Summary
हम इस तरह के रूप में शक्तिशाली photothermal चिकित्सा एजेंटों कामकाज, संरचना पर निर्भर प्रतिदीप्ति आत्म - शमन और अद्वितीय photothermal गुण होते हैं जो porphysomes बुलाया उपन्यास आंतरिक multifunctional nanovesicles, विकसित की है. हम उच्च दबाव बाहर निकालना का उपयोग porphysomes तैयार की है और एक xenograft ट्यूमर मॉडल में उनके photothermal चिकित्सा प्रभावकारिता की जांच की.
Abstract
हमने हाल ही में आंतरिक रूप से multifunctional nanovesicles रूप porphysomes विकसित की है. एक photosensitizer, α pyropheophorbide, एक फॉस्फोलिपिड संयुग्मित किया गया था और तब liposome तरह गोलाकार पुटिका के लिए स्वयं को इकट्ठा किया. कारण porphyrin लिपिड bilayer में porphyrin के अत्यंत उच्च घनत्व के लिए, porphysomes बड़ी विलुप्त होने गुणांक, संरचना पर निर्भर प्रतिदीप्ति आत्म - शमन, और उत्कृष्ट photothermal प्रभावकारिता उत्पन्न. हमारे निर्माण में, porphysomes उच्च दबाव बाहर निकालना संश्लेषित का उपयोग कर रहे थे, और 120 एनएम के चारों ओर एक मतलब कण आकार का प्रदर्शन किया. Porphysomes के चौबीस घंटे बाद नसों में इंजेक्शन, ट्यूमर के स्थानीय तापमान तेजी से 750 मेगावाट (1.18 डब्ल्यू / 2 सेमी), 671 एनएम लेजर विकिरण के एक मिनट के जोखिम पर 62 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 डिग्री सेल्सियस से वृद्धि हुई है. ट्यूमर की पूरी थर्मल पृथक के बाद का गठन और चंगा 2 हफ्तों के भीतर, नियंत्रण समूहों में ट्यूमर विकसित करने के लिए जारी रखा, जबकि और सभी परिभाषित एन पहुंच गया eschars3 सप्ताह के भीतर डी बिंदु. इन आंकड़ों porphysomes शक्तिशाली photothermal चिकित्सा (पीटीटी) एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे दिखा.
Introduction
Porphysomes बहुविध इमेजिंग और चिकित्सा 1 में सक्षम हैं जो हम हाल ही में विकसित है कि उपन्यास multifunctional nanovesicles हैं. वे स्वयं को इकट्ठा porphyrin bilayers से गठन किया है और बड़े विलुप्त होने गुणांक और अद्वितीय संरचना पर निर्भर प्रतिदीप्ति आत्म - शमन में परिणाम उत्पन्न करता है, जो (83 ओवर, 000/porphysome कण) porphyrin की एक अत्यंत उच्च घनत्व, होते रहे हैं. Porphysomes अच्छा vivo में pharmacokinetic और biodistribution गुण होते हैं: वे व्यवस्थित प्रशासन के बाद 12 घंटे का एक रक्त आधा जीवन प्रदर्शन, और निष्क्रिय 24 घंटा बाद इंजेक्शन 2 में 7.5% आईडी / जी के साथ xenograft ट्यूमर में जमा.
उनके अद्वितीय संरचना और physiochemical गुण बहुविध इमेजिंग और छवि निर्देशित चिकित्सा के लिए porphysome एक अच्छा उम्मीदवार हैं. सबसे पहले, porphyrin युक्त, porphysomes ट्यूमर संचय 1 पर ट्यूमर के प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए आंतरिक रूप से उपयुक्त हैं.इसके अलावा, प्रत्येक porphyrin इसलिए, porphysomes आसानी से पीईटी इमेजिंग 3 के लिए इस तरह के 64Cu रूप radioisotopes के साथ लेबल किया जा सकता chelating radioisotopes के लिए एक स्थिर साइट है. Porphysomes भी अद्वितीय photoacoustic इमेजिंग और पीटीटी क्षमताओं का प्रदर्शन इतना porphysome संरचना बरकरार है इसके अलावा, जब अवशोषित प्रकाश ऊर्जा लेजर विकिरण जोखिम के तहत thermally छितराया हुआ है. यह porphysomes की नसों में इंजेक्शन के बाद 24 घंटा, porphysome-संचित ट्यूमर की लेजर विकिरण एक तेजी से तापमान में वृद्धि और मजबूत photothermal ट्यूमर पृथक प्रेरित है कि दिखाया गया है. इस porphysomes सोने के नैनोकणों (AuNPs) के रूप में उच्च विलुप्त होने गुणांक के साथ कुशल photothermal enhancers हैं कि प्रदर्शन किया 1. दूसरी ओर, AuNPs सहित अन्य अकार्बनिक photothermal एजेंटों के साथ तुलना में, porphysomes कारण उनके जैविक प्रकृति के जैव सुरक्षा में एक उत्कृष्ट लाभ दिखा. Porphysomes enzymatically biodegradable रहे हैं और कम से कम तीव्र toxicit प्रेरित1000 मिलीग्राम / किग्रा 1 के रूप में उच्च नसों में खुराक के साथ चूहों में y. इसके अलावा, liposomes के लिए इसी तरह, porphysomes के बड़े जलीय कोर निष्क्रिय हो सकता है या सक्रिय रूप से चिकित्सीय या इमेजिंग एजेंट के साथ भरा हुआ है. ऑप्टिकल गुण और porphysomes के biocompatibility biophotonic इमेजिंग और चिकित्सा के लिए जैविक नैनोकणों के बहुविध क्षमता का प्रदर्शन.
