Одна минута, Суб-Один-ваттный Фототермическая опухоли абляция Использование Porphysomes, Внутренняя Многофункциональный Nanovesicles

Summary

Мы разработали новые внутренние многофункциональные nanovesicles называемые porphysomes, которые имеют структуру в зависимости от флуоресценции самогасящихся и уникальные свойства фототермической, таким образом, функционирует как мощные агенты фототермическая терапии. Мы сформулировали porphysomes методом экструзии высокого давления и исследовали их фототермическая терапии эффективность в модели опухоли ксенотрансплантата.

Abstract

Мы недавно разработали porphysomes как внутренне многофункциональных nanovesicles. Фотосенсибилизатор, пирофеофорбида α, конъюгируют с фосфолипидом и затем самособранные в липосомы как сферических пузырьков. В связи с чрезвычайно высокой плотностью порфирина порфирина-липидный бислой, porphysomes генерируется большие коэффициенты экстинкции, структура зависит от флуоресценции самогасящихся и отличную фототермического эффективность. В нашем препарате, porphysomes были синтезированы с использованием экструзии под высоким давлением, и отображается средний размер частиц около 120 нм. Двадцать четыре часа в пост-внутривенная инъекция porphysomes, локальная температура опухоли увеличился с 30 ° С до 62 ° С быстро на одной минутной экспозиции 750 мВт (1,18 Вт / см ^2), 671 нм лазерного облучения. После полной тепловой абляции опухоли, eschars формируется и исцелил в течение 2 недель, в то время как в контрольных группах опухоли продолжали расти, и все достигли определен анг точки в течение 3 недель. Эти данные показывают, как porphysomes может быть использован в качестве мощного фототермической терапии (PTT) агентов.

Introduction

Porphysomes являются новыми многофункциональными nanovesicles, что мы недавно разработанные, которые способны мультимодальных изображений и терапии ^1. Они образуются из самоорганизующихся порфирина бислоями и содержат чрезвычайно высокую плотность порфирина (более 83, 000/porphysome частицу), который генерирует большой коэффициент поглощения и приводит к уникальной структуры в зависимости от флуоресценции самотушения. Porphysomes имеют хорошие фармакокинетические в естественных условиях биологического распределения и свойства: они обладают крови период полураспада 12 ч следующее систематического введения и пассивно накапливать в ксенотрансплантатов опухолей с 7,5% ID / г через 24 часа после инъекции ^2.

Их уникальная структура и физико-химические свойства делают porphysome хорошим кандидатом для мультимодальных изображений и изображений наведением терапии. Прежде всего, содержащий порфирин, porphysomes по своей природе подходит для флуоресценции визуализации опухолей при накоплении опухоли ^1.Кроме того, каждый порфирин имеет стабильную сайт для хелатирующих радиоизотопов, таким образом, porphysomes может быть легко меченного радиоактивными изотопами, как 64Cu для ПЭТ ^3. Кроме того, поглощенная световая энергия рассеивается термически под воздействием лазерного облучения, когда porphysome структура не повреждена, поэтому porphysomes также демонстрируют уникальный ФА изображений и возможности PTT. Было показано, что 24 ч после внутривенного введения porphysomes, лазерное облучение porphysome-накопленной опухоли вызывало быстрое повышение температуры и сильное фототермического опухоли абляции. Это показывает, что porphysomes являются эффективными усилители фототермические с коэффициентом экстинкции выше, чем наночастиц золота (AuNPs) ^1. С другой стороны, в сравнении с другими неорганическими фототермических агентов, в том числе AuNPs, porphysomes показывают замечательную преимущество в биологической из-за их органической природы. Porphysomes ферментативно биологическому разложению и вызывают минимальное острый toxicitу мышей с внутривенных дозах выше, чем 1000 мг / кг ^1. Кроме того, аналогично липосом, большой водный ядро ​​porphysomes может быть пассивно или активно загружен в терапевтических или визуализирующих агентов. Оптические свойства и биосовместимость porphysomes продемонстрировать мультимодальный потенциал органических наночастиц для Биофотонный изображений и терапии.

