Digital Inline Holografisk Microscopy (DIHM) af svagt-sprednings Emner

Summary

De tre-dimensionelle placeringer af svagt spredning objekter kan identificeres entydigt ved hjælp af digital inline holografisk mikroskopi (DIHM), der indebærer en mindre ændring til en standard mikroskop. Vores software bruger en simpel imaging heuristisk kombineret med Rayleigh-Sommerfeld back-propagation til opnåelse af den tredimensionale position og geometri af en mikroskopisk fase objekt.

Abstract

Svagt-spredning genstande, såsom små kolloide partikler og de fleste biologiske celler, ofte stødt på mikroskopi. Faktisk har en række teknikker er udviklet til bedre at visualisere disse fase objekter fasekontrast og DIC er blandt de mest populære metoder til at øge kontrasten. Men optagelse stilling og form i out-of-imaging-plane retning forbliver udfordrende. Denne rapport introducerer en simpel eksperimentel metode til præcist at bestemme placeringen og geometri af objekter i tre dimensioner, ved hjælp af digital inline holografisk mikroskopi (DIHM). Groft sagt er den tilgængelige prøvevolumen defineret af kameraets sensor størrelse i den laterale retning, og belysningen sammenhæng i den aksiale retning. Typiske prøvevolumener spænder fra 200 um x 200 um x 200 um ved anvendelse af LED-belysning til5 mm x 5 mm x 5 mm eller større ved hjælp af laser belysning. Denne belysning lys er konfigureret, så plane bølger er hændelse på prøven. Objekter i målevoluminet derefter spreder lys, der interfererer med unscattered lys til at danne interferensmønstre vinkelret på belysningen retning. Dette billede (hologrammet) indeholder de oplysninger dybde, der kræves til tredimensionel rekonstruktion, og kan fanges på en standard imaging enhed, såsom en CMOS eller CCD-kamera. Rayleigh-Sommerfeld tilbage formeringsmetode er ansat til at numerisk koncentrere mikroskopbilleder, og en enkel billedbehandling heuristisk baseret på Gouy fasen anomali bruges til at identificere spredning objekter i den rekonstruerede volumen. Denne enkle, men robust metode resulterer i en entydig, model-fri måling af placering og udformning af objekter i mikroskopiske prøver.

Introduction

Digital inline holografisk mikroskopi (DIHM) giver mulighed for hurtig tre-dimensionelle billeder af mikroskopiske prøver, såsom svømning mikroorganismer ^1,2 og bløde stof systemer ^3,4, med minimal modifikation til en standard mikroskop setup. I dette papir gives en pædagogisk demonstration af DIHM, centreret omkring software udviklet i vores laboratorium. Dette papir indeholder en beskrivelse af, hvordan du opsætter mikroskopet, optimere datafangst, og behandle de optagede billeder til rekonstruere tredimensionelle data. Den software (delvist baseret på software udviklet af GD Grier og andre ^5), og Billederne er frit tilgængelige på vores hjemmeside. Der gives en beskrivelse af de nødvendige skridt for at konfigurere mikroskopet rekonstruere tredimensionelle mængder fra hologrammer og gør de resulterende mængder af interesse ved hjælp af en gratis raytracing softwarepakke. Artiklen slutter med en diskussion af faktorer, der påvirker kvaliteten af ​​genopbygning, Og en sammenligning af DIHM med konkurrerende metoder.

Selvom DIHM blev beskrevet for nogen tid siden (for en generel gennemgang af sine principper og udvikling, se Kim ^6), har den nødvendige computerkraft og billedbehandling ekspertise hidtil stort set begrænset brugen til specialiserede forskergrupper med fokus på instrument udvikling. Denne situation ændrer sig i lyset af de seneste fremskridt inden for computer-og kamera-teknologi. Moderne stationære computere kan nemt klare behandling og krav til opbevaring af data; CCD-eller CMOS-kameraer er til stede i de fleste mikroskopi laboratorier, og den nødvendige software bliver gjort frit tilgængelige på internettet af grupper, der har investeret tid i at udvikle teknikken.

