Digital Inline Holografisk Mikros (DIHM) av Weakly-spredning Emner

Summary

Den tre-dimensjonale steder av svakt-spredningsobjekter kan identifiseres entydig ved hjelp av digital inline holografiske mikroskopi (DIHM), som innebærer en mindre modifikasjon av en vanlig mikroskop. Vår programvaren bruker en enkel avbildning heuristisk kombinert med Rayleigh-Sommerfeld tilbake-forplantning, hvorved den tredimensjonale posisjon og geometri av et mikroskopisk objekt fase.

Abstract

Svakt-spredning objekter, for eksempel små kolloidale partikler og de fleste biologiske celler er ofte oppstått i mikroskopi. Faktisk har en rekke teknikker blitt utviklet for å bedre visualisere disse fase objekter; fasekontrast og DIC er blant de mest populære metoder for å øke kontrasten. Men innspillingen posisjon og form i out-of-imaging-flyet retning er fortsatt utfordrende. Denne rapporten presenterer en enkel eksperimentell metode for å fastslå nøyaktig plassering og geometri av objekter i tre dimensjoner ved hjelp av digital inline holografisk mikroskopi (DIHM). Generelt sett, er tilgjengelige prøvevolum definert av kamerasensoren størrelsen i sideretningen, og belysnings koherens i aksial retning. Typiske prøvevolumer varierer fra 200 mikrometer x 200 mikrometer x 200 mikrometer ved hjelp av LED-belysning, til5 mm x 5 mm x 5 mm eller større ved hjelp av laser-lys. Denne belysningslampen konfigurert slik at plane bølger som faller inn på prøven. Objekter i prøvevolumet og sprer lyset, noe som forstyrrer den unscattered lys for å danne interferensmønstre perpendikulær på belysningsretningen. Dette bildet (hologram) inneholder detaljert informasjon som kreves for tredimensjonal rekonstruksjon, og kan fanges opp på en standard bildeenhet, for eksempel en CMOS eller CCD-kamera. Den Rayleigh-Sommerfeld tilbake forplantning metode som anvendes for å numerisk refokusere mikroskop-bilder, og en enkel avbildning heuristisk basert på Gouy fase anomali blir brukt til å identifisere spredningsobjekter i det rekonstruerte volum. Denne enkle, men robust metode resulterer i en entydig, model-fri måling av beliggenheten og formen av objekter i mikroskopiske prøver.

Introduction

Digital inline holografisk mikroskopi (DIHM) gir rask tredimensjonal avbildning av mikroskopiske prøver, slik som svømmemikroorganismer ^1,2 og myke materie systemer ^3,4, med minimal endring til en standard mikroskop oppsett. I denne utredningen en pedagogisk demonstrasjon av DIHM er gitt, sentrert rundt programvare utviklet i vår lab. Denne artikkelen inneholder en beskrivelse av hvordan du setter opp mikroskopet, optimalisere datainnsamling, og behandle de lagrede bilder for å rekonstruere tredimensjonale data. Programvaren (delvis basert på programvare utviklet av DG Grier og andre ⁵⁾ og eksempel bilder er fritt tilgjengelig på våre nettsider. En beskrivelse er gitt av de nødvendige skritt for å konfigurere mikroskopet, rekonstruere tredimensjonale volumer fra hologrammer og gjengi de resulterende volum av interesse å bruke en gratis ray tracing programvarepakken. Notatet avsluttes med en diskusjon av faktorer som påvirker kvaliteten på gjenoppbygging, Og en sammenligning av DIHM med konkurrerende metoder.

Selv DIHM ble beskrevet for en tid siden (for en generell gjennomgang av sine prinsipper og utvikling, se Kim ^6), har den nødvendige datakraft og bildebehandling kompetanse hittil i stor grad begrenset bruken til spesialist forskningsgrupper med fokus på instrumentutvikling. Denne situasjonen er i endring i lys av nylige fremskritt innen databehandling og kamerateknologi. Moderne stasjonære datamaskiner kan lett takle behandling og datalagringsbehov; CCD eller CMOS-kameraer er til stede i de fleste mikros laboratorier, og den nødvendige programvaren blir gjort fritt tilgjengelig på internett ved grupper som har investert tid i å utvikle teknikken.