В данной работе мы вводим способа синтеза пирофеофорбида-липидный конъюгатов, производство и метод характеризации porphysomes использованием экструзии высокого давления. В естественных условиях PTT на мышах проводится также продемонстрировать эффективность porphysome с поддержкой PTT в опухоли лечение с использованием подкожного ксенотрансплантата модель опухоли.

Protocol

1. Синтез пирофеофорбида-липида

1. Смешайте 200 ммоль пирофеофорбида (полученного из водорослей Spirulina Pacifica как описано выше;... Zheng и др., Bioconj Chem, 2002, 13 -392) ^4, 98,7 мг lysophophatidylcholine 16:00 (1-пальмитоил-2-гидрокси-Sn-глицеро -3-фосфохолин, Avanti Polar Lipids # 855675), 76,3 мг EDC, 48,7 мг DMAP (4 - (диметиламино) пиридина) в 5 мл хлороформа амилен стабилизировалась на соотношении 1:1:2:2 Пиро: липид: EDC : УД.
2. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение 24 часов. Упаривают хлороформ при пониженном давлении с использованием роторного испарителя при нагревании до 40 ° С. Смесь пиро-липид изомеров (пиро присоединенных в положении Sn-1 или SN-2) производится.
3. Ресуспендируют пиро-липид смесь изомеров в 1 мМ CaCl _2, 50 мМ Трис (рН 8), 0,5% Triton X-100 и 10% метанола в концентрации 5 мг / мл. Добавить фосфолипазу A2 (PLA2) с медом пчелиным ядом в0,1 мг / мл концентрация и инкубировать раствора при 37 ° С в течение 24 часов, чтобы переварить Sn-1 пиро-липид и с получением чистого олова-2 пиро-липид изомер.
4. Добавить еще 2 объемов хлороформа и 1,25 объемы метанола, экстракт, а затем удаления растворителя с помощью роторного испарителя при пониженном давлении при 40 ° С Ресуспендируют продукта расщепления в 1% MeOH в DCM и очистить на небольшой диольную колонки с диоксидом кремния для чистого изомера пиро-липида.

2. Подготовка Porphysomes

1. Растворить пирофеофорбида-липид, дистеароил-Sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-метокси (полиэтиленгликоль) (ПЭГ-2000-PE) и холестерина в хлороформе отдельно и записывать концентрации соответственно.
2. Подготовка porphysome липидной пленки в 12x75 мм боросиликатного пробирку с общей массы липидов 5 мг / трубки путем объединения 65% молярного порфирина липида, 5 мольное% ПЭГ-2000-ПЭ и 30 молярных% холестерина.
3. Сушат липидные пленки в потоке нитроGen газ, и пусть они дополнительно сушили под вакуумом в течение 1 часа. Хранить не липидные пленки при -20 ° С в атмосфере аргона до будущего гидратации и экструзии.
4. Добавить 1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS, 150 мМ NaCl, 10 мМ фосфата, рН 7,4) в каждой липидной пленки трубки. Замораживание пробирку в жидком азоте до полного заморожены, а затем оттаивают в трубку 65 ° С на водяной бане, пока образец не все растает. Vortex трубка в общей сложности 30 сек (3x на 10 сек каждая, с 5 сек повторного нагрева в 65 ° С водяной бане между каждым встряхиванием).
5. Повторите замораживания-оттаивания в течение 5 циклов или более при необходимости, пока нет больших агрегатов не может наблюдаться в гидратной решения. Оставьте porphysome подвеску на льду, когда закончите.
6. Соберите экструдер высокого давления (10 мл) с двумя сложенных 100 нм поликарбонатных фильтров, установленных дюйма Connect thermobarrel экструдер для термостатированной термостат для 65 ° С, циркулирующей водяной бане, и подключить систему экструдера в резервуар азота для высоких давленияхуверен питания.
7. Перенести porphysome суспензии для экструдера камере с помощью 9-дюймовый стекло пипетки передачи. Установите давление, поворачивая диск на регуляторе бака азота до чтения от 200 до 300 фунтов на квадратный дюйм не наблюдается, как начального давления экструзии. Открыть кран регулятора давления постепенно, пока скорость потока достаточно porphysome не будет достигнута или максимум 800 фунтов на квадратный дюйм (5440 кПа) давления достигается.
8. После первого прохода экструзии будет завершена, закрыть клапан регулировки давления и снятия давления экструдера путем открытия клапана сброса давления на верхней экструдера. Заполните экструдер с недавно экструдированного раствора porphysome, и повторить экструзии по крайней мере в 10 раз, чтобы обеспечить конечный экструдированный раствор однородно.
9. Определите концентрацию окончательного решения porphysome путем измерения поглощение разведенного образца в метаноле по UV-VIS-спектрометра. Рассчитайте концентрацию, используя следующее уравнение остроумиеч коэффициент экстинкции 97000 М ^-1 см ^-1 при 410 нм для пирофеофорбида-липида.