Der er blevet foreslået forskellige ordninger til afbildning af konfigurationen af ​​mikroskopiske objekter i en tredimensionel prøvevolumen. Mange af disse er scanning teknikker ^7,8, hvor en stabel af billeder er optaget af mechanically oversætte billedplanet gennem prøven. Konfokal fluorescens mikroskopi er måske den mest kendte eksempel. Typisk er et fluorescerende farvestof tilsættes til en fase objekt for at opnå et acceptabelt niveau af prøve kontrast og konfokal arrangement bruges til rumligt lokalisere fluorescerende emission. Denne metode har ført til betydelige fremskridt, for eksempel i kolloid videnskab, hvor det har givet adgang til de tre-dimensionelle dynamik overfyldte systemer ^9-11. Brugen af ​​mærkningen er en vigtig forskel mellem fluorescens konfokal mikroskopi og DIHM, men andre elementer i de to teknikker er værd at sammenligne. DIHM har en betydelig hastighed fordel, at apparatet ikke har nogen bevægelige dele. De mekaniske scanning spejle i konfokal systemer placerer en øvre grænse for datafangst sats - typisk omkring 30 billeder / sek for en 512 x 512 pixel billede. En stak af sådanne billeder fra forskellige fokale planer kan opnås ved fysisk translating prøven scenen eller objektiv mellem rammer, der fører til et endeligt fange på omkring ét volumen pr sekund for en 30 rammestak. Til sammenligning kan et holografisk system baseret på en moderne CMOS kamera indfange 2.000 billeder / sek ved samme billedstørrelse og opløsning hver frame behandles `offline 'at give en uafhængig øjebliksbillede af prøvens volumen. At gentage: kræves ikke fluorescerende prøver til DIHM, selvom et system er blevet udviklet, der udfører holografisk rekonstruktion af et fluorescerende emne ^12. Samt tre-dimensionelle information volumen kan DIHM også bruges til at give kvantitative fasekontrast billeder ^13, men det er uden for rammerne af diskussionen her.

Raw DIHM data billeder er to-dimensionelle, og i nogle henseender ligner standard mikroskop billeder, omend ude af fokus. Den væsentligste forskel mellem DIHM og standard lysfeltmikroskopi ligger i diffraktion ringe, der omgiver objekter in synsfeltet, og disse er på grund af karakteren af ​​belysningen. DIHM kræver en mere sammenhængende kilde end lyse felt - typisk en LED eller laser. De diffraktion ringe i hologrammet indeholde de nødvendige oplysninger til at rekonstruere et tredimensionelt billede. Der er to primære tilgange til tolkning DIHM data, direkte montering og numerisk Nyt fokus. Den første metode er anvendelig i tilfælde, hvor den matematiske form diffraktionsmønstret er kendt på forhånd, ^3,4, denne betingelse er opfyldt af en lille håndfuld enkle genstande som kugler, cylindre, og halv-plane forhindringer. Direkte montering gælder også i tilfælde, hvor objektets aksial position er kendt, og billedet kan monteres ved hjælp af en look-up tabel billedfiler skabeloner ^14.

Den anden metode (numerisk refokusering) er noget mere generelt og er afhængig af hjælp af diffraktion ringene i det todimensionale hologram billede til numerisk rekonstruere det optiske felt påen række (vilkårligt fordelte) brændplaner hele prøvevolumen. Der findes flere tilhørende metoder til at gøre dette ^6; dette arbejde bruger Rayleigh-Sommerfeld tilbage formering teknik som beskrevet af Lee og Grier ^5.. Resultatet af denne procedure er en stak billeder, der kopierer effekten af ​​manuelt at ændre mikroskop fokusplan (deraf navnet `numeriske refokusering"). Når en stak billeder er blevet genereret, skal motivets placering i centrum volumen opnås. Et antal billedanalyse heuristikker, såsom lokal intensitet varians eller indhold rumlig frekvens, er blevet præsenteret for kvantificere skarpheden af fokus på forskellige punkter i prøven ^15. I hvert tilfælde, når et bestemt billede metrisk er maksimeret (eller minimeret), er det objekt, anses for at være i fokus.

