Summary
Le posizioni tridimensionali di oggetti debolmente scattering possono essere identificati univocamente tramite linea digitale microscopia olografica (DIHM), che comporta una modifica minore ad un microscopio standard. Il nostro software utilizza un semplice euristica di imaging accoppiato con Rayleigh-Sommerfeld back-propagation cedere la posizione tridimensionale e la geometria di un oggetto fase microscopico.
Abstract
Oggetti debolmente di scattering, come piccole particelle colloidali e la maggior parte delle cellule biologiche, si incontrano spesso in microscopia. Infatti, una serie di tecniche sono state sviluppate per visualizzare meglio questi oggetti di fase; contrasto di fase e DIC sono tra i metodi più diffusi per migliorare il contrasto. Tuttavia, la posizione di registrazione e la forma in direzione out-of-imaging-plane rimane difficile. Questa relazione introduce un semplice metodo sperimentale per determinare con precisione la posizione e la geometria di oggetti in tre dimensioni, utilizzando la microscopia olografica digitale inline (DIHM). In generale, il volume del campione accessibile è definita dalla dimensione del sensore telecamera nella direzione laterale, e la coerenza illuminazione nella direzione assiale. Volumi di campione tipiche vanno da 200 micron x 200 micron x 200 micron con illuminazione a LED, per5 millimetri x 5 mm x 5 mm o superiore in illuminazione laser. Questa luce di illuminazione è configurato in modo che le onde piane sono incidenti sul campione. Oggetti nel volume del campione poi diffondono la luce, che interferisce con la luce unscattered per formare modelli di interferenza perpendicolare alla direzione di illuminazione. Questa immagine (l'ologramma) contiene le informazioni profondità richiesta per ricostruzione tridimensionale, e può essere catturata su un dispositivo di imaging quali uno CMOS o CCD. Il metodo Back Propagation Rayleigh-Sommerfeld è impiegato per rifocalizzare numericamente immagini al microscopio, e una semplice euristica di imaging basata sulla fase Gouy anomalia viene utilizzato per identificare spargendo oggetti all'interno del volume ricostruito. Questo metodo semplice e robusto risulta in un, misura univoca senza modello della posizione e forma degli oggetti in campioni microscopici.
Introduction
Linea digitale microscopia olografica (DIHM) permette veloce l'imaging tridimensionale di campioni microscopici, quali microrganismi nuoto 1,2 e sistemi di materia morbidi 3,4, con modifiche minime a una configurazione microscopio standard. In questo documento viene fornita una dimostrazione pedagogica di DIHM, incentrata su software sviluppato nel nostro laboratorio. Questo documento contiene una descrizione di come impostare il microscopio, ottimizzare l'acquisizione dei dati, ed elaborare le immagini registrate per ricostruire i dati tridimensionali. Il software (basato in parte su software sviluppato dalla DG Grier e altri 5) e immagini di esempio sono disponibili gratuitamente sul nostro sito web. Fornire una descrizione dei passaggi necessari per configurare il microscopio, ricostruire i volumi tridimensionali da ologrammi e rendere i volumi risultanti di interesse utilizzando un raggio gratuito tracing pacchetto software. L'articolo si conclude con una discussione di fattori che incidono sulla qualità della ricostruzione, E un confronto di DIHM con metodi concorrenti.
Anche se DIHM stato descritto qualche tempo fa (per una revisione generale dei suoi principi e sviluppo, vedi Kim 6), la potenza di calcolo necessaria e la competenza di elaborazione delle immagini hanno sinora in gran parte limitato l'uso di gruppi di ricerca specializzati con una particolare attenzione allo sviluppo dello strumento. Questa situazione sta cambiando alla luce dei recenti progressi nella tecnologia informatica e fotocamera. Computer desktop moderni possono facilmente far fronte con la trasformazione e sui requisiti di archiviazione dati; telecamere CCD o CMOS sono presenti nella maggior parte dei laboratori di microscopia e del software necessario è effettuata liberamente disponibile su internet da gruppi che hanno investito tempo nello sviluppo della tecnica.
