Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الرقمية المضمنة المجسم مجهرية (DIHM) من الموضوعات وكلي نثر

Published: February 8, 2014 doi: 10.3791/50488
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1The Rowland Institute, Harvard University, 2Faculdade de Ciências e Letras de Assis, Universidade Estadual Paulista

Summary

المواقع الثلاثة الأبعاد للأجسام نثر ضعيفة ويمكن تحديدها بشكل فريد باستخدام مضمنة الرقمية المجهر الثلاثية الأبعاد (DIHM)، والذي ينطوي على تعديلات طفيفة على المجهر القياسية. برنامجنا يستخدم ارشادي التصوير بسيطة إلى جانب رايلي-سمرفلد العودة الانتشار لانتاج موقف ثلاثي الأبعاد والهندسة لكائن المرحلة المجهرية.

Abstract

كائنات نثر ضعيفة، مثل الجسيمات الغروية الصغيرة ومعظم الخلايا البيولوجية، كثيرا ما واجه في المجهر. في الواقع، تم تطوير مجموعة من التقنيات لتصور أفضل هذه الكائنات المرحلة؛ الطوري ومدينة دبي للإنترنت هي من بين الأساليب الأكثر شعبية لتعزيز التباين. ومع ذلك، وتسجيل موقف والشكل في الاتجاه خارج التصوير الطائرة لا تزال صعبة. يقدم هذا التقرير المنهج التجريبي بسيطة لتحديد دقيق لمكان وهندسة الكائنات في ثلاثة أبعاد، وذلك باستخدام المجهر مضمنة الرقمية الثلاثية الأبعاد (DIHM). بشكل عام، يتم تعريف حجم العينة الوصول إليها عن طريق حجم مستشعر الكاميرا في الاتجاه الجانبي، وتماسك الإضاءة في الاتجاه المحوري. وتتراوح أحجام عينة نموذجية من 200 ميكرون × 200 ميكرون × 200 ميكرون باستخدام الإضاءة LED، ل5 مم × 5 مم × 5 مم أو أكبر باستخدام إضاءة الليزر. يتم تكوين هذا الضوء الإضاءة بحيث موجات الطائرة هي الحادثة على العينة. الكائنات في حجم العينة ثم تبعثر الضوء، والتي تتعارض مع ضوء unscattered لتشكيل أنماط التدخل عمودي على اتجاه الإضاءة. هذه الصورة (الهولوغرام) يحتوي على المعلومات المطلوبة لإعادة الإعمار عمق ثلاثي الأبعاد، ويمكن أن يتم القبض على جهاز التصوير القياسية مثل CMOS أو كاميرا CCD. يعمل على رايلي-سمرفلد طريقة الانتشار مرة أخرى إلى إعادة تركيز عدديا الصور المجهر، والكشف عن مجريات الأمور التصوير البسيط القائم على المرحلة GOUY الشذوذ يستخدم لتحديد نثر الكائنات ضمن حجم أعيد بناؤها. النتائج هذه الطريقة بسيطة ولكنها قوية في لا لبس فيها، خالية من نموذج قياس موقع وشكل الأشياء في عينات مجهرية.

Introduction

مضمنة الرقمية المجهر الثلاثية الأبعاد (DIHM) يسمح بسرعة التصوير ثلاثي الأبعاد للعينات مجهرية، مثل الكائنات الحية الدقيقة السباحة 1،2 و 3،4 أنظمة المسألة لينة، مع الحد الأدنى من التعديل لإعداد المجهر القياسية. في هذه الورقة يتم توفير مظاهرة تربوية من DIHM، تتمحور حول برنامج تم تطويره في المختبر. وتشمل هذه الورقة وصفا لكيفية إعداد المجهر، وتحسين الحصول على البيانات، ومعالجة الصور المسجلة لإعادة بناء البيانات ثلاثية الأبعاد. برنامج (مقرها في جزء منه على البرامج التي وضعتها المديرية العامة جرير وغيرهم 5) والمثال الصور هي متاحة بحرية على موقعنا. ويرد وصف الخطوات اللازمة لتكوين المجهر، وإعادة بناء ثلاثة مجلدات الأبعاد من الصور المجسمة وتقديم وحدات التخزين الناتجة من الاهتمام باستخدام شعاع الحرة تتبع حزمة البرامج. تخلص الورقة مع مناقشة العوامل التي تؤثر على جودة إعادة الإعمار، ومقارنة مع طرق DIHM المتنافسة.

على الرغم من DIHM وصفت منذ بعض الوقت (لاستعراض عام للمبادئ وتطورها، انظر كيم 6)، والقدرة الحاسوبية المطلوبة وصورة الخبرة تجهيز وحتى الآن تقتصر إلى حد كبير استخدامه لمجموعات بحثية متخصصة مع التركيز على تطوير الصك. هذا الوضع يتغير في ضوء التطورات الحديثة في مجال الحوسبة والتكنولوجيا الكاميرا. يمكن لأجهزة الكمبيوتر المكتبية الحديثة التعامل بسهولة مع تجهيز ومتطلبات تخزين البيانات؛ CCD أو CMOS الكاميرات موجودة في معظم مختبرات الفحص المجهري، وتبذل البرنامج المطلوبة متاحة بحرية على شبكة الانترنت من قبل الجماعات الذين استثمروا الوقت في تطوير هذه التقنية.

