Digital Inline Holographic mikroskopi (DIHM) av svagt-spridnings Ämnen

Summary

De tredimensionella platser för svagt spridande objekt kan identifieras med hjälp av digital inline holografisk mikroskopi (DIHM), vilket innebär en mindre ändring av ett standardmikroskop. Vår programvara använder en enkel avbildning heuristisk kopplas med Rayleigh-Sommerfeld back-förökning för att ge det tredimensionella positionen och geometrin hos en mikroskopisk fas objektet.

Abstract

Svagt spridande föremål, såsom små kolloidala partiklar och de flesta biologiska celler, är ofta påträffas i mikroskopi. I själva verket har en rad tekniker utvecklats för att bättre visualisera dessa fas föremål, faskontrast och DIC är bland de mest populära metoderna för att öka kontrasten. Dock återstår att spela in position och form i out-of-imaging-planet riktning utmanande. Denna rapport presenterar en enkel experimentell metod för att exakt bestämma läge och geometri av objekt i tre dimensioner, med hjälp av digital inline holografisk mikroskopi (DIHM). I stort sett är den tillgängliga provvolym som definieras av kamerans sensor storlek i sidoriktningen, och belysningens enhetlighet i den axiella riktningen. Typiska provvolymer varierar från 200 ìm x 200 ìm x 200 ìm med hjälp av LED-belysning, till5 mm x 5 mm x 5 mm eller större med användning av laserbelysning. Denna belysningsljus är konfigurerad så att plana vågor infaller på provet. Objekt i provvolymen sprider sedan ljus, som stör den ospridda ljus bildar interferensmönster vinkelrätt mot belysningsriktningen. Detta avbildar (hologrammet) innehåller den djupinformation som krävs för tredimensionell rekonstruktion, och kan fångas upp på en standard avbildningsanordning, såsom en CMOS-eller CCD-kamera. Rayleigh-Sommerfeld back propagation metod används för att numeriskt refocus mikroskopbilder, och en enkel avbildning heuristisk baserad på Gouy fas anomali används för att identifiera scattering objekt inom den rekonstruerade volymen. Denna enkla men robust metod resulterar i en otvetydig, modell-fri mätning av läge och form av föremål i mikroskopiska prover.

Introduction

Digital inline holografisk mikroskopi (DIHM) möjliggör snabb tredimensionell avbildning av mikroskopiska prover, såsom simning mikroorganismer ^1,2 och mjuka material system ^3,4, med minimal modifiering till en standard mikroskop setup. I denna uppsats en pedagogisk demonstration av DIHM tillhandahålls, centrerad kring mjukvara som utvecklats i vårt labb. Detta dokument innehåller en beskrivning av hur du ställer in mikroskopet, optimera datainsamling, och bearbeta de inspelade bilderna för att rekonstruera tredimensionella data. Mjukvaran (delvis baserad på programvara utvecklad av GD Grier och övriga ⁵⁾ och exempelbilder är fritt tillgängliga på vår hemsida. En beskrivning ges av de åtgärder som krävs för att konfigurera mikroskopet, rekonstruera tredimensionella volymer från hologram och gör de resulterande volymerna av intresse med hjälp av en fri ray tracing programpaket. Dokumentet avslutas med en diskussion om faktorer som påverkar kvaliteten på återuppbyggnad, Och en jämförelse av DIHM med konkurrerande metoder.

Även DIHM beskrevs för en tid sedan (för en allmän översyn av dess principer och utveckling, se Kim ^6), har det som krävs datorkraft och bildbehandling expertis hittills till stor del begränsat dess användning till specialiserade forskargrupper med fokus på instrumentutveckling. Denna situation förändras mot bakgrund av de senaste framstegen inom data-och kamerateknik. Moderna datorer kan lätt klara av kraven datalagring bearbetning och, CCD eller CMOS-kameror finns i de flesta mikroskopi labb, och den nödvändiga mjukvaran görs fritt tillgänglig på internet av grupper som har investerat tid i att utveckla tekniken.