Vari sistemi sono stati proposti per l'imaging la configurazione di oggetti microscopici in un volume di campione tridimensionale. Molti di questi sono tecniche di scansione 7,8, in cui una pila di immagini viene registrata dalla mechanically tradurre il piano dell'immagine attraverso il campione. Confocale a scansione microscopia a fluorescenza è forse l'esempio più familiare. Tipicamente, un colorante fluorescente viene aggiunto a un oggetto fase per raggiungere un livello accettabile di contrasto campione, e la disposizione confocale utilizzato per localizzare spazialmente emissione fluorescente. Questo metodo ha portato a progressi significativi, per esempio nel campo della scienza colloidale in cui è consentito l'accesso alla dinamica tridimensionale di sistemi affollati 9-11. L'uso di etichettatura è una differenza importante tra la microscopia confocale e DIHM, ma le altre caratteristiche delle due tecniche sono paragonabili. DIHM ha un vantaggio significativo in velocità che l'apparecchio ha parti in movimento. Gli specchi a scansione meccanica in sistemi confocale pongono un limite superiore sul tasso di acquisizione dei dati - in genere circa 30 fotogrammi / sec per immagine pixel a 512 x 512. Una pila di tali immagini da diversi piani focali può essere ottenuta con fisicamente transldall'uso della fase del campione o lente obiettivo tra i fotogrammi, portando ad una velocità di acquisizione finale di circa un volume al secondo per uno stack frame 30. In confronto, un sistema olografico basato su una moderna fotocamera CMOS in grado di catturare 2.000 fotogrammi / sec con le stesse dimensioni e la risoluzione dell'immagine, ogni fotogramma viene elaborato `in linea 'per dare uno snapshot indipendente dal volume del campione. Per ribadire: campioni fluorescenti non sono richiesti per DIHM, anche se un sistema è stato sviluppato che esegue la ricostruzione olografica di un soggetto fluorescente 12. Nonché informazioni sul volume tridimensionale, DIHM può anche essere utilizzato per fornire immagini a contrasto di fase quantitative 13, ma che non rientra nell'ambito della discussione qui.
Immagini di dati Raw DIHM sono bidimensionali, e per certi aspetti sembrano immagini al microscopio normali, anche se fuori fuoco. La differenza principale tra DIHM e microscopia a campo luminoso norma risiede negli anelli di diffrazione che circondano oggetti in il campo visivo; questi sono a causa della natura della illuminazione. DIHM richiede una fonte più coerente del campo luminoso - tipicamente un LED o laser. Gli anelli di diffrazione nell'ologramma contengono le informazioni necessarie per ricostruire una immagine tridimensionale. Ci sono due approcci principali per l'interpretazione dei dati DIHM; rifocalizzazione montaggio e numerica diretta. Il primo approccio è applicabile nei casi in cui la forma matematica del modello di diffrazione è noto in anticipo 3,4; questa condizione è soddisfatta da una piccola manciata di oggetti semplici come sfere, cilindri, e ostacoli mezzo aereo. Raccordo diretto si applica anche nei casi in cui la posizione assiale dell'oggetto è noto, e l'immagine può essere montato utilizzando una tabella di look-up di modelli di immagini 14.
Il secondo approccio (rifocalizzazione numerico) è invece più generale e si basa sull'utilizzo degli anelli di diffrazione dell'immagine ologramma bidimensionale a ricostruire numericamente il campo otticoun numero di (arbitrariamente distanziati) piani focali in tutto il volume del campione. Esistono diversi metodi correlati per fare questo 6; questo lavoro utilizza il Rayleigh-Sommerfeld indietro tecnica di propagazione come descritto da Lee e Grier 5. L'esito di questa procedura è una pila di immagini che riproducono l'effetto di modificare manualmente il piano focale del microscopio (da qui il nome `rifocalizzazione numerica '). Una volta che è stata generata una pila di immagini, la posizione del soggetto nel volume focale deve essere ottenuta. Una serie di euristica di analisi delle immagini, come ad esempio la varianza intensità locale o contenuto di frequenza spaziale, sono stati presentati per quantificare la nitidezza di messa a fuoco in diversi punti del campione 15. In ogni caso, quando una particolare metrica immagine è ingrandita (o minimizzata), l'oggetto è considerato a fuoco.