وقد اقترحت عدة مخططات لتصوير تكوين الكائنات المجهرية في حجم العينة ثلاثية الأبعاد. العديد من هذه التقنيات يتم مسح 7،8، والتي يتم تسجيلها في كومة من الصور عن طريق مترجمة echanically الطائرة الصورة من خلال العينة. المسح المجهري متحد البؤر مضان وربما كان المثال الأكثر دراية. عادة، يتم إضافة صبغة الفلورسنت إلى كائن المرحلة من أجل تحقيق مستوى مقبول من عينة النقيض من ذلك، وترتيب متحد البؤر تستخدم لتوطين مكانيا الانبعاثات الفلورسنت. وقد أدى هذا الأسلوب إلى تقدم كبير، على سبيل المثال في العلوم الغروي، حيث سمح لها الوصول إلى ديناميكية ثلاثية الأبعاد للأنظمة مزدحمة 9-11. استخدام الوسم هو الفرق المهم بين المجهري متحد البؤر مضان وDIHM، ولكن ميزات أخرى من التقنيات اثنين تستحق المقارنة. DIHM لديه ميزة سرعة كبيرة في هذا الجهاز ليس لها أجزاء متحركة. المرايا المسح الميكانيكية في أنظمة متحد البؤر وضع حد أعلى لمعدل الحصول على البيانات - عادة حوالي 30 لقطة / ثانية للحصول على صورة بكسل 512 X 512. وتستخدم مجموعة من مثل هذه الصور من طائرات التنسيق المختلفة التي يمكن أن يحصل عليها جسديا translating المرحلة عينة أو عدسة الهدف بين الإطارات، مما أدى إلى معدل التقاط النهائية حول حجم واحد في الثانية لمدة 30 إطار المكدس. في المقابل، يمكن لنظام الثلاثية الأبعاد استنادا على كاميرا CMOS الحديثة التقاط 2،000 لقطة / ثانية في نفس حجم الصورة والقرار؛ تتم معالجة كل إطار `حاليا 'لإعطاء لقطة مستقلة من حجم العينة. أن أكرر: ليس مطلوبا من عينات الفلورسنت لDIHM، على الرغم من أن النظام تم تطويره الذي ينفذ إعادة الإعمار الثلاثية الأبعاد للموضوع الفلورسنت 12. فضلا عن معلومات وحدة التخزين ثلاثي الأبعاد، DIHM يمكن أن تستخدم أيضا لتوفير الكمية المرحلة على النقيض من الصور 13، ولكن هذا خارج نطاق المناقشة هنا.

الصور DIHM البيانات الخام هي ثنائية الأبعاد، وفي بعض النواحي تبدو وكأنها صور المجهر القياسية، وإن كان خارج التركيز. والفرق الرئيسي بين DIHM ومعيار المجهر حقل مشرق يكمن في حلقات حيود التي تحيط الأجسام طن مجال الرؤية، وهذه هي نتيجة لطبيعة الإضاءة. يتطلب DIHM مصدر أكثر تماسكا من حقل مشرق - عادة ما يكون LED أو ليزر. حلقات حيود في صورة ثلاثية الأبعاد تحتوي على المعلومات الضرورية لإعادة بناء صورة ثلاثية الأبعاد. هناك نوعان من الأساليب الرئيسية لتفسير البيانات DIHM؛ المباشر المناسب وإعادة تركيز العددية. النهج الأول هو المعمول بها في الحالات التي يعرف الشكل الرياضي للنمط حيود مقدما 3،4؛ يتحقق هذا الشرط من قبل حفنة صغيرة من أشياء بسيطة مثل المجالات، واسطوانات، والعقبات نصف الطائرة. تركيب المباشرة ينطبق أيضا في الحالات التي يعرف الموقف المحوري للكائن، والصورة يمكن تركيبها باستخدام ننظر إلى أعلى الجدول من القوالب صورة 14.

النهج الثاني (إعادة تركيز العددية) بل هي أعم وتعتمد على استخدام حلقات حيود في صورة ثلاثية الأبعاد ثنائي الأبعاد لإعادة بناء المجال البصري عدديا فيعدد من طائرات التنسيق (متباعدة بشكل تعسفي) في جميع أنحاء حجم العينة. توجد العديد من الطرق ذات الصلة للقيام بذلك 6؛ يستخدم هذا العمل رايلي-سمرفلد الظهر تقنية إكثار كما وصفها لي وجرير 5. نتائج هذا الإجراء هو كومة من الصور التي تحاكي تأثير تغيير البؤري المجهر (ومن هنا جاء اسم `إعادة تركيز العددية ') يدويا. مرة واحدة تم إنشاؤها كومة من الصور، يجب الحصول على موقف من هذا الموضوع في الحجم البؤري. ، وقد تم عرض عدد من الاستدلال تحليل الصور، مثل التباين كثافة المحلية أو محتوى التردد المكاني لتحديد من حدة التركيز في نقاط مختلفة في العينة 15. في كل حالة، عندما يتم تكبير الصورة متري معين (أو التقليل منها)، ويعتبر الكائن ليكون في التركيز.

