Digitale Inline Holographic Microscopy (Dihm) von Schwach-Streuung Themen

Summary

Die dreidimensionalen Positionen der schwach streuende Objekte eindeutig mit digitalen Inline holografische Mikroskopie (Dihm), die eine geringfügige Modifikation an einem Standardmikroskop umfasst identifiziert werden. Unsere Software verwendet eine einfache Heuristik Bildgebung verbunden mit Rayleigh-Sommerfeld-Back-Propagation, um die dreidimensionale Position und Geometrie eines mikroskopischen Phasenobjekt zu erhalten.

Abstract

Schwach streuende Objekte, wie beispielsweise kleine kolloidale Partikel und die meisten biologischen Zellen, sind in der Mikroskopie häufig angetroffen. In der Tat eine Reihe von Techniken entwickelt worden, um diese Phase Objekte besser zu visualisieren, Phasenkontrast und DIC gehören zu den beliebtesten Methoden zur Verbesserung der Kontrast. Jedoch bleibt Aufzeichnungs Position und Form in der Richtung außerhalb der Abbildungsebene herausfordernd. Dieser Bericht stellt eine einfache experimentelle Methode, um die Position und Geometrie der Objekte in drei Dimensionen genau zu bestimmen, mit digitalen Inline-holographische Mikroskopie (Dihm). Grob gesagt, ist die zugängliche Probenvolumen von der Kamera Sensorgröße in der seitlichen Richtung und der Beleuchtungskohärenz in axialer Richtung definiert. Typische Probenvolumina reichen von 200 um x 200 um x 200 um unter Verwendung LED-Beleuchtung, um5 mm x 5 mm x 5 mm oder mehr unter Verwendung von Laserbeleuchtung. Dieses Beleuchtungslicht wird so konfiguriert, daß ebene Wellen treffen auf die Probe. Objekte im Probenvolumen dann streuen Licht, das mit dem nicht gestreuten Licht stört den Interferenzmuster senkrecht zur Beleuchtungsrichtung bilden. Dieses Bild (das Hologramm) enthält den Tiefeninformationen für dreidimensionale Rekonstruktion erforderlich und kann auf einem Standard-Bildgebungsvorrichtung, wie eine CMOS-oder CCD-Kamera aufgenommen werden. Die Rayleigh-Sommerfeld-Backpropagation-Verfahren wird eingesetzt, um numerisch konzentrieren Mikroskopbilder, und eine einfache Heuristik Bildgebung auf der Grundlage der Gouy-Phase Anomalie wird verwendet, um zu identifizieren Streuobjekten im rekonstruierten Volumen. Diese einfache, aber robuste Methode ergibt sich eine eindeutige, Modell freie Messung der Lage und Form von Objekten in mikroskopischen Proben.

Introduction

Inline-Digital-holographische Mikroskopie (Dihm) ermöglicht die schnelle dreidimensionale Bildgebung von mikroskopischen Proben, wie Schwimmen Mikroorganismen ^1,2 und Soft Matter ^3,4 Systeme mit minimalen Änderungen an einer Standard-Mikroskop-Setup. In diesem Papier eine pädagogische Demonstration Dihm vorgesehen ist, um Software in unserem Labor entwickelt zentriert. Dieses Papier enthält eine Beschreibung, wie Sie das Mikroskop, Optimierung der Datenerfassung und Verarbeitung der aufgenommenen Bilder zu dreidimensionalen Daten zu rekonstruieren. Das Software-und beispielsweise Bilder (zum Teil auf Software von der GD Grier und andere entwickelten ^fünf) sind auf unserer Website frei verfügbar. Eine Beschreibung der notwendigen Schritte, um das Mikroskop zu konfigurieren, zu rekonstruieren dreidimensionale Volumen von Hologrammen und machen die daraus resultierenden Volumina von Interesse mit einem kostenlosen Ray-Tracing-Software-Paket zur Verfügung gestellt. Der Beitrag schließt mit einer Diskussion der Faktoren, die die Qualität der RekonstruktionUnd ein Vergleich der Dihm mit konkurrierenden Verfahren.

Obwohl Dihm wurde vor einiger Zeit beschrieben (für eine allgemeine Überprüfung der Grundlagen und Entwicklung, siehe Kim ^6), die erforderliche Rechenleistung und Bildverarbeitung Know-how hat sich bisher weitgehend seine Verwendung an Facharbeitsgruppen mit Fokus auf Instrumentenentwicklung beschränkt. Diese Situation ändert sich im Licht der jüngsten Fortschritte in der Computer-und Kameratechnik. Moderne Desktop-Computer kann problemlos mit der Verarbeitung und Datenspeicheranforderungen zu bewältigen; CCD-oder CMOS-Kameras sind in den meisten Labors Mikroskopie vorhanden ist und die erforderliche Software wird frei verfügbar im Internet von Gruppen, die sich Zeit für die Entwicklung, die Technik investiert haben.