I modsætning til andre ordninger, der søger at identificere en bestemt fokalplan hvor en genstand er "i fokus", metoden i dette arbejde henter ud points, der ligger inde i objektet af interesse, som kan strække sig over en bred vifte af fokusplaner. Denne fremgangsmåde er anvendelig for en bred vifte af fag og er især velegnet til forlænget, svagt spredning prøver (fase objekter), såsom stavformede kolloider, kæder af bakterier eller eukaryot flageller. I sådanne prøver ændrer billedets kontrast, når genstanden passerer gennem brændplanet, en sløret billede har en lys center hvis objektet er på den ene side af brændplanet og en mørk center, hvis det er på den anden. Pure fase objekter har lidt at ingen kontrasten, når de ligger netop i brændplanet. Dette fænomen kontrast inversion er blevet diskuteret af andre forfattere ^16,17 og er i sidste ende skyldes den Gouy fase anomali ^18. Dette er blevet sat på en mere stringent fod i forbindelse med holografi andetsteds, hvor grænserne for teknik evalueres, den typiske usikkerhed i position er i størrelsesordenen 150 nm (ca. én pixel) i EACh retning ^19.. Den Gouy fase anomali metode er en af ​​de få veldefinerede DIHM ordninger til bestemmelse af strukturen af ​​udvidede objekter i tre dimensioner, men ikke desto mindre nogle objekter er problematisk at rekonstruere. Objekter, der ligger direkte langs den optiske akse (peger på kameraet) er vanskelig at rekonstruere nøjagtigt, at usikkerhed i længden og positionen af ​​objektet bliver store. Denne begrænsning er dels på grund af den begrænsede bit dybde af pixels optager hologrammet (antallet af forskellige gråtoner, at kameraet kan optage). Et andet problematisk konfiguration opstår, når genstanden af ​​interesse er meget tæt til brændplanet. I dette tilfælde er de reelle og virtuelle billeder af objektet rekonstrueret i umiddelbar nærhed, hvilket giver anledning til komplicerede optiske felter, der er vanskelige at fortolke. En anden, lidt mindre vigtig bekymring her er, at de resulterende diffraktion frynser optager mindre af billedsensoren, og dette grovere kornet information fører til en dårligere kvalitet genopbygning.

I praksis er en simpel gradient filter anvendt tredimensionelle rekonstruerede volumener til at opdage stærke intensitet inversioner langs belysning retning. Områder, hvor intensitet skifter hurtigt fra lys til mørk, eller omvendt, bliver så forbundet med spredning regioner. Svagt-spredning objekter er godt beskrevet som en vekselvirkende samling af sådanne elementer ^20; disse individuelle bidrag sum for at give den totale spredte område, der er nemt vendes ved hjælp af Rayleigh-Sommerfeld tilbage formering metode. I dette papir, er den aksiale intensitet gradient teknik anvendt til en kæde af Streptococcus-celler. Cellen organer er fase objekter (arten E. coli har et brydningsindeks målt ²¹ til at være 1.384 ved en bølgelængde λ = 589 nm; Streptococcus stammen sandsynligvis være lignende) og fremstår som en høj intensitet kæde af forbundne klatter i the prøvevolumen efter gradientfiltret er blevet anvendt. Standard tærskel-og feature extraction, der anvendes for det filtrerede volumen tillader udvinding af volumetriske pixels (voxels) svarende til regionen inde i cellerne. En særlig fordel ved denne metode er, at den muliggør entydig rekonstruktion af et objekts position i den aksiale retning. Lignende metoder (i det mindste de at pladeselskaberne hologrammer tæt på objektet, filmede gennem et mikroskop målsætning) lider af at være i stand til at bestemme tegnet af denne forskydning. Selvom Rayleigh-Sommerfeld genopbygning metode er også tilmelde uafhængige i den forstand, hældning operation tillader os at skelne mellem svage fase objekter over og under brændplanet.