خلافا لغيرها من البرامج التي تسعى إلى تحديد المستوى البؤري خاص حيث هو كائن "في التركيز"، وطريقة في هذا العمل يختار من عoints التي تقع داخل الكائن من الفائدة، والتي قد تمتد عبر مجموعة واسعة من طائرات التنسيق. هذا النهج ينطبق على طائفة واسعة من المواضيع ومناسبة خاصة للمدد، وعينات من نثر ضعيفة (كائنات المرحلة)، مثل الغرويات على شكل قضيب، وسلاسل من البكتيريا أو سياط حقيقية النواة. في مثل هذه العينات يغير الصورة النقيض عندما يمر جسم من خلال البؤري؛ صورة امتبائر بها مركز الضوء إذا كان الكائن على جانب واحد من الطائرة ومركز التنسيق الظلام إذا كان من جهة أخرى. كائنات مرحلة نقية ليس لديهم أي النقيض عندما تقع بالضبط في المستوى البؤري. وقد تمت مناقشة هذه الظاهرة من انعكاس على النقيض من قبل مؤلفين آخرين 16،17 هو في نهاية المطاف وبسبب المرحلة GOUY الشذوذ 18. وقد تم وضع هذا على أساس أكثر صرامة في سياق تصوير ثلاثي الأبعاد في أي مكان آخر، حيث يتم تقييم حدود التقنية، وعدم اليقين في موقف نموذجي هو من أجل من 150 نانومتر (ما يقرب من واحد بكسل) في مجموعة شرق افريقياح 19 اتجاه. على طريقة GOUY مرحلة الشذوذ هو واحد من عدد قليل من مخططات DIHM واضحة المعالم لتحديد بنية الكائنات الموسعة في ثلاثة أبعاد، ولكن مع ذلك بعض الكائنات هي إشكالية لإعادة بناء. الكائنات التي تقع مباشرة على طول المحور البصري (مشيرا في الكاميرا) يصعب إعادة بناء بدقة؛ الشكوك في طول وموضع الكائن تصبح كبيرة. هذا القيد هو في جزء منه نتيجة لعمق بت محدود من وحدات البكسل تسجيل الهولوغرام (عدد مستويات الرمادي المتميزة التي يمكن أن تسجل الكاميرا). يحدث التكوين إشكالية أخرى عند موضع اهتمام هو قريب جدا من المستوى البؤري. في هذه الحالة، يتم بناؤها الصور الحقيقية والافتراضية للكائن على مقربة، مما أدى إلى الحقول البصرية المعقدة التي يصعب تفسيرها. ثانيا، والقلق قليلا أقل أهمية هنا هو أن هامش حيود الناتجة تشغل أقل من صورة الاستشعار، وهذا الوقود النووي المشع الحبيبات الخشنةormation يؤدي إلى إعادة بناء ذات جودة الفقيرة.

في الممارسة العملية، يتم تطبيق مرشح التدرج إلى وحدات تخزين بسيطة أعيد بناؤها ثلاثي الأبعاد للكشف عن ظاهرة الانقلاب كثافة قوية على طول اتجاه الإضاءة. المناطق التي يتغير بسرعة شدة من الضوء إلى الظلام، أو العكس، ثم يتم المرتبطة المناطق نثر. موصوفة جيدا الأجسام نثر ضعيفة، كمجموعة noninteracting من هذه العناصر 20، وهذه المساهمات الفردية المبلغ لإعطاء مجموع الحقل متناثرة الذي هو مقلوب بسهولة باستخدام رايلي-سمرفلد أسلوب ظهر الانتشار. في هذه الورقة، يتم تطبيق كثافة المحوري تقنية الانحدار إلى سلسلة من الخلايا العقدية. أجسام الخلايا هي كائنات المرحلة (الأنواع كولاي ديها معامل الانكسار قياس 21 ليكون 1.384 في الطول الموجي λ = 589 نانومتر؛ من المرجح أن تكون مماثلة سلالة العقدية) وتبدو وكأنها سلسلة عالية الكثافة من النقط المتصلة في اله حجم العينة بعد التصفية التدرج تم تطبيقه. عتبة وميزة أساليب الاستخراج القياسية المطبقة على وحدة التخزين هذه تصفيتها تسمح استخراج بكسل الحجمي (voxels) المقابلة لمنطقة داخل الخلايا. وهناك ميزة خاصة لهذا الأسلوب هو أنه يتيح إعادة الإعمار لا لبس فيه من موقف كائن في الاتجاه المحوري. أساليب مماثلة (على الأقل، وتلك التي الهولوغرام سجل على مقربة من وجوه، من خلال تصويرها الهدف المجهر) يعانون من عدم القدرة على تحديد علامة على هذا النزوح. على الرغم من أن طريقة إعادة الإعمار رايلي-سمرفلد هو أيضا التوقيع مستقلة في هذا المعنى، فإن عملية التدرج يتيح لنا أن تميز بين الكائنات المرحلة ضعيفة فوق وتحت المستوى البؤري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الإعداد والحصول على البيانات

  1. تنمو ثقافة العقدية سلالة V4051-197 (السباحة على نحو سلس) الخلايا في كتاي المتوسطة من الأسهم المجمدة 22. احتضان في شاكر دوارة بين عشية وضحاها في 35 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة، لالتشبع.
  2. تطعيم 10 مل من الطازجة المتوسطة كتاي مع 500 ميكرولتر من ثقافة مشبعة. احتضان لمدة 3.5 ساعة أخرى في 35 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة حتى الخلايا التوصل إلى الكثافة البصرية ما يقرب من 1.0 في λ = 600 نانومتر (حوالي 5 × 10 8 خلية / مل).
  3. تمييع 1:400 في وسائل الإعلام الجديدة للحصول على التركيز النهائي للخلايا متحركة.
  4. على شريحة المجهر، وجعل حلقة من الشحوم (على سبيل المثال من حقنة مليئة الفازلين) حوالي 1 مم في الارتفاع ووضع قطرة من محلول العينة في المركز. وضع غطاء زجاجي على أعلى واضغط برفق على حواف لختم، وضمان أن السائل هو في اتصال مع كل الشرائح والزجاج غطاء. وينبغي أن تكون حجرة العينة الناتجة أروالثانية 100-200 ميكرون في العمق.
  5. وضع حجرة العينة في المجهر مع غطاء زجاجي لأسفل، وبعناية، لمنع تشكيل فقاعات الهواء في النفط بين الزجاج والعدسة.
  6. تركيز المجهر على السطح السفلي من الغرفة العينة، وتحقيق المكثف على التركيز.
  7. إيقاف تشغيل الإضاءة القياسية ووضع الرأس الصمام وراء فتحة المكثف من المجهر. تعيين وادى امدادات الطاقة إلى أقصى الانتاج.
  8. إغلاق الفتحة مكثف إلى أقصى مداه، وإذا لزم الأمر، دفع الصمام في جبل لحين تركزت الإضاءة على فتحة عدسة الهدف.
  9. التبديل على جهاز الكمبيوتر والكاميرا، وتوجيه كل الضوء إلى منفذ الكاميرا المجهر. ضبط معدل الإطار وحجم الصورة في البرنامج الحصول على الصور.
  10. جعل زمن التعرض الإطار قصيرة قدر الإمكان في حين لا يزال الإبقاء على النقيض جيدة. تحقق صورة كثافة الرسم البياني للتأكد من أن الصورة ليست saturaتيد أو تحت المكشوفة.
  11. إذا لزم الأمر، إعادة تركيز المجهر بحيث يتم امتبائر موضع اهتمام قليلا (عادة بنسبة 10-30 ميكرون). يجب أن يكون الهدف والمستوى البؤري في نفس المتوسطة (أي البؤري يجب أن تقع داخل حجرة العينة).

