Summary
Uma nova abordagem combinando transplantação intra-ocular e microscopia confocal permite longitudinal, não-invasivo de imagem em tempo real, com uma única célula de resolução dentro dos tecidos enxertados
Abstract
Intravital imagem surgiu como uma ferramenta indispensável na pesquisa biológica. No processo, muitas técnicas de imagiologia têm sido desenvolvidos para estudar diferentes processos biológicos em animais não-invasiva. No entanto, uma das principais limitações na técnica existentes modalidades de imagens intravital é a incapacidade de combinar não-invasivos de imagem, com as capacidades longitudinal de uma única célula de resolução. Mostramos aqui como o transplante para a câmara anterior do olho contorna limitação significativa tal que oferece uma plataforma versátil experimental que permite a não-invasivos de imagem, com a resolução longitudinal celular in vivo. Demonstramos o procedimento de transplante em ratinhos e proporcionam resultados representativos utilizando um modelo com relevância clínica, nomeadamente o transplante de ilhéus pancreáticos. Além de permitir a visualização directa de uma variedade de tecidos transplantados para a câmara anterior do olho, esta abordagem fornece uma plataforma para Screedrogas n realizando acompanhamento a longo prazo eo acompanhamento em tecidos-alvo. Devido à sua versatilidade o transplante, o tecido / célula para dentro da câmara anterior do olho, não só as terapias de transplante benefícios, estende-se a outras aplicações in vivo para o estudo de processos fisiológicos e patológicos tais como o cancro e a transdução do sinal ou o desenvolvimento da doença auto-imune.
Introduction
Os avanços na microscopia intravital revelaram fenómenos fisiológicos não preditos por estudos in vitro 1. Isto realça o desafio na tradução resultados obtidos por métodos in vitro convencional para o animal vivo. Na última década, a visualização de tecidos em animais vivos foi consideravelmente melhorada por avanços tecnológicos em modalidades de imagem 2, 3, 4, 5, 6. Isto estimulou a necessidade de abordagens de imagiologia in vivo, com aplicação possível em modelos animais experimentais, para permitir a visualização de tecidos-alvo longitudinal de forma não invasiva.
Técnicas de imagem, como ressonância magnética e tomografia por emissão de pósitrons ou bioluminescência permitiram não-invasivas de órgãos / tecidos profundos dentro do corpo 7-8, 9. Mas estas técnicas não podem atingir única célula de resolução devido aos sinais de fundo elevados e de resolução espacial baixa, a despeito do uso of materiais de elevado contraste ou tecido específico 4 luminescência. Esta foi tratada com o advento de dois fotões microscopia de fluorescência confocal 10. Dois fótons de microscopia intravital habilitado estudos de imagem para visualizar e quantificar eventos celulares com detalhes sem precedentes 11, 12. Isto conduziu à caracterização dos principais processos biológicos na saúde e na doença de 13, 14, 15, 16. Embora os estudos de imagem pioneiras intravital têm essencialmente "imitada" em condições in vivo em tecido excisado (por exemplo, nódulos linfáticos), outros estudos usaram abordagens invasivas em tecidos-alvo de imagem expostos in situ 17, 18, 19, 20, 21. Outros estudos também têm utilizado "modelos de janelas de câmara" para contornar limitações associadas a abordagens invasivas e resolução de imagem limitada in vivo 22, 23, 24, 25. No modelo de câmara de janela, uma câmara com uma janela transparente é implantado cirurgicamente na pele em difelocais de rendas (pele dorsal ou na orelha, almofada de gordura mamaria, no fígado, etc) no animal (por exemplo, rato, rato, coelho). Enquanto esta abordagem é claramente facilitador de alta resolução em imagiologia in vivo, requer uma cirurgia invasiva para implante da câmara e pode não ser capaz de acomodar os estudos de imagem longitudinais ao longo de semanas ou meses 22.