इस पत्र में, हम pyropheophorbide लिपिड conjugates के संश्लेषण विधि, विनिर्माण और उच्च दबाव बाहर निकालना का उपयोग porphysomes के लक्षण वर्णन विधि परिचय. चूहों पर में विवो पीटीटी ट्यूमर में porphysome सक्षम पीटीटी की दक्षता प्रदर्शित करने के रूप में अच्छी तरह से आयोजित किया जाता है एक चमड़े के नीचे xenograft ट्यूमर मॉडल का उपयोग कर इलाज.
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Protocol
1. Pyropheophorbide लिपिड के संश्लेषण
- 4, 98.7 मिलीग्राम 16:00 lysophophatidylcholine (1 palmitoyl-2-हाइड्रोक्सी एस.एन. ग्लिसरो, (... झेंग एट अल, Bioconj केम, 2002, 13 -392 रूप में पहले वर्णित Spirulina Pacifica शैवाल से तैयार) 200 mmol pyropheophorbide जुडा लिपिड: ईडीसी - 3 phosphocholine, अवंती ध्रुवीय Lipids # 855,675), ईडीसी के 76.3 मिलीग्राम, 48.7 मिलीग्राम DMAP (4 (dimethylamino) 5 मिलीलीटर amylene में pyridine) 1:1:2:2 आतिशबाज़ी के अनुपात के लिए क्लोरोफॉर्म स्थिर : DMPA.
- 24 घंटे के लिए आर्गन के तहत कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण हिलाओ. 40 डिग्री सेल्सियस के ताप के साथ एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कम दबाव में क्लोरोफॉर्म लुप्त हो जाना (आतिशबाज़ी एस.एन. -1 या एस.एन.-2 स्थिति में संलग्न) आतिशबाज़ी लिपिड isomers के मिश्रण का उत्पादन किया है.
- 1 मिमी 2 CaCl, 50 मिमी Tris पीएच (8), 0.5% ट्राइटन X-100 और 5 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में 10% मेथनॉल में Resuspend आतिशबाज़ी लिपिड isomer मिश्रण. मधु मक्खी विष में से phospholipase A2 (PLA2) जोड़ें0.1 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता और एस.एन. -1 आतिशबाज़ी लिपिड को पचाने के लिए और शुद्ध एस.एन. 2 आतिशबाज़ी लिपिड isomer निर्माण करने के लिए 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान सेते हैं.
- अतिरिक्त क्लोरोफॉर्म के 2 संस्करणों और मेथनॉल, निकालने के 1.25 मात्रा में जोड़ें, और फिर 40 डिग्री सेल्सियस पर कम दबाव पर रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग विलायक हटाने डीसीएम में 1% MeOH में दरार उत्पाद Resuspend और isomerically शुद्ध आतिशबाज़ी लिपिड के लिए एक छोटा सा diol सिलिका स्तंभ पर शुद्ध.
2. Porphysomes की तैयारी
- Pyropheophorbide लिपिड, distearoyl-एस.एन. ग्लिसरो-3-phosphoethanolamine-N-methoxy (polyethylene glycol) (खूंटी-2000-पीई) और क्लोरोफॉर्म में कोलेस्ट्रॉल अलग से भंग, और क्रमशः सांद्रता रिकॉर्ड.