Forskjellige ordninger har blitt foreslått for å avbilde konfigurasjonen av mikroskopiske objekter i et tredimensjonalt prøvevolum. Mange av disse skanner teknikker ^7,8, hvori en stabel av bilder er registrert av mechanically sette bildeplanet gjennom prøven. Scanning confocal fluorescens mikroskopi er kanskje det mest kjente eksempelet. Typisk blir et fluorescerende fargestoff tilsatt til en fase objekt for å oppnå et akseptabelt nivå av prøve kontrast og confocal arrangement som brukes til å lokalisere romlig fluorescensemisjon. Denne metoden har ført til betydelige fremskritt, for eksempel i kolloid vitenskap hvor det har gitt tilgang til de tre-dimensjonale dynamikken i overfylte systemer ^9-11. Bruken av merking er en viktig forskjell mellom fluorescens konfokal mikroskopi og DIHM, men også andre funksjoner i de to teknikkene er verdt å sammenligne. DIHM har en betydelig hastighet fordel i at anordningen ikke har noen bevegelige deler. De mekaniske skanning speil i confocal systemer plassere en øvre grense for datainnsamling rate - typisk rundt 30 bilder / sek for en 512 x 512 piksler. En bunke med slike bilder fra ulike fokus flyene kan fås ved fysisk Translkende prøven scenen eller objektiv mellom rammer, som fører til en endelig fangstrate på rundt ett volum per sekund for en 30 ramme stabelen. Til sammenligning kan en holografisk system basert på en moderne CMOS kamera fanger 2000 bilder / sek på samme bildestørrelsen og oppløsningen, hver ramme er behandlet 'offline "for å gi en uavhengig bilde av prøvevolumet. For å gjenta: fluorescerende prøvene er ikke nødvendig for DIHM, selv om et system har blitt utviklet som utfører holografisk rekonstruksjon av et fluorescerende emne ^12. I tillegg til tre-dimensjonal informasjon volum kan DIHM også brukes til å gi kvantitative fasekontrastbilder ^13, men det ligger utenfor rammen av diskusjonen her.

Raw DIHM data bilder er todimensjonal, og i noen henseender ser ut som vanlige mikroskop bilder, om enn ut av fokus. Den største forskjellen mellom DIHM og standard lyse felt mikros ligger i diffraksjon ringene som omgir gjenstander in synsfeltet, og disse er på grunn av naturen av belysningen. DIHM krever en mer sammenhengende kilde enn lyse felt - typisk en LED eller laser. De diffraksjon ringer i hologrammet inneholder informasjon som er nødvendig for å rekonstruere et tredimensjonalt bilde. Det er to hovedtilnærminger til å tolke DIHM data, direkte montering og numerisk omstilling. Den første metode er anvendelig i tilfeller hvor den matematiske form av diffraksjonsmønsteret er kjent på forhånd, ^3,4; denne betingelsen er oppfylt av et lite knippe av enkle gjenstander som kuler, sylindre, og en halv-plane hindringer. Direkte montering er også anvendelig i de tilfeller hvor objektets aksielle posisjon er kjent, og bildet kan monteres ved hjelp av en oppslagstabell for bilderammer ^14.

Den andre metoden (numerisk refokusering) er noe mer generell og er avhengig av bruk av diffraksjon ringene i de to-dimensjonale hologram bilde i numerisk rekonstruere det optiske feltet påen rekke (vilkårlig fordelte) fokale plan i hele prøvevolumet. Flere relaterte metoder finnes for å gjøre dette ^6, dette arbeidet bruker Rayleigh-Sommerfeld tilbake forplantning teknikk som beskrevet av Lee og Grier ^fem. Utfallet av denne prosedyren er en bunke bilder som gjenskaper effekten av å manuelt endre mikroskop fokusplanet (derav navnet `numerisk omstilling '). Når en stabel bilder som har blitt generert, må innhentes posisjonen av emnet i det sentrale volum. En rekke bildeanalyse heuristikk, som lokal intensitet varians eller romlig frekvens innhold, har blitt presentert for å kvantifisere skarpheten i fokus på ulike punkter i utvalget ^15. I hvert tilfelle, når et bestemt bilde metrisk maksimeres (eller minimal), er objektet betraktes å være i fokus.