Olika system har föreslagits för avbildning av utformningen av mikroskopiska objekt i en tredimensionell provvolymen. Många av dessa skannar tekniker ^7,8, där en bunt bilder i följd med mechanically översätta bildplanet genom provet. Scanning konfokala fluorescensmikroskopi är kanske det mest kända exemplet. Typiskt är ett fluorescerande färgämne sattes till en fas-objektet för att uppnå en godtagbar nivå av provet kontrast och konfokala arrangemang användas för att rumsligt lokalisera fluorescerande emission. Denna metod har lett till betydande framsteg, till exempel i kolloid vetenskap där man har tillstånd att ha tillgång till de tredimensionella dynamiken i trånga system ^9-11. Användningen av märkningen är en viktig skillnad mellan fluorescens konfokalmikroskopi och DIHM, men andra funktioner i de två teknikerna är värt att jämföra. DIHM har en betydande hastighet fördel av att apparaten inte har några rörliga delar. De mekaniska skanning speglar i konfokala system sätta en övre gräns för datainsamling hastighet - vanligtvis runt 30 bilder / sek för en 512 x 512 pixel bild. En stapel av sådana bilder från olika fokalplan kan erhållas genom att fysiskt translrande provstadiet eller objektiv mellan ramar, vilket leder till en slutlig fånga på cirka en volym per sekund för en 30 ram stack. Som jämförelse kan ett holografiskt system baserat på en modern CMOS-kamera fånga 2.000 bilder / sek vid samma bildstorlek och upplösning, varje ram bearbetas `offline" för att ge en oberoende bild av provvolymen. För att upprepa: fluorescerande prov krävs inte för DIHM, även om ett system har utvecklats som utför holografisk rekonstruktion av ett fluorescerande ämne ^12. Förutom tredimensionell volyminformation kan DIHM också användas för att åstadkomma kvantitativa faskontrast bilder ^13, men det är utanför ramen för diskussionen här.

Raw DIHM databilder är tvådimensionell, och i vissa avseenden ser ut som vanliga mikroskop bilder, om än ur fokus. Den huvudsakliga skillnaden mellan DIHM och standard ljusfältsmikroskopi ligger i de diffraktions ringar som omger föremålen in synfältet, och dessa är på grund av utformningen av belysningen. DIHM kräver en mer koherent källa än ljusa fält - vanligtvis en LED eller laser. De diffraktion ringarna i hologrammet innehålla de uppgifter som behövs för att rekonstruera en tredimensionell bild. Det finns två huvudsakliga metoder för att tolka DIHM uppgifter, direkt montering och numerisk omfokusering. Det första är tillämplig i de fall då den matematiska formen av diffraktionsmönster är känd på förhand ^3,4, detta villkor är uppfyllt med en liten handfull enkla föremål som sfärer, cylindrar och halvplans hinder. Direkt montering gäller även i de fall där objektets axiella läge är känt, och bilden kan monteras med hjälp av en uppslagstabell i bildmallar ^14.

Den andra metoden (numerisk omfokusering) är något mer allmänt och förlitar sig på att använda diffraktion ringarna i den tvådimensionella hologram bilden för att numeriskt rekonstruera det optiska fältet vidett antal (godtyckligt placerade) fokalplan hela provvolymen. Flera relaterade metoder finns för att göra detta ^6, detta arbete använder Rayleigh-Sommerfeld tillbaka förökning teknik som beskrivs av Lee och Grier ^5. Resultatet av detta förfarande är en bunt bilder som efterliknar effekten av att manuellt ändra mikroskopets fokalplan (därav namnet `numeriska omfokusering"). När en stapel av bilder har genererats, måste positionen hos objektet i fokalvolymen erhållas. Ett antal bildanalys heuristik, såsom lokal intensitet varians eller innehåll spatial frekvens, har lagts fram för att kvantifiera skärpan i fokus vid olika punkter i provet ^15. I samtliga fall när en viss bild metrisk är maximerad (eller minimeras) är objektet anses vara i fokus.

