chamber of athymic rats: electrophysiological and structural studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (16), 5957-5961 (1987).
- Adeghate, E., Donath, T. Morphological findings in long-term pancreatic tissue transplants in the anterior eye chamber of rats. Pancreas. 5 (3), 298-305 (1990).
- Abdulreda, M. H., Faleo, G., Molano, R. D., Lopez-Cabezas, M., Molina, J., Tan, Y., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).
- Unutmaz, D., Xiang, W., Sunshine, M. J., Campbell, J., Butcher, E., Littman, D. R. The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its expression pattern is conserved between human and mouse. J. Immunol. 165 (6), 3284-3292 (2000).
- Pileggi, A., Molano, R. D., Berney, T., Cattan, P., Vizzardelli, C., Oliver, R., et al. Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation. Diabetes. 50 (9), 1983-1991 (2001).