Verschiedene Schemata sind für die Abbildung der Konfiguration von mikroskopischen Objekten in einem dreidimensionalen Probenvolumen vorgeschlagen. Viele davon sind ^{7,8-Scan-Techniken,} bei dem ein Stapel von Bildern aufgezeichnet wird, indem mechanically Übersetzen der Bildebene durch die Probe. Konfokalen Fluoreszenzmikroskopie ist vielleicht das bekannteste Beispiel. Typischerweise wird ein Fluoreszenzfarbstoff an ein Phasenobjekt, um ein akzeptables Niveau der Probe Kontrast zu erzielen zugegeben und die konfokalen Anordnung verwendet werden, um räumlich zu lokalisieren Fluoreszenzemission. Dieses Verfahren hat erhebliche Fortschritte, beispielsweise in Kolloid-Wissenschaft, wo es Zugang zu den dreidimensionalen Dynamik voll Systeme ^9-11 erlaubt geführt. Die Nutzung der Kennzeichnung ist ein wichtiger Unterschied zwischen der konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Dihm, aber auch andere Merkmale der beiden Techniken sind ein Vergleich lohnt sich. Dihm hat einen erheblichen Geschwindigkeitsvorteil, dass die Vorrichtung keine beweglichen Teile. Mechanischen Abtastspiegeln in Konfokalsystemen platzieren eine Obergrenze Datenerfassungsrate - typischerweise um 30 Frames / sec für Pixelbild 512 x 512. Ein Stapel solcher Bilder aus verschiedenen Fokusebenen kann durch physikalisches transl erhalten werdentriebs der Probentisch oder Objektivlinse zwischen den Bildern, die zu einer endgültigen Erfassungsrate von etwa einem Volumen pro Sekunde für eine 30-Frame-Stack. Im Vergleich dazu kann ein holographisches System basierend auf einem modernen CMOS-Kamera 2000 Bildern / sec bei der gleichen Bildqualität und Auflösung zu erfassen, wobei jeder Frame 'offline' verarbeitet, um eine unabhängige Snapshot des Volumens der Probe zu geben. Um es zu wiederholen: fluoreszierende Proben nicht für Dihm erforderlich, obwohl ein System entwickelt worden, das holographische Rekonstruktion eines fluoreszierenden Gegenstand ¹² führt. Sowie dreidimensionaler Volumeninformation, Dihm kann auch verwendet werden, um quantitative Phasenkontrastaufnahmen ^{13 vorzusehen,} aber das ist nicht Gegenstand des hier diskutierten.

Raw-Daten Dihm Bilder sind zweidimensional, und in mancher Hinsicht aussehen wie Standard-Mikroskopbilder, wenn auch unscharf. Der Hauptunterschied zwischen Standard-und Dihm Hellfeldmikroskopie liegt in den Beugungsringen umgeben, die Objekte in das Sichtfeld, das sind durch die Art der Beleuchtung. Dihm erfordert eine kohärentere Quelle als helles Feld - in der Regel eine LED oder Laser. Die Beugungsringe im Hologramm enthält die notwendigen Informationen, um ein dreidimensionales Bild zu rekonstruieren. Es gibt zwei Hauptansätze zur Interpretation Dihm Daten; direkte Montage und numerische Neuausrichtung. Der erste Ansatz ist in Fällen, in denen die mathematische Form des Beugungsmusters wird im Voraus bekannt ^3,4 anwendbar, wird dieser Zustand durch eine kleine Handvoll einfache Objekte wie Kugeln, Zylinder und Halbebene Scheide. Direkte Montage ist auch in Fällen, in denen das Objekt axialen Position bekannt ist zutreffend, und das Bild kann unter Verwendung einer Look-up-Tabelle von Bildvorlagen ¹⁴ ausgestattet werden.

Der zweite Ansatz (numerische Refokussierung) ist eher allgemein und beruht auf der Verwendung der Beugungsringe in dem zweidimensionalen Bildhologramm zur numerischen Rekonstruktion des optischen Feldes aneine Anzahl von (willkürlich) beabstandet Brennebenen der gesamten Probenvolumen. Mehrere verwandte Methoden existieren, dies zu tun ^6; diese Arbeit verwendet die Rayleigh-Sommerfeld-Back-Propagation-Technik, wie von Lee und Grier ⁵ beschrieben. Das Ergebnis dieses Verfahrens ist ein Stapel von Bildern, die die Wirkung der Brennebene des Mikroskops (daher der Name `numerische Neuausrichtung ') manuell ändern zu replizieren. Sobald ein Stapel von Bildern erzeugt worden ist, muss die Position des Objekts in der Brennvolumen erhalten werden. Eine Anzahl von Bildanalyseheuristiken, wie lokale Intensitätsvarianz oder räumliche Frequenzgehalt, wurden vorgestellt, um die Bildschärfe an verschiedenen Stellen in der Probe ¹⁵ zu quantifizieren. In jedem Fall, wenn ein bestimmtes Bildmetrik maximiert (oder minimiert), wird das Objekt als im Mittelpunkt.