Till skillnad från andra system som syftar till att identifiera en viss fokalplan där ett objekt är "i fokus", den metod som i detta arbete plockar ut points som ligger i objektet av intresse, som kan sträcka sig över ett brett spektrum av fokalplan. Denna metod kan tillämpas på ett brett spektrum av ämnen och är särskilt lämplig för längre, svagt-spridnings prover (fas objekt), såsom stavformiga kolloider, kedjor av bakterier eller eukaryota flageller. I sådana prover som förändrar bildkontrast när objektet passerar genom fokalplanet, en defokuserad bild har en ljuscentrum om objektet är på ena sidan av fokalplanet och en mörk centrum om den är på den andra. Rena fas objekt har liten eller ingen skillnad när de ligger precis i fokalplanet. Detta fenomen av kontrast inversion har diskuterats av andra författare ^16,17 och är i slutändan beror på Gouy fasen anomali ^18. Detta har lagts på en strängare villkor i samband med holografi annat håll, där gränserna för tekniken utvärderas, den typiska osäkerheten i position är i storleksordningen 150 nm (ungefär en pixel) i each riktning ^19. Den Gouy fas anomali metoden är en av de få väldefinierade DIHM system för att bestämma strukturen för utökade objekt i tre dimensioner, men ändå vissa objekt är problematiskt att rekonstruera. Objekt som ligger direkt längs den optiska axeln (pekar på kameran) är svåra att rekonstruera exakt, osäkerheter i längden och objektets position blir stora. Denna begränsning är delvis på grund av den begränsade bitdjup pixlarna inspelnings hologrammet (antalet distinkta gråskalor som kameran kan spela in). En annan problematisk konfiguration uppstår när objektet av intresse är mycket nära fokalplanet. I detta fall är de reella och virtuella bilder av objektet rekonstrueras i omedelbar närhet, vilket ger upphov till komplicerade optiska fält som är svåra att tolka. En andra, något mindre viktig fråga här är att de resulterande diffraktion fransar upptar mindre av bildsensorn, och denna grövre korniga information leder till en sämre kvalitet rekonstruktion.

I praktiken är en enkel gradient filter tillämpas på tredimensionella rekonstruerade volymer för att upptäcka starka intensitet inversioner längs belysningsriktningen. Regioner där intensitet ändras snabbt från ljust till mörkt, eller vice versa, är sedan associerad med spridnings regioner. Svagt spridande föremål är väl beskrivas som ett icke-interagerande samling av sådana element ^20, och dessa individuella bidrag summa att ge den totala spridda fält som lätt kan inverteras med hjälp av Rayleigh-Sommerfeld back propagation metod. I detta dokument är den axiella intensitets gradient teknik tillämpas på en kedja av Streptococcus-celler. Cell kroppar är fas objekt (arten E. coli har ett brytningsindex mätt ²¹ för att vara 1.384 vid en våglängd λ = 589 nm, den Streptococcus stammen är sannolikt är liknande) och visas som en högintensiv kedja anslutna blobbar i the provvolym efter gradientfiltret har tillämpats. Standard tröskel-och feature extraction metoder som tillämpas på denna filtrerade volymen tillåta extraktionen av volymetriska pixlar (voxlar) som motsvarar regionen inuti cellerna. En särskild fördel med denna metod är att den tillåter otvetydig rekonstruktion av ett objekts position i den axiella riktningen. Liknande metoder (åtminstone de som rekord hologram nära objektet, avbildas genom ett mikroskop objektiv) lider av att inte kunna bestämma tecknet på denna förskjutning. Trots att Rayleigh-Sommerfeld rekonstruktion metod är också anmäla oberoende i denna mening tillåter lutning operationen oss att skilja mellan svaga fas föremål ovanför och nedanför fokalplanet.

