Summary
En ny tilnærming kombinere intraokulær transplantasjon og konfokalmikroskopi muliggjør langsgående, ikke-invasiv sanntids avbildning med encellede oppløsning innenfor podet vev
Abstract
Intravital bildebehandling har dukket opp som et uunnværlig verktøy i biologisk forskning. I prosessen, har mange bildedannende teknikker blitt utviklet for å studere forskjellige biologiske prosesser i dyr ikke-invasiv. Imidlertid er en stor teknisk begrensning i eksisterende intravital bildediagnostikk manglende evne til å kombinere ikke-invasiv, langsgående avbildning med encellede løsningsmuligheter. Vi viser her hvordan transplantasjon i fremre kammer av øyet omgår slik betydelig begrensning tilbyr en allsidig eksperimentell plattform som muliggjør ikke-invasiv, langsgående avbildning med cellulær oppløsning in vivo. Vi viser til transplantasjon prosedyre i musen og gi representative resultater ved hjelp av en modell med klinisk relevans, nemlig bukspyttkjertelen holme transplantasjon. I tillegg til å aktivere direkte visualisering i en rekke vev transplantert inn i fremre kammer av øyet, gir denne tilnærmingen en plattform for å rasmarkn legemidler ved å utføre langsiktig oppfølging og overvåking i målet vev. På grunn av sin fleksibilitet, vev / celle transplantasjon i fremre kammer av øyet ikke bare fordeler transplantasjon terapier, strekker det i andre in vivo applikasjoner å studere fysiologiske og patofysiologiske prosesser som signaltransduksjon og kreft eller autoimmun sykdom utvikling.
Introduction
Fremskritt i intravital mikroskopi har avdekket fysiologiske fenomener ikke spådd av in vitro studier en. Dette understreker utfordringen med å oversette funn oppnådd ved konvensjonelle in vitro metoder i levende dyr. I det siste tiåret, ble visualisering av vev i levende dyr betydelig forbedret ved teknologiske fremskritt i bildediagnostikk 2, 3, 4, 5, 6. Dette har påvirket en behov for in vivo imaging tilnærminger med gjennomførbart program i eksperimentelle dyremodeller for å muliggjøre langsgående visualisering av målvev ikke-invasiv.
Imaging-teknikker slik som magnetisk resonans imaging og positronemisjonstomografi eller Bioluminescens har aktivert ikke-invasiv avbildning av organer / vev dypt inne i kroppen 7-8, 9. Men disse teknikkene ikke kan oppnå enkelt celle-oppløsning på grunn av høy bakgrunnssignaler og lav romlig oppløsning, til tross for bruk of høy kontrast materialer eller vev-spesifikk luminescence 4. Dette ble adressert med bruk av to-foton fluorescens konfokalmikroskopi 10. To-foton mikroskopi aktivert intravital imaging studier for å visualisere og kvantifisere mobilnettet hendelser med enestående detaljer 11, 12. Dette har ført til karakterisering av sentrale biologiske prosesser i helse og sykdom 13, 14, 15, 16.. Mens banebrytende intravital imaging studier har primært "etterlignet" in vivo betingelser i excised vev (f.eks lymfeknuter), har andre studier benyttet invasive tilnærminger til bilde eksponerte målvev in situ 17, 18, 19, 20, 21. Andre studier har også brukt "vindu kammer modeller" for å omgå begrensninger knyttet invasive metoder og begrenset bildebehandling oppløsning i 22 vivo, 23, 24, 25. I vinduet kammeret modellen er et kammer med et gjennomsiktig vindu implantert inn i huden på diffeleie steder (dorsal eller øret hud, mammary fettpute, lever, osv.) på dyret (f.eks mus, rotte, kanin). Mens denne tilnærmingen klart gir høy oppløsning in vivo imaging, krever det en invasiv kirurgi for å implantere kammeret og kan ikke være i stand til å imøtekomme longitudinelle imaging studier over flere uker eller måneder 22.