- 65 दाढ़% porphyrin लिपिड, 5 दाढ़% खूंटी-2000-पीई और 30 दाढ़% कोलेस्ट्रॉल के संयोजन से 5 मिलीग्राम / ट्यूब की कुल लिपिड वजन के साथ एक 12x75 मिमी borosilicate टेस्ट ट्यूब में porphysome लिपिड फिल्म तैयार करें.
- नाइट्रो की एक धारा के तहत लिपिड फिल्मों से सूखीजनरल गैस और उन्हें आगे 1 घंटे के लिए शून्य के नीचे सूख जाने. भविष्य हाइड्रेशन और बाहर निकालना तक आर्गन के तहत -20 डिग्री सेल्सियस पर लिपिड फिल्मों स्टोर.
- प्रत्येक लिपिड फिल्म ट्यूब 1 एमएल फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, 150 मिमी NaCl, 10 मिमी फॉस्फेट, पीएच 7.4) जोड़ें. पूरी तरह से जमे हुए जब तक तरल नाइट्रोजन में टेस्ट ट्यूब फ्रीज, और नमूना सब पिघल गया है जब तक फिर 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब पिघलना. भंवर 30 सेकंड के एक कुल (प्रत्येक vortexing के बीच 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 5 सेकंड फिर हीटिंग के साथ 10 सेकंड प्रत्येक में 3x,) के लिए ट्यूब.
- कोई बड़ी समुच्चय हाइड्रेटेड समाधान में मनाया जा सकता है जब तक की जरूरत पर 5 चक्रों या अधिक के लिए फ्रीज पिघलना दोहराएँ. जब किया बर्फ पर porphysome निलंबन छोड़ दें.
- नहाने के पानी परिसंचारी 65 डिग्री सेल्सियस के लिए एक thermostatted फैलानेवाला को thermobarrel extruder कनेक्ट अंदर स्थापित दो खड़ी 100 एनएम पॉली कार्बोनेट फिल्टर के साथ उच्च दबाव extruder (10 मिलीग्राम) इकट्ठा, और उच्च दबाव के लिए एक नाइट्रोजन टैंक को extruder सिस्टम से कनेक्टसुनिश्चित करें कि आपूर्ति.
- एक 9 इंच कांच हस्तांतरण पिपेट का उपयोग extruder चैम्बर के लिए porphysome निलंबन स्थानांतरण. 200 और 300 psig के बीच एक पढ़ने प्रारंभिक बाहर निकालना दबाव के रूप में मनाया जाता है जब तक नाइट्रोजन टैंक नियामक पर डायल मोड़ से दबाव सेट करें. पर्याप्त porphysome प्रवाह दर हासिल की है या दबाव की 800 psig (5440 kPa) की एक अधिकतम तक पहुँच जाता है धीरे - धीरे दबाव नियामक का वाल्व खुला.
- पहले बाहर निकालना पास के पूरा होने पर, दबाव नियंत्रण वाल्व बंद करने और extruder के शीर्ष पर दबाव राहत वाल्व खोलकर extruder के दबाव जारी है. हौसले extruded porphysome समाधान के साथ extruder फिर से भरना, और अंतिम extruded समाधान सजातीय है सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 10 बार के लिए बाहर निकालना दोहराएँ.
- यूवी विज़ स्पेक्ट्रोमीटर से मेथनॉल में एक पतला नमूना के अवशोषण को मापने के द्वारा अंतिम porphysome समाधान की एकाग्रता का निर्धारण. निम्नलिखित समीकरण बुद्धि का उपयोग एकाग्रता की गणनाज 97,000 एम के विलुप्त होने के गुणांक -1 -1 सेमी pyropheophorbide लिपिड के लिए 410 एनएम.
- गतिशील प्रकाश बिखरने से एक Malvern Zetasizer ZS90 का उपयोग porphysomes के अंतिम आकार के वितरण उपाय. पीबीएस में porphysome समाधान पतला और औसतन परिणाम के लिए 15 रन से प्रत्येक के साथ तीन माप प्रदर्शन.
- Spectrofluorometer का उपयोग (1% ट्राइटन X-100 में 1 मिमी) प्रतिदीप्ति बुझती porphysome का उत्सर्जन (पीबीएस में 1 मिमी) और unquenched porphysome तुलना द्वारा porphysome की प्रतिदीप्ति शमन का निर्धारण करते हैं. (Tirton एक्स 100) जोड़ा जाता है से पहले और डिटर्जेंट के बाद स्पेक्ट्रा ले लो, और अधिकतम प्रतिदीप्ति को पढ़ने के संकेत मानक के अनुसार. 410 एनएम, और 600-800 एनएम होना उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य रेंज होने की उत्तेजना सेट करें.