Protocol

1. Inställning och datainsamling

1. Odla en kultur av Streptococcus stam V4051-197 (jämn simning) celler i KTY medium från frysta lager ^22. Inkubera i en roterande skakanordning över natten vid 35 ° C och 150 rpm, till mättnad.
2. Inokulera 10 ml färskt KTY-medium med 500 | il av den mättade kulturen. Inkubera under ytterligare 3,5 h vid 35 ° C och 150 rpm tills cellerna når en optisk densitet av ca 1,0 vid λ = 600 nm (cirka 5 x 10 ⁸ celler / ml).
3. Späd 1:400 i färskt media för att erhålla den slutliga koncentrationen av rörliga celler.
4. På ett objektglas, göra en ring av fett (t ex från en spruta fylld med vaselin) runt en mm i höjd och placera en droppe av provlösningen i centrum. Placera ett täckglas på toppen och tryck lätt vid kanterna för att täta, så att vätskan är i kontakt med både bild och täckglas. Den resulterande provkammaren bör vara around 100-200 nm i djupet.
5. Placera provkammaren i mikroskop med täckglaset nedåt och försiktigt, för att förhindra bildandet av luftbubblor i oljan mellan glas och lins.
6. Fokusera mikroskop på undersidan av provkammaren, och ta med kondensorn för att fokusera.
7. Stäng av standardbelysning och placera LED-huvudet bakom kondensorn öppning mikroskop. Ställ in LED-drivdon till maximal effekt.
8. Stäng kondensorn öppningen i full utsträckning, och om nödvändigt, knuffa LED i sitt fäste tills belysnings är centrerad på objektivöppningen.
9. Slå på datorn och kameran, och omdirigera alla ljus till mikroskopets kameraporten. Justera bildfrekvens och bildstorlek i bilden förvärvet programvara.
10. Gör exponerings tidsram så kort som möjligt och ändå behålla god kontrast. Kontrollera en bildintensitets histogram för att se till att bilden inte mättnadted eller underexponerad.
11. Vid behov, fokusera mikroskopet så att objekt av intresse är en aning oskärpa (vanligen med 10-30 mikrometer). Objektet och fokalplanet bör vara i samma medium (dvs. fokalplanet bör ligga inuti provkammaren).

2. Rekonstruktion

Det första steget i behandlingen av data är att numeriskt refocus en videoruta på en serie med olika djup, vilket ger en stapel av bilder. Användarvänlig programvara för att göra detta kan hittas här: http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html tillsammans med exempelbilder (som förvärvats med hjälp av ett inverterat mikroskop och en 60X oljeimmersionsobjektiv) och en scen fil för stråle spårade rendering.

1. Ingång ramen av intresse och sin respektive bakgrund som separata bildfiler, i de relevanta rutorna på gränssnittet. En bakgrundsbild är en ram som fairly representerar bakgrunden av videon, i frånvaro av hologrammet, och kommer att användas för att undertrycka varje fast-mönsterbrus som skulle kunna interferera med hologrammet lokalisering och analys.
2. Ange värden i de globala inställningarna rutorna på vänster sida av skärmen innan du kör programmet. De tre första är utgångs stack parametrar: Axiell position den första ramen ("Starta fokus '); antal segment i den rekonstruerade stacken (" Antal steg'); axiella avståndet mellan varje skiva i stapeln ("Step storlek ') .
3. För att rekonstruera objekt med korrekta proportioner bör stegstorleken vara av samma storlek som avståndet i sidled pixel. Ange kamerans frekvens lateral samplings (1/pixel avstånd) i "Pixel / mikron 'box, belysnings våglängd och medelindex brytnings i de två sista rutorna. Programmets standardvärden är lämpliga för att rekonstruera exempeldata.
4. Tryck på "Flip Z-gradient"-knappen om mitten av object är mörkt i hologram (se exempel ram 2005 och diskussionen avsnitt för mer detaljer).
5. Kontrollera bandpassfilter på / av tillstånd (standard är på). Detta tillval bandpassfilter, som ligger i en låda under övertonings-flip switch, är ansvarig för att undertrycka bidrag från bullriga pixlar. Den bandpassfilter tillämpas på varje bild skiva direkt efter generation.
6. Kontrollera mellan utgångsomkopplaren på / av stater (standard är på). Mellananalyssteg är skrivna på två utgångs filmer, som okomprimerad avi-filer:. Den första är den ny inriktning stacken (filnamn som slutar på "_stack.avi"), är den andra stacken efter den axiella lutning operationen (filnamn som slutar på " _gradient.avi '). Helst ska denna andra stapeln innehåller föremålet av intresse markeras som ett ljust föremål mot en mörk bakgrund.
7. När alla parametrar, tryck på "Kör" i huvudfönstret. Den valda ramen visas i huvudrutan för programmet.
8. Användförstoringsglas verktyg du finner i verktygsfältet till vänster om bilden för att zooma in (vänsterklicka) och zooma ut (skift + vänsterklick). Använd rektangelverktyget i verktygsfältet för att välja ett område av intresse (ROI). Fånga så många av hologram s fransar som möjligt inne i rektangeln, eftersom det kommer att optimera återuppbyggnaden.
9. Tryck på "Process" för att generera de två bildstaplar. Inspektera de resulterande stackar med ImageJ (som kan erhållas gratis på http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Om objektet av intresse kan tydligt ses i lutning bildstapel, gå vidare till nästa steg för att extrahera objekt koordinaterna.