Im Gegensatz zu anderen Systemen, die auf eine bestimmte Brennebene, wo sich ein Objekt "im Fokus" identifizieren zu suchen, das Verfahren in dieser Arbeit holt sich punkte, die in das Objekt von Interesse liegen, die in einem breiten Spektrum von Brennebenen erstrecken kann. Dieser Ansatz ist auf ein breites Spektrum von Themen und eignet sich besonders für ausgedehnte, schwach streuenden Proben (Phase-Objekte), wie stabförmige Kolloide, Ketten von Bakterien oder eukaryotischen Flagellen. In diesen Proben ändert sich die Bildkontrast, wenn das Objekt durch die Fokusebene verläuft, eine defokussierte Bild hat ein Lichtzentrum, wenn das Objekt auf einer Seite der Bildebene und einer dunklen Mitte, wenn es auf der anderen. Reine Phasenobjekte haben wenig bis keinen Kontrast, wenn sie genau in der Brennebene liegen. Dieses Phänomen der Kontrastinversion von anderen Autoren ^16,17 diskutiert und letztlich aufgrund der Gouy-Phase Anomalie ^18. Dies wurde auf einer strengeren berechtigt im Kontext der Holographie setzen an anderer Stelle, wo die Grenzen der Technik ausgewertet, die typische Unsicherheit in der Position ist, in der Größenordnung von 150 nm (ca. ein Pixel) in each Richtung ^19. Die Gouy-Phase Anomalie-Methode ist eine der wenigen gut definierten Dihm Systeme zur Bestimmung der Struktur ausgedehnter Objekte in drei Dimensionen, aber dennoch einige Objekte problematisch zu rekonstruieren sind. Objekte, die direkt entlang der optischen Achse (die auf die Kamera) liegen, sind schwierig genau zu rekonstruieren; Unsicherheiten in der Länge und der Position des Objektes groß werden. Diese Einschränkung ist zum Teil auf die eingeschränkte Farbtiefe der Pixel Aufzeichnung des Hologramms (die Anzahl der verschiedenen Graustufen, die die Kamera aufnehmen kann). Ein weiterer problematischer Konfiguration tritt auf, wenn das Objekt von Interesse ist sehr nahe an der Brennebene. In diesem Fall werden die reale und virtuelle Bilder des Objekts in unmittelbarer Nähe wieder aufgebaut, was zu komplizierte optische Felder, die schwer zu interpretieren sind. Eine zweite, etwas weniger wichtiges Anliegen dabei ist, dass die daraus resultierenden Beugungsstreifen besetzen weniger von der Bildsensor, und das gröbere informationen führt zu einer schlechteren Qualität Wiederaufbau.

In der Praxis wird ein einfacher Farbverlauf-Filter, um dreidimensionale rekonstruierten Volumen angewendet starke bis Inversionen entlang der Beleuchtungsrichtung zu erkennen. Regionen, in denen Intensitätsänderungen schnell von hell nach dunkel oder umgekehrt, werden dann mit Streubereiche verbunden. Diese einzelnen Beiträge Summe, um die Gesamtstreufeld, das einfach mit dem Rayleigh-Sommerfeld-Backpropagation-Verfahren invertiert geben; schwach streuenden Objekte sowie eine nicht wechselwirkenden Erhebung solcher Elemente ²⁰ beschrieben. In dieser Arbeit wird die axiale Intensitätsverlauf Technik mit einer Kette von Streptococcus Zellen angelegt. Die Zellkörper sind Phasenobjekte (der Spezies E. coli hat einen Brechungsindex, gemessen ²¹ bis 1,384 bei einer Wellenlänge λ = 589 nm sein, der Streptococcus-Stamm dürfte ähnlich sein) und erscheinen als ein Hochintensität-Kette von verbundenen Blobs the Probenvolumens nach dem Gradienten-Filter aufgebracht wurde. Standard auf diesem gefilterten Volumen angewendet Schwelle und Merkmalsextraktion Methoden ermöglichen die Extraktion von volumetrischen Pixel (Voxel), die der Region in den Zellen. Ein besonderer Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es eine eindeutige Rekonstruktion der Position eines Objekts in der axialen Richtung. Ähnliche Verfahren (zumindest diejenigen, die Aufzeichnung von Hologrammen in der Nähe des Objekts durch ein Mikroskopobjektiv abgebildet) leiden darunter, nicht in der Lage, die Zeichen für diese Verschiebung zu bestimmen. Obwohl die Rayleigh-Sommerfeld-Rekonstruktionsverfahren ist auch Zeichen-unabhängige in diesem Sinne ermöglicht die Gradientenbetrieb uns, zwischen schwacher Phasenobjekte oberhalb und unterhalb der Fokusebene zu unterscheiden.