- भविष्य के उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर आर्गन के तहत porphysomes समाधान रखें, और एल्यूमीनियम च द्वारा प्रकाश से बचाने केतेल.
3. पशु xenograft मॉडल की तैयारी
- संस्कृति KB RPMI 1640 में कोशिकाओं (10% FBS के साथ), और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 और moisturized वातावरण में कोशिकाओं को बनाए रखने
- मानक सेल कल्चर तकनीक का प्रयोग कर फसल KB कोशिकाओं. इंजेक्शन के समय तक अल्पकालिक भंडारण के लिए बर्फ पर फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) में सेल निलंबन (20,000 कोशिकाओं / एमएल) रखें.
- नग्न चूहों पर एक KB xenografts तैयार करें. मानक आहार और बिस्तर (Harlan प्रयोगशालाओं को देखते हुए, आहार: वे (एन यू (एनसीआर) Foxn1 परमाणु, 6-7 सप्ताह पुराने श्रेणी # सीआरएल): 20 जी रहे हैं जब नग्न चूहों चार्ल्स नदी प्रयोगशालाओं से खरीदी कर रहे हैं विकिरणित एल एम -485, # 7912; बिस्तर: corncob बिस्तर, ¼ ", # 7097). सभी पशु हैंडलिंग उपकरण (सिरिंज, संदंश, और पशु पैड) पूर्व प्रयोगों को जीवाणुरहित. 100% ऑक्सीजन वाहक गैस में 2% isoflurane वी / वी के साथ चूहों anesthetize. सभी पशु प्रोटोकॉल संस्था (विश्वविद्यालय स्वास्थ्य Ne द्वारा अनुमोदित कर रहे हैंtwork इस मामले में) पशु की देखभाल और उपयोग समिति.
- चूहों की सही दिशा को पीबीएस subcutaneously में निलंबित ट्यूमर कोशिकाओं इंजेक्षन. चूहे ट्यूमर 4-5 मिमी और 2-3 मिमी की मोटाई के व्यास तक पहुँचता है जब 10 दिनों के बाद इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार हैं.
4. में vivo photothermal चिकित्सा
- नसों पूंछ नस के माध्यम से (200 μl मात्रा में 750 nmol आतिशबाज़ी युक्त) porphysomes इंजेक्षन. Porphysomes की लेजर विकिरण 24 घंटा बाद इंजेक्शन का संचालन.
- इस खंड में, एक संलग्न लेजर सुरक्षा कक्ष में सभी प्रक्रियाओं का संचालन. लेजर विकिरण के दौरान लेजर सुरक्षा काले चश्मे पहन लो.
- लेजर विकिरण उपकरण स्थापित करें. एक स्टैंड पर एक क्लैंप से लेजर फाइबर और एक विसारक पकड़ो. निम्न स्तर पर लेजर सत्ता स्थापित करने और लेजर पर बारी. (DPSS लेजर, LaserGlow टेक्नोलॉजीज, टोरंटो, कनाडा), एपी का उपयोग कर 750 मेगावाट (1.18 डब्ल्यू / 2 सेमी) करने के लिए लेजर शक्ति जांचना व्यास में 9 मिमी की एक विकिरण क्षेत्र को प्राप्त करने के लिए लेजर फाइबर की ऊंचाई समायोजित करेंower तो मीटर और पशु तैयार करने के लिए लेजर बंद कर देते हैं.
- नाक शंकु के माध्यम से 100% ऑक्सीजन वाहक गैस में 2% isoflurane वी / वी के साथ पशुओं चतनाशून्य नहीं) isoflurane एक मानव स्वास्थ्य जोखिम खतरा का स्पष्ट सफाई. जानवर जानवर की हिंद पंजे को संदंश या उंगलियों के साथ एक पैर के अंगूठे चुटकी प्रदर्शन से गहरी पर्याप्त anesthetized है कि पुष्टि करें. वे इस प्रक्रिया को अनुत्तरदायी है जब जानवरों लेजर विकिरण के लिए तैयार हैं.
- एक अवरक्त थर्मल कैमरा (Mikroshot, LUMASENSE टेक्नोलॉजीज) द्वारा ट्यूमर तापमान की निगरानी. इसे अच्छी तरह ध्यान केंद्रित करने और एक पूर्व पीटीटी छवि के साथ ही पीटीटी विकिरण शुरू होने से पहले एक नियमित रूप से सफेद प्रकाश छवि ले, करीब ट्यूमर को कैमरे रखें.
- फिर लेजर पर मुड़ें, और 750 मेगावाट करने के लिए प्रकाश की शक्ति में वृद्धि. ट्यूमर पूरी तरह से कवर करने के लिए लेजर बीम के केंद्र में ट्यूमर की स्थिति, और विकिरण समय शुरू करते हैं. एक एक मिनट लेजर उपचार के लिए ट्यूमर तापमान छवि हर 5 सेकंड ले लो. 1 मिनट में लेजर बंद करें. सेंटसेशन 2 isoflurane% की गैस की आपूर्ति, संज्ञाहरण से पशु ठीक है जब तक प्रतीक्षा करें और वापस पिंजरे में डाल दिया.
- विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क द्वारा अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार 00:12 घंटा अंधेरे और प्रकाश चक्र के तहत normothermia पशु कमरे में चूहों रखें. Buprenorphine (0.05 मिलीग्राम / किग्रा, निशान की वजह से दर्द कम करने के लिए लेजर विकिरण के बाद एक सप्ताह के लिए subcutaneously दो बार एक दिन इंजेक्षन. हर दो दिन, एक कैलीपर का उपयोग ट्यूमर व्यास मापने के लिए और एक तस्वीर लेने के. का उपयोग ट्यूमर मात्रा की गणना समीकरण निम्नलिखित: वी = π / 6 · एक · एक लंबे व्यास है, और ख कम एक है जहां बी 2,.
- यह हमारी प्रयोगशाला में परिभाषित अंत बिंदु के रूप में ट्यूमर की लंबी व्यास, 10 मिमी तक पहुँच जाता है जब सीओ 2 चैम्बर में डाल द्वारा पशुओं का बलिदान. सीओ 2 के इलाज के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करना. अस्तित्व वक्र प्लॉट.
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Representative Results
Pyropheophorbide एक स्थिर लिपिड मोनोमर (चित्रा 1 ए) के रूप में फॉस्फोलिपिड संयुग्मित और conjugates एक उच्च दबाव extruder उपयोग झिल्ली बाहर निकालना विधि द्वारा porphysomes फार्म करने के लिए स्वयं को इकट्ठा किया जाता है. यह अपेक्षाकृत धीमी प्रवाह की दर के साथ बाहर निकालना के पहले 3 चक्र के दौरान porphysome लिपिड निलंबन हटा आमतौर पर मुश्किल होता है. अधिक extrusions दोहराया जाता है, extruded समाधान के प्रवाह की दर धीरे - धीरे बढ़ जाती है, और यदि आवश्यक हो तो दबाव थोड़ा कम किया जा सकता है. Porphysome आकार, एकाग्रता, और शमन दक्षता सही बाहर निकालना के बाद नैनोकणों चिह्नित करने के लिए तीन महत्वपूर्ण गुण हैं. आकार के वितरण की उच्च एकरूपता (120 एनएम के आसपास चोटी) के साथ Porphysomes उत्पन्न होता है (आंकड़े 1 बी और -1 सी) के दो मुख्य absorbance चोटियों (410 एनएम और 677 एनएम, चित्रा -1) और 4 में संग्रहीत किया जा रहा है जब 12 महीने के लिए स्थिर रह सकते हैं साथ डिग्री सेल्सियस porphyrin के प्रतिदीप्ति डब्ल्यू 99.8% के रूप में उच्च के रूप में बुझती हैमुर्गी nanostructure (चित्रा 1E) बरकरार है.
Vivo में पीटीटी के लिए, गर्मी 24 घंटे के बाद porphysome प्रशासन पर लेजर विकिरण (चित्रा 2) पर तेजी से उत्पन्न किया जा सकता है. लेजर विकिरण के साथ Porphysomes अकेले लेजर कम से कम 10 डिग्री सेल्सियस के तापमान में वृद्धि लाती है, जबकि तापमान, विकिरण के 1 मिनट के बाद 35 डिग्री सेल्सियस से अधिक की वृद्धि का कारण यह अंतिम ट्यूमर तापमान पूरा ट्यूमर पृथक सुनिश्चित करने के लिए 55 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है कि महत्वपूर्ण है. पीटीटी विकिरण के बाद, ट्यूमर क्योंकि आम तौर पर शक्तिशाली थर्मल प्रभाव से सफेद हो जाता है. माउस पैर पीटीटी निम्नलिखित लगभग 2 दिनों के लिए ट्यूमर क्षेत्र में एक छोटे से सूजन हो जाता है. ट्यूमर और ट्यूमर मात्रा के 100% की कमी पर अंधेरे भूरा eschar में थर्मल पृथक परिणाम. Eschars 24 घंटा के बाद इलाज में स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है और वे धीरे - धीरे निम्नलिखित 2 सप्ताह (चित्रा 3 ए) के दौरान ठीक हो. Porphysomes का प्रयोग, चमड़े के नीचे तूअकेले porphysome और लेजर अकेले नियंत्रण में ट्यूमर (चित्रा 3 बी) हो जाना जारी है जबकि Mors पूरी तरह से, (चित्रा 3 बी) पुनरावृत्ति के बिना समाप्त किया जा सकता है, और सभी 2 सप्ताह में अंत बिंदु तक पहुँचने.
चित्रा 1. Porphysome nanovesicles और characterizations की संरचना. एक. एक pyropheophorbide लिपिड porphysome. बी के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. इसी मंदिर छवि. सी. उच्च दबाव बाहर निकालना. डी के बाद porphysomes के आकार के वितरण. 410 एनएम. ई में चोटी के लिए सामान्यीकृत मेथनॉल में pyropheophorbide लिपिड, के absorbance. प्रतिदीप्ति उत्सर्जन बुझती (लाल पानी का छींटा लाइन) की (उन्हें) और unquenched (नीला ठोस लाइन), सामान्यीकृत porphysomes अधिकतम प्रतिदीप्ति के लिए. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
पीटीटी दौरान चित्रा 2. थर्मल प्रतिक्रिया. एक. लेजर transdermal प्रकाश विकिरण के लिए निर्धारित किया है. बी और सी. . - Porphysomes या पीबीएस डी के 24 घंटे के बाद इंजेक्शन पर KB ट्यूमर असर चूहों में लेजर विकिरण पर ट्यूमर का तापमान, 60 सेकंड लेजर विकिरण के दौरान अधिकतम ट्यूमर तापमान (प्रत्येक समूह में 5 चूहों के लिए एसडी + / मतलब है). के लिए क्लिक करें बड़ा आंकड़ा देखने .
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चित्रा 3. एक. तीन समूहों सहित पीटीटी 1 के लिए चिकित्सकीय प्रतिक्रिया, दिखा फोटो: लेजर विकिरण, लेजर विकिरण के साथ पीबीएस इंजेक्शन के साथ इंजेक्शन porphysomes, और अकेले इंजेक्शन porphysomes. बी. प्रत्येक उपचार के बाद औसत मात्रा ट्यूमर (* के साथ n = 5, पी <0.0005 प्रतिनिधित्व करता है). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
के एक उच्च दवा पेलोड को बनाए रखते हुए दवा वितरण प्रौद्योगिकियों के विकास में, multifunctional नैनोकणों दवा वितरण वाहन की सटीक ट्रैकिंग के लिए विस्तृत जांच के अंतर्गत वर्तमान में हैं. Porphyrin भरी हुई liposomes बेहतर pharmacokinetic गुण और porphyrin के प्रत्यक्ष प्रशासन से भी अधिक कुशल प्रसव के लिए विकसित किया गया है, लेकिन बाधाओं porphyrin के प्रतिबंधित लोड हो रहा है राशि और प्लाज्मा प्रोटीन 5,6 करने के लिए liposomes से porphyrin की तेजी पुनर्वितरण सहित मौजूद हैं. मुफ्त porphyrin liposome की कोर या लिपिड bilayer या तो में डाला जाता है, जहां परंपरागत लिपोसोमल वितरण प्रणाली, के विपरीत, pyropheophorbide (आतिशबाज़ी) अब सीधे और stably फॉस्फोलिपिड और स्वयं को इकट्ठा porphysomes के लिए फार्म liposome की तरह है nanostructures में संयुग्मित है . नतीजतन, porphysome bilayer आतिशबाज़ी fluore की संरचना पर निर्भर आत्म - शमन की ओर जाता है जो अत्यंत उच्च porphyrin पैकिंग घनत्व, को प्राप्त होता हैScence और उच्च विलुप्त होने गुणांक.