10. Измерьте окончательное распределение по размерам porphysomes использованием Malvern Zetasizer ZS90 помощи динамического рассеивания света. Развести porphysome решение в PBS и выполнить три измерения с 15 трасс каждый для усредненных результатов.
11. Определить тушение флуоресценции porphysome путем сравнения флуоресцентное излучение закаленного porphysome (1 мМ в PBS) и незамороженный porphysome (1 мМ в 1% Triton X-100) с помощью спектрофлуорометра. Возьмите спектры до и после моющего средства (Tirton Х-100) будет добавлена, а нормализовать сигнал чтения до максимальной флуоресценции. Установите возбуждение быть 410 нм, а излучение диапазона длин волн, чтобы быть 600-800 нм.
12. Хранить porphysomes раствор в атмосфере аргона при 4 ° С до дальнейшего использования, и защитить его от света алюминиевой емасло.

3. Подготовка животных Xenograft модели

1. Культура клетки КБ в RPMI-1640 (с 10% FBS), и поддерживать клетки в 5% CO ₂ и увлажненной атмосфере при 37 ° С
2. Урожай KB клетки, используя стандартную технику культивирования клеток. Хранить клеточной суспензии (20000 клеток / мл) в фосфатном буферном растворе (PBS) на льду в течение кратковременного хранения до времени инъекции.
3. Подготовить KB ксенотрансплантаты на голых мышей. Голые мыши закупаются у Charles River Laboratories, когда они 20 г (Категория # Crl: NU (NCR)-Foxn1 ^ню, 6-7 недель-старый), данный стандарт диета и постельные принадлежности (Харлан лаборатории; Диета: Облученный LM-485, # 7912; Постельное белье: Corncob постельные принадлежности, ¼ ", # 7097). Стерилизовать все обработки животных инструментов (шприцев, щипцы, и животное площадку) до экспериментов. Обезболить мышей с 2% изофлуран объем / объем в 100% газа-носителя кислорода. Все протоколы животных утверждаются учреждения (университет Здоровье Network в данном случае) уход за животными и использование комитет.
4. Введите опухолевые клетки, взвешенные в PBS подкожно в правый бок мышей. Мыши готов к использованию через 10 дней, когда опухоль достигает диаметром 4-5 мм и толщиной 2-3 мм.

4. В естественных условиях Фототермическая терапия

1. Введите porphysomes (содержащие 750 нмоль пиротехнику при 200 мкл объем) внутривенно через хвостовую вену. Провести лазерное облучение 24 часами после инъекции porphysomes.
2. В этом разделе, провести все процедуры в закрытом помещении лазерной безопасности. Надеть очки лазерной безопасности во время лазерного облучения.
3. Настройте оборудования с лазерным излучением. Держите волоконного лазера и диффузор с помощью зажима на подставке. Установите мощность лазера на низком уровне и включите лазер. Отрегулируйте высоту лазерного волокна для достижения облучения площадь 9 мм в диаметре (DPSS лазер, LaserGlow технологии, Торонто, Канада), калибровки мощности лазера до 750 мВт (1,18 Вт / см ^2), используя арАуэр метр и затем выключите лазер для подготовки животных.
4. не Обезболить животных с 2% изофлуран объем / объем в 100% газа-носителя кислорода через носовой конус не очистки очевидно изофлурана опасности опасность для здоровья человека). Убедитесь, что животное находится под наркозом достаточно глубоко, выполняя ног щепотку пинцетом или пальцами до задних лап животного. Животных готовы для лазерного облучения, когда они не реагируют на этой процедуре.
5. Контролируйте температуру опухоли с помощью инфракрасного тепловизора (Mikroshot, LumaSense Technologies). Наведите камеру близко к опухоли, сфокусировать его хорошо и принять предварительно PTT изображение, а также регулярный белого света изображение до начала облучения PTT.
6. Включите лазера снова, и увеличить мощность света до 750 мВт. Расположите опухоль в центре лазерного луча, чтобы опухоль полностью покрыты, и начать отсчет времени облучения. Взять образ температур при опухоли каждые 5 секунд в течение одной минуты лазерного лечения. Выключите лазер на 1 мин. Улицаоп газоснабжение 2% изофлуран, подождите, пока восстановится животных из наркоза и положил его обратно в клетку.
7. Держите мышей в нормотермии животных комнате под 12:12 ч темного и светлого цикла в соответствии с протоколами животных, утвержденных Сети Здоровья Университета. Введите бупренорфин (0,05 мг / кг, подкожно два раза в день в течение недели, следующего за лазерное облучение, чтобы уменьшить боль, вызванную рубца. Каждые два дня, измерить диаметр опухоли с помощью циркуля и сфотографировать. Вычислить объем опухоли с помощью следующее уравнение: V = π / 6 · · б ^2, где является длинный диаметр, и б является коротким.
8. Жертвоприношение животных, поместив их в CO ₂ камеры, когда долго диаметр опухоли достигает 10 мм, как это определено конечной точкой в нашей лаборатории. Выполните шейки дислокации после лечения СО2. Постройте кривую выживания.

Representative Results

Пирофеофорбида конъюгируют с фосфолипидом в качестве стабильного липидов мономера (рис. 1а) и конъюгаты самосборке с образованием porphysomes методом экструзии мембраны с использованием экструдера под высоким давлением. Это правило, трудно выдавить porphysome-липидный подвеска в течение первых 3 циклов экструзии с относительно низкой скоростью потока. Поскольку все больше экструзии повторяются, скорость потока экструдированного раствора постепенно увеличивается, и давление может быть немного уменьшена, если это необходимо. Porphysome размер, концентрация, и закалки эффективность три важных свойства для характеристики наночастиц сразу после экструзии. Porphysomes с высокой однородности распределения по размерам (пик около 120 нм) порождается (рис. 1 б и 1c) с двумя основными пиков поглощения (410 нм и 677 нм, рис 1D) и может оставаться стабильным в течение более 12 месяцев, когда время хранить при температуре 4 ° C. Флуоресценции порфирина гасили выше, чем 99,8% маскурица наноструктуры цела (рис. 1д).

Для в естественных условиях PTT, тепло может быть быстро генерируются на лазерном облучении на 24 часами администрации после porphysome (рис. 2). Porphysomes с лазерным облучением привести к повышению температуры более чем на 35 ° С 1 мин после облучения, в то время как один лазер вызывает повышение температуры менее 10 ° С. Важно, чтобы конечная температура опухоли достигает 55 ° C, чтобы обеспечить полное удаление опухоли. После облучения PTT, опухоль обычно оказывается беловатый из-за мощного теплового эффекта. Нога мыши становится немного опухшим в области опухоли в течение около 2 дней после PTT. Тепловые результаты абляции в темной коричнево струп на опухоли и уменьшению объема опухоли 100%. Eschars можно наблюдать очевидно при 24 ч после обработки, и они постепенно восстанавливаться в течение следующих 2 недель (фиг. 3а). Использование porphysomes, подкожный тусмерть могут быть полностью устранены без рецидива (рис. 3б), в то время как опухоли в одной только porphysome и лазерной только контроля продолжают расти (рис. 3б), и все достижения конечной точки через 2 недели.

Рисунок 1. Структура porphysome nanovesicles и характеристик. . Схематическое изображение пирофеофорбида-липидный porphysome. Ъ. соответствующие ПЭМ-изображение. с. Распределение размера porphysomes после экструзии под высоким давлением. D. Поглощение из пирофеофорбида-липидов в метаноле, нормированной на пике при 410 нм. Электронной. флуоресценции (ет) из закаленного (красная линия тире) и незамороженных (синий сплошная линия) porphysomes, нормализуется до максимальной флуоресценции. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2. Тепловая ответ в течение PTT.. лазер настроен на трансдермальных облучении светом. б и в. . Температура опухоли при лазерном облучении в KB опухоли мышей через 24 часа после инъекции porphysomes или PBS д, Максимальная температура опухоли в течение 60 сек лазерного облучения (в среднем + / - SD течение 5 мышей в каждой группе). Щелкните здесь, чтобы увеличить рисунок .

iles/ftp_upload/50536/50536fig3highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50536/50536fig3.jpg "/>
Рисунок 3. . Фотографии, показывающие терапевтический ответ на PTT ^1, в том числе три группы: porphysomes инъекции с лазерным облучением, PBS инъекции с лазерным облучением, и porphysomes инъекции в одиночку. б. Средний объем опухоли после каждой обработки (п = 5, с * представляет р <0,0005). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Discussion

В развитии технологий доставки лекарств, многофункциональные наночастицы находятся в стадии широких исследований для точного отслеживания доставки лекарственного средства при сохранении высокого полезную нагрузку наркотиков. Порфирин-нагруженных липосом были разработаны для улучшения фармакокинетических свойств и более эффективной доставки, чем прямого введения порфирина, но существуют трудности, в том числе с ограниченным количеством загрузки порфирина и быстрого перераспределения порфирина с липосомами с белками плазмы ^5,6. В отличие от обычных систем доставки липосомального, где свободный порфирин которые вставлены в любом сердечника или липид-бислое липосомы, пирофеофорбида (пиро) теперь непосредственно и стабильно конъюгируют с фосфолипидом и самосборке в липосомы как наноструктур для формирования porphysomes . В результате porphysome двухслойная достигает чрезвычайно высокого порфирина плотность упаковки, что приводит к структурно-зависимой самостоятельного тушения пиро fluoreСЦЕНА и высокий коэффициент поглощения.

Эти пиро-липидный сопряженные самостоятельно собираться в porphysomes в водном буфере с помощью подобного метода получения липосом, таких как методом экструзии мембраны, который обычно используется для генерации однослойные везикулы хорошо определенным размером ^7-9. Экструзионная начинается с сухой липидной пленки, которые гидратируют в водном растворе и подвергают нескольких циклов замораживания-оттаивания для формирования многослойных везикул с широким распределением по размерам ^10. Когда гидратированный porphysome липидную пленку достигает более 1 мг / мл, ручной экструзии становится физически сложной, так что высокое давление экструзии выбирается для масштабируемого до производства porphysomes, например, для исследований на животных, когда по крайней мере 5 мг / мл porphysome требуется ^{8 , 9.} Для достижения еще более высокой конечной концентрации пиро, porphysome липидов пленка, могут быть получены с более высокой первоначальной суммы. Но концентрация выше, чем 10 мг / мл не рекомендуется, в связи с трудностьюэкструзии с 10 мл высокого давления экструдера. В ходе экструзии, если скорость потока экструдированного раствора, выходящего крайне медленно (например, 30 мин / мл) даже при очень высоком давлении (≤ 800 фунтов на квадратный дюйм за проблемы безопасности), фильтр может быть изменен на новый набор, а также температура воды циркуляции может быть увеличена с 65 ° C-75 ° C. Размер однородность липосомальных nanovesicles было показано, чтобы помочь уменьшить печени и селезенки поглощение в естественных условиях ^11. Таким образом, чтобы получить гомогенный и узкое распределение по размерам, экструзию porphysome липидов суспензии через мембранный фильтр (100 нм) повторяют по меньшей мере в десять раз или еще больше.

Мы нашли porphysomes очень стабильны после экструзии при хранении при 4 ° С, с незначительным изменением размера или закалки свойства не менее одного года в наших исследованиях (данные не представлены). Он по-прежнему рекомендуется проверить размер porphysome и тушения эффективность перед каждой инъекцией животныхдля обеспечения porphysome исправности.

Porphysomes первые органические наночастицы, чтобы служить в качестве эффективных усилителей фототермической при сохранении потенциала доставки лекарств и биосовместимость обычных липосом. Они основаны на порфиринов, имеющих отличные показатели для theranostic приложений. ¹² Они имеют высокий коэффициент экстинкции сравнительный к наночастиц золота (ВНП) для быстрой генерации тепла и эффективный отвод тепла абляции ^1. В естественных условиях исследования в показали преимущества porphysome с поддержкой PTT в качестве альтернативного метода к обычному лечению рака. PTT очень просто, с лазерным лечением относительно локализованной в выбранной области облучения (9 мм в диаметре), и очень короткий период лечения (1 мин), необходимое для достижения температуры опухоли выше, чем 55 ° C для эффективного теплового абляции. И простота и высокая селективность может помочь улучшить время восстановления и снизить риск осложнений FOг трансляционные терапевтические применения. Если другие ксенотрансплантата типы, имеющие меньше, чем накопление опухоли KB опухоли (7,5% ID / г) используется, высокая доза может быть porphysome IV вводят для эффективной генерации тепла при лазерном воздействии. В процессе облучения, важно, чтобы лазерное пятно покрывает всю область опухоли, опухоли и температура повышается до 55 ° С или выше для быстрого и полного тепловой абляции при опухолей.

Исследования в настоящее время продолжаются исследовать мультимодальных изображений и терапевтическое применение porphysomes качестве сильных агентов PTT в более клинически значимых животных моделях для будущего поступательного исследования.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotary evaporator	Thermo-Savant	SPD131DDA
Votex	Scientific Industries	SI-0236	Model number: G560
High pressure extruder	LIPEX, Northern Lipids Inc.	T.001	10 ml Thermobarrel Extruder
Heated bath circulators (Thermostatted circulator)	Thermo SCIENTIFIC	SC100-S5P
Polycarbonate filters	Avanti Polar Lipids	610005	Pore size 100 nm, and membrane diameter 19 mm
Zetasizer	Malvern Instruments	ZS90
UV/Visible Spectrophototmeter	Varian Australia	Cary 50 Bio UV/ Visible Spectrophotometer
Spectrofluorometer	HORIBA Scientific	FluoroMax-4
Transmission Electron Microscopy (TEM)	Hitachi	H-7000
Cell culture incubator	SANYO	MCO-18AIC
Powermeter	Thorlabs	PM100D	with sensor S142C
671nm Laser	LaserGlow Technologies	LRS-0671_PFN-02000-05	S/N:10097270
Infrared Thermometer	Mikroshot, LUMASENSE Technologies	9102409
Laser protective eye goggles	LaserGlow Technologies	AGF6602XX	Optical Density: 1.5+ at 630-700 nm