Protocol

1. Setup-und Datenkommunikation

1. Wachsen einer Kultur von Streptococcus-Stamm V4051-197 (glatte Schwimmen) Zellen in KTY Medium aus der Tiefkühl ^22. Inkubieren in einem Rundschüttler über Nacht bei 35 ° C und 150 UpM bis zur Sättigung.
2. Beimpfen von 10 ml frischem KTY Medium mit 500 &mgr; l der gesättigten Kultur. Inkubation für weitere 3,5 h bei 35 ° C und 150 Upm, bis die Zellen erreichen eine optische Dichte von etwa 1,0 bei λ = 600 nm (etwa 5 x 10 ⁸ Zellen / ml).
3. Verdünnt 1:400 in frischem Medium auf eine Endkonzentration von beweglichen Zellen zu erhalten.
4. Auf einen Objektträger, einen Ring von Fett (zB aus einer Spritze mit Vaseline gefüllten) um 1 mm in der Höhe und einen Tropfen der Probenlösung in der Mitte. Legen Sie ein Deckglas oben und drücken Sie leicht an den Kanten zu versiegeln, sicherzustellen, dass die Flüssigkeit in Kontakt mit beiden Träger und Deckglas. Die daraus resultierende Probenkammer sollte arou seinnd 100-200 um in die Tiefe.
5. Setzen Sie die Probenkammer im Mikroskop mit dem Deckglas nach unten, und vorsichtig, um die Bildung von Luftblasen in dem Öl zwischen Glas und Linse zu verhindern.
6. Fokussierung des Mikroskops auf der Bodenfläche der Probenkammer, und bringen den Kondensator zu konzentrieren.
7. Schalten Sie die Standardbeleuchtung und legen Sie den LED-Kopf hinter dem Kondensator Apertur des Mikroskops. Stellen Sie die LED-Stromversorgung für maximale Leistung.
8. Schließen Kondensorapertur in vollem Umfang, und wenn nötig, verschieben die Leuchtdiode in der Halterung, bis die Beleuchtung auf der Objektivlinse Öffnung mittig.
9. Schalten Sie den Computer und der Kamera, und leiten alles Licht, um Kamera-Anschluss des Mikroskops. Passen Sie die Bildrate und die Bildgröße in der Bildaufnahme-Software.
10. Machen Sie den Bild-Belichtungszeit so kurz wie möglich unter Beibehaltung guten Kontrast. Überprüfen einer Bildintensitätshistogramm, um sicherzustellen, dass das Bild nicht saturaTED-oder unterbelichtet.
11. Wenn nötig, neu auszurichten, so dass das Mikroskop Objekt von Interesse leicht (in der Regel von 10 bis 30 um) defokussiert. Das Objekt und der Brennebene sollten im gleichen Medium (dh die Brennebene sollten innerhalb der Probenkammer liegen).

2. Wiederaufbau

Der erste Schritt der Datenverarbeitung ist die numerisch refokussieren ein Videobild in einer Reihe von verschiedenen Tiefen, wodurch ein Stapel von Bildern. : Benutzerfreundliche Software, dies zu tun finden Sie hier http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html zusammen mit B. Bilder (mit einem inversen Mikroskop erfasst und einem 60X Ölimmersions-Objektiv) und eine Szene-Datei für Raytracing Rendering.

1. Eingang der Rahmen von Interesse und deren jeweiligen Hintergrund als separate Bilddateien in die entsprechenden Felder auf der Schnittstelle. Ein Hintergrundbild ist ein Rahmen, fairly stellt den Hintergrund des Videos, in Abwesenheit des Hologramms, und wird verwendet, um eine Festmusterrauschen, das mit dem Hologramm Lokalisierung und Analyse stören könnten, zu unterdrücken.
2. Werte eingeben, bevor Sie das Programm in den globalen Einstellungen Boxen auf der linken Seite des Bildschirms. Die ersten drei sind Stack-Parameter Ausgang: Axial Position des ersten Rahmen ('Start Fokus'), Anzahl der Scheiben in der rekonstruierten Stapel ('Anzahl der Schritte'); axiale Abstand zwischen jeder Scheibe im Stapel ('Schrittweite') .
3. Um Objekte mit den richtigen Proportionen zu rekonstruieren, sollte die Schrittweite die gleiche Größe wie die laterale Pixelabstand sein. Geben Sie der Kamera seitlichen Abtastfrequenz (1/pixel Abstand) in der 'Pixel / micron' Box, die Belichtungswellenlänge und mittleren Brechungsindex in den letzten zwei Boxen. Die Standardwerte des Programms sind für die Rekonstruktion der Daten beispielsweise geeignet.
4. Drücken Sie die Taste 'Flip Z-Gradienten ", wenn der Mittelpunkt der object ist dunkel in dem Hologramm (siehe Beispiel Rahmen 2005 und die Diskussion Abschnitt für weitere Details).
5. Überprüfen Sie die Bandpassfilter ein / aus (default ist). Diese optionale Bandpass-Filter, in einer Box unter dem Verlaufs-Flip-Schalter befindet, ist für die Unterdrückung der Beitrag laut Pixel verantwortlich. Der Bandpass-Filter auf jedem Bild Scheibe unmittelbar nach Generation angewendet.
6. Überprüfen Sie die Zwischenausgangs Ein-/ Aus-Zustände (Standard ist). Zwischenanalyse Schritte sind in zwei Ausgangsvideos als unkomprimierte geschrieben, avi Dateien:. Ist die erste der neu ausgerichteten Stapel (Dateinamen, die auf '_stack.avi'), der zweite ist der Stapel nach der axialen Gradienten Operation (Dateiname, die auf ' _gradient.avi). Im Idealfall wird diese zweite Stapel enthalten das Objekt von Interesse hervorgehoben als ein helles Objekt vor einem dunklen Hintergrund.
7. Nach Einstellung aller Parameter, drücken Sie "Ausführen" im Hauptfenster. Der ausgewählte Rahmen wird im Hauptfeld der Software angezeigt.
8. Verwenden Sie dieLupe-Werkzeug in der Werkzeugleiste auf der linken Seite das Bild, um es zu vergrößern (linke Maustaste) und verkleinern (Shift + linke Maustaste) gefunden. Verwenden Sie das Rechteck-Werkzeug in der Werkzeugleiste, um eine Region of Interest (ROI) zu wählen. Zu erfassen, wie viele Streifen des Hologramms wie möglich innerhalb des Rechtecks, da dies die Wieder optimieren.
9. Drücken Sie die "Process"-Taste, um die beiden Bildstapeln zu generieren. Überprüfen Sie die resultierende Stapel mit ImageJ (die kostenlos zur erhalten werden können http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Wenn das Objekt von Interesse eindeutig im Gradienten Bildstapel gesehen werden, zu dem nächsten Schritt fort, um die Objektkoordinaten zu extrahieren.