2. إعادة الإعمار

الخطوة الأولى في معالجة البيانات لإعادة تركيز عدديا إطار الفيديو في سلسلة من أعماق مختلفة، وإنتاج كومة من الصور. صديقة للمستخدم البرنامج للقيام بذلك ويمكن الاطلاع هنا: http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html جنبا إلى جنب مع صور سبيل المثال (المكتسبة باستخدام مجهر مقلوب، و60X الغمر النفط عدسة الهدف) وملف المسرح لتتبع أشعة التقديم.

  1. إدخال إطار المصالح والخلفية الخاصة به على شكل ملفات صورة منفصلة، ​​في المربعات ذات الصلة على الواجهة. صورة الخلفية هو الإطار الذي وairly يمثل خلفية شريط الفيديو، في غياب صورة ثلاثية الأبعاد، وسيتم استخدامها لقمع أي الضوضاء نمط ثابت التي يمكن أن تتداخل مع التعريب صورة ثلاثية الأبعاد وتحليلها.
  2. إدخال قيم في مربعات الإعدادات العمومية على الجانب الأيسر من الشاشة قبل تشغيل البرنامج. الثلاثة الأولى هي إخراج معلمات مكدس: الموقف المحوري من الإطار الأول ('بدء التركيز')؛ عدد من الشرائح في كومة بناؤها ('عدد من الخطوات')؛ مسافة محورية بين كل شريحة في المكدس ('حجم الخطوة') .
  3. من أجل إعادة بناء الأجسام مع النسب الصحيح، يجب أن يكون حجم الخطوة بنفس حجم التباعد بكسل الجانبي. دخول الجانبية تردد أخذ العينات الكاميرا (تباعد 1/pixel) في المربع "بكسل / ميكرون"، والطول الموجي الإضاءة ومعامل الانكسار المتوسطة في مربعات الماضيين. القيم الافتراضية للبرنامج هي مناسبة لإعادة بناء البيانات المثال.
  4. اضغط على زر 'Z-التدرج فليب' إذا كان مركز objeط مظلمة في صورة ثلاثية الأبعاد (انظر الإطار سبيل المثال لعام 2005 ومناقشة القسم لمزيد من التفاصيل).
  5. التحقق من ممر الموجة مرشح على / قبالة الدولة (الافتراضي هو جرا). هذا ممر الموجة مرشح اختياري، وتقع في المربع أدناه التبديل التدرج في الوجه، هي المسؤولة عن قمع مساهمة من بكسل صاخبة. يتم تطبيق ممر الموجة مرشح لكل شريحة الصورة على الفور بعد جيل.
  6. التحقق من التبديل الناتج متوسطة على / قبالة الدول (الافتراضي هو جرا). تتم كتابة الخطوات تحليل وسيطة في اثنين من أشرطة الفيديو الناتج، غير مضغوط ملفات افي: الأول هو مكدس تركيز (اسم الملف تنتهي في '_stack.avi')، والثاني هو مكدس بعد العملية التدرج المحوري (اسم الملف تنتهي في ' _gradient.avi '). من الناحية المثالية، سوف يحتوي هذا المكدس الثاني موضع اهتمام أبرز ككائن مشرق على خلفية داكنة.
  7. بعد وضع جميع المعلمات، اضغط على "تشغيل" في النافذة الرئيسية. سيظهر الإطار المحدد في المربع الرئيسي من البرنامج.
  8. استخدامالمكبرة أداة الزجاج وجدت في شريط الأدوات على يسار الصورة للتكبير (فوق اليسار) والتصغير (التحول + فوق اليسار). استخدام الأداة مستطيل على شريط الأدوات لتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI). التقاط أكبر عدد ممكن من هامش الهولوغرام وممكن داخل المستطيل، حيث سيؤدي ذلك إلى تحسين إعادة الإعمار.
  9. اضغط على زر 'عملية' لتوليد اثنين من مداخن الصورة. تفقد المداخن الناتجة باستخدام يماغيج (التي يمكن الحصول عليها مجانا في http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). إذا كان موضع اهتمام ويمكن رؤيتها بوضوح في صورة التدرج مكدس، انتقل إلى الخطوة التالية لاستخراج الإحداثيات الكائن.