Det ble nylig vist at å kombinere høy oppløsning konfokalmikroskopi med en minimal invasiv prosedyre, nemlig transplantasjon i fremre kammer av øyet (ACE) gir en "naturlig kropp vindu" som et kraftig og allsidig in vivo imaging plattform 26, 27. Transplantasjon i ACE har vært brukt i de siste årtier å studere biologiske aspekter av en rekke 28 vev, 29, 30, og dens siste kombinasjon med høy oppløsning aktivert studere fysiologi pankreatiske øyer med enkeltcelle-oppløsning ikke- invasiv og lengderetningen <sup> 26, 27. Denne tilnærmingen ble brukt til å studere autoimmune reaksjoner under utvikling av type 1 diabetes i dyremodeller (upubliserte data). Det ble også brukt til å studere bukspyttkjertelen utvikling, samt, i studier av nyrefunksjon ved transplantere inn ACE pancreatic knopper eller individuelle renale glomeruli, henholdsvis (upubliserte data). En fersk rapport ved hjelp av denne tilnærmingen ytterligere demonstrert sin søknad for å studere immunresponser etter bukspyttkjertelen holme transplantasjon 31. Viktigere, viste denne studie at transplantasjon i fremre kammer av øyet gir en naturlig kropp vindu å utføre: (1) langsgående, ikke-invasiv avbildning av transplanterte vev in vivo, (2) in vivo cytolabeling å vurdere cellulær fenotype og levedyktighet i situ, (3) sanntids sporing av infiltrerende immunceller i målvevet, og (4) lokal intervensjon ved lokal applikasjon eller intraokulær injeksjon.
Her D Viemonstrate hvordan å utføre transplantasjon i fremre kammer av øyet ved hjelp av pankreatiske øyer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende prosedyre utføres under stereoskop i 2 trinn, innebærer det første trinnet lasting holmene inn kanylen og det andre trinnet er den faktiske transplantasjon i ACE. Alle prosedyrer utført på dyr ble godkjent av den institusjonelle dyr omsorg og bruk komité (IACUC) ved Universitetet i Miami.
1. Lasting Islets i Kanyle for transplantasjon
- Senter holmer i kultur tallerken ved å spinne rett i innsnevring sirkler.
- Koble kanylen fra "reservoar" og plassere kanylen og koble slangen på en ren overflate. Reservoaret kan være laget av en 300 ul disponibel plast pipettespiss uten filter (Figur 1a).
- Spyl luftbobler ut av reservoaret for å sikre kontinuerlig drift av holmer når aspirere inn reservoaret. Spyling av reservoaret er gjort ved å kjøre frem hands-free motorisert sprøyte-driveren ved hjelp av fotpedalen(Figur 1b, c). Dette vil også gi plass i sprøyten for å tillate aspirasjon av holmene i reservoaret (forhåndslastet med steril oppløsning som saltvann, PBS eller kultur medier).
- Forsiktig aspirer ønsket mengde holmer i reservoaret. Holmer vil tendere til å virvle som de kommer inn i reservoaret og vil forbli sammen mot bunnen. Aspirasjon gjøres ved å kjøre bakover den motoriserte sprøyte-driveren ved hjelp av fotpedal.
- Koble kanylen til reservoaret via kobler slangen.
- Plasser kanylen tips tilbake i kulturen parabolen og skylle holmer ut av reservoaret inn i røret og deretter inn i kanylen. Sørg for at holmer forbli sammen som du back-fyll slangen / kanyle ved forsiktig "flicking" (tapping) slangen (figur 1d). Stopp enten før eller etter at alle luftbobler foran holmene skylles ut kanylen. Hvis ikke er sikker, slutte som holmer inn på baksiden av kanylen som gjenværende luftbobler foran holmer kan bidra til å forhindre reflux (tilbakestrømning) av holmer ut av ACE. Vil spre over natten.
- På dette stadiet, er du klar til å injisere holmene i ACE (se neste trinn).
2. Holme transplantasjon i fremre kammer av øyet
- Plasser bedøvet mus på en varm pad under stereoscope.
- Plasser snuten av musen til anestesi "maske" koblet til oksygen / isofluran anestesi maskin. Masken er laget av en 1 ml engangs plast pipettespiss (uten filter) og koblet til anestesi slangen gjennom den smale enden (figur 2a, b).
- Forsiktig trekke øyelokkene i øyet å bli transplantert med pekefingeren og tommelen på den ledige hånden og "pop" øyet ut for bedre eksponering og enkel tilgang (Figur 2c). Dette vil kreve noe praksis for å perfeksjonere uten å hindre innånding av musen ved stort trykk pånakke eller blokkering blodtilførselen til hodet.