3. Rendering

1. Förutom ram omfokusering, kan detta program lokalisera x, y, z-koordinater för varje voxel i objektet av intresse. Tryck på "Feature Extraction"-knappen för att aktivera denna funktion.
2. Ange en sökväg, inklusive förlängning (till exempel: c: output.inc), förutgång samordnar fil. Välj 'POV-Ray-stil "i" output samordna stil "rutan. Detta gör att programmet för att skriva ett objekt-fil som kan visualiseras med hjälp av gratis POV-Ray raytracing programvarupaket (som kan erhållas från http://www.povray.org/ ).
3. Upparbeta bilderna som i avsnitt 2 ovan. Programmet kommer att ge en serie av (x, y, z) koordinater i den valda ROI, skrivit till filnamnet i "Output samordna" rutan. Utvinning av objekt koordinater tar betydligt längre tid än stack generation.
4. Se till att prov POV-Ray-fil (levereras med återuppbyggnaden koden) är i samma mapp som koordinaterna filen bara genererat. Redigera provet. Pov-filen och byt filnamnet inom citationstecken på linjen
   # Include "MYFILE.inc"
   med namnet på den datafil som genereras av återuppbyggnaden koden.
5. Klicka på "Kör" knappen i POV-Ray för att göra en bitmappsbild. THan kameraläge, belysning och texturalternativ är bara några av de anpassningar möjliga i POV-Ray, se online-dokumentationen för detaljer.

Representative Results

För att visa möjligheterna med DIHM, utfördes experiment på en kedja av Streptococcus-bakterier. Kedjan själv mätte 10,5 mm lång, och bestod av 6-7 sfärens och cylindriska celler (två av cellerna i kedjan är nära att dela) med diametrar i intervallet 0,6-1 um. Figurerna 1a och 1b visar de viktigaste gränssnittet för återuppbyggnad och renderingsprogram. Exempel på den numeriska omfokusering förfarandet ses i figur 2, där en spatial bandpassfilter har använts. Figur 3 visar effekten av gradientfiltret om bilderna i figur 2. De rådata som används för att konstruera båda dessa bilder är kombinerade med koden nedladdning som exempelvis ram 108. Slutligen Figur 4 visar effekten av god och dålig kvalitet på data på den rekonstruerade geometri. Båda ramar i denna sista siffran togs från en video av same kedja av celler (en annan kedja till det i de två första siffrorna). En bra rekonstruktion är möjlig i de flesta fall, men när kedjan är orienterad slut på rekonstruktionen misslyckas, vilket ger ett stort runt föremål på fokalplanet. Detta feltillstånd är karakteristisk för objekt orienterade längs den optiska axeln. För skala, i dator renderade bilder, kontrollerna på golvet är 1 mikrometer på en sida. För en utförligare diskussion om den precision och noggrannhet av denna metod, bör läsaren konsul Wilson och Zhang ^19.