I motsetning til andre ordninger som søker å identifisere en bestemt fokusplan der et objekt er "i fokus ', metoden i dette arbeidet plukker ut points som ligger inne i objektet av interesse, som kan strekker seg over et bredt spekter av fokale plan. Denne fremgangsmåten kan anvendes på et bredt spekter av fag, og er spesielt egnet for stor, svakt-spredning prøver (fase objekter), for eksempel stavformede kolloider, kjeder av bakterier eller eukaryote flag. I slike prøver kontrasten i bildet endrer seg når objektet passerer gjennom fokalplan, en defokusert bilde har lys hvis objektet er på den ene side av midtplanet, og et mørkt senter hvis den er på den andre siden. Pure fase objekter har liten eller ingen kontrast når de ligger akkurat i fokusplanet. Dette fenomenet kontrast inversjon har vært diskutert av andre forfattere ^16,17 og er i siste instans på grunn av Gouy fase anomali ^18. Dette har blitt satt på en mer stringent fotfeste i sammenheng med holografi andre steder, hvor grensene av teknikken blir evaluert, og den typiske usikkerhet i posisjonen er av størrelsesorden 150 nm (omtrent en piksel) på each retning ^19. Den Gouy fase anomali metoden er en av de få veldefinerte DIHM ordninger for å bestemme strukturen til utvidede objekter i tre dimensjoner, men likevel noen objekter er problematisk å rekonstruere. Objekter som ligger direkte langs den optiske aksen (peker på kameraet) er vanskelig å rekonstruere nøyaktig; usikkerheter i lengden og plasseringen av objektet blir store. Denne begrensningen er delvis på grunn av den begrensede bitdybde av pikslene opptak hologrammet (antall forskjellige gråtoner som kameraet kan tas opp). Et annet problem konfigurasjon oppstår når objektet av interesse er svært nær til fokalplanet. I dette tilfellet er de virkelige og virtuelle bilder av objektet rekonstrueres i umiddelbar nærhet, noe som gir opphav til kompliserte optiske felt som er vanskelige å tolke. En annen, litt mindre viktig bekymring her er at de resulterende diffraksjon frynser opptar mindre av bildesensoren, og dette grovere kornet informasjon fører til en dårligere kvalitet på rekonstruksjon.

I praksis blir en enkel gradient filter anvendt på tre-dimensjonale rekonstruerte volumer for å detektere sterk intensitet inversjoner langs belysningsretningen. Regioner hvor intensiteten endringer raskt fra lys til mørk, eller vice versa, er så forbundet med spredning regioner. Svakt-spredningsobjekter blir også beskrevet som en noninteracting samling av slike elementer ^20, og disse individuelle bidrag sum for å gi det totale spredte felt som lett kan inverteres ved bruk av Rayleigh-Sommerfeld tilbake forplantning metode. I dette dokumentet blir det aksiale intensitet gradient teknikk anvendt på en kjede av streptokokk-celler. Cellen organer er fase objekter (arten E. coli har en brytningsindeks målt ²¹ til å være 1,384 ved en bølgelengde λ = 589 nm, den Streptococcus stamme er sannsynlig å være lignende) og vises som en høyintensiv kjede av sammenhengende punkter i the prøve volum etter graderingen filteret er brukt. Standard terskel og har uttrekksmetoder anvendt på denne filtrert volum tillate utvinning av volumetriske piksler (voxel) tilsvarende regionen inne i cellene. En spesiell fordel med denne metoden er at den tillater entydig rekonstruksjon av et objekts posisjon i den aksielle retning. Lignende metoder (minst, de som rekord hologrammer nær objektet, avbildes gjennom et mikroskop mål) lider av å være ute av stand til å bestemme fortegnet til denne forskyvningen. Selv om Rayleigh-Sommerfeld gjenoppbygging metoden er også registrere uavhengig i denne forstand, lar gradient operasjonen oss å skille mellom svake fase gjenstander over og under fokusplanet.