- Ved hjelp av en disponibel insulinsprøyte (29 - 31G) som skalpell, nøye trenge bare spissen i hornhinnen og lage et enkelt lateral snitt. Gjør snittet på midtpunktet mellom apex av hornhinnen og Limbus å minimere tilbakeløp av holmene under injeksjon ut av ACE (figur 2d).
- Sett forsiktig kanylen (forhåndslastet med holmer) gjennom snittet.
- Sakte mate holmer ut av kanylen og deponere dem på toppen av iris. Å unngå holme tilbakeløp skyldes overdreven trykkøkning i ACE, mate holmene i korthet thrusts i så lite volum (er) som mulig i kvadranten motsatt til snittet. Dette kan videre sikres ved å komprimere holmer i slangen under lasting kanylen (se trinn 1.6).
- Langsomt trekke kanylen ut av ACE. Dette er et kritisk trinn, spesielt hvis et stort volum av holmer ble injisert som holme tilbakeløp grunnet pressikker bygge opp inne i ACE kan være uunngåelig. For å eliminere / minimere holme reflux, forsiktig rotere kanylen mens inne i ACE å frigjøre overflødig trykk gjennom snitt rundt kanylen. Se etter tegn på reflux som du prøver å trekke kanylen og, om nødvendig, vent til trykket avtar før helt trekke kanylen ut av ACE.
- Skyll det transplanterte øyet med sterilt PBS eller saltvann.
- Injisere buprenorfin for postoperativ analgesi (0,05-0,1 mg / kg, subkutant) for den første 48 timen.
- Påfør erytromycin ophthalmica antibiotisk salve til transplanterte øyet umiddelbart etter transplantasjonen.
- Plasser dyret tilbake i en oppvarmet buret for å tillate utvinning fra anestesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er et par parametere som definerer en "god" transplantasjon. En god transplantasjon er en som går uten blødning når gjøre innsnitt som kan sees i videoen. Blødning forhindres / minimert ved å trenge bare spissen av skalpellen (nålen) i ACE (Figur 3a). Dette vil også bidra til å forhindre kontakt og punktering av iris. Det vil også sikre et lite snitt som vil gro godt uten forårsaker uklarhet i hornhinnen over tid (figur 3c, d). Et annet viktig aspekt i et vellykket transplantasjon er å være i stand til å transplantere den totale ønskede mengde holmer uten tap på grunn av tilbakeløp ut av ACE. Som nevnt i protokollen trinn 1,6, kan dette reduseres ved mate holmene i minst mulig volum og, når det er aktuelt, ved hjelp av luftbobler for å forsegle innsnitt ved endelig tilbaketrekning av kanylen ut av ACE (Figur 3b). Videre leverer jeg slets oppå iris mellom kanten av pupillen og Limbus posisjonerer holmene på et sted meget mottagelig for in vivo avbildning (Figur 3d). Fra praktisk perspektiv, at holmene på denne mellomliggende posisjon av iris reduserer tykkelsen av imaging z-stabler som kreves for å spenne hele holmer (figur 4). Dette er spesielt viktig under fluorescens confocal / to-foton in vivo avbildning der et mindre z-stabel tillater bedre utvinning av spesifikke fluorescence signaler i dypere deler av den avbildede vev med bedre xy og z oppløsninger på grunn av mindre lysspredning ved vevet. Videre tykkere z-stabler krever lengre registreringstid som øker sannsynligheten for instrumental eller animalsk avdrift, spesielt under in vivo avbildning.
ftp_upload/50466/50466fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Fotografier av vår transplantasjon apparater inkludert alle deler. (A) montert glass sprøyte med slange, reservoar, og kanyle. (B) Motorisert sprøyte-driver med sprøyte montert. (C) Dual fotpedal å drive motorisert sprøyten driver. Trykke enten pedalen driver sprøytestempelet bakover (aspirasjon) eller videresender (utkast). (D) nærbilde av kanylen og koble slangen som viser holmene pakket på baksiden av kanylen. Denne konfigurasjonen tillater levering av holmene i fremre kammer av øyet i et minimalt volum for å redusere tilbakestrømming og tap av holmer.