Figur 1. Programvara gränssnitt. Det viktigaste gränssnittet för återuppbyggnaden programvaran visas i panel (a), där fil inmatningsrutor, globala inställningar parametrar och andra viktiga funktionernämns i texten har markerats. Panel (b) visar exempel scenen filen för POV-Ray, i programmets standard scen redaktör. Filnamnet mellan citationstecken på linjen som anges ska vara inställd på utdatafilen från återuppbyggnadsprogram. Det kan vara nödvändigt att ändra kamerans position och riktning (motsvarande avsnitt anges) för att korrekt visualisera rekonstruktionen. Se online POV-Ray-dokumentationen för mer information. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Exempel på numeriskt tydligare mål för bilder. Siffran paneler i den vänstra kolumnen visar numeriskt ny inriktning(X, y) plan på en mängd olika höjder inom den rekonstruerade volymen (såsom anges). Den nedre vänstra bilden visar den ursprungliga hologramuppgifter dividerat igenom av bakgrundsdata. Den stora panelen till höger visar en (x, z) skiva genom samma stacken. Poängen med kontrast inversion längs z-axeln kan tydligt ses vid ca en tredjedel av vägen från toppen av bilden. De röda linjerna på den större bilden visar var detta plan (x, z) skär (x, y)-planen till vänster. På samma sätt, de blå linjerna i de mindre panelerna visar korsningen av (x, z) skiva. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. Exempel på gradient-filtrerade bilderna.0; Denna bild visar effekten av att tillämpa gradientfiltret till data i figur 2. Observera att föremålet för intresset är markerat som en symmetrisk ljuspunkt. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4. Exempel på uppgifter som leder till goda och dåliga renderade bilder. De två bilderna i paneler (a) och (c) har tagits från samma video av en tumlande kedja av celler. Data i panel (a) är representativt för de flesta bildrutor i denna serie, där kedjan inte är orienterad direkt längs den optiska axeln. Formen och positionen hos objektet troget reproduceras irendering i panel (b). I fallet med panelen (c), erhölls kedja momentant orienterade slutbehandling till fokalplanet; objekt i denna konfiguration är det svårt att rekonstruera, och typiskt att ge en "klump" nära fokalplanet, såsom visas i panel (d ). Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Det viktigaste steget i denna experimentella protokollet är det exakt fånga bilder från en stabil experimentuppställning. Med dålig bakgrundsdata, är hifi rekonstruktion intill omöjligt. Det är också viktigt att undvika objektiv med en intern fas kontrastelement (syns som en mörk ring när man tittar genom baksidan av målet), eftersom detta kan försämra den rekonstruerade bilden. Föremål för intresse bör vara tillräckligt långt från fokalplanet att några par diffraktion fransar är synliga i bilden (en lämplig heuristik är att den defocused mönstret ska visas för att ha 10 gånger den linjära dimensionen av det fokuserade objektet - se exempeldata ). Objekt för nära fokalplanet lider av twin-bild-och provtagningsartefakter, som tidigare beskrivits. Det är också viktigt att ha en god karakteristik av kamerans pixelavståndet, eftersom detta är en kritisk faktor för korrekt bestämning refocus avstånd. Ofta kamera DOKUMENTATjon kommer att lista "pixelstorlek" i specifikationerna, vilket kan vara lite tvetydigt, eftersom vissa typer av kamera (CMOS-kameror i synnerhet) kan ha betydande delar av utrymmet mellan bildpunkter som inte är känsliga för ljus. Det mest tillförlitliga sättet att få denna information är att använda en standardkalibrerings mål, till exempel en USAF 1951 upplösning diagram, och mäta samplingsfrekvensen (antal pixlar per mikrometer) direkt från en bild.