Protocol

En. Oppsett og Data Acquisition

1. Dyrk en kultur av Streptococcus belastning V4051-197 (glatt svømming) celler i KTY medium fra frossen lager ^22. Inkuber i en roterende rystemaskin over natten ved 35 ° C og 150 opm, til metning.
2. Inokuler 10 ml av frisk KTY medium med 500 pl av den mettede kultur. Inkuber i ytterligere 3,5 timer ved 35 ° C og 150 opm inntil cellene komme frem til en optisk densitet på ca 1,0 på λ = 600 nm (omtrent 5 x 10 ⁸ celler / ml).
3. Fortynn 1:400 i friskt media for å oppnå den endelige konsentrasjon av motile celler.
4. På et objektglass, lage en ring av fett (for eksempel fra en sprøyte fylt med vaselin) rundt 1 mm i høyde og plassere en dråpe av prøveoppløsningen i midten. Plasser et dekkglass på toppen og trykk lett på kantene for å forsegle, slik at væsken er i kontakt med både sklie og cover glass. Den resulterende prøvekammeret bør være around 100-200 mikrometer i dybden.
5. Plasser prøvekammeret i et mikroskop med dekkglass som vender nedover, og forsiktig, for å hindre dannelsen av luftbobler i oljen mellom glass og linsen.
6. Fokusere mikroskopet på den nedre overflaten av prøvekammeret, og bringe kondensatoren til å fokusere.
7. Slå av standard belysning og plassere LED hode bak kondensatoren blenderåpning av mikroskopet. Sett LED strømforsyning til maksimal effekt.
8. Lukk kondensator blenderåpning til sitt fulle omfang, og om nødvendig, dytte LED i sin mount før belysningen er sentrert på objektivets blenderåpning.
9. Slå på datamaskinen og kameraet, og omdirigere all lys til mikroskopet kameraporten. Juster bildehastighet og bildestørrelsen i bildet oppkjøpet programvaren.
10. Gjøre rammen eksponeringstiden så kort som mulig og samtidig beholde god kontrast. Kontroller en bildeintensitet histogram for å sikre at bildet ikke er mettetted eller undereksponert.
11. Hvis det er nødvendig, refokusere mikroskopet slik at objekt av interesse er litt uskarp (typisk med 10-30 mikrometer). Gjenstanden og fokalplanet skal være i det samme medium (dvs. fokalplanet bør ligge inne i prøvekammeret).

2. Rekonstruksjon

Det første trinn av behandlingen av data, er å numerisk refokusere en videoramme ved en rekke forskjellige dybder, som produserer en stabel bilder. Brukervennlig programvare for å gjøre dette kan bli funnet her: http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html sammen med eksempelbilder (ervervet ved hjelp av en invertert mikroskop, og en 60X oljeneddyppingsobjektivet linse) og en scene fil for ray sporet gjengivelse.

1. Input rammen av interesse og dens respektive bakgrunn som separate bildefiler, i de aktuelle boksene på grensesnittet. Et bakgrunnsbilde er en ramme som fairly representerer bakgrunnen for video, i fravær av hologrammet, og vil bli brukt til å undertrykke enhver fast støymønster som kunne interferere med hologram lokalisering og analyse.
2. Skriv inn verdier i de globale innstillingene boksene på venstre side av skjermen før du kjører programmet. De tre første er utgangs stabel parametere: Aksial posisjonen til den første ramme ("Start fokus '); antall skiver i det rekonstruerte stabel (' Antall trinn '); aksiale avstand mellom hver skive i stabelen (' Trinn size") .
3. For å rekonstruere objekter med riktige proporsjoner, bør den trinnstørrelsen være av samme størrelse som den sideveis avstand mellom pixel. Skriv inn kameraets lateral samplingfrekvens (1/pixel mellomrom) i "Pixel / micron 'boks, belysning bølgelengde og mellombrytningsindeks i de to siste boksene. Programmets standardverdier som er aktuelle for å rekonstruere eksempeldataene.
4. Trykk på 'Flip Z-gradient "-knappen hvis midten av object er mørkt i hologrammet (se eksempel ramme 2005 og diskusjonskapittelet for mer informasjon).
5. Kontroller båndpassfilter på / av-tilstand (standard er på). Denne valgbåndpassfilter, som ligger i en eske under gradient-flip bryteren, er ansvarlig for å undertrykke bidraget fra støyende piksler. Båndpassfilteret tilføres hvert bilde skive umiddelbart etter produksjon.
6. Sjekk den mellomliggende utgangsbryter på / av stater (standard er på). Intermediate analyse trinn er skrevet i to utgang videoer, så ukomprimert avi-filer:. Det første er den refokuserte stakken (filnavn som ender på '_stack.avi'), er den andre bunken etter den aksiale gradient drift (filnavn som ender på ' _gradient.avi '). Ideelt sett vil denne andre stabel inneholder objektet av interesse fremhevet som et lyst objekt mot en mørk bakgrunn.
7. Etter å ha satt alle parametre, trykker du "Kjør" i hovedvinduet. Den valgte rammen vises i hovedboksen av programvaren.
8. Brukforstørrelsesglass verktøyet finnes på verktøylinjen til venstre på bildet for å zoome inn (venstreklikk) og zoome ut (shift + venstreklikk). Bruk rektangel på verktøylinjen for å velge en region av interesse (ROI). Fang så mange av Hologrammet frynser som mulig inne i rektangelet, da dette vil optimalisere gjenoppbygging.
9. Trykk på 'Process "-knappen for å generere de to bildestakker. Inspiser de resulterende stabler ved hjelp ImageJ (som kan fås gratis på http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Hvis objektet av interesse kan sees tydelig i gradient bildestakk, går du videre til neste trinn for å trekke ut de objekt koordinater.

Tre. Rende

1. Foruten rammen omstilling, kan dette program finne x, y, z-koordinater for hver voksel i objektet av interesse. Trykk på 'Feature Extraction "-knappen for å aktivere denne funksjonen.
2. Angi en bane, herunder utvidelse (for eksempel: c: hjem output.inc), forutgang koordinerer fil. Velg 'POV-Ray-stil "i" output koordinatsystemet' boksen. Dette fører til at programmet til å skrive et objekt fil som kan visualiseres ved hjelp av gratis POV-Ray raytracing programvarepakke (som kan fås fra http://www.povray.org/ ).
3. Reprosessere bildene som i pkt. 2 ovenfor. Programmet vil gi en rekke (x, y, z) koordinater i det valgte ROI, skrevet til filnavnet i "Output koordinere 'boksen. Utvinning av objekt koordinater tar betydelig lenger tid enn stack generasjon.
4. Sørg for at utvalget POV-Ray-fil (følger med gjenoppbyggingen kode) er i samme mappe som koordinatene fil bare generert. Redigere prøven. Pov fil og erstatte filnavnet i anførselstegn på linjen
   # Include "MYFILE.inc"
   med navnet på datafilen som genereres av rekonstruksjon koden.
5. Klikk på "Kjør"-knappen i POV-Ray for å gjengi et punktgrafikkbilde. Than kameraposisjon, lyssetting og tekstur alternativer er bare noen av de tilpasningene mulig i POV-Ray, se den elektroniske dokumentasjonen for detaljer.

Representative Results

For å demonstrere egenskapene til DIHM, ble eksperimenter utført på en kjede av Streptococcus bakterier. Kjeden selv målte 10,5 mm lang, og er sammensatt av 6-7 Sphero-sylindrisk celler (to av cellene i kjeden er nær delende) med diameter i området 0,6-1 um. Figurene 1a og 1b viser de viktigste grensesnitt av gjenoppbygging og rendering programvare. Eksempler på den numeriske omstilling prosedyren er sett i figur 2, hvor en romlig båndpassfilter er installert. Figur 3 viser effekten av gradient-filter på bildene i figur 2. Rådata som brukes til å konstruere begge disse bildene er buntet med koden nedlasting som eksempel ramme 108. Til slutt, Figur 4 viser effekten av gode og dårlige kvalitet av data på den rekonstruerte geometri. Begge rammer i dette siste tallet ble tatt fra en video av den same-kjeden av celler (en annen kjede til det i de to første figurer). En god rekonstruksjon er mulig i de fleste tilfeller, men når kjedet er innrettet ende-mot rekonstruksjonen svikter, noe som gir en stor rund gjenstand i fokalplanet. Denne feilmodus er karakteristisk for gjenstander orientert langs den optiske aksen. For skala, i datamaskinen gjengis bildene, de sjekker på gulvet er en mikrometer på en side. For en mer detaljert gjennomgang av presisjon og nøyaktighet av denne metoden, bør leserne rådføre Wilson og Zhang ^19.

Figur 1. Programvaregrensesnitt. Den viktigste grensesnittet av gjenoppbygging programvaren er vist i panel (a), hvor fil input bokser, globale innstillinger parametere og andre viktige funksjonerreferert til i teksten er uthevet. Panel (b) viser eksempel scene fil for POV-Ray, i programmets standard scene editor. Filnavnet mellom gåseøyne på linjen indikert bør settes til utdatafilen fra rekonstruksjonen programvare. Det kan være nødvendig å endre kameraets plassering og retning (relevante delen angitt) for å visualisere gjenoppbyggingen. Se den elektroniske POV-Ray dokumentasjon for ytterligere instruksjoner. Klikk her for å se større bilde .