Figur 2. Skildring av transplantatipå prosedyren i fremre kammer av øyet (ACE). (a) Fotografi av musen anestesi maske. (b) Close-up visning av anestesi maske laget av en 1 ml disponibel plast pipettespissen uten filter. Flere hull ble gjort i spissen for å tillate blanding av oksygen med isofluran før de når musen. (C) Close-up vise viser øyet å bli transplantert utsatt for bedre tilgang. Øyet er eksponert ut ved å strekke huden av hodet ved hjelp av tommel og pekefinger. (D) Skjematisk fremstilling av transplantasjonen prosedyren utheving plasseringen av innsnitt på midtpunktet mellom toppen av hornhinnen og Limbus. Kanylen settes inn gjennom snittet til å levere holmene i ACE. Holmer avsettes på toppen av iris der de engraft.
Figur 3. Representative bilder av "gode" transplantasjon utheving kritiske trinnene i å sikre vellykkede resultater. (A) serie med bilder som viser hvor langt spissen av skalpell (nål) skyves inn i hornhinnen, samtidig som snittet. Et lite snitt er gjort uten blødning. Snittet er litt større enn kanylen. (B) Serie av bilder som viser holmer blir slynget ut av kanylen på toppen av iris mens luftbobler å hindre tilbakeløp. Legg merke til hvordan "bøyd" kanylen vises på grunn av lysbrytning gang inne i ACE. (C) representant bilde av et transplantert øye fremhever klarhet i ACE umiddelbart etter transplantasjonen. (D) Serie av bilder av det samme øyet kjøpt på den angitte postoperative dager (POD) fremhever den foretrukne plasseringen av holmer for in vivo imaging og hvor godt leget og lokalisert snittet er og klarhet i hornhinnen ved 6 uker etter transplantasjon.
Figur 4. Representativ fluorescens konfokal bilde av en pankreatisk holme transplantert i fremre kammer av musen øyet (ACE) fremheve fordelene holmen posisjon på iris og evnen til å løse enkelte celler under in vivo avbildning (a) Maksimal projeksjon (2. - D visning) for en z-stabel med en holme (skissert med stiplet linje) på toppen av iris til en C57BL / 6 transgene mus som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) i aktivert og minne T-celler 32. Bildet ble anskaffet 5 dager etter transplantasjonen hvor noen infiltrere T-celler (grønt) ble observert i iris omgir holmen. Holmen og iris ble visualisert ved laser backscatter eller reflection (grå). (b) Tredimensjonal (3-D) visninger av samme holmen fremhever fordelene ved visning / bildebehandling vinkel for å redusere z-stack tykkelse for å skaffe hele holmen volum og omliggende struktur og immunceller. Legg merke til xyz aksene for rotasjon av bildet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Murine pankreatiske øyer ble isolert ved hjelp av kollagenase fordøyelsen etterfulgt av rensing på tetthetsgradienter, som beskrevet tidligere 33. Isolerte småøyer ble dyrket over natten før transplantasjon. Mens dette ikke kan være nødvendig, er det anbefalt å la holmene å gjenopprette fra isolasjon prosedyren. Dette er avgjørende når transplantasjon utføres i diabetiker mottakere som det vil sikre transplantasjon for å overleve / robuste holmer.
Transplantasjon utføres under generalisert anestesi med oksygen / isofluran blanding (1,5 til 3%) inhalasjon til effekt. Alternative innånding eller injeksjon anestetika (f.eks ketamin) kan brukes. Hvis injeksjon bedøvelse blir brukt, hopper du over trinn 2.2 i protokollen. Gi en bedøvet dyret med en kilde for varme for å hindre nedkjøling under prosedyren. I noen mus, er det mulig å bryte blodkar når gjøre innsnitt i det typisk avaskulært cornea. For eksempel har en tendens hornhinnen nakne mus til å være vascularized, unngå vascularized områder når det er mulig. Bruk en ny sprøyte per snitt. Unngå punktering iris med nålen når du gjør snitt. Hindrer kontakt med iris kan videre sikres ved vender skråkantede side av nålespissen mot iris. Ikke tørk / aspirere kammervann etter at snittet. Det er lettere å trenge inn i kanylen gjennom snittet i en "våt" hornhinne; tilsett noen dråper av sterile PBS eller kultur mediet til hornhinnen hvis nødvendig.