3. أداء

  1. إلى جانب إعادة تركيز الإطار، يمكن هذا البرنامج تحديد إحداثيات س، ص، ض لكل فوكسل في كائن من الفائدة. اضغط على زر 'ميزة استخراج "لتمكين هذه الوظيفة.
  2. إدخال مسار، بما في ذلك التمديد (على سبيل المثال: C: منزل output.inc)، لخرج إحداثيات ملف. اختر 'نمط بوف راي "في مربع" تنسيق الإخراج أسلوب'. يؤدي هذا البرنامج إلى إرسال ملف الكائن الذي يمكن تصور باستخدام بوف راي حزمة البرامج raytracing الحرة (التي يمكن الحصول عليها من http://www.povray.org/ ).
  3. اعادة معالجة الصور كما في القسم 2 أعلاه. سيوفر البرنامج سلسلة من (س، ص، ض) الإحداثيات في العائد على الاستثمار مختارة، وكتب إلى اسم الملف في 'إخراج التنسيق' مربع. استخراج الإحداثيات الكائن يأخذ فترة أطول كثيرا من الجيل المكدس.
  4. تأكد من أن العينة ملف بوف راي (مرفق مع رمز إعادة الإعمار) هو في نفس المجلد مثل ملف الإحداثيات ولدت للتو. تحرير ملف بوف العينة. واستبدال اسم الملف في الفواصل المقلوب على الخط
    # تشمل "MYFILE.inc"
    مع اسم ملف البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة رمز إعادة الإعمار.
  5. انقر فوق الزر 'تشغيل' في بوف راي لتقديم صورة نقطية. Tانه موقف الكاميرا، والإضاءة وخيارات الملمس ليست سوى عدد قليل من التخصيصات ممكن في بوف راي؛ راجع وثائق على الانترنت لمزيد من التفاصيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

للتدليل على قدرات DIHM، أجريت التجارب على سلسلة من البكتيريا العقدية. سلسلة نفسها قياس 10.5 مم طويل، وكان يتألف من 6-7 خلايا اسطوانية الكروية (اثنين من الخلايا في سلسلة هي قريبة من تقسيم) بأقطار في نطاق 0،6-1 ميكرون. أرقام 1A 1B وتظهر الواجهة الرئيسية إعادة الإعمار وبرنامج التقديم. وينظر إلى أمثلة من هذا الإجراء إعادة تركيز العددية في الشكل 2، حيث تم تطبيق ممر الموجة مرشح المكانية. الشكل 3 يظهر تأثير مرشح التدرج على الصور في الشكل 2. هي واحدة من البيانات الخام المستخدمة في بناء كل من هذه الصور مع تحميل الكود كما المثال الإطار 108. أخيرا، ويبين الشكل 4 تأثير بيانات جيدة ورديئة الجودة على هندسة أعيد بناؤها. واتخذت كل من الإطارات في هذا الرقم الأخير من شريط فيديو من وسامسلسلة (ه) من الخلايا (سلسلة مختلفة إلى واحد في الأرقام الأولين). وإعادة البناء الجيد هو ممكن في معظم الحالات، ولكن عندما يتم توجيه سلسلة النهاية على إعادة إعمار فشل، وإعطاء كائن جولة كبيرة في المستوى البؤري. هذا الوضع الفشل هو سمة من الكائنات الموجهة على طول المحور البصري. على نطاق و، في الصور المقدمة كمبيوتر، يتحقق على الأرض هي 1 ميكرون على الجانب. للاطلاع على مناقشة أكثر تفصيلا من الدقة ودقة هذه الطريقة، يجب استشارة القراء ويلسون وتشانغ 19.