Inom gränsen för monokromatiska belysning, är upplösningen på en DIHM-systemet slutligen fastställts av numeriska apertur objektiv (NA) och våglängden av belysning (λ) ^23,24. I sidled åtskilda punkter bör ligga åtminstone ett avstånd Δ _lat = 'λ' / 2NA isär om de skall vara separat löst. På liknande sätt är den axiella upplösningsgränsen i det ideala fallet ges av 'Δ' _ax = λ / 2 (NA) ^2. Vid användning av en LED i DIHM, finns det en gräns för djupet hosden volym som kan avbildas, vilket är ytterst bestäms av det optiska systemet och sammanhanget av belysningen. Ett typiskt djup på detta "känsliga volym" är runt 100-200 nm för en LED, men kan hittas någon annanstans ²⁵ en detaljerad redogörelse för denna typ av effekt. Den känsliga volym är begränsad i de andra två riktningarna av storleken av bilden. Även om programvaran är ganska robust, vissa operationer är ganska minneshungriga. Att återskapa en bild stack och få intensiteten gradienten är båda ganska konservativ, men extrahera koordinaterna för en funktion av intresse från en gradient stack kan förbruka mycket minne (flera hundra megabyte till flera gigabyte). För detta ändamål är det lämpligt att begränsa den rekonstruerade volymen av intresse till 100-150 pixels i varje dimension. Denna begränsning kan lindras något om koden körs på en 64-bitars operativsystem med mer än 4 GB RAM (programmet var skrivet på en maskin med 12 GB),även om beräkningstiden kan bli oöverkomliga.

För att undersöka ett större system, kan LED-ljuskällan ersättas med en laser, som möjliggör rekonstruktion av föremål som ligger på ett betydligt större djup från fokalplanet - lätt upp till millimeter - och till lägre förstoring. Preliminära experiment med en sådan inställning, med hjälp av en laserdiod som är kopplad till en enkelmods optisk fiber, är tillåtna rekonstruerade djup upp till 10 mm med hjälp av en 10x mikroskopobjektiv. Denna ökade skärpedjup kommer till en kostnad, men; laserns stor koherenslängd leder till bildbrus, särskilt reflektioner från olika ytor i det optiska tåget Dessa effekter motverkades något (väggarna i provkammaren, linsytor, etc.) när apparaten är stabil nog för att få en bra bakgrundsbild. Emellertid ovidkommande reflektioner har en okänd fördelning av faserna, så, om deras storlek är jämförbar med den för referensvågen (ospridda ljuset), reconstruInsatser kan bli omöjlig. Andra författare har ändrat konsekvens av en laserljuskällan, till exempel genom att modulera laserdrivström ²⁶ eller med hjälp av en roterande mattskiva för att minska samstämmighet ^27.

Ur felsökningssynpunkt, de flesta problem som uppstått vid användning av holografisk rekonstruktion programvara är bäst lösas genom att inspektera de mellanliggande stadier av dataanalys. I fallet med den återskapade bilden stacken, objekten ska "Deblur" symmetriskt som de kommer i fokus. Om diffraktion fransar ser starkt asymmetrisk, är en dålig eller offset bakgrundsbild ofta skulden. Om bilden för återuppbyggnad har tagits från en stapel av liknande bilder, till exempel en bildruta från en videosekvens av ett rörligt objekt, en bakgrundsbild kan ibland erhållas genom att ta medelvärdet (med medel-eller medianvärde) pixelvärden över hela videon ramar. Om motivet rör sig kraftigt under videosekvensen, dessbidrag till något värde pixel är liten och det dominerande bidraget kommer från de oförändrade bakgrundsramar där motivet var frånvarande. I det fall där ett objekts koordinater inte är korrekt returneras, kan gradienten bildstapel vara en användbar diagnostisk. Om objektet ses som ett tomrum omgivna av en ljus ring i gradienten bildstapel bör gradientfiltret vändas och bilden upparbetas. Som nämndes i inledningen är Rayleigh-Sommerfeld rekonstruktion metoden okänslig för tecken på ett objekts avstånd från fokalplanet. Om två svagt spridande föremål är på samma avstånd från fokalplanet men på motsatta sidor, skulle de kommit i fokus vid samma position i den rekonstruerade bilden stacken. Däremot skulle deras axiella intensitetsmönster vändas. I mitten av objektet ursprungligen hittades över fokalplanet (med avseende på den inverterat mikroskop geometri) ändras från ljust till mörkt på passerar genom i-fokus ponings, medan föremålet under Focal Plane ändras från mörker till ljus. Alternativet gradient-flip extraherar därför antingen föremål ovanför fokalplanet (standard) eller nedanför fokalplanet (med lutning-flip 'Till'), vilket ger en entydig axiell koordinat. Notera att detta strikt håller endast svagt spridande föremål, vilken metod fungerar mycket bra för polystyren mikrosfärer upp till 1 | im i diameter, men mindre väl för större polystyrenpartiklar. Biologiska prover uppvisar typiskt mycket svagare spridning, eftersom deras brytningsindex är närmare den för det omgivande mediet (polystyren har ett brytningsindex nära 1,5), kan studeras så större föremål.