Postoperativ analgesi kan fås ved å injisere subkutant buprenorfin (0,05-0,1 mg / kg) eller foretrukket analgetisk (e) for den første 48 timen. I trinn 2.9, administrere vi analgesi umiddelbart etter prosedyren som dyret er allerede dypt under narkose. Dersom det er ønskelig, kan imidlertid trinn 2,9 utføres etter trinn 2.2 i protokollen, med eller uten en aktuell bedøvelse i øyet (ta kontakt med din lokaleIACUC eller veterinær). Alternative oftalmiske antibiotika kan også anvendes.
Her har vi brukt en spesialbygd mikroinjeksjon apparat betjenes via en fot pedal for å drive 100 pl presisjon glassprøyte til å suge (belastning) og mate holmene ut av kanylen inn i ACE (figur 1). Dette kan være substituert med en hvilken som helst 100 ul gasstett presisjon glassprøyte med en skrue-drevet stempel som kan betjenes manuelt for å aspirere / mate holmene, dette imidlertid vil trolig kreve hjelp av en annen person for å operere. I begge tilfeller, selv om ikke nødvendig vi anbefale pre-lasting sammensatte sprøyten, produksjonsrør, og reservoaret med en steril oppløsning (saltvann, PBS eller kultur medier) for å sikre jevn aspirasjon og utstøting av holmene. Dette er spesielt viktig hvis / når de pakkede holmer tette kanylen.
Vi vanligvis utfører våre transplantasjon prosedyrer under rene forhold i en biosafety drosjeinet uten risiko for infeksjoner. Alle brukte løsninger, sprøyter, kanyle, slange, og gasbind autoklaveres eller gass-steriliseres. Mens vi kan ikke fastslå fullt sterilitet på grunn av håndkontakt med musen under prosedyren, har vi ikke hatt noen problemer med holme forurensning etter de ovenfor anbefalte tiltak.
Vi viste her hvordan å transplantere bukspyttkjertelen holmer i ACE for imaging formål der færre holmer er nødvendig å transplantere. I det tilfellet hvor diabetes reversering ønskes i mottakerens dyr, må en større mengde av holmer å bli transplantert 26, 27. Mens transplantasjon prosedyren er identisk med hva vi viste her, bør det rettes spesiell oppmerksomhet til trinn 2,6 og 2,7 i protokollen for å unngå tap av transplanterte holmene grunn reflux.
Når mestret kan denne transplantasjon prosedyre utføres i ~ 5 min per mus. Denne teknikken kan brukes til å transplantere en rekke tissues inn i den fremre kammer av øyet. Som nevnt ovenfor, har vi transplantert renale glomeruli samt embryonale vev (pankreatiske knopper) for å studere utviklingen bukspyttkjertelen i fremre kammer av øyet i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
PO.B. er en av grunnleggerne av den bioteknologiske selskapet Biocrine, som kommer til å bruke den fremre kammer av øyet som en kommersiell service plattform. AC er på patent beskytter denne teknologien.
Acknowledgments
Vi erkjenner Drs. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier og Daniel Nyqvist for fruktbare diskusjoner. Vi vil også takke Eleut Hernandez og Diego Espinosa-Heidmann for teknisk assistanse, og Mike Valdes og Margaret Formoso for hjelp med videoopptak. Byron Maldonado registrert, redigert og produsert den endelige videoen. Forskningsstøtte ble gitt av Diabetes Research Institute Foundation ( www.DiabetesResearch.org ), NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 til MHA, NIH RO3DK075487 til AC; U01DK089538 til PO.B.). Ytterligere forskning støtte til PO.B ble gitt gjennom midler fra Karolinska Institutet, det svenske Vetenskapsrådet, den svenske Diabetes Foundation, Family Erling-Persson Foundation, familien Knut og Alice Wallenberg Foundation, Skandia Insurance Company Ltd, VIBRANT ( FP7-228933-2), strategisk forskningsprogram i Diabetes ved Karolinska Institutet, Novo Nordisk Fonden, og Berth von Kantzow stiftelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
References
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
- Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O. Non-invasive in vivo imaging of pancreatic ?-cell function and survival - a perspective. Acta Physiol. (Oxf). , (2011).
- Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE Trans Biomed. Eng. 57 (10), 2576-2578 (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat. Methods. 7, 603-614 (2010).