Protocol

1.. Opsætning og dataopsamling

1. Dyrk en kultur af Streptococcus stamme V4051-197 (glat svømning) celler i KTY mediet fra frossen lager ^22. Inkuberes i et roterende rysteapparat natten over ved 35 ° C og 150 rpm, til mætning.
2. Podes 10 ml frisk KTY medium med 500 ul af mættet kultur. Inkuberes i yderligere 3,5 timer ved 35 ° C og 150 rpm, indtil cellerne når en optisk densitet på ca 1,0 ved λ = 600 nm (ca. 5 x 10 ⁸ celler / ml).
3. Fortyndes 1:400 i frisk medium for at opnå den endelige koncentration af motile celler.
4. På et objektglas, at en ring af fedt (fx fra en sprøjte fyldt med vaseline) omkring 1 mm i højden og placere en dråbe af prøveopløsningen i midten. Placer et dækglas på toppen og tryk let på kanterne at forsegle, der sikrer, at væsken er i kontakt med både slide og dækglas. Den resulterende prøvekammer bør around 100-200 um i dybden.
5. Anbring prøven kammer i mikroskopet med dækglasset nedad, og forsigtigt, for at forhindre dannelsen af ​​luftbobler i olien mellem glas og linse.
6. Fokus mikroskopet på bundfladen af ​​prøven kammeret, og bringe kondensatoren til at fokusere.
7. Sluk for standard belysning og placere LED hoved bag kondensatoren blænde af mikroskopet. Sæt LED-strømforsyning til maksimalt output.
8. Luk kondensatoren blænde til sin fulde udstrækning, og om nødvendigt skubbe LED i holderen, indtil lysstyrken er centreret på objektivets blænde.
9. Tænd for computeren og kameraet, og omdirigere al lys til mikroskop kamera port. Juster frame rate og billedstørrelse i billedet erhvervelse software.
10. Gøre rammen eksponeringstid så kort som muligt, mens du stadig bevarer en god kontrast. Check et billede intensitet histogram at sikre, at billedet ikke er mætningTED eller undereksponeret.
11. Hvis det er nødvendigt, omlægge mikroskop, så objekt af interesse er let uskarpe (typisk med 10-30 um). Objektet og brændplanet bør være på samme medium (dvs. brændplanet skal ligge inden i prøvekammeret).

2. Genopbygning

Det første trin i databehandlingen er at numerisk koncentrere et videobillede på en række forskellige dybder, der producerer en stak billeder. Brugervenlig software til at gøre dette kan findes her: http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html sammen med fx billeder (erhvervet ved hjælp af et inverteret mikroskop, og en 60X olie nedsænkning objektiv) og en scene fil ray spores rendering.

1. Input rammen af ​​interesse og dens respektive baggrund som separate billedfiler, i de relevante felter på grænsefladen. Et baggrundsbillede er en ramme, fairly repræsenterer baggrund af videoen i fravær af hologrammet, og vil blive brugt til at bekæmpe enhver fast mønster støj, som kan forstyrre hologrammet lokalisering og analyse.
2. Indtast værdier i de globale indstillinger bokse på venstre side af skærmen, før du kører programmet. De første tre er output stack parametre: Axial position første ramme ('Start fokus'); antal skiver i rekonstruerede stabel ('Antal trin'); aksiale afstand mellem hver skive i stakken ("Step size ') .
3. For at rekonstruere objekter med de korrekte proportioner bør trinstørrelsen være den samme størrelse som den laterale pixelafstanden. Indtast kameraets laterale samplingfrekvens (1/pixel afstand) i 'Pixel / micron' boksen, belysningen bølgelængde og medium brydningsindeks i de sidste to bokse. Programmets standardværdier er egnede til at rekonstruere eksempel data.
4. Tryk på knappen 'Flip Z-gradient', hvis centrum object er mørkt i hologram (se eksempel ramme 2005 og diskussionen sektion for flere detaljer).
5. Kontroller bandpass filter on / off tilstand (standard er aktiveret). Denne valgfri båndpasfilter, der ligger i en kasse under gradient-flip skifte, er ansvarlig for at undertrykke bidraget fra støjende pixels. Båndpasfiltret anvendes på hvert billede skive umiddelbart efter generation.
6. Tjek den mellemliggende output tænd / sluk stater (standard er aktiveret). Intermediate analyse trin er skrevet i to output videoer, som ukomprimeret avi filer:. Den første er fokuseret stak (filnavn ender på '_stack.avi "), den anden er stakken efter den aksiale gradient operation (filnavn ender på' _gradient.avi "). Ideelt vil denne anden stak indeholde genstand for interesse fremhævet som en lys genstand mod en mørk baggrund.
7. Efter indstilling af alle parametre, skal du trykke på 'Run' i hovedvinduet. Den valgte ramme vises i Hovedboksen af ​​softwaren.
8. Brugforstørrelsesglas værktøj findes på værktøjslinjen til venstre på billedet for at zoome ind (venstre klik), og zoome ud (shift + venstre klik). Brug rektangelværktøjet på værktøjslinjen for at vælge et område af interesse (ROI). Fange så mange af hologram frynser som muligt inde i rektanglet, da dette vil optimere genopbygningen.
9. Tryk på knappen 'Proces' til at generere de to billedstakke. Undersøg de resulterende stakke ved hjælp ImageJ (som kan fås gratis på http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Hvis objektet af interesse kan tydeligt ses i gradient billedstak, gå videre til næste trin for at udtrække objektets koordinater.