الشكل 1
الشكل 1. واجهات البرمجيات. يظهر الواجهة الرئيسية للبرنامج إعادة الإعمار في لوحة (أ)، حيث صندوق الإدخال الملف، المعلمات الإعدادات العمومية وميزات أخرى هامةالمشار إليها في النص تم تسليط الضوء عليها. لوحة (ب) يظهر ملف سبيل المثال مشهد لبوف راي، في تحرير المشهد الافتراضي للبرنامج. يجب تعيين اسم الملف بين علامتي اقتباس على خط اشارت الى ملف الإخراج من برنامج إعادة الإعمار. قد يكون من الضروري تغيير موقع الكاميرا واتجاهها (القسم ذات الصلة المشار إليها) من أجل تصور صحيح اعادة الاعمار. راجع وثائق بوف راي على الانترنت لمزيد من التعليمات. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 2
الشكل 2. أمثلة من الصور تركيز عدديا. لوحات شخصية في المعرض العمود الأيمن تركيز عدديا(س، ص) طائرات في مجموعة متنوعة من المرتفعات داخل حجم أعيد بناؤها (كما هو مبين) يظهر أسفل الصورة اليسرى البيانات ثلاثية الأبعاد الأصلي، وتنقسم من خلال البيانات في الخلفية. يظهر لوحة كبيرة على الناحية اليمنى و(خ، ض) شريحة من خلال نفس المكدس. نقطة انعكاس المقابل على طول محور ض يمكن رؤيتها بوضوح عند حوالي ثلث الطريق من الجزء العلوي من الصورة. الخطوط الحمراء على العرض صورة بشكل اكبر حيث هذه الطائرة (خ، ض) يتقاطع (س، ص) الطائرات إلى اليسار. وبالمثل، فإن الخطوط الزرقاء في لوحات صغيرة تظهر تقاطع (خ، ض) شريحة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 3
الرقم 3. أمثلة من الصور التي تمت تصفيتها التدرج.0؛ هذه الصورة تبين أثر تطبيق مرشح التدرج إلى البيانات في الشكل 2. لاحظ أن الكائن من الفائدة يتم تمييز بمثابة نقطة مضيئة متناظرة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 4
الشكل 4. أمثلة من البيانات التي تؤدي إلى صور جيدة والفقراء المقدمة. والصورتين في لوحات (أ) و (ج) أخذت من شريط الفيديو نفسه من سلسلة تراجع من الخلايا. البيانات في لوحة (أ) تمثل معظم الإطارات في هذه السلسلة، التي لا يتم توجيه سلسلة مباشرة على طول المحور البصري. شكل وموضع الكائن مستنسخة بأمانة فيتقديم في لوحة (ب). في حالة لوحة (ج)، وسلسلة موجهة للحظات نهاية إلى المستوى البؤري؛ الكائنات في هذا التكوين من الصعب إعادة بناء، وعادة ما تسفر عن 'فقاعة' على مقربة من المستوى البؤري، كما رأينا في لوحة (د ). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أهم خطوة في هذا البروتوكول التجريبي هو التقاط دقيقة من الصور من الإعداد التجريبية مستقرة. مع البيانات الأساسية الفقراء والتعمير الدقة العالية هو أقرب إلى المستحيل. من المهم أيضا لتجنب العدسات الهدف مع عنصر النقيض من المرحلة الداخلية (مرئية كما بالطوق الظلام عندما تبحث عن طريق الجزء الخلفي من الهدف)، وهذا يمكن أن تتحلل الصورة أعيد بناؤها. وينبغي أن يكون موضع اهتمام بعيدا بما فيه الكفاية من المستوى البؤري أن بضعة أزواج من هامش حيود واضحة في صورتها (أ ارشادي مناسبة هو أن نمط امتبائر يجب أن تظهر لديك 10 مرات البعد الخطي للكائن مركزة - راجع بيانات المثال ). الأشياء القريبة جدا من المستوى البؤري يعانون من التوأم الصورة وأخذ العينات القطع الأثرية، كما هو موضح سابقا. من المهم أيضا أن يكون هناك توصيف جيد للتباعد الكاميرا بكسل، وهذا يشكل عاملا حاسما في تحديد مسافات إعادة التركيز بشكل صحيح. في كثير من الأحيان، وكاميرا documentatأيون سوف قائمة 'حجم بكسل' في المواصفات، وهذا يمكن أن يكون غامضا قليلا، لأنواع معينة من الكاميرا (الكاميرات CMOS على وجه الخصوص) يمكن أن يكون لها مساحات كبيرة من الفضاء بين بكسل التي ليست حساسة للضوء. الطريقة الأكثر موثوقية للحصول على هذه المعلومات هي استخدام هدف المعايرة القياسية، مثل القوات الجوية الأمريكية 1951 قرار المخطط، وقياس تردد أخذ العينات (عدد بكسل لكل ميكرومتر) مباشرة من الصورة.

والحد من الإضاءة أحادي اللون، تم تعيين دقة نظام DIHM نهاية المطاف من قبل الفتحة العددية للعدسة الهدف (NA) والطول الموجي من (λ) إضاءة 23،24. نقطة تفصل أفقيا يجب أن تقع على الأقل مسافة Δ اللات = 'λ' / 2NA بصرف النظر إذا ما أريد لها أن تحل بشكل منفصل. وبالمثل، يتم إعطاء قرار الحد المحوري في حالة مثالية ل 'Δ' الفأس = λ / 2 (NA) 2. عند استخدام LED في DIHM، هناك حد لعمقوحدة التخزين التي يمكن تصويرها، وهذا يتحدد في نهاية المطاف من قبل النظام البصري وتماسك الإضاءة. وعمق نموذجية من هذا 'حجم حساسة "حوالي 100-200 ميكرون لLED، على الرغم من وصفا تفصيليا لهذا النوع من التأثير يمكن العثور في أي مكان آخر 25. هو حجم الحساسة محدودة في الأخريين الاتجاهات حسب حجم من الصورة. على الرغم من أن البرنامج هو قوية إلى حد ما، بعض العمليات هي بالأحرى الذاكرة الجياع. إعادة بناء مكدس الصورة والحصول على التدرج كثافة على حد سواء المحافظ إلى حد ما، ولكن يمكن استخراج إحداثيات سمة من سمات الفائدة من كومة التدرج تستهلك الكثير من الذاكرة (عدة مئات ميغابايت إلى عدة غيغابايت). تحقيقا لهذه الغاية، فإنه من المستحسن لتقييد حجم أعيد بناؤها من تهم 100-150 بكسل في كل البعد. يمكن تخفيف هذا القيد نوعا ما إذا تم تشغيل التعليمات البرمجية على نظام تشغيل 64 بت مع أكثر من 4 غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي (وقد كتب البرنامج على الجهاز مع 12 غيغابايت)،على الرغم من أن الوقت اللازم للحساب يمكن أن تصبح باهظة.

لدراسة نظام أكبر، ومصدر للضوء LED ويمكن الاستعاضة عن الليزر، والذي يسمح إعادة بناء الأجسام الكذب على عمق أكبر بكثير من المستوى البؤري - بسهولة ما يصل إلى ملليمتر - وعلى أقل التكبير. التجارب الأولية مع مثل هذا الإعداد، وذلك باستخدام ليزر ديود إلى جانب الألياف البصرية أحادية النمط، يسمح بناؤها أعماق تصل إلى 10 ملم باستخدام الهدف 10X المجهر. هذا العمق زيادة الحقل يأتي بتكلفة، ولكن؛ كبيرة طول التماسك الليزر يؤدي إلى تشويش الصورة، وخاصة الانعكاسات من السطوح المختلفة في القطار البصرية ويقابل هذه الآثار إلى حد ما (على جدران حجرة العينة، السطوح عدسة، الخ.) عندما الجهاز مستقرة بما فيه الكفاية للحصول على صورة خلفية جيدة. ومع ذلك، وانعكاسات غريبة لها التوزيع غير معروف من مراحل، لذلك إذا حجمها هي مماثلة لتلك الموجة المرجعية (ضوء unscattered)، التعميريمكن أن تصبح كشن المستحيل. الكتاب الآخرين قد عدلت تماسك مصدر ضوء الليزر، على سبيل المثال، من خلال تحوير الليزر القيادة الحالية 26 أو باستخدام الدورية شاشة زجاجية الأرض للحد من التماسك 27.