A differenza di altri programmi che cercano di identificare un piano focale particolare se un oggetto è 'a fuoco', il metodo in questo lavoro individua points che si trovano dentro l'oggetto di interesse, che possono giungere attraverso una vasta gamma di piani focali. Questo approccio si applica ad una vasta gamma di argomenti ed è particolarmente adatto per estesi, campioni debolmente-Scattering (oggetti fase), come colloidi astiformi, catene di batteri o flagelli eucariotici. In tali campioni il contrasto dell'immagine cambia quando l'oggetto passa attraverso il piano focale; un'immagine sfocata ha un centro luce se l'oggetto è su un lato del piano focale e un centro scuro se è dall'altra. Oggetti pura fase hanno poco o nessun contrasto quando esse si trovino esattamente nel piano focale. Questo fenomeno di inversione contrasto è stato discusso da altri autori 16,17 ed è infine dovuto alla fase Gouy anomalia 18. Questo è stato introdotto in forma più rigorosa nel contesto di olografia altrove, dove vengono valutati i limiti della tecnica, la tipica incertezza in posizione è dell'ordine di 150 nm (circa un pixel) in EACh direzione 19. Il metodo della fase anomalia Gouy è uno dei pochi regimi DIHM ben definiti per determinare la struttura di oggetti estesi in tre dimensioni, ma comunque alcuni oggetti sono problematici per ricostruire. Gli oggetti che si trovano direttamente lungo l'asse ottico (indicando la telecamera) sono difficili da ricostruire con precisione, incertezze nella lunghezza e la posizione dell'oggetto diventano grandi. Questa limitazione è in parte dovuta alla profondità bit ristretta dei pixel di registrazione dell'ologramma (il numero di livelli di grigio distinti che la fotocamera può registrare). Un'altra configurazione problematica si verifica quando l'oggetto di interesse è molto vicino al piano focale. In questo caso, le immagini reali e virtuali dell'oggetto sono ricostruiti in prossimità, dando luogo a campi ottici complessi che sono difficili da interpretare. Un secondo, leggermente meno importante preoccupazione qui è che le frange di diffrazione risultanti occupano meno del sensore di immagine, e questo inf grossolana graniormazione porta ad una ricostruzione più povera qualità.
In pratica, un filtro gradiente semplice viene applicato ai volumi ricostruiti tridimensionali per rilevare forti inversioni intensità lungo la direzione di illuminazione. Regioni dove l'intensità cambia rapidamente dal chiaro allo scuro, o viceversa, vengono quindi associati con le regioni di scattering. Oggetti debolmente di scattering sono ben descritti come una collezione non interagenti di tali elementi 20, questi contributi individuali somma per dare il campo diffuso totale che è facilmente invertita utilizzando il retro metodo di propagazione di Rayleigh-Sommerfeld. In questo lavoro, l'intensità tecnica gradiente assiale viene applicato a una catena di cellule Streptococcus. I corpi cellulari sono oggetti di fase (la specie E. coli ha un indice di rifrazione misurato 21 per essere 1.384 alla lunghezza d'onda λ = 589 nm; ceppo Streptococcus è probabilmente simili) e appaiono come una catena ad alta intensità di blob collegati in thè stata applicata e volume del campione dopo il filtro gradiente. Soglia e includono metodi di estrazione standard applicati a questo volume filtrato consentono l'estrazione di pixel volumetrici (voxel) corrispondenti alla regione all'interno delle cellule. Un particolare vantaggio di questo metodo è che permette la ricostruzione non ambigua di posizione di un oggetto in direzione assiale. Metodi simili (almeno, quelli che registrano ologrammi vicino all'oggetto, impressi attraverso un obiettivo microscopio) soffrono di essere in grado di determinare il segno di questo spostamento. Anche se il metodo di ricostruzione Rayleigh-Sommerfeld è anche l'accesso indipendente in questo senso, l'operazione di sfumatura permette di discriminare tra oggetti deboli fase sopra e sotto il piano focale.
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Protocol
1. Setup and Data Acquisition
- Far crescere una cultura di Streptococcus ceppo V4051-197 (nuoto liscio), le cellule in KTY medio da congelato magazzino 22. Incubare in un agitatore rotativo notte a 35 ° C e 150 rpm, a saturazione.
- Inoculare 10 ml di mezzo fresco KTY con 500 microlitri della cultura satura. Incubare per un ulteriore 3,5 ore a 35 ° C e 150 rpm fino a quando le cellule raggiungono una densità ottica di circa 1,0 a λ = 600 nm (circa 5 x 10 8 cellule / ml).
- Diluire 1:400 in mezzi freschi per ottenere la concentrazione finale di cellule mobili.