3. Rendering

1. Neben Rahmen Neuausrichtung kann dieses Programm finden die x-, y-, z-Koordinaten für jedes Voxel in dem Objekt von Interesse. Drücken Sie die "Feature Extraction"-Taste, um diese Funktion zu aktivieren.
2. Geben Sie einen Pfad, einschließlich Erweiterung (zB: c: home output.inc), für dieAusgangskoordinaten-Datei. Wählen Sie "POV-Ray-Stil" in der "Ausgabe-Koordinaten Stil"-Box. Dies bewirkt, dass das Programm auf eine Objektdatei, die mit der kostenlosen POV-Ray Raytracing-Software-Paket (das gewonnen werden kann visualisiert werden kann schreiben http://www.povray.org/ ).
3. Nachbearbeiten der Bilder, wie in Abschnitt 2 oben. Das Programm wird eine Reihe von (x, y, z)-Koordinaten in der gewählten ROI, an den Dateinamen in der "Output koordinieren" Feld geschrieben. Extraktion von Objektkoordinaten dauert deutlich länger als Stack-Generation.
4. Stellen Sie sicher, dass die Probe POV-Ray-Datei (mit der Rekonstruktion Code geliefert) in dem gleichen Ordner wie die Datei nur Koordinaten erzeugt. Bearbeiten Sie die Probe. Pov-Datei und ersetzen Sie den Dateinamen in Anführungszeichen auf der Linie
   # Include "MYFILE.inc"
   mit dem Namen der durch den Rekonstruktionsdatendatei Code generiert.
5. Klicken Sie auf den "Ausführen"-Button in POV-Ray, ein Bitmap-Bild zu machen. Ter Kameraposition, Beleuchtung und Textur-Optionen sind nur einige der Anpassungen in POV-Ray möglich, siehe die Online-Dokumentation.

Representative Results

Um die Funktionen des Dihm zu demonstrieren, wurden Versuche an einer Kette von Streptococcus-Bakterien durchgeführt. Die Kette selbst gemessen 10,5 mm lang und wurde von 6-7 sphärozylindrische Zellen (zwei der Zellen in der Kette sind in der Nähe Division) mit Durchmessern im Bereich von 0,6 bis 1 um zusammen. 1a und 1b die wichtigste Schnittstelle zeigen des Wiederaufbaus und der Rendering-Software. Beispiele der numerischen Refokussierung Verfahrens sind in Fig. 2 zu sehen, wo eine räumliche Bandpaß-Filter angewendet wurde. Fig. 3 zeigt die Wirkung des Gradienten-Filter auf die Bilder in 2. Die Rohdaten verwendet werden, um diese beiden Bilder zu konstruieren mit dem Code-Download wie beispielsweise Rahmen 108 gebündelt. Schließlich Abbildung 4 zeigt die Wirkung von guten und schlechten Datenqualität auf der rekonstruierten Geometrie. Beide Rahmen in diesem letzten Bild wurden aus einem Video von der sam genommene Kette von Zellen (eine andere Kette mit dem in den ersten beiden Ziffern). Eine gute Rekonstruktion ist in den meisten Fällen möglich, aber wenn die Kette Ende auf die Rekonstruktion orientiert ausfällt, was eine große runde Objekt in der Brennebene. Dieser Fehlermodus ist charakteristisch für Objekte entlang der optischen Achse ausgerichtet ist. Für Skala, in der Computer gerenderten Bilder, die Kontrollen auf dem Boden sind ein um auf einer Seite. Für eine detaillierte Diskussion der Präzision und Genauigkeit dieser Methode sollten die Leser Wilson und Zhang ¹⁹ zu konsultieren.