من وجهة نظر استكشاف الأخطاء وإصلاحها نظر، واجه معظم المشاكل أثناء استخدام برنامج إعادة الإعمار الثلاثية الأبعاد هي أفضل حل عن طريق التفتيش المراحل الانتقالية من تحليل البيانات. في حالة الصورة أعيد بناؤها المكدس، الكائنات يجب 'deblur' بشكل متناظر لأنها تأتي في التركيز. إذا كان هامش حيود تبدو غير المتكافئة بقوة، صورة خلفية فقيرة أو تعويض في كثير من الأحيان إلى إلقاء اللوم. إذا كان قد تم التقاط الصورة لاعادة الاعمار من كومة من صور مماثلة، على سبيل المثال إطارا من سلسلة فيديو لجسم متحرك، ويمكن في بعض الأحيان الحصول على صورة خلفية عن طريق حساب متوسط ​​(عن طريق متوسط ​​أو متوسط) القيم بكسل عبر كل من الفيديو الإطارات. إذا تحرك هذا الموضوع بشكل كبير خلال تسلسل الفيديو، لمساهمة إلى أي قيمة بكسل واحد صغير وسوف تأتي مساهمة المهيمنة من إطارات الخلفية دون تغيير في أي موضوع كان غائبا. وفي حالة ما إذا لم يتم إرجاع الإحداثيات الكائن بشكل صحيح، يمكن التدرج صورة مكدس تكون مفيدة التشخيص. إذا تم النظر إلى الكائن كما فراغا تحيط بها حلقة مشرقة في صورة التدرج المكدس، وينبغي انقلبت مرشح التدرج والصورة إعادة تصنيعها. كما ذكر في المقدمة، وطريقة إعادة الإعمار رايلي-سمرفلد غير حساس لعلامة مسافة كائن من البؤري. إذا كائنين نثر ضعيفة هي نفس المسافة من البؤري ولكن على طرفي نقيض، فإنها تأتي في التركيز في نفس الموقف في الصورة أعيد بناؤها المكدس. ومع ذلك، سيكون عكس أنماطها كثافة المحوري. مركز الكائن وجدت أصلا فوق المستوى البؤري (فيما يتعلق الهندسة مجهر مقلوب) يتغير من الضوء إلى الظلام على مرورا بو في التركيزsition، في حين أن جسم أدناه التغييرات البؤري من الظلام الى النور. وبالتالي فإن الخيار التدرج الوجه مقتطفات إما كائنات فوق المستوى البؤري (الافتراضي) أو أقل من المستوى البؤري (مع التدرج الوجه لمجموعة 'على')، وهو ما يعطي محوري لا لبس فيها التنسيق. لاحظ أن هذا يحمل بدقة فقط لكائنات نثر ضعيفة؛ الأسلوب يعمل بشكل جيد جدا لالمجهرية البوليسترين تصل إلى 1 ميكرومتر في القطر، ولكن بشكل أقل لجزيئات البوليستيرين أكبر. العينات البيولوجية تظهر عادة نثر أضعف بكثير، ومؤشراتها الانكسار هي أقرب إلى الوسط المحيط (البوليسترين لديها معامل الانكسار على مقربة من 1.5)، الأجسام الكبيرة حتى يمكن دراستها.

من حيث التوجهات المستقبلية، ويمكن تمديد هذا البرنامج لمعالجة إطارات متعددة في الفيديو، لتمكين تتبع الكائنات الدقيقة السباحة أو الجسيمات الغروية في ثلاثة أبعاد. معدل الإطار العالية التي تتيح هذه التقنية هي مناسبة تماما لتتبع حتى أسرع السباحةالسائدة، مثل الضمة alginolyticus التي تعيش في المحيطات، والتي تسبح بسرعات تصل إلى 150 ميكرون / ثانية 28. وتتبع مسارات السباحة مجهرية من الخلايا واحد لأول مرة منذ بعض الوقت 29، ولكن هذا عادة ما يتطلب أجهزة متخصصة. المرحلة GOUY الاقتراب الشذوذ ليس فقط يفسح المجال لتتبع بسيط واحد من الخلايا عبر مسافات طويلة، ولكن يتيح الفرصة لدراسة العلاقات المتبادلة بين سلوك السباحة من مختلف الأفراد. هذا يعتمد تحديدا على الهندسة ثلاثية الأبعاد، والبيانات التي كانت حتى الآن لا يمكن الوصول إليها لأسباب فنية.