- Su un vetrino da microscopio, fare un anello di grasso (per esempio da una siringa riempita di vaselina) di circa 1 mm di altezza e una goccia della soluzione campione al centro. Inserire un vetro di copertura sulla parte superiore e premere leggermente ai bordi per sigillare quella che liquido è in contatto sia con vetrino e coprioggetto. La camera del campione risultante dovrebbe essere around 100-200 micron di profondità.
- Posizionare la camera di campione nel microscopio con il vetro di copertura rivolto verso il basso, e con attenzione, per evitare la formazione di bolle d'aria nell'olio tra vetro e lente.
- Fuoco il microscopio sulla superficie inferiore della camera del campione, e portare il condensatore a concentrarsi.
- Spegnere l'illuminazione standard e posizionare la testina LED dietro l'apertura del condensatore del microscopio. Impostare il LED di alimentazione alla massima potenza.
- Chiudere l'apertura del condensatore a sua misura massima e, se necessario, spostare il LED relativo supporto fino a quando l'illuminazione è centrata sul diaframma lente dell'obiettivo.
- Accendere il computer e la macchina fotografica, e reindirizzare tutta la luce alla porta macchina fotografica del microscopio. Regolare il frame rate e la dimensione dell'immagine nel software di acquisizione immagini.
- Rendere il tempo di esposizione telaio il più breve possibile, pur mantenendo un buon contrasto. Controllare un'intensità istogramma dell'immagine per assicurare che l'immagine non è saturated o sottoesposta.
- Se necessario, riorientare il microscopio in modo tale oggetto di interesse è leggermente sfocato (tipicamente del 10-30 micron). L'oggetto e il piano focale dovrebbe essere nello stesso mezzo (cioè il piano focale dovrebbe trovarsi all'interno della camera del campione).
2. Ricostruzione
Il primo passo di elaborazione dati è riorientare numericamente un fotogramma video di una serie di diverse profondità, producendo una pila di immagini. Software di facile utilizzo per fare questo possono essere trovate qui: http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html insieme a esempio immagini (acquisite utilizzando un microscopio invertito, e una immersione in olio lente obiettivo 60X) e un file di scena per il raggio tracciato rendering.
- Inserire il telaio di interesse e rispettiva background come file immagine separati, nelle caselle relative sull'interfaccia. Una immagine di sfondo è una cornice che fAirly rappresenta lo sfondo del video, in assenza dell'ologramma, e verrà utilizzato per sopprimere qualsiasi rumore schema fisso che potrebbe interferire con la localizzazione ologramma e analisi.
- Inserire i valori nelle caselle di impostazioni globali sul lato sinistro dello schermo prima di eseguire il programma. I primi tre sono i parametri dello stack di uscita: la posizione assiale del primo telaio ('Start focus'), numero di strati dello stack ricostruita ('Numero di passi'); distanza assiale tra ogni fetta dello stack ('Step size') .
- Per ricostruire oggetti con le giuste proporzioni, la dimensione del passo dovrebbe essere la stessa dimensione della spaziatura tra pixel laterale. Immettere la frequenza di campionamento laterale della fotocamera (spaziatura 1/pixel) nella casella 'Pixel / micron', la lunghezza d'onda illuminazione e indice di rifrazione medio negli ultimi due caselle. Valori di default del programma sono appropriate per ricostruire i dati di esempio.
- Premere il tasto 'Flip Z-gradient' se il centro del object è scuro in ologramma (vedi esempio telaio 2005 e la sezione di discussione per maggiori dettagli).
- Controllare il filtro passa-banda sullo stato / off (di default è on). Questo filtro passabanda opzionale, situata in una scatola sotto l'interruttore gradiente-flip, è responsabile per la soppressione del contributo di pixel rumorosi. Il filtro passa-banda è applicato ad ogni fetta immagine immediatamente dopo generazione.
- Controllare l'interruttore di uscita intermedia stati on / off (di default è on). Fasi di analisi intermedia sono scritti in due video in uscita, come non compresso file avi:. Il primo è lo stack riorientato (nome file che termina in '_stack.avi'), il secondo è lo stack dopo l'operazione gradiente assiale (nome file che termina in ' _gradient.avi '). Idealmente, questo secondo pila conterrà l'oggetto di interesse ha evidenziato come un oggetto luminoso su uno sfondo scuro.
- Dopo aver impostato tutti i parametri, premere 'Run' nella finestra principale. La cornice selezionata viene visualizzata nel riquadro principale del software.
