Summary
Un nuevo enfoque de la combinación de trasplante intraocular y microscopía confocal permite longitudinal, no invasiva imágenes en tiempo real con una sola célula de resolución dentro de los tejidos injertados
Abstract
Intravital de imágenes se ha convertido en una herramienta indispensable en la investigación biológica. En el proceso, muchas técnicas de imagen se han desarrollado para estudiar los diferentes procesos biológicos en los animales no invasiva. Sin embargo, una limitación técnica importante en existentes modalidades de imagen intravital es la incapacidad para combinar la no-invasivo, formación de imágenes longitudinal con capacidades de resolución de una sola célula. Se muestra aquí cómo el trasplante a la cámara anterior del ojo elude esta limitación significativa que ofrece una plataforma versátil experimental que permite no invasiva, la imagen longitudinal con resolución celular in vivo. Se demuestra el procedimiento de trasplante en el ratón y proporcionar resultados representativos usando un modelo con relevancia clínica, es decir, trasplante de islotes pancreáticos. Además de permitir la visualización directa en una variedad de tejidos trasplantados en la cámara anterior del ojo, este enfoque proporciona una plataforma para Screen mediante la realización de las drogas a largo plazo de seguimiento y monitoreo en los tejidos diana. Debido a su versatilidad, el tejido / trasplante de células en la cámara anterior del ojo no sólo terapias de trasplante beneficios, se extiende a otras aplicaciones in vivo para estudiar los procesos fisiológicos y fisiopatológicos tales como la transducción de señales y el cáncer o desarrollo de la enfermedad autoinmune.
Introduction
Los avances en microscopía intravital han revelado fenómenos fisiológicos no predichas por los estudios in vitro 1. Esto pone de relieve el desafío en la traducción de los resultados obtenidos por los métodos in vitro convencional en el animal vivo. En la última década, la visualización de los tejidos en los animales vivos se mejoró considerablemente por los avances tecnológicos en las modalidades de imagen 2, 3, 4, 5, 6. Esto ha estimulado la necesidad de enfoques en formación de imágenes in vivo con aplicación factible en modelos animales experimentales para permitir la visualización longitudinal de los tejidos diana de manera no invasiva.
Las técnicas de imagen como la resonancia magnética y la tomografía por emisión de positrones o bioluminiscencia han permitido que la imagen no invasiva de órganos / tejidos profundos dentro del cuerpo 7-8, 9. Pero estas técnicas no pueden lograr células únicas resolución debido a señales de fondo elevadas y baja resolución espacial, a pesar del uso of materiales de alto contraste o 4 tejidos específicos de luminiscencia. Esto fue tratada con la llegada de dos fotones microscopía de fluorescencia confocal 10. Dos fotones microscopía intravital permitió estudios de formación de imágenes para visualizar y cuantificar acontecimientos celulares con detalles sin precedentes 11, 12. Esto ha llevado a la caracterización de procesos biológicos esenciales en la salud y la enfermedad 13, 14, 15, 16. Mientras pioneros estudios de imagen han intravital principalmente "imitado" en condiciones in vivo en los tejidos extirpados (ganglios linfáticos, por ejemplo), otros estudios han utilizado métodos invasivos para los tejidos diana de imagen expuestos in situ 17, 18, 19, 20, 21. Otros estudios también han utilizado modelos de cámara "ventana" para eludir las limitaciones asociadas con los métodos invasivos y resolución de imágenes limitado en vivo 22, 23, 24, 25. En el modelo de cámara de ventana, una cámara con una ventana transparente se implanta quirúrgicamente en la piel en difeubicaciones de alquiler (piel dorsal o el oído, almohadilla de grasa mamaria, hígado, etc) sobre el animal (por ejemplo, ratón, rata, conejo). Si bien este enfoque claramente permite una alta resolución de imágenes in vivo, se requiere una cirugía invasiva para implantar la cámara y no puede ser capaz de acomodar los estudios longitudinales de imagen durante varias semanas o meses 22.