كما ذكر في المقدمة، مقارنة مع مضان المجهري متحد البؤر ليست مثالية، ولكن انتشار ونظم متحد البؤر يجعل المقارنة من الجانب التصوير ثلاثي الأبعاد جديرة بالاهتمام. في الواقع، DIHM مكمل للالمجهري متحد البؤر، وهناك مزايا وعيوب كل من المقارنة. DIHM يسمح أسرع بكثير acquisitio البياناتمعدلات ن: عدة آلاف من وحدات التخزين في الثانية الواحدة أمر روتيني، نظرا الكاميرا بسرعة كافية. وهذا يسمح تتبع (على سبيل المثال) البكتيريا السباحة متعددة، الذي هو أبعد من قدرة نظم متحد البؤر أبطأ. حتى مع وجود الكاميرا بسرعة، DIHM هو أمر من حجم أرخص من المجهري متحد البؤر، ويمكن تخزين البيانات لحجم ثلاثي الأبعاد في صورة ثنائية الأبعاد واحد، والحد من الطلب على تخزين البيانات والنسخ الاحتياطي. DIHM هو أكثر استيعابا بسهولة بمعنى أن العمل مع تكبير السفلى، عينات أكبر ومسافات أطول العمل هو تافهة. المجهري متحد البؤر لا تزال لديه اليد العليا في عينات كثيفة أو معقدة، ولكن. على سبيل المثال، في تعليق الغروية الكثيفة، نثر متعددة يجعل من المستحيل عمليا إعادة الإعمار الثلاثية الأبعاد؛ فإن نظام متحد البؤر إما في الانبعاثات الفلورسنت أو وضع انعكاس تكون أكثر ملاءمة لدراسة مثل هذه النظم 9. علاوة على ذلك، متحد البؤر المجهري هو خيار أكثر طبيعية لأنظمة التجريبية التي ووضع العلامات luorescent له أهمية مركزية. على الرغم من ثبت مضان تصوير ثلاثي الأبعاد للعمل مع مجموعة من اختبار يخضع 30 كفاءة جمع هو حاليا أقل بكثير من أن نظام متحد البؤر جيدة. علاوة على ذلك، مثل هذه النظم التجريبية تتطلب حاليا أجهزة البصرية المتخصصة والخبرة في العمل؛ نأمل أنها سوف تصبح متاحة على نطاق أوسع مع مزيد من التطوير.

باختصار، DIHM لا نظير له في قدرته على الحصول على صور عالية الدقة ثلاثية الابعاد من الكائنات المجهرية، بسرعات عالية. نحن نقدم البرمجيات سهلة الاستخدام التي تجعل من هذه التقنية في متناول nonspecialist مع تعديلات الحد الأدنى لمجهر القائمة. وعلاوة على ذلك، فإن البرنامج إعادة الإعمار يتكامل بسهولة مع برنامج العرض متاحة بحرية الكمبيوتر. وهذا يسمح التصور بديهية من الموضوعات المجهرية، للعرض من أي زاوية. نظرا لطبيعة ثلاثية الأبعاد من العديد من العمليات المجهرية سريع يضم هذاكائنات نثر ضعيفة جي (مثل الضرب سياط حقيقية النواة أو أهداب، والسباحة البكتيريا، أو نشرها الغرويات)، وينبغي أن تكون هذه التقنية من الفائدة عبر مجموعة واسعة من المجالات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

والمؤلفان بالشكر ليندا تيرنر للمساعدة في إعداد الميكروبيولوجية. وتم تمويل RZ وLGW من قبل معهد رولاند في جامعة هارفارد وCGB كما تم تمويل مؤسسة عالم الرؤوس، والعلوم بلا حدود البرنامج، البرازيل (عملية # 7340-11-7)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope Nikon Corp.  
LED Thorlabs M660L3 emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm 
LED power supply Thorlabs LEDD1B  
Thread Adapter Thorlabs SM2T2  
Thread Adapter Thorlabs SM1A2  
Frame Grabber board EPIX PIXCI E4  
High-Speed CMOS camera Mikrotron MC-1362  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. Digital in-line holography for biological applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).
  2. Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).
  3. Lee, S. H., Roichman, Y., et al. Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy. Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).
  4. Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy. Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).
  5. Lee, S. H., Grier, D. G. Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures. Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).
  6. Kim, M. Principles and techniques of digital holographic microscopy. SPIE Rev. 1, 018005 (2010).
  7. Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. Tracking sperm in three-dimensions. Biochem. Biophys. Res. Comm. 373, 125-129 (2008).
  8. Santi, P. Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review. J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).
  9. van Blaaderen, A., Wiltzius, P. Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).
  10. Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear. Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).
  11. Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses. Science. 318, 1895-1899 (2007).
  12. Rosen, J., Brooker, G. Fluorescence incoherent color holography. Opt. Exp. 15, 2244-2250 (2007).
  13. Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy. Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).
  14. Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical. J. Vis. Exp. 34, (2009).
  15. Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl. Opt. 47 (19), (2008).
  16. Elliot, M. S., Poon, W. C. K. Conventional optical microscopy of colloidal suspensions. Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).
  17. Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).
  18. Born, M., Wolf, E. Principles of Optics, 6th Ed. , Cambridge University Press. (1998).
  19. Wilson, L., Zhang, R. 3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation. Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).
  20. Bohren, C., Huffman, D. Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , John Wiley & Sons. (1983).
  21. Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. Refractive index of escherichia coli cells. Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).
  22. Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria. Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).
  23. Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J. Digital in-line holographic microscopy. Appl. Optics. 45 (5), 836-850 (2006).
  24. Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform. Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).
  25. Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence. Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).
  26. Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers. Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).
  27. Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source. Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).
  28. Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed. Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).
  29. Berg, H. C., Brown, D. A. Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking. Nature. 239 (5374), 500-504 (1972).
  30. Brooker, G., Siegel, N., Wang, V., Rosen, J. Optimal resolution in Fresnel incoherent correlation holographic fluorescence microscopy. Opt. Express. 19 (6), 5047-5062 (2011).

Tags

بروتوكول الأساسية، العدد 84، تصوير ثلاثي الأبعاد، مضمنة الرقمية المجهر الثلاثية الأبعاد (DIHM)، علم الأحياء الدقيقة، المجهري، والتصوير 3D،
الرقمية المضمنة المجسم مجهرية (DIHM) من الموضوعات وكلي نثر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Giuliano, C. B., Zhang, R., Wilson,… More

Giuliano, C. B., Zhang, R., Wilson, L. G. Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects. J. Vis. Exp. (84), e50488, doi:10.3791/50488 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter