Summary
我们开发了新的内在的多功能纳米囊泡称为porphysomes，它具有结构依赖性荧光自猝灭和独特的光热特性，从而起到有效的光热治疗剂。我们制定了利用高压挤压porphysomes并研究了它们的光热治疗的疗效在异种移植瘤模型。
Abstract
我们最近开发porphysomes为本质的多功能纳米囊泡。光敏剂，焦脱α，缀合到磷脂，然后自组装到脂质体样球形囊泡。由于卟啉的卟啉 - 脂质双分子层的密度非常高，porphysomes产生大的消光系数，结构依赖性的荧光自猝灭，以及卓越的光热功效。在我们的制剂，合成porphysomes采用高压挤出，和大约120纳米显示的平均粒度。二十四小时后静脉注射porphysomes的，肿瘤的局部温度从30°C时为750毫瓦（1.18瓦/厘米2），671 nm激光照射1分钟风险迅速上升至62℃。随着肿瘤的完全消融，焦痂2周内形成和愈合，而在对照组的肿瘤继续生长，并全部达到定义的连接3周内三维点。这些数据表明porphysomes如何可以用作有效的光热治疗（PTT）剂。
Introduction
Porphysomes是我们最近开发的新型多功能纳米囊泡，它们能够多模式成像和治疗1。它们是由自组装卟啉双分子层形成，并含有极高密度卟啉（超过83，000/porphysome颗粒），从而产生较大的消光系数，并导致独特的结构依赖的荧光自猝灭。 Porphysomes具有良好的体内药物动力学和生物分布性质：它们显示出12小时的血中半衰期以下系统的管理，并被动地积聚在异种移植肿瘤有7.5％ID / g的在24小时后注射2。
其独特的结构和理化性质做出porphysome一个很好的候选人，多模式成像和图像引导治疗。首先，含有卟啉，porphysomes本质上是适合的肿瘤时的肿瘤积累1荧光成像。此外，每个卟啉具有稳定的网站螯合放射性同位素，因此，porphysomes可以很容易地用放射性同位素标记如64Cu用于PET成像3。此外，所吸收的光的能量下激光照射曝光的热消散时porphysome结构是完整的，所以porphysomes也表现出独特的光声成像和PTT功能。它已经显示，24小时静脉注射porphysomes后，本porphysome积累的肿瘤的激光照射引起的温度的急剧上升和强的光热肿瘤消融。这表明porphysomes是有效率的光热增强与消光系数高达金纳米粒子（纳米金）1。在另一方面，与其它无机光热剂，包括纳米金相比，porphysomes显示生物安全的突出优势，由于其有机性。 Porphysomes是可生物降解酶和诱发急性最小toxicitÝ小鼠静脉内剂量高达1000毫克/千克1。此外，类似于脂质体，porphysomes的大型水核可以是被动或主动加载的治疗或成像剂。的光学特性和porphysomes的生物相容性证明有机纳米粒子的生物光子成像和治疗的多峰电位。
在本文中，我们介绍的焦脱-脂质共轭物的合成方法，在制造和使用高压挤出porphysomes的表征方法。 体内 PTT对小鼠中进行，以及证明porphysome启用PTT在肿瘤的效率治疗采用皮下移植瘤模型。
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Protocol
1。焦脱脂质的合成
- 结合200毫摩尔焦脱（如前所述螺旋藻茵藻类制备;。郑等人 ，Bioconj化学，2002年，13 -392）4，98.7毫克十六时lysophophatidylcholine（1 -棕榈酰-2 -羟基-sn-甘油基-3 - 磷酸胆碱，阿凡提极性脂质＃855675），76.3毫克的EDC，48.7毫克的DMAP（4 - （二甲氨基）吡啶）的5ml戊烯稳定的氯仿为1:1:2:2烟火的比率：脂质：EDC ：DMPA的。
- 在室温下搅拌反应混合物在氩气下放置24小时。使用旋转蒸发器加热至40℃。蒸发在减压下将氯仿的热电脂质异构体（焦附着在sn-1和sn-2位）的混合物制备。
- 重悬热电脂质异构体混合物中1mM的氯化钙 ，50毫摩尔Tris（pH 8）中，0.5％的Triton X-100和10％甲醇中，在5毫克/毫升的浓度。从蜜蜂毒液在加入磷脂酶A2（PLA2）0.1毫克/毫升的浓度和孵育的溶液在37℃下放置24小时以消化SN-1热电脂质，并产生纯Sn-2热电脂质异构体。
- 添加额外的2倍体积的氯仿和1.25体积的甲醇，提取物，然后用旋转蒸发器在减压下于40℃除去溶剂重悬裂解产物在1％MeOH的DCM和净化过的异构体纯的热电脂质小二醇硅胶柱。
2。 Porphysomes的制备
- 溶解焦脱脂，二硬脂酰-sn-甘油基-3 - 磷酸乙醇胺-N-甲氧基（聚乙二醇）（PEG-2000-PE）和胆固醇的氯仿分开，并分别记录该浓度。
- 通过将65％（摩尔）的卟啉 - 脂质，5％（摩尔）PEG-2000-PE和30摩尔％的胆固醇准备在一个12×75毫米的硼硅酸盐试管porphysome脂质膜用5毫克/管的总脂质的重量。
- 干下硝基流脂膜根气，让他们在真空条件下1小时进一步干燥。存储该脂质膜在-20℃和氩气下，直到将来水化和挤压。
- 添加1毫升的磷酸盐缓冲盐水（PBS，150 mM氯化钠，10mM磷酸盐，pH7.4）中，以每脂质膜管。冷冻试管在液氮中，待完全冷冻，然后解冻的管在65℃水浴中，直到样品已全部熔化。涡流管，总共30秒（3倍于每10秒，5秒再加热于65℃水浴中的每个涡旋之间）。
- 重复冻融循环5次或更多时需要的，直到没有大的聚集体可以在水合溶液中被观察到。离开porphysome悬挂在冰上完成时。
- 组装高压挤出机（10毫升）与安装。连接thermobarrel挤出机恒温循环器为65℃循环水浴2层叠100nm的聚碳酸酯过滤器，并在挤出机的系统连接到一个氮气罐的高压力确保供应。
- 用9英寸的玻璃移液管转移porphysome悬浮到挤出机腔室。通过转动拨盘上的氮罐调节器设置的压力，直到在200和300 psig的读数被观察为初始挤压力。打开压力调节阀逐渐直到足够porphysome流速达到或最大压力800 psig的（5440千帕）的到达。
- 第一挤出扫描完成后，关闭压力控制阀，并通过在挤出机顶部打开泄压阀释放该挤出机的压力。笔芯挤出机的新挤压porphysome溶液，并重复挤压至少10次，以确保最终的挤压溶液是均匀的。
- 通过测量稀释后的样品在甲醇中的吸收由紫外 - 可见分光光度计确定的最终porphysome溶液的浓度。使用下列公式计算机智的浓度ħ的97,000 M中的消光系数-1厘米-1在410 nm处的焦脱脂。
- 测量使用Malvern激光粒度仪ZS90通过动态光散射porphysomes的最终粒度分布。稀porphysome溶液在PBS中，并执行三次测量与每15运行的平均结果。
- 通过使用荧光光谱仪比较猝灭porphysome的荧光发射（1 mM的PBS中）和非淬火porphysome（1毫在1％的Triton X-100）确定porphysome的荧光淬灭。取光谱（Tirton X-100）加入之前和之后的洗涤剂，并正常化读取到最大荧光信号。设置激励为410 nm，而发射波长范围为600-800纳米。
- 保持porphysomes解决方案氩气保护下，在4°C，直到将来使用，并保护其免受光铝f油。
3。异种移植动物模型的制备
- 培养KB细胞在RPMI-1640（含有10％FBS），并在37℃下维持细胞在5％CO 2和增湿的气氛
- 使用标准的细胞培养技术，收获KB细胞。保持细胞悬浮液（20,000个细胞/ ml）在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中在冰上短期存储，直到注入的时间。
- 准备在裸鼠移植瘤KB。裸鼠是从Charles River实验室购买时，他们在20克（类别＃CRL：NU（NCR）Foxn1 NU，6-7周龄），给予标准饮食和床上用品（哈伦实验室;饮食：辐照LM-485， ＃7912;床上用品：床上用品玉米芯，¼“，＃7097）。消毒所有的动物处理工具（注射器，镊子，和动物垫）之前的实验。麻醉小鼠在100％氧气载气2％异氟醚/ V。所有的动物协议由该机构（大学健康氖批准T工作在这种情况下）的动物护理和使用委员会。
- 注射肿瘤细胞悬浮于PBS皮下注射到小鼠的右侧腹。老鼠是准备在10天后被用来当肿瘤达到4-5毫米和2-3毫米厚度的直径。
（4） 在体内的光热治疗
- 经尾静脉注射静脉注射porphysomes（含750纳摩尔焦在200微升体积）。进行激光照射24小时后注射porphysomes的。
- 在本节中，进行在一个封闭的激光安全室的所有程序。激光照射时佩戴激光防护镜。
- 设置在激光照射设备。保持激光纤维和扩散器由支架上的夹具。设置激光功率在较低水平，并开启激光器。调整激光光纤的高度，以实现9毫米的直径的照射区域（DPSS激光，LaserGlow技术，多伦多，加拿大），使用AP校准激光功率，以750毫瓦（1.18瓦/厘米2）奥尔米，然后关闭激光来准备的动物。
- 通过鼻锥与100％氧气载气2％异氟醚/ V麻醉动物没有明显的清除异氟醚人体健康风险的危害）。确认动物麻醉深度不够用产钳或手指动物的后爪进行脚趾捏。这种动物是准备好激光照射时，他们反应迟钝到这个程序。
- 通过红外热成像仪（Mikroshot，的LumaSense Technologies）的监测肿瘤的温度。将相机靠近肿瘤，专注得很好，并采取预先PTT形象，以及PTT照射开始之前一个规则的白色光图像。
- 再次打开激光，并提高光功率为750毫瓦。定位在肿瘤中的激光束的中心，以获得肿瘤完全覆盖，并开始计时的照射。就拿肿瘤温度图像每5秒为一分钟的激光治疗。关闭激光在1分钟。圣OP 2％异氟醚的天然气供应，等到从麻醉动物复苏，并把它放回笼子。
- 根据批准的大学健康网络协议动物小鼠保持在常温动物房下12时12小时明暗周期。注射丁丙诺啡（0.05毫克/千克，皮下每天两次一个星期的激光照射，以减少所造成的疤痕疼痛以下，每两天用测径器测量肿瘤直径并拍照。使用计算肿瘤体积的以下公式：V =π/ 6·A·B 2，其中a为长径，b为短1。
- 通过把他们的CO 2室当肿瘤长径达10mm时，因为它是在我们的实验室中定义的终点牺牲动物。以下的二氧化碳处理进行颈椎脱位。绘制生存曲线。
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Representative Results
焦脱缀合到磷脂作为稳定脂质单体（ 图1a）和缀合物自我装配由膜挤出法使用高压挤出来形成porphysomes。它通常是难以在挤出过程中的前3个循环用相对慢的流速挤出porphysome - 脂质悬浮液。随着越来越多的挤压重复，挤压溶液的流速逐渐增大，并且压力可以在需要时略有下降。 Porphysome大小，浓度和淬火效率是在挤出后右侧的纳米粒子来表征的三个重要特性。 Porphysomes具有高均匀粒度分布的（大约120nm的峰值）被产生（ 图1B和1C）具有两个主要的吸收峰（410 nm和677 nm处， 图1d），可以保持稳定的被储存在4时12个月以上°C。卟啉的荧光被淬灭高达99.8％（重量）母鸡的纳米结构是否完好（ 图1e）。
对于体内的PTT，热量可以迅速地将激光照射于24小时后porphysome给药（ 图2）时所产生的。 Porphysomes用激光照射引起的温度增加了35℃下照射1分钟后，而单独的激光诱导低于10℃的温度上升重要的是，最终的肿瘤温度达到55℃，以确保完全的肿瘤消融。随着PTT照射，肿瘤通常是轮流的，因为强大的热效应发白。鼠标腿变得有点肿在肿瘤区域约2天后的PTT。热消融导致的肿瘤和100％，减少肿瘤体积深棕焦痂。焦痂能明显在24小时后进行治疗，并观察他们在以下2个周（ 图3a）逐渐恢复。使用porphysomes，皮下TUMORS可以完全不复发（ 图3b）淘汰，而在单独porphysome和激光单独控制肿瘤继续生长（ 图3b），并在2周内均达到终点。
图1。 porphysome纳米囊泡和表征的结构。一个 。焦脱一脂质porphysome。 乙示意图。相应的TEM图像。 角 porphysomes后高压挤出，D型分布。在吸收焦脱脂甲醇，归一化到峰值为410 nm。 电子 。淬灭（红色虚线）的荧光发射（EM）和非淬火（蓝色实线）porphysomes，归一化最大荧光。 点击这里查看大图 。
PTT在图2热响应。 一个。激光成立透皮光照射。 b和 c。 。肿瘤后24小时注射后porphysomes或PBS D的KB荷瘤小鼠的激光照射下，60秒激光照射在肿瘤最大温度（平均值+ / -标准差为5各组小鼠）。 点击这里查看大图 。
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图3。一个。照片显示治疗反应，以PTT 1，包括三组：porphysomes注射用激光照射，PBS注射用激光照射，独自porphysomes注射。湾每次治疗后平均肿瘤体积（N = 5，用*表示P <0.0005）。 点击这里查看大图 。
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Discussion
中的药物递送技术的发展，多官能纳米粒子是目前正在广泛研究的药物递送载体的精确跟踪，同时保持高的药物的有效载荷。卟啉-脂质体已经被开发用于更好的药代动力学特性和更有效地提供比卟啉的直接施用，但存在的障碍，包括卟啉的受限负载量和卟啉的快速再分配从脂质体与血浆蛋白5,6。相对于传统的脂质体递送系统，其中自由卟啉被插入到脂质体中的任一核心或脂质双层，焦脱（焦）现在是直接且稳定地缀合到磷脂和自组装成脂质体纳米结构，以形成porphysomes 。作为一个结果，porphysome双层达到极高的卟啉的填充密度，从而导致结构相关的自猝灭焦fluore的杨继明和高消光系数。
这些热电脂质缀合物通过脂质体，例如膜挤出法是常用来产生良好定义的大小7-9的单层囊泡的类似方法制备自组装成在水性缓冲液中porphysomes。挤出开始从该水合水溶液中，并进行一些冻融循环，以形成多层囊泡具有宽的粒度分布10的干燥的脂质膜。当水合porphysome脂质膜达到超过1毫克/毫升，手动挤压变得具有挑战性的身体，所以高压挤压被选择用于按比例放大生产porphysomes，如用于动物研究的时porphysome的至少5毫克/毫升，需要8 ，9。以实现更高的最终热电浓度，porphysome脂质膜可以以较高的初始量来制备。但浓度超过10毫克/毫升更高，不建议，由于难以挤出用10毫升的高压挤出机。在挤出中，如果挤出的溶液出来的流速非常缓慢（ 例如，30分钟/毫升），即使以非常高的压力（≤800 psig的安全问题），过滤器可以被改变到一个新的组，并且水的循环的温度可以从65℃〜75℃增加脂质体纳米囊泡的尺寸均匀性已经被证明有助于减少肝和脾吸收体内 11。因此，通过过滤膜（100nm以下），以获得均匀且粒径分布窄，porphysome脂质悬浮液的挤压重复至少10次，甚至更多。
我们发现存放在4℃时，在尺寸或淬火在我们的研究，至少一年性质的变化可以忽略不计（数据未显示）porphysomes是非常稳定的挤出后。但仍建议每个动物注射前测试porphysome大小和淬火效率确保porphysome完整性。
Porphysomes是第一个有机纳米粒子作为高效光热增强，同时保持了药物输送容量的常规脂质体和生物相容性。它们是基于卟啉，它有治疗诊断应用程序的优秀记录。12，具有很高的消光系数的比较，以金纳米粒子（国民生产总值），以便快速发热，高效的热消融1。的体内研究显示porphysome启用PTT的优点作为一种替代方法，以常规的癌症治疗。 PTT是非常简单的，用激光治疗比较局限在选定的照射区（9毫米直径），并实现有效的热消融肿瘤温度高于55°C时需要很短的治疗周期（1分钟）。无论是简单性和高选择性可以帮助改善恢复时间和减少FO并发症的风险Ř平移治疗应用。如果其它类型的异种移植物具有较少的肿瘤积累比KB肿瘤（7.5％ID / g）的使用，较高的porphysome剂量可以是在激光照射IV注射有效的热生成。在照射过程中，重要的是，激光光斑覆盖整个肿瘤区域，肿瘤温度，在肿瘤中增加至55℃或更高，以便快速和完整的热消融。
现在正在进行研究，探讨多模式成像和porphysomes的治疗应用在更多的临床相关动物模型有力的PTT剂为未来的翻译研究。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由玛嘉烈医院基金会，美国国家科学和加拿大，加拿大卫生研究院，创新的加拿大基础工程研究理事会，以及乔伊和托比的Tanenbaum /巴西球椅在前列腺癌研究，支持一个授予纽约州立大学研究基金会和大学水牛城分校的启动支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotary evaporator | Thermo-Savant | SPD131DDA | |
| Votex | Scientific Industries | SI-0236 | Model number: G560 |
| High pressure extruder | LIPEX, Northern Lipids Inc. | T.001 | 10 ml Thermobarrel Extruder |
| Heated bath circulators (Thermostatted circulator) | Thermo SCIENTIFIC | SC100-S5P | |
| Polycarbonate filters | Avanti Polar Lipids | 610005 | Pore size 100 nm, and membrane diameter 19 mm |
| Zetasizer | Malvern Instruments | ZS90 | |
| UV/Visible Spectrophototmeter | Varian Australia | Cary 50 Bio UV/ Visible Spectrophotometer | |
| Spectrofluorometer | HORIBA Scientific | FluoroMax-4 | |
| Transmission Electron Microscopy (TEM) | Hitachi | H-7000 | |
| Cell culture incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Powermeter | Thorlabs | PM100D | with sensor S142C |
| 671nm Laser | LaserGlow Technologies | LRS-0671_PFN-02000-05 | S/N:10097270 |
| Infrared Thermometer | Mikroshot, LUMASENSE Technologies | 9102409 | |
| Laser protective eye goggles | LaserGlow Technologies | AGF6602XX | Optical Density: 1.5+ at 630-700 nm |
References
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