Fig. 1 ist. Software-Schnittstellen. Die wichtigste Schnittstelle der Rekonstruktionssoftware ist in Panel (a) gezeigt, in dem die Datei Eingabefelder, globale Einstellungen Parameter und andere wichtige Funktionenauf die im Text genannt sind besonders hervorgehoben. Panel (b) zeigt das Beispiel Szene für POV-Datei Ray, in Standard-Szenen-Editor des Programms. Der Dateiname in Anführungszeichen auf der angegebenen Zeile sollte in die Ausgabedatei von der Rekonstruktionssoftware eingestellt werden. Es kann notwendig sein, um der Kamera Position und Richtung (angegeben entsprechenden Abschnitt), um den Wiederaufbau richtig visualisieren zu ändern. In der Online-POV-Ray-Dokumentation für weitere Anweisungen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

2. Beispiele für numerisch neu ausgerichtet Bilder. Die Figur Platten in der linken Spalte zeigen numerisch neu ausgerichtet(X, y)-Ebene in verschiedenen Höhen innerhalb des rekonstruierten Volumens (wie angegeben). Das Bild unten links zeigt die Original-Hologrammdaten, durch die von den Hintergrunddaten unterteilt. Das große Feld auf der rechten zeigt ein (x, z) Schnitt durch den gleichen Stack. Die Kontrastpunkt Inversions entlang der z-Achse kann bei etwa einem Drittel der Strecke von der Oberseite des Bildes erkennen. Die roten Linien auf dem größeren Bild zeigen, wo dieser Ebene (x, z) schneidet, die (x, y)-Ebene nach links. Ebenso die blauen Linien in den kleineren Tafeln zeigen den Schnittpunkt der (x, z)-Slice. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

3. Beispiele für Gradienten-gefilterten Bilder.0; Dieses Bild zeigt die Wirkung der Anwendung des Gradienten-Filter für die Daten in Fig. 2. Beachten Sie, dass das Objekt von Interesse als symmetrischer Lichtblick hervorgehoben. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

4. Beispiele von Daten, um gute und schlechte gerenderten Bildern führen. Die beiden Bilder in Tafeln (a) und (c) wurden aus dem gleichen Video einer Taumel Kette von Zellen aufgenommen. Die Daten in der Tafel (a) repräsentativ sind für die meisten Rahmen in dieser Reihe, in der die Kette nicht direkt entlang der optischen Achse ausgerichtet ist. Die Form und die Position des Objekts in der getreu reproduziertRendering in Panel (b). Im Fall der Platte (c) wurde die Kette kurz orientierte End-on auf die Brennebene; Objekte in dieser Konfiguration schwierig zu rekonstruieren sind, und liefern typischerweise einen "Klecks" in der Nähe der Brennebene, wie in Feld (d gesehen ). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Discussion

Der wichtigste Schritt in diesem Versuchsprotokoll ist die genaue Erfassung von Bildern von einer stabilen experimentellen Aufbau. Bei schlechten Hintergrunddaten, ist High-Fidelity-Rekonstruktion unmöglich. Es ist auch wichtig, Objektivlinsen mit einer internen Phasenkontrastelement (als dunkler Kreisring beim Blick durch die Rückseite des Ziels sichtbar ist) zu vermeiden, da dies das rekonstruierte Bild verschlechtern. Das Objekt des Interesses sollte weit genug von der Brennebene, die ein paar Paare von Beugungsstreifen sind in der Bild sichtbar (eine geeignete Heuristik ist, dass die Unschärfe-Muster erscheinen soll zum 10-fachen der linearen Dimension des fokussierten Objekt haben - siehe Beispieldaten ). Objekte zu nahe an der Brennebene leiden unter Doppel Bild-und Sampling-Artefakte, wie zuvor beschrieben. Es ist auch wichtig, um eine gute Charakterisierung des Kamerapixelabstand haben, da dies ein kritischer Faktor bei der Bestimmung Refokusierungs Abstände korrekt. Oft Kamera DOKUMENTATIonen sind in den Spezifikationen Liste 'Pixelgröße ", das kann ein wenig zweideutig, weil bestimmte Arten von Kamera (CMOS-Kameras im Besonderen) können erhebliche Bereiche der Raum zwischen den Pixeln, die nicht lichtempfindlich sind, haben. Der zuverlässigste Weg, um diese Informationen zu erhalten, ist ein Standard-Kalibrierungsziel verwenden, wie eine USAF 1951 Resolution Chart, und messen Sie die Sampling-Frequenz (Anzahl der Pixel pro Mikrometer), die direkt aus einem Bild.

Im Grenz monochromatische Beleuchtung wird die Auflösung eines Dihm System schließlich durch die numerische Apertur des Objektivs (NA) und der Wellenlänge der Beleuchtung (λ) ^23,24 gesetzt. Seitlich getrennt Punkte sollten mindestens einen Abstand Δ _lat = 'λ' / 2NA auseinander, wenn sie separat gelöst werden, sind liegen. In ähnlicher Weise wird die axiale Auflösungsgrenze im Idealfall durch "Δ" _ax = λ / 2 (NA) ² gegeben. Bei Verwendung einer LED in Dihm, gibt es eine Grenze für die Tiefedas Volumen, das abgebildet werden kann, dies wird letztendlich von dem optischen System und der Kohärenz der Beleuchtung bestimmt. Eine typische Tiefe dieser "sensiblen Volumen" ist etwa 100-200 um für eine LED, wenn eine detaillierte Darstellung dieser Art von Effekt kann an anderer Stelle ²⁵ gefunden werden. Das Messvolumen ist in den beiden anderen Richtungen, die durch die Größe des Bildes begrenzt. Obwohl die Software ist ziemlich robust, bestimmte Operationen sind eher Speicher-hungrig. Rekonstruktion eines Bildstapels und den Erhalt der Intensitätsverlauf sind beide ziemlich konservativ, aber das Extrahieren der Koordinaten einer Funktion von Interesse von einem Gradienten-Stack kann eine Menge Speicher (mehrere hundert Megabyte bis zu mehreren Gigabyte) zu konsumieren. Zu diesem Zweck ist es ratsam, das rekonstruierte Volumen von Interesse 100-150 Pixel in jeder Dimension beschränken. Diese Einschränkung kann etwas nachgelassen wenn der Code auf einem 64-Bit-Betriebssystem mit mehr als 4 GB RAM (die Software auf einem Rechner mit 12 GB geschrieben) ausgeführt werden,obwohl Rechenzeit untragbar geworden.

Leicht bis zu Millimetern - - und bei geringer Vergrößerung Um einen größeren Systems zu untersuchen, kann das LED-Lichtquelle mit einem Laser, der Rekonstruktion von Objekten liegen auf einer viel größeren Tiefe von der Fokusebene ermöglicht ersetzt werden. Erste Versuche mit einer solchen Konfiguration mit einer Laserdiode in einer Single-Mode-Lichtleitfaser gekoppelt ist, erlaubt rekonstruierten Tiefen bis zu 10 mm unter Verwendung eines 10X-Mikroskopobjektiv. Diese erhöhte Tiefenschärfe ist mit Kosten verbunden, aber, große Kohärenzlänge des Lasers führt zu Bildrauschen, vor allem Reflexionen von verschiedenen Oberflächen in der optischen Zug Diese Effekte sind etwas versetzt (die Wände der Probenkammer, Linsenflächen, etc.) wenn das Gerät stabil genug ist, um ein gutes Bild zu bekommen Hintergrund. Haben jedoch Fremdreflexe eine unbekannte Verteilung der Phasen, so dass, wenn ihre Größe ist vergleichbar mit der Referenzwelle (ungestreuten Licht), Umbau vonction kann unmöglich geworden. Andere Autoren haben die Kohärenz einer Laserlichtquelle modifiziert, beispielsweise durch Modulation der Lasertreiberstrom ²⁶ oder mit einer rotierenden Mattscheibe, um die Kohärenz ²⁷ zu reduzieren.

Aus einer Fehlersuche Sicht begegnet die meisten Probleme bei der Verwendung des holografischen Rekonstruktionssoftware besten durch die Kontrolle der Zwischen Stufen der Datenanalyse behoben. Im Fall des rekonstruierten Bildstapel, die Objekte sollten "Deblur 'symmetrisch, wie sie in den Fokus gerückt. Wenn die Beugung Fransen aussehen stark asymmetrisch ist, ist eine schlechte oder Offset-Hintergrundbild oft schuld. Wenn das Bild für die Rekonstruktion von einem Stapel von ähnlichen Bildern genommen wurde, beispielsweise ein Bild aus einer Videosequenz eines sich bewegenden Objekts, ein Hintergrundbild kann manchmal durch Mittelung über alle Video erhalten werden (durch den Mittelwert oder Median) Pixelwerte Rahmen. Wenn sich das Motiv während der Videosequenz sich im wesentlichen, seineBeitrag zu einem Pixel-Wert klein ist und die dominante Beitrag von den unveränderten Hintergrundrahmen, in dem der Gegenstand nicht anwesend sind. In dem Fall, in Koordinaten eines Objekts nicht korrekt zurück kann der Gradient Bildstapel ein nützliches Diagnose sein. Wenn das Objekt als eine Leere von einem hellen Ring in der Steigung Bildstapel umgeben gesehen, sollte die Steigung Filter umgedreht werden und das Bild verarbeitet. Wie in der Einleitung erwähnt, ist die Rayleigh-Sommerfeld-Rekonstruktionsverfahren unempfindlich gegen die Zeichen der Abstand eines Objekts von der Brennebene. Wenn zwei schwach streuenden Objekte den gleichen Abstand von der Brennebene, aber auf gegenüberliegenden Seiten, so würden sie in den Brennpunkt an der gleichen Position in dem rekonstruierten Bild Stapel kommen. Jedoch würde die axiale Intensitätsmuster umgekehrt werden. Die Mitte des Objekts ursprünglich über der Brennebene (bezogen auf die umgekehrte Mikroskop Geometrie) gefunden wechselt von hell nach dunkel an, die durch die In-Fokus-position, während das Objekt unterhalb der Brennebene wechselt von dunkel zu hell. Die Option Gradienten-Flip extrahiert daher entweder Objekte über dem Brennebene (Standard) oder unterhalb der Fokusebene (mit Farbverlauf-Flip auf 'on' gesetzt), was eine eindeutige axiale koordinieren. Beachten Sie, dass dies gilt strikt nur schwach streuenden Objekten, wobei das Verfahren funktioniert sehr gut für Polystyrolmikrokügelchen bis zu 1 &mgr; m im Durchmesser, aber weniger gut für größere Polystyrolpartikel. Biologische Proben zeigen typischerweise viel schwächer Streuung, deren Brechungsindizes sich näher an dem des umgebenden Mediums (Polystyrol hat einen Brechungsindex nahe 1,5), so dass größere Gegenstände untersucht werden können.