3. Rendering

1. Udover ramme fokusering, kan dette program finde x, y, z-koordinater for hver voxel i objektet af interesse. Tryk på knappen 'Feature Extraction "for at aktivere denne funktion.
2. Indtast en sti, herunder udvidelse (for eksempel: c: home output.inc), foroutput koordinater fil. Vælg 'POV-Ray-stil' i 'output koordinere stil' boksen. Dette bevirker, at programmet til at skrive et objekt fil, der kan visualiseres ved hjælp af gratis POV-Ray-raytracing softwarepakke (som kan fås fra http://www.povray.org/ ).
3. Ombearbejd billederne som i afsnit 2 ovenfor. Programmet vil give en serie af (x, y, z)-koordinater i det valgte ROI, skrevet til filnavnet i 'Output koordinere' boksen. Udvinding af objekt koordinater tager betydeligt længere end stak generation.
4. Sørg for, at prøven POV-Ray-fil (leveres med genopbygningen kode) er i samme mappe som koordinaterne filen blot genereres. Rediger prøven. Pov fil og erstatte filnavnet i anførselstegn på linjen
   # Include "MYFILE.inc"
   med navnet på den datafil, der genereres af genopbygningen kode.
5. Klik på "Kør" knappen i POV-Ray til at gengive et bitmap billede. Than kameraets position, belysning og tekstur muligheder er blot et par af de mulige tilpasninger i POV-Ray, se online-dokumentationen for detaljer.

Representative Results

For at demonstrere mulighederne i DIHM blev eksperimenter udført på en kæde af Streptococcus bakterier. Selve kæden målte 10,5 mm lang og var sammensat af 6-7 sfærisk-cylindriske celler (to af cellerne i kæden er tæt på at dividere) med diametre i området fra 0,6 til 1 um. Figurerne 1a og 1b viser den primære grænseflade af genopbygningen og rendering software. Eksempler på den numeriske recentrering procedure ses i figur 2, hvor en rumlig båndpasfilter er blevet anvendt. Figur 3 viser virkningen af gradientfiltret på billederne i figur 2. De rå data, der anvendes til at konstruere begge af disse billeder er bundtet med koden download som eksempel ramme 108. Endelig viser figur 4 virkningen af gode og dårlige kvalitet data på den rekonstruerede geometri. Begge rammer i denne sidste tal blev taget fra en video af Same kæde af celler (en anden kæde til den i de første to tal). En god rekonstruktion er mulig i de fleste tilfælde, men når kæden er orienteret udgangen på genopbygningen mislykkes, hvilket giver en stor rund genstand på brændplanet. Dette svigt er karakteristisk for objekter orienteret langs den optiske akse. For skalaen, i de edb-rendered images, er kontrollen på gulvet 1 um på en side. For en mere detaljeret diskussion af præcision og nøjagtighed af denne metode, skal læseren konsultere Wilson og Zhang ^19..

Figur 1. Software grænseflader. Den vigtigste interface af genopbygningen software er vist i panel (a), hvor filen input bokse, parametre globale indstillinger og andre vigtige funktionerder er nævnt i teksten er blevet fremhævet. Panel (b) viser eksempel scene fil til POV-Ray, i programmets standard scene editor. Filnavnet mellem gåseøjne på linjen angivne bør sættes til output filen fra genopbygningen software. Det kan være nødvendigt at ændre kameraets placering og retning (relevante afsnit er angivet) med henblik på korrekt visualisere genopbygning. Se online POV-Ray-dokumentation for yderligere anvisninger. Klik her for at se større billede .

Figur 2. Eksempler numerisk genfokuseringen billeder. Tallet paneler i kolonnen Vis venstre hånd numerisk fokuseret(X, y) fly i en række forskellige højder inden for det rekonstruerede volumen (som vist). Den nederste venstre billede viser de originale hologram data, delt igennem som baggrundsdata. Den store panel til højre viser et (x, z) skive gennem den samme stak. Pointen kontrast inversion langs z-aksen kan tydeligt ses på omkring en tredjedel af vejen fra toppen af ​​billedet. De røde linjer på større billede show, hvor dette plan (x, z) skærer (x, y), målt til venstre. Tilsvarende de blå linjer i mindre paneler viser skæringspunktet mellem (x, z) skive. Klik her for at se større billede .

Figur 3. Eksempler på gradient-filtrerede billeder.0. Dette billede viser virkningen af anvendelsen gradientfiltret til dataene i figur 2. Bemærk, at genstand for interesse fremhæves som en symmetrisk lyspunkt. Klik her for at se større billede .

Figur 4.. Eksempler på data, der fører til gode og dårlige gengivne billeder. De to billeder i paneler (a) og (c) er taget fra den samme video af en tumbling kæde af celler. Dataene i panel (a), er repræsentative for de fleste billedfelter i denne serie, hvor kæden ikke er orienteret direkte langs den optiske akse. Formen og placeringen af ​​objektet trofast gengivet irendering i panel (B). I tilfælde af panelet (c) blev kæden momentant orienteret fra enden til brændplanet, objekter i denne konfiguration er vanskelige at rekonstruere og giver typisk en "klat" tæt på brændplanet, som det ses i panel (d ). Click here to view larger image .

Discussion

Det vigtigste skridt i denne eksperimentelle protokol er den præcis indsamling af billeder fra en stabil forsøgsopstilling. Med dårlige baggrundsdata, high fidelity genopbygning er næste umuligt. Det er også vigtigt at undgå objektivlinser med en intern fasekontrast element (synlig som et mørkt annulus, når man ser gennem bagsiden af ​​målet), da dette kan forringe rekonstruerede billede. Formålet med interesse bør være langt nok fra brændplanet at nogle få par af diffraktion frynser er synlige i sit image (en egnet heuristisk er, at sløret mønster skal vises at have 10 gange den lineære dimension af den fokuserede objekt - se eksempler på data ). Objekter for tæt på brændplanet lider twin-image og prøvetagning artefakter, som tidligere beskrevet. Det er også vigtigt at have en god karakterisering af kameraets pixelafstanden, da dette er en kritisk faktor i korrekt bestemmelse koncentrere afstande. Ofte kamera DOKUMENTATion vil listen 'pixelstørrelse "i specifikationerne, og det kan være lidt tvetydig, fordi visse typer kamera (CMOS-kameraer i særdeleshed) kan have væsentlige områder af rummet mellem pixels, der ikke er følsomme over for lys. Den mest pålidelige måde at få denne information er at bruge en standard kalibrering mål, såsom en USAF 1951 resolution chart, og måle samplingfrekvensen (antal pixels pr mikrometer) direkte fra et billede.

I grænsen for monokromatisk belysning, er løsningen af et DIHM-systemet i sidste ende fastsat af den numeriske åbning af målet linse (NA) og bølgelængden af belysning (λ) ^23,24. Sideværts adskilte punkter skal ligge mindst en afstand Δ _lat = »λ '/ 2NA hinanden, hvis de skal være separat løst. Tilsvarende er grænsen aksial opløsning i det ideelle tilfælde givet ved »Δ _'økse = λ / 2 (NA) ^2. Ved brug af en LED i DIHM, er der en grænse for dybden afden mængde, der kan afbildes, og dette er i sidste ende bestemt af det optiske system og sammenhæng belysningen. En typisk dybden af denne "følsomme volumen" er omkring 100-200 um for en LED, selv om en nærmere redegørelse for denne type effekt kan findes andre steder ^25. Den følsomme volumen er begrænset i de to andre retninger af størrelsen af ​​billedet. Selvom softwaren er temmelig robust, visse operationer er snarere memory-sulten. Rekonstruktionen en billedstak og opnå intensitet gradient er begge temmelig konservativ, men udvinding af koordinaterne for en funktion af interesse fra en gradient stak kan forbruge en masse hukommelse (flere hundrede megabyte til flere gigabyte). Til dette formål, er det tilrådeligt at begrænse rekonstrueret volumen af ​​interesse for 100-150 pixels i hver dimension. Denne begrænsning kan lettede noget hvis koden er kørt på en 64 bit operativsystem med mere end 4 GB RAM (softwaren blev skrevet på en maskine med 12 GB),selvom beregningstid kan blive uoverkommelig.

For at undersøge et større system, kan LED-lyskilde erstattes af en laser, som giver mulighed for genopbygningen af ​​genstande, der ligger på et langt større dybde fra brændplanet - nemt op til millimeter - og ved lavere forstørrelse. Indledende forsøg med sådan en opsætning, der anvender en laserdiode koblet til en single-mode optisk fiber, tilladt rekonstruerede dybder på op til 10 mm ved hjælp af en 10X mikroskopobjektiv. Denne øgede dybdeskarphed kommer til en pris, men; laserens store kohærenslængde medfører billedstøj, især refleksioner fra forskellige overflader i den optiske toget Disse virkninger opvejes noget (væggene i prøvekammeret, linseoverflader osv.) når apparatet er stabilt nok til at få en god baggrundsbillede. Men uvedkommende refleksioner har en ukendt fordeling af faser, så hvis deres omfang er sammenlignelig med reference bølge (unscattered lys), reconstruIndsatsen kan blive umulig. Andre forfattere har ændret sammenhængen af en laser-lyskilde, for eksempel ved at modulere laseren drivstrøm ²⁶ eller ved hjælp af en roterende jorden glasskærm at reducere sammenhængen ^27.

Fra et fejlfinding synspunkt stødt fleste problemer, mens du bruger det holografiske genopbygning software er bedst løses ved at inspicere de mellemliggende stadier af dataanalyse. I tilfælde af det rekonstruerede billedstak genstandene skal »deblur 'symmetrisk som de kommer i fokus. Hvis diffraktion frynser ser stærkt asymmetrisk, en fattig eller offset baggrundsbillede er ofte skyld. Hvis billedet til genopbygning er taget fra en stak af lignende billeder, for eksempel et billede fra en videosekvens af en genstand i bevægelse, et baggrundsbillede kan undertiden opnås ved at tage gennemsnittet (ved gennemsnit eller median) pixelværdier på tværs af alle video billeder. Hvis motivet bevæger sig betydeligt i løbet af videosekvens, densbidrag til et enkelt pixel værdi er lille og dominerende bidrag vil komme fra de uændrede baggrund rammer, hvor emnet var fraværende. I det tilfælde, hvor et objekts koordinater er ikke korrekt tilbage, kan gradienten billedstak være et nyttigt diagnostisk. Hvis objektet ses som et tomrum, er omgivet af en lysende ring i gradienten billedstak bør gradientfiltret vendes og billedet oparbejdes. Som nævnt i indledningen, Rayleigh-Sommerfeld genopbygning metoden er ufølsom over for tegn på et objekts afstand fra brændplanet. Hvis to svagt spredende objekter er i samme afstand fra brændplanet men på modsatte sider, ville de komme i fokus på den samme position i det rekonstruerede billede stakken. Dog vil deres aksiale intensitet mønstre vendes. I midten af ​​objektet oprindeligt fundet over brændplanet (med hensyn til den omvendte mikroskop geometri) skifter fra lys til mørk på passerer igennem i fokus position, mens objektet under brændplanet skifter fra mørk til lys. Gradienten-flip option udtrækker derfor enten objekter over brændplanet (standard) eller under brændplanet (med gradient-flip sat til 'on'), hvilket giver en entydig aksial koordinat. Bemærk, at dette er strengt holder kun svagt spredende objekter metoden virker meget godt for polystyrenmikrosfærer op til 1 um i diameter, men mindre godt for større polystyrenpartiklerne. Biologiske prøver udviser typisk meget svagere spredning, da deres brydningsindekser er tættere på, at det omgivende medium (polystyren har et brydningsindeks i nærheden af ​​1,5), kan så større objekter undersøges.