Recentemente, foi demonstrado que a combinação de alta resolução de microscopia confocal com um procedimento minimamente invasivo, isto é, o transplante para a câmara anterior do olho (ACE) fornece uma "janela de corpo natural", como um. Poderosa e versátil in vivo plataforma de imagem 26, 27 O transplante para o ACE tem sido utilizado nas últimas décadas para estudar aspectos biológicos de uma variedade de tecidos 28, 29, 30, e sua combinação recente com alta resolução de imagem permitiu o estudo da fisiologia das ilhotas pancreáticas, com uma única célula de resolução não- invasiva e longitudinalmente <sup> 26, 27. Esta abordagem foi utilizada para estudar as respostas auto-imunes, durante o desenvolvimento de diabetes do tipo 1 em modelos animais (dados não publicados). Também foi usado para estudar o desenvolvimento do pâncreas, bem como, em estudos de função renal através do transplante de pâncreas em papilas ECA ou individuais nos glomérulos renais, respectivamente (dados não publicados). Um relatório recente usando essa abordagem demonstrou ainda a sua aplicação para estudar as respostas imunes após transplante de ilhotas de pâncreas 31. Importante, este estudo mostrou que o transplante para a câmara anterior do olho fornece uma janela natural do corpo para realizar: (1) longitudinal, de imagem não invasiva de tecidos transplantados in vivo, (2) in vivo cytolabeling para avaliar o fenótipo celular e da viabilidade em situ, (3) acompanhamento em tempo real do infiltrado de células imunitárias no tecido alvo, e (4) a intervenção local por aplicação tópica ou por injecção intraocular.
Aqui, nós demonstrate como realizar o transplante para a câmara anterior do olho utilizando ilhotas pancreáticas.
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Protocol
O procedimento seguinte é realizado sob a estereoscópio em 2 passos, o primeiro passo envolve o carregamento das ilhotas para dentro da cânula e a segunda etapa é o transplante de real no ACE. Todos os procedimentos realizados em animais foram aprovados pelo cuidado com os animais institucional e comissão de uso (IACUC), da Universidade de Miami.
1. Ilhotas de carga em cânula para Transplante
- Centro das ilhotas no prato de cultura girando o prato em círculos mais estreitos.
- Desligar a cânula da "reservatório" e colocar a cânula eo tubo de ligação sobre uma superfície limpa. O reservatório pode ser feito de uma ponta de pipeta de plástico descartável 300 ul sem filtro (Figura 1a).
- Lave as bolhas de ar para fora do reservatório para assegurar fluxo contínuo de ilhotas quando a aspiração no reservatório. A lavagem do reservatório é feito por impulsionar o mãos-livres motorizada seringa motorista usando o pedal(Figura 1b, c). Isto também irá criar espaço dentro da seringa para permitir que a aspiração das ilhotas para o reservatório (pré-carregado com uma solução estéril tal como a media salina, PBS ou cultura).
- Aspirar cuidadosamente quantidade desejada de ilhotas para o reservatório. Ilhotas tenderá a rodar à medida que entram no reservatório e permanecerá em conjunto em direcção ao fundo. A aspiração é feita por condução motorizada para trás a seringa motorista usando o pedal.
- Reconecte a cânula para o reservatório através da tubagem de ligação.
- Colocar a ponta da cânula para trás na placa de cultura e lavar as ilhotas para fora do reservatório para dentro do tubo, em seguida, para dentro da cânula. Certifique-se de que as ilhotas permanecer juntos como de volta a encher o tubo / cânula suavemente "sacudir" (derivação) do tubo (Figura 1d). Parar, antes ou depois de todas as bolhas de ar antes de as ilhotas são lavadas para fora da cânula. Se não for claro, parar como ilhotas entrar na parte de trás da cânula enquanto o ar restantebolhas antes de ilhotas pode ajudar a prevenir o refluxo (retorno) de ilhotas fora da ACE. Dissipará durante a noite.
- Nesta fase, você está pronto para injetar as ilhotas na ACE (por favor, consulte os passos seguintes).
2. Islet Transplantation dentro da câmara anterior do olho
- Posicione o mouse anestesiados em uma almofada quente sob estereoscópio.
- Coloque o focinho do mouse em "máscara" anestesia ligado ao oxigênio / máquina de anestesia isoflurano. A máscara é feita de uma ponta de plástico descartável 1 ml pipeta (sem filtro), e ligada ao tubo da anestesia através da parte mais estreita (Figura 2a, b).
- Gentilmente retrair as pálpebras do olho a ser transplantado utilizando o dedo indicador eo polegar de sua mão livre e "pop" do olho para fora para melhor exposição e fácil acesso (Figura 2c). Isso vai exigir um pouco de prática para aperfeiçoar sem impedindo a respiração do mouse por uma pressão excessiva sobre opescoço ou bloqueando o fluxo de sangue para a cabeça.