- Utilizzare l'ingrandimento strumento di vetro trovato nella barra degli strumenti a sinistra l'immagine per ingrandire (click sinistro) e zoom out (Shift + click sinistro). Utilizzare lo strumento rettangolo sulla barra degli strumenti per selezionare una regione di interesse (ROI). Cattura il maggior numero di frange del ologramma possibile all'interno del rettangolo, in modo da ottimizzare la ricostruzione.
- Premere il tasto 'Processo' per generare i due stack di immagine. Ispezionare le pile risultanti utilizzando ImageJ (che può essere ottenuto gratuitamente presso http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Se l'oggetto di interesse può essere chiaramente visto nella pila di immagini gradiente, procedere al passaggio successivo per estrarre le coordinate dell'oggetto.
3. Rendering
- Oltre telaio rifocalizzazione, questo programma può individuare la x, y, z coordinate per ogni voxel in oggetto di interesse. Premere il pulsante 'Feature Extraction' per abilitare questa funzione.
- Immettere un percorso, inclusa l'estensione (per esempio: c: home output.inc), per ilUscita coordinate file. Selezionare 'stile POV-Ray' nella casella 'stile coordinata di uscita'. Questo fa sì che il programma di scrivere un file oggetto che può essere visualizzato utilizzando il pacchetto software raytracing libero POV-Ray (che può essere ottenuto da http://www.povray.org/ ).
- Rielaborare le immagini come al precedente punto 2. Il programma fornirà una serie di (x, y, z) coordina nel ROI selezionata, scritto nel nome del file nella 'uscita coordinate' box. Estrazione di coordinate dell'oggetto richiede molto più tempo rispetto alla generazione stack.
- Assicurarsi che il file POV-Ray campione (fornito con il codice ricostruzione) si trova nella stessa cartella il file delle coordinate appena generati. Modificare il file pov di esempio. E sostituire il nome del file tra virgolette sulla linea
# Include "MYFILE.inc"
, con il nome del file di dati generati dalla ricostruzione del codice. - Fare clic sul pulsante 'Esegui' in POV-Ray per il rendering di un'immagine bitmap. Tegli posizione della telecamera, l'illuminazione e le opzioni di texture sono solo alcune delle personalizzazioni possibili in POV-Ray, vedere la documentazione in linea per i dettagli.
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Representative Results
Per dimostrare le capacità di DIHM, esperimenti sono stati eseguiti su una catena di batteri Streptococcus. La catena stessa misurato 10,5 millimetri lungo, ed era composta di 6-7 cellule sferico cilindrico (due delle cellule della catena sono vicini a dividere) con diametri nell'intervallo 0,6-1 micron. Figure 1a e 1b mostrano l'interfaccia principale della ricostruzione e del software di rendering. Esempi del procedimento rifocalizzazione numerico si vedono nella figura 2, in cui è stato applicato un filtro passabanda spaziale. Figura 3 mostra l'effetto del filtro gradiente sulle immagini in Figura 2. I dati grezzi utilizzati per la costruzione sia di queste immagini sono in bundle con il codice per il download come ad esempio telaio 108. Infine, la Figura 4 mostra l'effetto di dati di buona qualità scadente e sulla geometria ricostruita. Entrambe le cornici in questo ultimo dato sono state prese da un video di same catena di celle (una catena diversa da quella dei primi due figure). Una buona ricostruzione è possibile in molti casi, ma quando la catena è orientato finale sulla ricostruzione fallisce, dando un grande oggetto rotondo al piano focale. Questo tipo di guasto è caratteristica di oggetti orientati lungo l'asse ottico. Per la scala, nelle immagini del computer resi, i controlli sul pavimento sono 1 micron su un lato. Per una discussione più dettagliata la precisione e l'accuratezza di questo metodo, i lettori dovrebbero consultare Wilson e Zhang 19.
Figura 1. Interfacce software. L'interfaccia principale del software di ricostruzione è indicata nel grafico (a), dove le caselle di immissione di file, parametri delle impostazioni globali e altre caratteristiche importantidi cui al testo sono stati evidenziati. Panel (b) mostra il file di esempio scena per POV-Ray, editor scena di default del programma. Il nome del file tra virgolette sulla linea indicata dovrebbe essere impostato il file di output dal software di ricostruzione. Può essere necessario modificare la posizione della telecamera e la direzione (relativa sezione indicata) per visualizzare correttamente la ricostruzione. Vedere la documentazione POV-Ray in linea per ulteriori istruzioni. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 2. Esempi di immagini numericamente ridefinite. I pannelli figura nella colonna sinistra mostra numericamente rifocalizzati(X, y) piani in una varietà di altezze all'interno del volume ricostruito (come indicato). L'immagine in basso a sinistra mostra i dati ologramma originali, divise attraverso dai dati di fondo. Il grande pannello a destra mostra un (x, z) fetta attraverso lo stesso stack. Il punto di inversione contrasto lungo l'asse z è chiaramente visibile a circa un terzo della distanza dalla parte superiore dell'immagine. Le linee rosse sulla un'immagine più grande spettacolo dove questo piano (x, z) interseca gli aerei (x, y) a sinistra. Allo stesso modo, le linee blu nei pannelli più piccoli mostrano l'intersezione della fetta (x, z). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. Esempi di immagini gradiente filtrata.0; Questa immagine mostra l'effetto dell'applicazione del filtro gradiente ai dati in Figura 2. Si noti che l'oggetto di interesse è evidenziato come un punto luminoso simmetrico. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 4. Esempi di dati che portano a buoni e poveri immagini renderizzate. Le due immagini a pannelli (a) e (c) sono stati prelevati dallo stesso video di una catena tumbling di celle. I dati nel grafico (a) sono rappresentativi della maggior parte dei telai di questa serie, in cui la catena non è orientato direttamente lungo l'asse ottico. La forma e la posizione dell'oggetto vengono fedelmente riprodotte nelil rendering in pannello (b). Nel caso di pannello (c), la catena è stata momentaneamente orientato finale sul piano focale; oggetti in questa configurazione sono difficili da ricostruire, e tipicamente produrre un 'blob' in prossimità del piano focale, come si vede nel grafico (d ). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
Il passo più importante in questo protocollo sperimentale è la cattura accurata di immagini da un setup sperimentale stabile. Con scarsi dati di base, ad alta ricostruzione fedeltà è quasi impossibile. E 'anche importante evitare lenti dell'obiettivo con un elemento di contrasto di fase interna (visibile come un anello scuro quando guardando attraverso il posteriore dell'obiettivo), in quanto questo può degradare l'immagine ricostruita. L'oggetto di interesse deve essere sufficientemente lontana dal piano focale che alcune paia di frange di diffrazione sono visibili nella sua immagine (una euristica adatto è che il pattern sfocato dovrebbe apparire avere 10 volte la dimensione lineare dell'oggetto attivo - vedi esempio dati ). Oggetti troppo vicino al piano focale soffrono di doppia immagine e di campionamento artefatti, come descritto in precedenza. E 'anche importante avere una buona caratterizzazione della spaziatura dei pixel della fotocamera, in quanto questo è un fattore critico nel determinare correttamente le distanze Refocus. Spesso, fotocamera DOCUMENTAZIONEion elencherà 'dimensione dei pixel' nelle specifiche, questo può essere un po 'ambiguo, perché alcuni tipi di macchina fotografica (telecamere CMOS in particolare) possono avere aree significative dello spazio tra i pixel che non sono sensibili alla luce. Il modo più affidabile per ottenere queste informazioni è quello di utilizzare un profilo di calibrazione standard, ad esempio di risoluzione grafico USAF 1951 e misurare la frequenza di campionamento (numero di pixel per micrometro) direttamente da un'immagine.
Nel limite di illuminazione monocromatica, la risoluzione di un sistema DIHM è infine impostato l'apertura numerica della lente obiettivo (NA) e la lunghezza d'onda di illuminazione (λ) 23,24. Lateralmente punti separati dovrebbero trovarsi ad una distanza minima Δ lat = 'λ' / 2NA parte se devono essere risolti separatamente. Analogamente, il limite di risoluzione assiale nel caso ideale è dato da 'Δ' ax = λ / 2 (NA) 2. Quando si utilizza un LED in DIHM, vi è un limite alla profondità diil volume che può essere ripreso; questa dipende in ultima analisi dal sistema ottico e la coerenza dell'illuminazione. Un tipico profondità di questo 'volume sensibile' è di circa 100-200 micron per un LED, se una descrizione dettagliata di questo tipo di effetto può essere trovato altrove 25. Il volume sensibile è limitata nelle altre due direzioni dalla dimensione dell'immagine. Anche se il software è abbastanza robusto, alcune operazioni sono piuttosto memory-fame. Ricostruire una serie di immagini e di ottenere il gradiente di intensità sono entrambi abbastanza conservativo, ma estraendo le coordinate di una caratteristica di interesse da una pila gradiente può consumare molta memoria (diverse centinaia di megabyte a diversi gigabyte). A tal fine, è consigliabile limitare il volume ricostruito di interesse a 100-150 pixel in ciascuna dimensione. Questa restrizione può essere alleviato un po 'se il codice viene eseguito su un sistema operativo a 64 bit con più di 4 GB di RAM (il software è stato scritto su una macchina con 12 GB),anche se il tempo di calcolo può diventare proibitivo.
Per esaminare un sistema più grande, la sorgente luminosa del LED può essere sostituito da un laser, che permette la ricostruzione di oggetti che si trovano ad una maggiore profondità dal piano focale - facilmente fino a millimetri - ea basso ingrandimento. Esperimenti preliminari con una tale configurazione, utilizzando un diodo laser accoppiato ad una fibra ottica monomodale, ammessi profondità ricostruiti fino a 10 mm con un obiettivo microscopio 10X. Questa maggiore profondità di campo ha un costo, però, grande lunghezza di coerenza del laser porta a rumore dell'immagine, in particolare i riflessi varie superfici in treno ottico Questi effetti sono compensati in qualche modo (le pareti della camera del campione, superfici delle lenti, ecc.) quando l'apparecchio è abbastanza stabile per ottenere una buona immagine di sfondo. Tuttavia, riflessioni estranei hanno una distribuzione sconosciuta di fasi, per cui se la loro grandezza è paragonabile a quella dell'onda di riferimento (luce unscattered), reconstruction può diventare impossibile. Altri autori hanno modificato la coerenza di una sorgente di luce laser, per esempio, modulando la corrente di pilotaggio laser 26 o utilizzando uno schermo di vetro rotante terreno per ridurre coerenza 27.
Da un punto di risoluzione dei problemi di vista, la maggior parte dei problemi riscontrati durante l'utilizzo del software di ricostruzione olografica sono meglio risolti controllando le fasi intermedie di analisi dei dati. Nel caso della pila immagine ricostruita, gli oggetti devono 'Deblur' simmetricamente come vengono a fuoco. Se le frange di diffrazione appaiono fortemente asimmetrica, immagine di sfondo una scarsa o offset è spesso la colpa. Se l'immagine per la ricostruzione è stata adottata da una pila di immagini simili, ad esempio un fotogramma di una sequenza video di un oggetto in movimento, un'immagine di sfondo a volte può essere ottenuto facendo la media (da media o mediana) valori di pixel in tutti del video cornici. Se il soggetto si muove sostanzialmente durante la sequenza del video, l'contributo a qualsiasi valore di pixel è piccolo e il contributo dominante verrà dai inalterati fotogrammi di sfondo in cui il soggetto era assente. Nel caso in cui le coordinate di un oggetto non corretta restituzione, la pila di gradiente può essere un utile diagnostico. Se l'oggetto viene visto come un vuoto circondato da un anello luminoso nello stack dell'immagine gradiente, il filtro gradiente deve essere capovolto e l'immagine ritrattato. Come accennato nell'introduzione, il metodo di ricostruzione Rayleigh-Sommerfeld è insensibile al segno della distanza di un oggetto dal piano focale. Se due oggetti debolmente scattering sono alla stessa distanza dal piano focale, ma su lati opposti, avrebbero vanno a fuoco nella stessa posizione nella pila immagine ricostruita. Tuttavia, i loro modelli di intensità assiali sarebbero invertiti. Il centro dell'oggetto originariamente trovato sopra del piano focale (rispetto alla geometria microscopio invertito) cambia da chiaro a scuro attraversando il Po a fuocozione, mentre l'oggetto al di sotto dei cambiamenti sul piano focale dal buio alla luce. L'opzione gradiente-flip estrae quindi sia gli oggetti al di sopra del piano focale (default) o al di sotto del piano focale (con pendenza-flip impostati su 'on'), dando una coordinata assiale inequivocabile. Si noti che questo vale strettamente solo per oggetti debolmente scattering, il metodo funziona molto bene per microsfere di polistirene fino a 1 micron di diametro, ma meno bene per grandi particelle di polistirene. I campioni biologici mostrano tipicamente dispersione molto più debole, come i loro indici di rifrazione sono più vicina a quella del mezzo circostante (polistirene ha un indice di rifrazione vicino a 1,5), oggetti così grandi possono essere studiate.