I form af fremtidige retninger, kan denne software udvides til at behandle flere billeder i en video, for at muliggøre sporing af svømning mikroorganismer eller kolloide partikler i tre dimensioner. Den høje frame rate at teknikken giver, er velegnet til at spore selv den hurtigste svømmermerer, såsom hav-bolig Vibrio alginolyticus, der svømmer ved hastigheder op til 150 mM / sek ^28. De mikroskopiske svømning baner af enkelte celler blev først spores nogen tid siden ^29, men det kræver som regel specialiseret apparat. Den Gouy fase anomali nærme ikke kun egner sig til simple sporing af enkelte celler over lange afstande, men giver mulighed for at undersøge sammenhænge mellem svømning adfærd forskellige individer. Dette afhænger specifikt på tredimensionelle geometri, data, som hidtil har været utilgængelig af tekniske årsager.

Som nævnt i indledningen, en sammenligning med fluorescens konfokal mikroskopi er ikke ideel, men den allestedsnærværende konfokale systemer gør en sammenligning af de tre-dimensionelle billeder aspekt værd. Faktisk DIHM er komplementær til konfokal mikroskopi, og der er komparative fordele og ulemper ved begge. DIHM giver meget hurtigere data KØBn satser: Flere tusinde bind per sekund er rutine, givet en hurtig nok kamera. Dette muliggør sporing af (for eksempel) flere svømning bakterier, som ligger uden evnen til langsommere konfokale systemer. Selv med en hurtig kamera, DIHM er en størrelsesorden billigere end konfokal mikroskopi, og dataene for et tredimensionelt volumen kan opbevares i en enkelt to-dimensionelle billede, reducere krav til datalagring og backup. DIHM er mere let skalerbar i den forstand, at det at arbejde med lavere forstørrelser, større prøver og længere arbejdstid afstande er trivielt. Konfokal mikroskopi stadig har den øverste hånd i tætte eller komplekse prøver, dog. For eksempel i en tæt kolloid suspension, multipel spredning gør holografisk genopbygning praktisk umuligt, en konfokal system enten fluorescerende emission eller refleksion tilstand ville være bedre egnet til at studere sådanne systemer ^9. Desuden konfokal mikroskopi er et mere naturligt valg for eksperimentelle systemer, hvor fluorescent mærkning er af central betydning. Selv fluorescens holografi har vist sig at arbejde med en række testpersoner ³⁰ indsamling effektivitet er i øjeblikket langt under en god konfokal system. Endvidere har sådanne eksperimentelle systemer i øjeblikket kræver specialist optiske apparater og erfaring til at operere, forhåbentlig vil de blive mere bredt tilgængelig med yderligere udvikling.

Sammenfattende DIHM er enestående i sin evne til at opnå høj opløsning tredimensionelle billeder af mikroskopiske objekter, ved høje hastigheder. Vi leverer brugervenlig software, der gør denne teknik tilgængelig for nonspecialist med minimale ændringer til et eksisterende mikroskop. Desuden genopbygning software integrerer nemt med frit tilgængelig computer rendering software. Dette giver mulighed for intuitiv visualisering af mikroskopiske emner, kan ses fra alle vinkler. I betragtning af den tredimensionale karakter af mange hurtige mikroskopiske processer beligning svagt spredning genstande (f.eks slå eukaryot flageller eller cilier, svømning bakterier, eller spreder kolloider), bør denne teknik være af interesse på tværs af en bred vifte af områder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon Corp.
LED	Thorlabs	M660L3	emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm
LED power supply	Thorlabs	LEDD1B
Thread Adapter	Thorlabs	SM2T2
Thread Adapter	Thorlabs	SM1A2
Frame Grabber board	EPIX	PIXCI E4
High-Speed CMOS camera	Mikrotron	MC-1362