- Utilizando uma seringa descartável de insulina (29 - 31G) como bisturi, com cuidado apenas a ponta penetrar na córnea e fazer uma única incisão lateral. Fazer a incisão no ponto médio entre o vértice da córnea e limbo para minimizar o refluxo dos ilhéus durante a injecção para fora do ACE (figura 2d).
- Cuidadosamente inserir a cânula (pré-carregado com ilhotas) através da incisão.
- Lentamente ejectar ilhotas para fora da cânula e depositá-los sobre a íris. Para evitar o refluxo de ilhotas devido à acumulação de pressão excessiva no ACE, ejectar as ilhotas de impulsos breves como pequeno volume (s) possível no quadrante oposto ao da incisão. Isto pode ser ainda assegurada por compactação ilhotas na tubagem durante o carregamento da cânula (por favor ver passo 1.6).
- Lentamente retrair a cânula para fora da ACE. Este é um passo crítico, especialmente, se um grande volume de ilhotas foi injectado como refluxo islet devido à presse construir dentro da ACE pode ser inevitável. Para eliminar / minimizar refluxo ilhota, gire gentilmente a cânula enquanto dentro da ACE para liberar o excesso de pressão através da incisão ao redor da cânula. Verifique se há sinais de refluxo como você tentar retirar a cânula e, se necessário, aguarde até que desapareça completamente a pressão antes de retração da cânula para fora da ACE.
- Lavar o olho transplantado com PBS estéril ou soro fisiológico.
- Injectar buprenorfina para analgesia pós-operatória (0,05-0,1 mg / kg, por via subcutânea) a 48 h em primeiro lugar.
- Aplicar pomada oftálmica antibiótico eritromicina ao olho transplantado imediatamente após o transplante.
- Colocar o animal numa gaiola de volta aquecido para permitir a recuperação da anestesia.
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Representative Results
Existem alguns parâmetros que definem um transplante "bom". Um transplante é um bom que prossegue sem hemorragia ao fazer a incisão, como pode ser visto no vídeo. Sangramento é impedido / minimizada por penetrar apenas a ponta do bisturi (agulha) para dentro do ACE (figura 3a). Isso também irá ajudar a evitar o contato e punção da íris. Ele também irá garantir uma pequena incisão que vai curar muito bem sem causar nebulosidade da córnea ao longo do tempo (Figura 3c, d). Outro aspecto importante para um transplante bem sucedido é o de ser capaz de transplantar a quantidade total desejada de ilhotas sem perda devido a falta de refluxo da ACE. Tal como mencionado no passo protocolo 1.6, isto pode ser minimizado por ejecção dos ilhéus no volume mínimo possível e, quando aplicável, usando as bolhas de ar para ajudar a selar a incisão mediante retracção final da cânula para fora do ACE (figura 3b). Além disso, a entrega do i slets na parte superior do diafragma entre a borda da pupila e o limbo posiciona as ilhotas numa localização muito favorável para imagem in vivo (Figura 3d). Do ponto de vista prático, tendo as ilhotas nesta posição intermédia do diafragma reduz a espessura das pilhas de imagem z necessários para abranger ilhotas inteiros (Figura 4). Isto é particularmente importante durante a fluorescência confocal / two-photon imagem in vivo em que um menor z-stack permite uma melhor recuperação de sinais específicos de fluorescência em secções mais profundas do tecido com imagens com melhor xy e resoluções z devido à menor quantidade de luz de dispersão pelo tecido. Além disso, mais espessa z pilhas requerem mais tempo de aquisição, que aumenta a probabilidade de desvio instrumental ou animal, especialmente durante a imagem in vivo.
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Figura 1. Fotografias de nosso aparelho transplante incluindo todas as partes. (A) montado seringa de vidro com tubos, reservatório, e cânula. (B) Motorizado seringa condutor, com seringa montada. (C) pedal duplo para operar o controlador de seringa motorizado. Pressionando o pedal acciona o êmbolo da seringa para trás (aspiração), ou para a frente (de ejecção). (D) fechar-se da cânula e tubagem de ligação que mostra as ilhotas embalados na parte de trás da cânula. Esta configuração permite a entrega dos ilhéus para dentro da câmara anterior do olho de um volume mínimo para reduzir o refluxo e perda de ilhotas.