In termini di orientamenti futuri, questo software potrebbe essere esteso a elaborare più fotogrammi in un video, per consentire il monitoraggio di microrganismi nuoto o particelle colloidali in tre dimensioni. Il frame rate elevato che la tecnica offre è adatto a tracciare anche la nuotata più velocemers, come il Vibrio alginolyticus-oceano dimora, che nuota a velocità fino a 150 micron / sec 28. Le traiettorie di nuoto microscopiche di singole cellule sono stati rintracciati qualche tempo fa 29, ma questo di solito richiede apparato specializzato. La fase Gouy anomalia approccio si presta non solo alla semplice monitoraggio di singole cellule su lunghe distanze, ma offre l'opportunità di esaminare le correlazioni tra il comportamento di nuoto di individui diversi. Questo dipende in particolare sulla geometria tridimensionale, dati che sinora inaccessibile per motivi tecnici.
Come accennato nell'introduzione, un confronto con microscopia confocale non è ideale, ma l'ubiquità dei sistemi confocali effettua un confronto dell'aspetto immagini tridimensionali utile. Infatti, DIHM è complementare alla microscopia confocale, ci sono vantaggi comparativi e gli svantaggi di entrambi. DIHM permette molto più veloce ACQUISIZIO datin tassi: diverse migliaia di volumi al secondo è di routine, data una macchina fotografica abbastanza veloce. Questo permette di rintracciare (per esempio) più batteri di nuoto, che è al di là della capacità dei sistemi confocale più lenti. Anche con una fotocamera veloce, DIHM è un ordine di grandezza più economico di microscopia confocale, ei dati per un volume tridimensionale può essere memorizzato in una singola immagine bidimensionale, riducendo le richieste di memorizzazione dei dati e backup. DIHM è più facilmente scalabile nel senso che lavorare con ingrandimenti inferiori, campioni più grandi e distanze di lavoro è più banale. La microscopia confocale ha ancora il sopravvento in campioni densi e complessi, tuttavia. Ad esempio, in una sospensione colloidale denso, scattering multiplo rende praticamente impossibile la ricostruzione olografica; un sistema confocale in entrambi emissione fluorescente o modo di riflessione sarebbe più adatto per studiare tali sistemi 9. Inoltre, microscopia confocale è una scelta più naturale per sistemi sperimentali in cui fetichettatura luorescent è di centrale importanza. Sebbene fluorescenza olografia ha dimostrato di funzionare con una gamma di prova sottopone 30 l'efficienza di raccolta attualmente è molto inferiore a quella di un buon sistema confocale. Inoltre, tali sistemi sperimentali attualmente richiedono apparecchi ottici specialistica e l'esperienza per funzionare; si spera che diventeranno più ampiamente disponibile, con un ulteriore sviluppo.
In sintesi, DIHM è ineguagliabile nella sua capacità di acquisire immagini ad alta risoluzione tridimensionali di oggetti microscopici, alle alte velocità. Forniamo software user-friendly che rende questa tecnica accessibile al non specialista con modifiche minime al microscopio esistente. Inoltre, il software di ricostruzione si integra facilmente con liberamente disponibili software di rendering computer. Questo permette la visualizzazione intuitiva dei soggetti microscopici, visibile da qualsiasi angolazione. Data la natura tridimensionale di molti processi microscopici veloci involving oggetti debolmente di scattering (ad esempio battendo flagelli degli eucarioti o cilia, il nuoto batteri, o diffondente colloidi), questa tecnica dovrebbe essere di interesse in una vasta gamma di settori.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Linda Turner per l'assistenza con la preparazione microbiologica. RZ e LGW sono stati finanziati dall'Istituto Rowland ad Harvard e CGB è stato finanziato come studioso di una Fondazione CAPES, Scienza Senza Frontiere Programma, Brasile (Processo # 7340-11-7)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon Corp. | ||
| LED | Thorlabs | M660L3 | emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm |
| LED power supply | Thorlabs | LEDD1B | |
| Thread Adapter | Thorlabs | SM2T2 | |
| Thread Adapter | Thorlabs | SM1A2 | |
| Frame Grabber board | EPIX | PIXCI E4 | |
| High-Speed CMOS camera | Mikrotron | MC-1362 |
References
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