När det gäller framtida inriktning, kan detta program utvidgas till att bearbeta flera bildrutor i en video, för att möjliggöra spårning av simning mikroorganismer eller kolloidala partiklar i tre dimensioner. Den höga bildfrekvensen att tekniken ger är väl lämpad för att spåra även de snabbaste simmamerer, såsom havet levande Vibrio alginolyticus, som simmar i hastigheter upp till 150 nm / sek ^28. De mikroskopiska simning banor av enskilda cellerna först spåras för en tid sedan ^29, men detta kräver vanligen specialiserade apparater. Den Gouy fasen anomali närma sig inte bara lämpar sig för enkel spårning av enstaka celler över långa avstånd, men ger möjlighet att undersöka samband mellan simbeteende av olika individer. Detta beror speciellt på tre-dimensionell geometri data som hittills har varit oåtkomliga av tekniska skäl.

Som nämndes i inledningen, är en jämförelse med fluorescens konfokalmikroskopi inte idealiskt, men det gränslösa konfokala system gör en jämförelse av tredimensionell avbildning aspekt värt. I själva verket är DIHM komplementär med konfokalmikroskopi, det finns jämförbara fördelar och nackdelar med båda. DIHM möjliggör mycket snabbare data FÖRVÄRVN-grader: flera tusen volymer per sekund är rutin, ges en tillräckligt snabb kamera. Detta möjliggör spårning av (exempelvis) flera simning bakterier, som är utöver kapaciteten hos långsammare konfokala system. Även med en snabb kamera, är DIHM en tiopotens billigare än konfokalmikroskopi, och data för en tredimensionell volym kan lagras i en enda två-dimensionell bild, minska krav på datalagring och backup. DIHM är mer skalbar i den meningen att arbeta med lägre förstoringar, större urval och längre arbetsavstånd är trivialt. Konfokalmikroskopi har fortfarande övertaget i täta eller komplexa prover, dock. Till exempel, i en tät kolloidal suspension, gör multipel spridning holografisk rekonstruktion praktiskt taget omöjligt, ett konfokalt system antingen fluorescerande utsläpp eller reflektionsläge skulle vara bättre lämpade att studera sådana system ^9. Dessutom är konfokalmikroskopi ett mer naturligt val för experimentella system i vilka fluorescent märkning är av central betydelse. Även fluorescens holografi har visat sig fungera med en rad testpersonerna ³⁰ effektiviteten samling är för närvarande långt under det av en god konfokal system. Dessutom sådana experimentella system kräver idag specialist optiska apparater och erfarenhet för att fungera, förhoppningsvis kommer de att bli mer allmänt tillgänglig med ytterligare utveckling.

Sammanfattningsvis är DIHM motstycke i sin förmåga att förvärva högupplösta tredimensionella bilder av mikroskopiska objekt, vid höga hastigheter. Vi erbjuder användarvänlig programvara som gör denna teknik tillgänglig för nonspecialist med minimala ändringar i ett befintligt mikroskop. Dessutom integrerar uppbyggnaden programvaran enkelt med fritt tillgänglig dator renderingsprogram. Detta möjliggör intuitiv visualisering av mikroskopiska ämnen, synlig från alla vinklar. Med tanke på den tredimensionella karaktären hos många snabba mikroskopiska processer som involveraring svagt spridande föremål (t ex slå eukaryota flag eller cilier, simning bakterier, eller diffuse kolloider), bör denna teknik vara av intresse inom en rad olika områden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon Corp.
LED	Thorlabs	M660L3	emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm
LED power supply	Thorlabs	LEDD1B
Thread Adapter	Thorlabs	SM2T2
Thread Adapter	Thorlabs	SM1A2
Frame Grabber board	EPIX	PIXCI E4
High-Speed CMOS camera	Mikrotron	MC-1362