Figura 2. Representação da transplantatisobre o procedimento para a câmara anterior do olho (ACE). (a) Fotografia da máscara de anestesia do mouse. (b) vista Close-up da máscara de anestesia feita de uma ponteira descartável de plástico ml sem filtro. Foram feitos vários furos na ponta para permitir a mistura de oxigénio com isoflurano antes de atingir o rato. (C) Close-se ver que mostra o olho a ser transplantada para um melhor acesso exposta. O olho é exposto por esticar a pele da cabeça com o polegar eo dedo indicador. (D) Representação esquemática do procedimento de transplante de destacar o local da incisão no ponto médio entre o vértice da córnea e do limbo. A cânula é inserida através da incisão para entregar as ilhotas para o ACE. Ilhotas são depositados por cima da íris onde enxertar.
Figura 3. Imagens representativas de transplante "bom" destacando etapas críticas no sentido de garantir resultados de sucesso. (A) da série de imagens que mostram a distância da ponta do bisturi (agulha) é empurrado para dentro da córnea enquanto faz a incisão. Uma pequena incisão é feita sem sangramento. A incisão é ligeiramente maior do que a cânula. (B) da série de imagens que mostram ilhotas ser ejectados para fora da cânula no topo da íris durante a utilização de bolhas de ar para evitar o refluxo. Observe como "dobrado" da cânula aparece devido à luz refração uma vez dentro da ACE. (C) Imagem representativa de um olho transplantado destacando a clareza da ACE, imediatamente após o transplante. Series (d) de imagens do mesmo olho adquirida no especificado pós-operatório (DPO), destacando o local preferido de ilhotas no vivo imaging e como bem curado e a incisão é localizada e a claridade da córnea menos 6 semanas após o transplante.
Figura 4. Imagem de fluorescência confocal representante de um ilhéu de pâncreas transplantado na câmara anterior do olho de rato (ACE) destacando os benefícios da posição ilhota na íris e a capacidade de resolver as células individuais durante a imagiologia in vivo (a) máxima de projeção (2. - D-la) de um z-pilha de uma ilhota (delineado a tracejado), na parte superior da íris de um ratinho C57BL / 6 transgénica que expressa a proteína fluorescente verde (GFP) em activadas e células T de memória 32. A imagem foi obtida de 5 dias após o transplante, onde alguns infiltração de células T (verde) foram detectados na íris em torno do ilhéu. A ilhota e íris foram visualizados por retroespalhamento laser ou reflection (cinzento). (b) vistas tridimensionais (3-D) do ilhéu mesmo realçar os benefícios do ângulo de visualização de imagem / reduzir a espessura z-stack para adquirir o volume das ilhotas e toda a estrutura circundante e células do sistema imune. Observe os eixos xyz para rotação da imagem.
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Discussion
Ilhéus pancreáticos de murino foram isolados usando a digestão com colagenase seguido por purificação em gradiente de densidade, tal como descrito previamente 33. Ilhotas isoladas foram cultivadas durante a noite antes do transplante. Embora isto possa não ser necessário, é recomendado para permitir que as ilhotas para recuperar do procedimento de isolamento. Isto é crítico, quando é realizado o transplante em receptores diabéticos uma vez que irá assegurar o transplante de ilhéus sobreviventes / robustas.
Transplante é realizada sob anestesia generalizada com oxigênio / mistura isoflurano (1,5-3%) inalação para o efeito. Os anestésicos de inalação ou injecção alternativos (por exemplo, cetamina) pode ser usado. Se a anestesia injeção é usado, pular o passo 2,2 no protocolo. Fornecer o animal anestesiado com uma fonte de calor para evitar a hipotermia durante o procedimento. Em alguns ratinhos, é possível romper os vasos sanguíneos ao fazer a incisão na co normalmente avascularrnea. Por exemplo, a córnea de ratos pelados tende a ser vascularizado; evitar áreas vascularizadas quando possível. Use uma seringa nova por incisão. Evitar a perfuração da íris com a agulha ao fazer a incisão. Impedir o contacto com a íris pode ser ainda assegurado pela frente para o lado chanfrado da ponta da agulha para a íris. Não seque / aspirar humor aquoso após fazer a incisão. É mais fácil de penetrar a cânula através da incisão na córnea de um "molhado", adicionar algumas gotas de PBS ou meios estéreis de cultura para a córnea, se necessário.
Analgesia pós-operatória pode ser obtido através da injecção subcutânea de buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg) ou analgésica preferido (s) para o primeiro 48 hr. No passo 2.9, se administrar analgesia imediatamente após o procedimento conforme o animal já está profundamente sob anestesia geral. Se desejado, no entanto, o passo 2,9 pode ser realizada depois do passo 2.2 do protocolo, com ou sem uma anestesia tópica no olho (consultar o seu local deIACUC ou veterinário). Antibióticos oftálmicos alternativos também podem ser usados.
Aqui, utilizou-se um aparelho de micro-injecção construído sob encomenda operado através de um pedal de conduzir a seringa de vidro 100 ul de precisão para aspirar (carga) e ejectar as ilhotas para fora da cânula dentro do ACE (figura 1). Isto pode ser substituído por qualquer 100 ul seringa de vidro à prova de gás, com um êmbolo de precisão parafuso orientada que pode ser operado manualmente para aspirar / ejectar as ilhotas; isto, todavia, provavelmente necessitar da assistência de outra pessoa para operar. Em qualquer caso, embora não seja obrigatório, recomendamos pré-carga da seringa montada, tubos, e um reservatório com uma solução estéril (solução salina, PBS ou meio de cultura) para assegurar a aspiração suave e ejecção das ilhotas. Isto é particularmente importante, se / quando as ilhotas embalados entupir a cânula.
Nós normalmente executam os nossos procedimentos de transplante em condições limpas dentro de uma cabine de segurança biológicainet sem o risco de infecções. Todas as soluções usadas, seringas, cânulas, tubos, e gaze são autoclavados ou gás-esterilizado. Embora, não podemos verificar a esterilidade completa por causa de contato das mãos com o mouse durante o procedimento, não tivemos quaisquer problemas com contaminação ilhota, seguindo os passos acima recomendadas.
Demonstramos aqui como transplantar ilhotas pancreáticas na ACE para fins de imagem, onde ilhotas menos são necessários para o transplante. No caso de reversão diabetes é desejado no animal receptor, uma maior quantidade de ilhotas precisa ser transplantadas 26, 27. Embora o procedimento de transplante é idêntico ao que nós mostramos aqui, atenção especial deve ser dada às medidas 2.6 e 2.7 do protocolo para evitar perda de ilhotas transplantadas devido ao refluxo.
Uma vez dominado, este procedimento de transplante pode ser realizada em ~ 5 min por ratinho. Esta técnica pode ser usada para uma variedade de transplantar tissues para dentro da câmara anterior do olho. Como mencionado acima, nos glomérulos renais transplantados assim como tecido embrionário (gomos pancreáticas) para estudar o desenvolvimento do pâncreas na câmara anterior do olho in vivo.
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Disclosures
PO.B. é um dos fundadores da empresa de biotecnologia Biocrine, que vai usar a câmara anterior do olho como uma plataforma de serviços comerciais. AC é sobre a patente proteger esta tecnologia.
Acknowledgments
Reconhecemos os drs. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier e Daniel Nyqvist para discussões frutíferas. Agradecemos também Eleut Hernandez e Diego Espinosa-Heidmann para assistência técnica, e Mike Valdes e Margaret Formoso ajuda com gravação de vídeo. Byron Maldonado gravados, editados e produziu o vídeo final. Apoio à pesquisa foi fornecido pelo Instituto de Pesquisa do Diabetes Foundation ( www.DiabetesResearch.org ), o NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 a MHA; NIH RO3DK075487 a AC; U01DK089538 para PO.B.). Apoio à pesquisa adicional para PO.B foi fornecido através de fundos do Karolinska Institutet, da Suécia Research Council, a Fundação Diabetes sueca, a Família Erling Persson-Fundação, a Família Knut e Alice Wallenberg Foundation, a Skandia Insurance Company Ltd., VIBRANTE ( FP7-228933-2), Programa de Pesquisa Estratégica em Diabetes no Karolinska Institutet, a Novo Nordisk Foundation e Fundação Berth von Kantzow de.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
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