In Bezug auf die zukünftige Ausrichtung, könnte diese Software erweitert, um mehrere Bilder in einem Video zu verarbeiten, um Tracking zu schwimmen Mikroorganismen oder kolloidalen Teilchen in drei Dimensionen zu ermöglichen. Die hohe Bildrate, die die Technik bietet ist gut geeignet, um die Verfolgung selbst den schnellsten schwimmenmeren, wie das Meer lebende Vibrio alginolyticus, die bei Geschwindigkeiten bis zu 150 um / sec ²⁸ schwimmt. Die mikroskopischen Schwimmbahnen von Einzelzellen wurden zunächst vor einiger Zeit ²⁹ verfolgt, aber dies erfordert in der Regel spezialisierte Vorrichtung. Die Gouy-Phase Anomalie nähern eignet sich nicht nur auf einfache Verfolgung von Einzelzellen über lange Strecken, aber bietet die Möglichkeit, Zusammenhänge zwischen dem Schwimmverhalten verschiedener Individuen zu untersuchen. Dies hängt insbesondere von dreidimensionalen Geometrie-Daten, die bisher unzugänglich ist aus technischen Gründen.

Wie in der Einleitung erwähnt, kann ein Vergleich mit Fluoreszenz konfokalen Mikroskopie ist nicht ideal, aber die Allgegenwart der konfokalen Systeme macht einen Vergleich der dreidimensionalen Abbildung Aspekt lohnt. In der Tat ist Dihm komplementär zu der konfokalen Mikroskopie, es sind Vergleichs Vor-und Nachteile beider. Dihm ermöglicht deutlich schnellere Daten acquisition Preise: mehrere tausend Bände pro Sekunde ist Routine, da eine Kamera schnell genug. Dies ermöglicht Verfolgung von (zum Beispiel) mehrere Schwimm Bakterien, die über die Fähigkeit langsamer konfokalen Systemen. Selbst mit einer schnellen Kamera ist Dihm eine Größenordnung billiger als konfokale Mikroskopie, und die Daten für ein dreidimensionales Volumen in einem einzigen zweidimensionalen Bild gespeichert werden, wodurch Anforderungen an die Datenspeicherung und Sicherung. Dihm ist leicht skalierbar in dem Sinne, dass die Arbeit mit niedrigen Vergrößerungen, größere Proben und längere Arbeitsabstände ist trivial. Die konfokale Mikroskopie hat immer noch die Oberhand in dicht oder komplexen Proben, jedoch. Beispielsweise in einem dichten kolloidalen Suspension ermöglicht die Mehrfachstreuung holographischen Rekonstruktion praktisch unmöglich, ein konfokales System entweder Fluoreszenzemission oder Reflexion besser zu studieren solchen Systemen ⁹ geeignet. Darüber hinaus ist die konfokale Mikroskopie eine natürliche Wahl für experimentelle Systeme, in denen fluorescent Kennzeichnung ist von zentraler Bedeutung. Obwohl Fluoreszenz Holographie wurde gezeigt, dass mit einer Reihe von Tests unterzieht arbeiten ³⁰ der Sammeleffizienz ist derzeit weit unter der von einem guten konfokales System. Darüber hinaus erfordern derzeit wie experimentelle Systeme Fach optische Apparate und Erfahrung zu bedienen, hoffentlich werden sie weiter verbreitet mit weiteren Entwicklung werden.

Zusammenfassend ist Dihm in seiner Fähigkeit, hochauflösende dreidimensionale Bilder von mikroskopischen Objekten, bei hohen Drehzahlen zu erwerben beispiellos. Wir bieten eine benutzerfreundliche Software, die diese Technik zugänglich für die Nichtspezialisten mit minimalen Änderungen an einem bestehenden Mikroskop macht. Darüber hinaus integriert der Rekonstruktionssoftware problemlos mit frei verfügbaren Computer-Rendering-Software. Dies ermöglicht eine intuitive Visualisierung der mikroskopischen Themen, sichtbar aus jedem Winkel. Da die dreidimensionale Natur der vielen schnellen mikroskopischen Prozesse involving schwach streuenden Objekten (zB schlagen eukaryotischen Geißeln oder Cilien, Schwimm Bakterien oder treu Kolloide), sollte diese Technik von Interesse für ein breites Spektrum von Feldern sein.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon Corp.
LED	Thorlabs	M660L3	emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm
LED power supply	Thorlabs	LEDD1B
Thread Adapter	Thorlabs	SM2T2
Thread Adapter	Thorlabs	SM1A2
Frame Grabber board	EPIX	PIXCI E4
High-Speed CMOS camera	Mikrotron	MC-1362