ये आतिशबाज़ी लिपिड conjugates आमतौर पर अच्छी तरह से परिभाषित आकार 7-9 की unilamellar vesicles उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि इस तरह की झिल्ली बाहर निकालना विधि के रूप में liposomes, के समान तैयारी विधि के माध्यम से जलीय बफर में porphysomes में स्वयं को इकट्ठा. बाहर निकालना जलीय घोल में हाइड्रेटेड और व्यापक वितरण आकार 10 से multilamellar पुटिका के लिए फार्म कई फ्रीज पिघलना चक्र के अधीन है कि एक सूखी लिपिड फिल्म से शुरू होता है. हाइड्रेटेड porphysome लिपिड फिल्म से अधिक 1 मिलीग्राम / एमएल तक पहुँच जाता है, मार्गदर्शन बाहर निकालना, शारीरिक रूप से चुनौतीपूर्ण porphysome का कम से कम 5 मिलीग्राम / एमएल 8 आवश्यक है जब इतने उच्च दबाव बाहर निकालना ऐसे जानवरों के अध्ययन के लिए के रूप में porphysomes, के ऊपर पहुंचा उत्पादन के लिए चुना जाता हो जाता है , 9. यहां तक कि उच्च अंतिम आतिशबाज़ी एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए, porphysome लिपिड फिल्म उच्च प्रारंभिक राशि के साथ तैयार किया जा सकता है. लेकिन 10 मिलीग्राम / एमएल से अधिक एकाग्रता की वजह से कठिनाई के लिए अनुशंसित नहीं है,10 मिलीलीटर उच्च दबाव extruder के साथ बाहर निकालना. बाहर आने extruded समाधान के प्रवाह की दर भी (सुरक्षा मुद्दे के लिए 800 psig ≤) बहुत ही उच्च दबाव के साथ (उदाहरण के लिए 30 मिनट / एमएल) अत्यंत धीमी है अगर बाहर निकालना के दौरान, फिल्टर एक नया सेट करने के लिए बदल गया है, और किया जा सकता है पानी संचलन का तापमान 65 डिग्री सेल्सियस -75 डिग्री सेल्सियस से बढ़ाया जा सकता है लिपोसोमल nanovesicles का आकार एकरूपता विवो 11 में जिगर और तिल्ली तेज को कम करने के लिए दिखाया गया है. इसलिए, फिल्टर झिल्ली (100 एनएम) के माध्यम से एक सजातीय और संकीर्ण आकार के वितरण, porphysome लिपिड निलंबन के बाहर निकालना प्राप्त करने के लिए कम से कम दस बार दोहराया है या और भी अधिक.
हम (नहीं दिखाया डेटा) आकार या हमारे अध्ययन में कम से कम एक वर्ष के लिए गुण शमन में नगण्य परिवर्तन के साथ, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत जब porphysomes बाहर निकालना के बाद बहुत स्थिर रहे हैं पाया. यह अभी भी एक जानवर इंजेक्शन से पहले porphysome आकार और शमन दक्षता परीक्षण करने के लिए सिफारिश की हैporphysome intactness सुनिश्चित करने के लिए.
Porphysomes पारंपरिक liposomes के दवा वितरण क्षमता और biocompatibility बनाए रखते हुए के रूप में कुशल photothermal enhancers सेवा करने के लिए पहली बार जैविक नैनोकणों हैं. वे theranostic अनुप्रयोगों के लिए एक शानदार रिकॉर्ड है जो porphyrins, पर आधारित हैं. 12 वे उच्च विलुप्त होने गुणांक तेजी से गर्मी पीढ़ी के लिए सोने के नैनोकणों (GNPs) को तुलनात्मक और कुशल थर्मल पृथक 1 है. vivo अध्ययन में पारंपरिक कैंसर उपचार के लिए एक वैकल्पिक पद्धति के रूप में porphysome सक्षम पीटीटी के फायदे से पता चला है. पीटीटी अपेक्षाकृत चयनित विकिरण क्षेत्र (9 मिमी व्यास) के लिए स्थानीय लेजर उपचार, और प्रभावी थर्मल पृथक के लिए 55 डिग्री सेल्सियस से अधिक ट्यूमर तापमान प्राप्त करने की आवश्यकता बहुत कम उपचार की अवधि (1 मिनट) के साथ, बहुत सरल है. सादगी और उच्च चयनात्मकता दोनों वसूली समय में सुधार के लिए और जटिलताओं का जोखिम कम करने में मदद कर सकते हैंtranslational चिकित्सीय अनुप्रयोगों आर. KB ट्यूमर (7.5% आईडी / छ) से भी कम ट्यूमर संचय है कि अन्य xenograft प्रकार प्रयोग किया जाता है, तो उच्च porphysome खुराक चतुर्थ लेजर विकिरण पर कुशल गर्मी पीढ़ी के लिए इंजेक्शन जा सकता है. विकिरण प्रक्रिया के दौरान, यह स्थान लेजर पूरे ट्यूमर क्षेत्र शामिल हैं, और ट्यूमर तापमान ट्यूमर पर त्वरित और पूरा थर्मल पृथक के लिए 55 डिग्री सेल्सियस या इससे अधिक के लिए बढ़ जाती है कि महत्वपूर्ण है.
अध्ययनों से अब भविष्य translational अध्ययन के लिए अधिक नैदानिक प्रासंगिक पशु मॉडल में शक्तिशाली पीटीटी एजेंट के रूप में बहुविध इमेजिंग और porphysomes की चिकित्सीय अनुप्रयोगों का पता लगाने के लिए चल रहे हैं.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम प्रोस्टेट कैंसर रिसर्च में राजकुमारी मार्गरेट अस्पताल फाउंडेशन, राष्ट्रीय विज्ञान और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान, नवाचार की कनाडा फाउंडेशन के लिए कनाडा संस्थान के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल, और जॉय और टोबी Tanenbaum / ब्राजील गेंद कुर्सी, द्वारा समर्थित किया गया एक सनी रिसर्च फाउंडेशन और भैंस पर विश्वविद्यालय से स्टार्टअप समर्थन से अनुदान.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Rotary evaporator | Thermo-Savant | SPD131DDA | |
Votex | Scientific Industries | SI-0236 | Model number: G560 |
High pressure extruder | LIPEX, Northern Lipids Inc. | T.001 | 10 ml Thermobarrel Extruder |
Heated bath circulators (Thermostatted circulator) | Thermo SCIENTIFIC | SC100-S5P | |
Polycarbonate filters | Avanti Polar Lipids | 610005 | Pore size 100 nm, and membrane diameter 19 mm |
Zetasizer | Malvern Instruments | ZS90 | |
UV/Visible Spectrophototmeter | Varian Australia | Cary 50 Bio UV/ Visible Spectrophotometer | |
Spectrofluorometer | HORIBA Scientific | FluoroMax-4 | |
Transmission Electron Microscopy (TEM) | Hitachi | H-7000 | |
Cell culture incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
Powermeter | Thorlabs | PM100D | with sensor S142C |
671nm Laser | LaserGlow Technologies | LRS-0671_PFN-02000-05 | S/N:10097270 |
Infrared Thermometer | Mikroshot, LUMASENSE Technologies | 9102409 | |
Laser protective eye goggles | LaserGlow Technologies | AGF6602XX | Optical Density: 1.5+ at 630-700 nm |
References
- Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat. Mater. 10, 324-332 (2011).
- Lovell, J. F., et al. Enzymatic regioselection for the synthesis and biodegradation of porphysome nanovesicles. Angew Chem Int Ed Engl. 51, 2429-2433 (2012).
- Liu, T. W., MacDonald, T. D., Shi, J., Wilson, B. C., Zheng, G. Intrinsically Copper-64-Labeled Organic Nanoparticles as Radiotracers. Angewandte Chemie. , (2012).
- Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjug Chem. 13, 392-396 (2002).
- Chen, B., Pogue, B. W., Hasan, T.
Liposomal delivery of photosensitising agents. Expert Opin Drug Deliv. 2, 477-487 (2005). - Jin, C. S., Zheng, G. Liposomal nanostructures for photosensitizer delivery. Lasers Surg Med. 43, 734-748 (2011).
- Olson, F., Hunt, C. A., Szoka, F. C., Vail, W. J., Papahadjopoulos, D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochim Biophys Acta. 557, 9-23 (1979).
- Berger, N., Sachse, A., Bender, J., Schubert, R., Brandl, M. Filter extrusion of liposomes using different devices: comparison of liposome size, encapsulation efficiency, and process characteristics. Int J Pharm. 223, 55-68 (2001).
- Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: technologies and analytical applications. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 1, 801-832 (2008).
- Lapinski, M. M., Castro-Forero, A., Greiner, A. J., Ofoli, R. Y., Blanchard, G. J. Comparison of liposomes formed by sonication and extrusion: rotational and translational diffusion of an embedded chromophore. Langmuir. 23, 11677-11683 (2007).
- Liu, D., Huang, L. Size Homogeneity of a Liposome Preparation is Crucial for Liposome Biodistribution In Vivo. Journal of Liposome Research. 2, 57-66 (1992).
- Zhang, Y., Lovell, J. F. Porphyrins as Theranostic Agents from Prehistoric to Modern Times. Theranostics. 2, 905-915 (2012).