Figur 2. Eksempler på tallmessig refokuserte bilder. Figuren paneler i venstre kolonne viser tallmessig refokuserte(X, y) plan ved forskjellige høyder innenfor den rekonstruerte volum (som angitt). Den nederste venstre bildet viser de opprinnelige hologram data, fordelt gjennom av bakgrunnsdata. Den store panelet til høyre viser et (x, z) skive gjennom samme bunke. Poenget med kontrast inversjon langs z-aksen kan tydelig ses på omtrent en tredjedel av veien fra toppen av bildet. De røde strekene på større bildefremvisning hvor dette flyet (x, z) skjærer (x, y) plan til venstre. Tilsvarende, de blå linjene i de mindre panelene viser krysset av (x, z) skive. Klikk her for å se større bilde .

Figur 3. Eksempler på gradient-filtrert bilder.0; Dette bildet viser effekten av å anvende gradient-filteret til dataene i figur 2. Legg merke til at objektet av interesse er markert som en symmetrisk lyspunkt. Klikk her for å se større bilde .

Figur 4. Eksempler på data som fører til gode og dårlige gjengitte bilder. De to bilder i panelene (a) og (c) ble tatt fra samme video av en tumbling kjede av celler. Dataene i panel (a), er representative for de fleste rammer i denne serien, i hvilken kjeden ikke er orientert direkte langs den optiske aksen. Formen og plasseringen av objektet er korrekt gjengitt igjengivelse i panel (b). I tilfelle av panel (c), ble kjedet øyeblikk rettede ende-til fokalplanet; objekter i denne konfigurasjonen er vanskelige å rekonstruere, og gir vanligvis et "klatt" i nærheten av brennplanet, som vist i panel (d ). Klikk her for å se større bilde .

Discussion

Det viktigste skrittet i denne eksperimentelle protokollen er nøyaktig fangst av bilder fra en stabil eksperimentelle oppsettet. Med dårlige bakgrunnsdata, er high fidelity rekonstruksjon nesten umulig. Det er også viktig å unngå objektiv med en intern fase kontrast element (synlig som en mørk ringrommet når vi leter gjennom baksiden av målet), da dette kan forringe den rekonstruerte bildet. Den objekt av interesse bør være langt nok fra fokalplanet at noen få par av diffraksjon frynser er synlige i sin bilde (en egnet heuristisk er at defokusert mønsteret skal se ut til å ha 10 ganger den lineære dimensjon av den fokuserte objekt - se eksempel data ). Gjenstander for nær fokalplanet lider av tvilling-bilde-og prøvetakings gjenstander, som tidligere beskrevet. Det er også viktig å ha en god karakteristikk av kameraets avstand pixel, da dette er en kritisk faktor i riktig bestemme refokusere avstander. Ofte kamera documentation vil listen 'pikselstørrelse "i spesifikasjonene, og dette kan være litt tvetydig, fordi visse typer kamera (CMOS-kameraer spesielt) kan ha betydelige områder av plassen mellom piksler som ikke er følsomme for lys. Den sikreste måten å få denne informasjonen på er å bruke et standard kalibreringsmålet, for eksempel en USAF 1951 oppløsning diagram, og måle samplingfrekvens (antall piksler per mikrometer) direkte fra et bilde.

I grensen av monokromatisk lys, er oppløsningen på en DIHM system til slutt satt av numerisk blenderåpning på objektivet (NA) og bølgelengden til lys (λ) ^23,24. Lateralt adskilt poeng bør ligge minst en avstand Δ _lat = 'λ' / 2NA fra hverandre hvis de skal løses separat. På lignende måte er grensen for aksiell oppløsningen i det ideelle tilfellet gitt ved 'Δ' _ax = λ / 2 (NA) ^2. Når du bruker en LED i DIHM, det er en grense til dybden avvolum som kan bli fotografert, og dette er til syvende og sist bestemmes av det optiske systemet og indre sammenheng i belysningen. En typisk dybden av dette 'følsomme volum' er rundt 100-200 mikrometer for en LED, selv om en detaljert redegjørelse for denne type effekt kan finnes andre steder ^25. Det følsomme volum er begrenset i de to andre kanter av størrelsen på bildet. Selv om programvaren er ganske robust, visse operasjoner er heller minne-sulten. Rekonstruere en bildestakk og skaffe intensiteten gradient er begge ganske konservativ, men trekke ut koordinatene til en funksjon av interesse fra en gradient stabel kan konsumere mye minne (flere hundre megabyte til flere gigabyte). For å oppnå dette, er det lurt å begrense den rekonstruerte volum av interesse for 100-150 piksler i hver dimensjon. Denne begrensningen kan lindres noe hvis koden er kjørt på en 64 bits operativsystem med mer enn 4 GB RAM (programvaren ble skrevet på en maskin med 12 GB),selv om beregning tid kan bli uoverkommelige.

For å undersøke et større system, kan LED-lyskilde erstattes av en laser, som tillater rekonstruksjon av objekter som ligger på et mye større dybde fra fokalplanet - lett opp til millimeter - og ved lavere forstørrelse. Foreløpige forsøk med et slikt oppsett, ved hjelp av en laserdiode som er koblet til en enkelt-modus optisk fiber, tillates rekonstruerte dybder opp til 10 mm ved hjelp av et 10X objektiv mikroskop. Denne økte dybdeskarphet kommer til en kostnad, men; laseren store koherenslengde fører til bildestøy, spesielt refleksjoner fra ulike overflater i den optiske tog Disse effektene er motvirket noe (veggene i prøvekammeret, linseflater, etc.) når apparatet er stabil nok til å få et godt bakgrunnsbildet. Imidlertid utenforliggende refleksjoner har en ukjent fordeling av fasene, slik at hvis deres størrelse kan sammenlignes med referansebølgen (unscattered lys), reconstruDette skjer kan bli umulig. Andre forfattere har modifisert sammenhengen i en laser-lyskilde, for eksempel ved å modulere lasers drivende strøm ²⁶ eller ved hjelp av en roterende første glass-skjerm for å redusere koherens ^27..

Fra en feilsøking synspunkt, de fleste problemene mens du bruker den holografiske rekonstruksjon programvare best løses ved å inspisere de midlertidige stadier av dataanalyse. I tilfelle av den rekonstruerte bildestabelen, gjenstandene skal 'deblur' symmetrisk så de kommer i fokus. Dersom diffraksjon frynser ser sterkt asymmetrisk, er en dårlig eller offset bakgrunnsbilde ofte skylden. Dersom bildet for gjenoppbygging har blitt tatt fra en bunke med lignende bilder, for eksempel en ramme fra en videosekvens av et bevegelig objekt, et bakgrunnsbilde kan noen ganger bli oppnådd ved å ta gjennomsnittet (av gjennomsnitt eller median) pikselverdier på tvers av alle video rammer. Hvis motivet beveger seg betydelig i løpet av videosekvens, detsbidrag til ett pikselverdien er liten og den dominerende bidraget vil komme fra den uforandrede bakgrunnsrammer hvor motivet var fraværende. I tilfelle hvor et objekts koordinater ikke er skikkelig tilbake, kan den gradient bildestakk være et nyttig diagnostisk. Hvis objektet er sett på som et tomrom omgitt av en lys ring i gradient bildestakk, bør gradient filter vendes og bildet behandles på nytt. Som nevnt i innledningen, er den Rayleigh-Sommerfeld rekonstruksjon metoden følsom for fortegnet av et objekts avstand fra fokalplanet. Hvis to svakt sprednings-objekter er i samme avstand fra midtplanet, men på motsatte sider, vil de komme i fokus i samme posisjon i den rekonstruerte bildestabelen. Men, ville deres aksiale intensitet mønstre reverseres. Sentrum av gjenstanden opprinnelig funnet ovenfor fokalplanet (med hensyn til det inverterte mikroskop geometri) forandrer seg fra lys til mørk på passerer gjennom fokuserings posisjon, mens objektet under fokusplanet endres fra mørk til lys. Stigningen-flip alternativet trekker derfor enten objekter over fokusplanet (standard) eller under fokusplanet (med gradient-flip satt til "på"), noe som gir en entydig aksial koordinere. Merk at dette strengt holder bare svakt for-spredningsobjekter; metoden fungerer meget godt for polystyren-mikrokuler opp til 1 mikrometer i diameter, men mindre bra for større polystyrenpartikler. Biologiske prøver vanligvis oppvise mye svakere spredning, som deres brytningsindekser er nærmere til den av det omgivende medium (polystyren har en brytningsindeks nær 1,5), kan slik at større gjenstander skal studeres.

I forhold til fremtidige retninger, kan denne programvaren bli utvidet til å behandle flere rammer i en video, for å muliggjøre sporing av svømmemikroorganismer eller kolloidale partikler i tre dimensjoner. Den høye bildefrekvens som teknikken tillater, er godt egnet til å spore selv de raskeste svømmerdene, som for eksempel hav-bolig Vibrio alginolyticus, som svømmer i hastigheter opp til 150 mikrometer / sek ^28. De mikroskopiske svømming baner av enkeltceller ble først spores en tid siden ^29, men dette vanligvis krever spesialisert apparat. Den Gouy fase anomali tilnærming ikke bare gir seg til enkel sporing av enkeltceller over lange avstander, men gir mulighet for å undersøke sammenhenger mellom svømmeatferd av ulike individer. Dette avhenger spesielt på tredimensjonal geometri, data som hittil har vært utilgjengelige for tekniske årsaker.

Som nevnt i innledningen, er en sammenligning med fluorescens konfokalmikroskopi ikke ideell, men allestedsnærværelsen av confocal systemer gjør en sammenligning av de tre-dimensjonale avbildning aspekt verdt. Faktisk er DIHM komplementær til konfokalmikroskopi, for det er komparative fordeler og ulemper ved begge. DIHM åpner for en mye raskere data OPPKjØPn priser: flere tusen bind per sekund er rutine, gitt en rask nok kamera. Dette tillater sporing av (for eksempel) flere svømme bakterier, som er utover evnen til langsommere confocal systemer. Selv med en rask kamera, er DIHM en størrelsesorden billigere enn konfokal mikroskopi og data for et tredimensjonalt volum kan lagres i en enkel to-dimensjonalt bilde, noe som reduserer kravene til lagring og backup. DIHM er lettere skalerbar i den forstand at det å jobbe med lavere forstørrelser større prøver og lengre arbeidstid avstander er trivielt. Konfokalmikroskopi fortsatt har overtaket i tette eller komplekse prøver, imidlertid. For eksempel, i en tett kolloidal suspensjon, gjør flere spredning holografiske rekonstruksjon praktisk talt umulig, en konfokal system i enten fluorescensemisjon eller refleksjonsmodus ville være bedre egnet for å studere slike systemer ^ni. Videre er konfokalmikroskopi en mer naturlig valg for eksperimentelle systemer i hvilke fluorescent merking er av sentral betydning. Selv om fluorescens holografi har vist seg å fungere med en rekke forsøkspersoner ³⁰ oppsamlingseffektiviteten er for tiden langt under det av et godt confocal system. Videre slike eksperimentelle systemer for tiden krever spesialist optiske apparater og erfaring til å betjene, forhåpentligvis vil de bli mer allment tilgjengelig med videre utvikling.

Oppsummert er DIHM enestående i sin evne til å tilegne seg høyoppløselige tredimensjonale bilder av mikroskopiske objekter, ved høye hastigheter. Vi gir brukervennlig programvare som gjør denne teknikken tilgjengelig for nonspecialist med minimale modifikasjoner på en eksisterende mikroskop. Videre integrerer gjenoppbygging programvaren enkelt med fritt tilgjengelig datamaskin rendering programvare. Dette gjør intuitiv visualisering av mikroskopiske fag, synlig fra alle vinkler. Gitt den tredimensjonale natur mange raske mikroskopiske prosesser involving svakt-spredning gjenstander (f.eks slå eukaryote flag eller flimmerhårene, svømming bakterier, eller spre kolloider), bør denne teknikken være av interesse på tvers av et bredt spekter av fagområder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon Corp.
LED	Thorlabs	M660L3	emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm
LED power supply	Thorlabs	LEDD1B
Thread Adapter	Thorlabs	SM2T2
Thread Adapter	Thorlabs	SM1A2
Frame Grabber board	EPIX	PIXCI E4
High-Speed CMOS camera	Mikrotron	MC-1362