- Aswathy, R. G., Yoshida, Y., Maekawa, T., Kumar, D. S. Near-infrared quantum dots for deep tissue imaging. Anal. Bioanal Chem. 397 (4), 1417-1435 (2010).
- Ghoroghchian, P. P., Therien, M. J., Hammer, D. A. In vivo fluorescence imaging: a personal perspective. Wiley Interdiscip Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 1 (2), 156-167 (2009).
- Prescher, A., Mory, C., Martin, M., Fiedler, M., Uhlmann, D. Effect of FTY720 treatment on postischemic pancreatic microhemodynamics. Transplant Proc. 42 (10), 3984-3985 (2010).
- Leblond, F., Davis, S., Valdés, P., Pogue, B. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. J. Photochem. Photobiol. B. 98 (1), 77-94 (2010).
- Toso, C., Vallee, J. P., Morel, P., Ris, F., Demuylder-Mischler, S., Lepetit-Coiffe, M., et al. Clinical magnetic resonance imaging of pancreatic islet grafts after iron nanoparticle labeling. Am. J. Transplant. 8 (3), 701-706 (2008).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J. Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
- Denk, W., Delaney, K. R., Gelperin, A., Kleinfeld, D., Strowbridge, B. W., Tank, D. W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J. Neurosci. Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Khorshidi, M. A., Vanherberghen, B., Kowalewski, J. M., Garrod, K. R., Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H., et al. Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro. Integr. Biol. (Camb). 3 (7), 770-778 (2011).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D., Parker, I. Immunoimaging: studying immune system dynamics using two-photon microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top99 (2011).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat. Med. , (2011).
- Fan, Z., Spencer, J., Lu, Y., Pitsillides, C., Singh, G., Kim, P., et al. In vivo tracking of 'color-coded' effector, natural and induced regulatory T cells in the allograft response. Nat. Med. 16 (6), 718-722 (2010).
- Sabek, O., Gaber, M. W., Wilson, C. M., Zawaski, J. A., Fraga, D. W., Gaber, O. Imaging of human islet vascularization using a dorsal window model. Transplant Proc. 42 (6), 2112-2114 (2010).
- Coppieters, K., Martinic, M. M., Kiosses, W. B., Amirian, N., von Herrath, M. A novel technique for the in vivo imaging of autoimmune diabetes development in the pancreas by two-photon microscopy. PLoS One. 5 (12), e15732 (2010).
- Martinic, M. M., von Herrath, M. G. Real-time imaging of the pancreas during development of diabetes. Immunol Rev. 221, 200-213 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678 (2008).
- Palmer, G. M., Fontanella, A. N., Shan, S., Hanna, G., Zhang, G., Fraser, C. L., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent. 6 (9), 1355-1366 (2011).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Taylor, M. The response of capillary endothelium to changes in intravascular pressure, as seen in the rabbit's ear chamber. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 31 (5), 533-543 (1953).
- Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvasc. Res. 65 (2), 109-117 (2003).
- Speier, S., Nyqvist, D., Cabrera, O., Yu, J., Molano, R. D., Pileggi, A., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat. Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Speier, S., Nyqvist, D., Kohler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nat. Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Falck, B. Site of production of oestrogen in the ovary of the rat. Nature. 184, Suppl 14. 1082 (1959).
- Bickford-Wimer, P., Granholm, A. C., Bygdeman, M., Hoffer, B., Olson, L., Seiger, A., et al. Human fetal cerebellar and cortical tissue transplanted to the anterior eye chamber of athymic rats: electrophysiological and structural studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (16), 5957-5961 (1987).
- Adeghate, E., Donath, T. Morphological findings in long-term pancreatic tissue transplants in the anterior eye chamber of rats. Pancreas. 5 (3), 298-305 (1990).
- Abdulreda, M. H., Faleo, G., Molano, R. D., Lopez-Cabezas, M., Molina, J., Tan, Y., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).
- Unutmaz, D., Xiang, W., Sunshine, M. J., Campbell, J., Butcher, E., Littman, D. R. The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its expression pattern is conserved between human and mouse. J. Immunol. 165 (6), 3284-3292 (2000).
- Pileggi, A., Molano, R. D., Berney, T., Cattan, P., Vizzardelli, C., Oliver, R., et al. Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation. Diabetes. 50 (9), 1983-1991 (2001).