Se ha demostrado recientemente que la combinación de alta resolución de la microscopía confocal con un procedimiento mínimamente invasivo, es decir, el trasplante a la cámara anterior del ojo (ACE) proporciona una "ventana cuerpo natural" como un. Potente y versátil en vivo plataforma de imágenes 26, 27 El trasplante en el ACE se ha utilizado en las últimas décadas para estudiar aspectos biológicos de una variedad de tejidos 28, 29, 30, y su combinación reciente con imágenes de alta resolución permitió el estudio de la fisiología de los islotes pancreáticos con células únicas resolución no invasiva y longitudinalmente <sup> 26, 27. Este enfoque se utilizó para estudiar las respuestas autoinmunes durante el desarrollo de la diabetes tipo 1 en modelos animales (datos no publicados). También fue utilizado para estudiar el desarrollo de páncreas, así como, en los estudios de la función renal mediante el trasplante en las yemas de páncreas ECA o individuales glomérulos renales, respectivamente (datos no publicados). Un reciente informe utilizando este enfoque demostró además su solicitud para estudiar la respuesta inmune después de trasplante de islotes pancreáticos 31. Es importante destacar que, este estudio demostró que el trasplante a la cámara anterior del ojo proporciona una ventana natural del cuerpo para llevar a cabo: (1) longitudinal, la imagen no invasiva de tejidos trasplantados in vivo, (2) in vivo cytolabeling para evaluar el fenotipo celular y la viabilidad en situ, (3) seguimiento en tiempo real de la infiltración de células inmunes en el tejido diana, y (4) la intervención local por aplicación tópica o inyección intraocular.
En este sentido, demonstrate cómo realizar el trasplante en la cámara anterior del ojo utilizando islotes pancreáticos.
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Protocol
El siguiente procedimiento se realiza bajo el estereoscopio en 2 pasos, el primer paso consiste en cargar los islotes en la cánula y el segundo paso es el trasplante real en la ACE. Todos los procedimientos realizados con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Miami.
1. Islotes de carga en Cánula para trasplante
- Centro de los islotes en placa de cultivo al girar el plato en los círculos de estrechamiento.
- Desconectar la cánula de la "reserva" y colocar la cánula y el tubo de conexión sobre una superficie limpia. El depósito puede ser hecho de una punta desechable 300 l pipeta de plástico sin filtro (Figura 1a).
- Lavar las burbujas de aire fuera del depósito para asegurar flujo continuo de islotes cuando aspiración en el depósito. Enjuagar el depósito se hace por impulsar el manos libres motorizado jeringa controlador utilizando el pedal(Figura 1b, c). Esto también hará que el espacio en la jeringa para permitir la aspiración de los islotes en el depósito (pre-cargado con una solución estéril, tal como medios de solución salina, PBS o cultivo).
- Aspirar suavemente cantidad deseada de islotes en el depósito. Islotes tenderá a girar al entrar en el depósito y se mantendrá juntos hacia la parte inferior. La aspiración se realiza por conducción hacia atrás la jeringa motorizada-conductor utilizando el pedal de pie.
- Vuelva a conectar la cánula al depósito a través de la tubería de conexión.
- Colocar la punta de la cánula de nuevo en la placa de cultivo y lavar los islotes fuera del depósito en el tubo a continuación, en la cánula. Asegúrese de que los islotes permanecer juntos como hace una copia de llenar el tubo / cánula con cuidado "parpadeo" (pulsar) del tubo (Figura 1d). Detener ya sea antes o después de que todas las burbujas de aire por delante de los islotes son expulsadas de la cánula. Si no está seguro, deje de islotes como entrar en la parte posterior de la cánula como el aire restanteburbujas antes de islotes puede ayudar a prevenir el reflujo (regurgitación) de los islotes de la ACE. Se disipará durante la noche.
- En este punto, usted está listo para inyectar los islotes en el ACE (por favor, consulte los pasos siguientes).
2. El trasplante de islotes en la cámara anterior del ojo
- Coloque el ratón anestesiado sobre una almohadilla caliente bajo estereoscopio.
- Coloque el hocico del ratón en anestesia "máscara" conectado a oxígeno / máquina de anestesia con isoflurano. La máscara está hecha de un plástico desechable de 1 ml punta de la pipeta (sin filtro) y conectado a un tubo de anestesia a través del extremo estrecho (figura 2a, b).
- Retraer suavemente los párpados del ojo para ser trasplantados con el dedo índice y el pulgar de la mano libre y el "pop" el ojo para una mejor exposición y de fácil acceso (Figura 2c). Esto requerirá un poco de práctica para perfeccionar sin impedir la respiración del ratón por la presión excesiva en elcuello o bloqueando el flujo de sangre a la cabeza.
- Usando una jeringuilla de insulina desechable (29 - 31 g) como bisturí, cuidadosamente penetrar sólo la punta en la córnea y hacer una incisión lateral única. Hacer la incisión en el punto medio entre el vértice de la córnea y el limbo para minimizar el reflujo de los islotes durante la inyección de la ACE (Figura 2d).
- Cuidadosamente inserte la cánula (precargado con islotes) a través de la incisión.
- Lentamente expulsar islotes fuera de la cánula y los depositan en la parte superior del iris. Para evitar el reflujo islote debido a la acumulación de presión excesiva en la ACE, expulsar los islotes en impulsos breves en tan pequeño volumen (s) como sea posible en el cuadrante opuesto a la incisión. Esto puede ser aún más asegurada mediante la compactación de islotes en el tubo durante la carga de la cánula (por favor, véase el paso 1,6).
- Poco a poco retraer la cánula de la ACE. Este es un paso crítico, especialmente, si un gran volumen de islotes se inyectó como reflujo islote debido a la presenciaque se acumulan dentro de la ACE puede ser inevitable. Para eliminar / minimizar el reflujo islote, gire suavemente la cánula mientras que dentro de la ACE para liberar el exceso de presión a través de la incisión alrededor de la cánula. Busque signos de reflujo en tu intento de retirar la cánula y, si es necesario, espere hasta que desaparezca la presión antes de retraer completamente la cánula de la ACE.
- Enjuagar el ojo trasplantado con PBS estéril o solución salina.
- Inyectar buprenorfina para la analgesia postoperatoria (0.05 a 0.1 mg / kg, por vía subcutánea) para el primero 48 hr.
- Aplique un ungüento antibiótico eritromicina oftálmica al ojo trasplantado inmediatamente después del trasplante.
- Coloque de nuevo el animal en una jaula caliente para permitir la recuperación de la anestesia.
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Representative Results
Hay algunos parámetros que definen una "buena" trasplante. Un trasplante de buena es la que procede sin sangrado cuando se hace la incisión como se puede ver en el vídeo. El sangrado se impide / minimiza al penetrar sólo la punta del escalpelo (aguja) en la ACE (Figura 3a). Esto también ayudará a evitar el contacto y la punción del iris. También se asegurará de una pequeña incisión que se curan muy bien sin causar opacidad de la córnea con el tiempo (Figura 3c, d). Otro aspecto importante para un trasplante con éxito es ser capaz de trasplantar la cantidad total deseada de islotes sin pérdida debido a cabo de reflujo de la ACE. Como se menciona en el paso protocolo 1,6, esto puede ser minimizado por eyección de los islotes en el volumen mínimo posible y, cuando sea aplicable, mediante el uso de burbujas de aire para ayudar a sellar la incisión después de la retracción final de la cánula de la ACE (Figura 3b). Además, la entrega de la i slets en la parte superior del iris entre el borde de la pupila y el limbo las posiciones de los islotes en un lugar muy favorable para la formación de imágenes in vivo (Figura 3d). Desde la perspectiva práctica, teniendo los islotes en esta posición intermedia de la iris reduce el espesor de las imágenes z-pilas necesarias para abarcar islotes completos (Figura 4). Esto es particularmente importante durante la fluorescencia confocal / de dos fotones de imágenes in vivo, donde un menor z-pila permite una mejor recuperación de determinadas señales de fluorescencia en secciones más profundas del tejido con imágenes de mejor xy y resoluciones z debido a la dispersión menos luz por el tejido. Por otra parte, más gruesa z-pilas requerir mayor tiempo de adquisición que aumenta la probabilidad de deriva instrumental o animal, especialmente durante la formación de imágenes in vivo.
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Figura 1. Las fotografías de nuestro aparato de trasplante, incluyendo todas las piezas. (A) Reunidos jeringa de vidrio con tubo, depósito, y la cánula. (B) Los vehículos motorizados jeringa jeringa con conductor montado. (C) de doble pedal para hacer funcionar el controlador de jeringa motorizada. Pulsando cualquiera de los pedales impulsa hacia atrás el émbolo de la jeringa (aspiración) o hacia adelante (de eyección). (D) Primer plano de la cánula y el tubo de conexión que muestra los islotes envasados en la parte posterior de la cánula. Esta configuración permite la entrega de los islotes en la cámara anterior del ojo en un volumen mínimo para reducir el reflujo y la pérdida de los islotes.
Figura 2. Representación de la transplantatisobre el procedimiento en la cámara anterior del ojo (ACE). (a) Fotografía de la máscara de la anestesia ratón. (b) Primer plano de la máscara de la anestesia hecha de una punta desechable de 1 ml pipeta de plástico sin filtro. Se hicieron varios agujeros en la punta para permitir la mezcla de oxígeno con isoflurano antes de alcanzar el ratón. (C) la vista de cerca que muestra el ojo a ser trasplantado expuesto para un mejor acceso. El ojo se expone a cabo por el estiramiento de la piel de la cabeza usando el pulgar y el dedo índice. (D) Representación esquemática del procedimiento de trasplante destacando la localización de la incisión en el punto medio entre el vértice de la córnea y el limbo. La cánula se inserta a través de la incisión para entregar los islotes en la ACE. Los islotes se depositan en la parte superior del iris donde se injertan.
Figura 3. Imágenes representativas de "bueno" trasplante destacando pasos críticos para asegurar resultados exitosos. (A) de la serie de imágenes que muestran cómo lejos de la punta del escalpelo (aguja) se introduce en la córnea mientras que hacer la incisión. Una pequeña incisión sin sangrado. La incisión es ligeramente mayor que la cánula. (B) la serie de imágenes que muestran islotes de ser expulsadas fuera de la cánula en la parte superior del iris durante el uso de burbujas de aire para evitar el reflujo. Note como "doblado" la cánula aparece debido a la luz de refracción una vez dentro de la ACE. (C) Imagen representativa de un ojo trasplantado destacando la claridad de la ACE inmediatamente después del trasplante. (D) la serie de imágenes del ojo mismo adquirido en el especificado post-operatorio días (POD) destacando la localización preferida de los islotes in vivo para imaging y lo bien curado y localizada es la incisión y la claridad de la córnea a las 6 semanas después del trasplante.
Figura 4. La imagen confocal de fluorescencia de un islote pancreático trasplantadas en la cámara anterior del ojo del ratón (ACE) que destaca los beneficios de la posición de los islotes en el iris y la capacidad de resolver células individuales durante la formación de imágenes in vivo (a) de proyección máxima (2. - D vista) de un z-pila de un islote (se indica con línea de puntos) en la parte superior del iris de un ratón C57BL / 6 transgénico que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) en activado y células T de memoria 32. La imagen fue obtenida 5 días después del trasplante donde unos pocos células T infiltrantes (verde) se detectaron en el iris que rodea el islote. El islote y el iris se visualizaron por retrodispersión láser o reflection (gris). (b) vistas tridimensionales (3-D) de la misma islote destacando los beneficios del ángulo de proyección de imagen de visualización / para reducir el espesor z-pila para adquirir el volumen islote conjunto y la estructura circundante y células inmunes. Observe los ejes XYZ para la rotación de la imagen.
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Discussion
Islotes pancreáticos de murino fueron aisladas utilizando digestión con colagenasa seguido por purificación en gradientes de densidad, como se ha descrito previamente 33. Islotes aislados se cultivaron durante la noche antes del trasplante. Si bien esto puede no ser necesario, se recomienda para permitir que los islotes de recuperarse del procedimiento de aislamiento. Esto es crítico cuando se realiza el trasplante en los receptores diabéticos, ya que garantizará el trasplante de islotes sobrevivientes / robustas.
El trasplante se realiza bajo anestesia generalizada con oxígeno / mezcla de isoflurano (1.5-3%) inhalación a efecto. Anestésicos alternativos inhalación o inyección (por ejemplo, ketamina) se puede utilizar. Si se utiliza anestesia por inyección, omita el paso 2.2 en el protocolo. Proporcionar el animal anestesiado con una fuente de calor para prevenir la hipotermia durante el procedimiento. En algunos ratones, es posible romper los vasos sanguíneos cuando se hace la incisión en la co normalmente avascularrnea. Por ejemplo, la córnea de los ratones desnudos tiende a ser vascularizado; evitar áreas vascularizados cuando sea posible. Use una jeringa nueva por incisión. Evitar la perforación del iris con la aguja al hacer la incisión. Prevenir el contacto con el iris puede ser garantizada por más orientada hacia el lado biselado de la punta de la aguja hacia el iris. No secar / aspirar humor acuoso después de hacer la incisión. Es más fácil de penetrar en la cánula a través de la incisión en un "mojado" córnea; añadir unas gotas de medios de PBS estéril o cultura a la córnea si es necesario.
Analgesia post-operativa se puede conseguir mediante la inyección subcutánea buprenorfina (0.05-0.1 mg / kg) o analgésico preferido (s) para la primera 48 hr. En el paso 2,9, administramos analgesia inmediatamente después del procedimiento como el animal es ya muy bajo anestesia general. Si lo desea, sin embargo, el paso 2.9 se puede realizar después de la etapa 2.2 en el protocolo, con o sin anestesia tópica en el ojo (consulte con su distribuidor localIACUC o veterinario). Antibióticos alternativos oftálmicas también se puede utilizar.
Aquí, se utilizó un aparato de microinyección hecha a la medida operado a través de un pedal de pie para conducir la jeringa 100 l de vidrio de precisión para aspirar (carga) y expulsar los islotes fuera de la cánula en la ACE (Figura 1). Esto puede estar sustituido con cualquier 100 l hermética al gas jeringa de vidrio de precisión con un émbolo de tornillo accionado que puede ser operado manualmente para aspirar / expulsar los islotes; esto sin embargo es probable que requiera la asistencia de otra persona para operar. En cualquier caso, aunque no se requiere recomendamos pre-cargar la jeringa ensamblada, la tubería, y el depósito con una solución estéril (solución salina, PBS o medio de cultivo) para asegurar la aspiración suave y de eyección de los islotes. Esto es particularmente importante si / cuando los islotes envasados obstruir la cánula.
Por lo general realizamos nuestros procedimientos de trasplante en condiciones de limpieza dentro de una cabina de seguridad biológicainet sin riesgo de infecciones. Todas las soluciones, jeringas, cánulas, tubos y gasas se esterilizan en autoclave o esterilizados gas. Si bien, no podemos determinar la esterilidad completa a causa de contacto de la mano con el ratón durante el procedimiento, no hemos tenido ningún problema con la contaminación islote siguiendo los pasos anteriormente recomendadas.
Hemos demostrado aquí cómo trasplantar islotes pancreáticos en el ACE para fines de imagen islotes donde menos se necesitan para trasplantar. En el caso en que se desee inversión de la diabetes en el animal receptor, una mayor cantidad de islotes necesita ser trasplantado 26, 27. Aunque el procedimiento de trasplante es idéntico a lo que mostramos aquí, se debe prestar especial atención a los pasos 2,6 y 2,7 en el protocolo para evitar la pérdida de los islotes trasplantados debido al reflujo.
Una vez dominado, este procedimiento de trasplante se puede realizar en ~ 5 min por ratón. Esta técnica se puede utilizar para trasplantar una variedad de tissues en la cámara anterior del ojo. Como se ha mencionado anteriormente, se han trasplantado glomérulos renales así como el tejido embrionario (yemas de páncreas) para estudiar el desarrollo de páncreas en la cámara anterior del ojo in vivo.
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Disclosures
PO.B. Es uno de los fundadores de la empresa de biotecnología BioCrine, que se va a utilizar la cámara anterior del ojo como una plataforma de servicio comercial. AC se encuentra en la patente que protege esta tecnología.
Acknowledgments
Reconocemos los Dres. Camillo Ricordi, Pileggi Antonello, R. Damaris Molano, Speier Esteban y Daniel Nyqvist para un debate fructífero. También damos las gracias Eleut Diego Hernández y Espinosa-Heidmann de asistencia técnica, y Mike Valdes y Formoso Margaret ayuda con grabación de video. Byron Maldonado grabado, editado y producido el vídeo final. Apoyo a la investigación fue proporcionada por el Instituto de Investigación de Diabetes Foundation ( www.DiabetesResearch.org ), el NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 a MHA, NIH RO3DK075487 a AC; U01DK089538 a PO.B.). Apoyo a la investigación adicional para PO.B se proporciona a través de los fondos del Instituto Karolinska, el sueco Consejo de Investigación, la Fundación para la Diabetes sueca, la Fundación de la Familia Erling Persson-, la Familia Knut y Alice Wallenberg Foundation, el Skandia Insurance Company Ltd., vibrante ( FP7-228933-2), Programa Estratégico de Investigación en Diabetes en el Karolinska Inst.itutet, la Fundación Novo Nordisk, y la Fundación de amarre von Kantzow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
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