Programmering stamceller for Therapeutic Angiogenese Bruke biologisk nedbrytbart Polymer Nanopartikler

Summary

Vi beskriver en fremgangsmåte for programmering stamceller til økt ekspresjon av terapeutiske forhold for angiogenese ved bruk av biologisk nedbrytbare polymere nanopartikler. Prosessene som beskrives omfatter polymer-syntese, transfeksjon adipose-avledede stamceller in vitro, og validere effekten av programmerte stamceller for å fremme angiogenese i et murint bakben ischemia modell.

Abstract

Kontrollert vaskulær vekst er kritisk for vellykket vevsregenerering og sårheling, samt for behandling av ischemiske sykdommer, slik som slag, hjerteinfarkt eller perifere arterielle sykdommer. Direkte levering av angiogene vekstfaktorer har potensial til å stimulere ny vekst blodkar, men er ofte forbundet med begrensninger som mangel på kort halveringstid in vivo målretting og. Genterapi tilbyr en alternativ tilnærming ved å levere gener som koder angiogenetiske faktorer, men ofte krever bruk av virus, og er begrenset av sikkerhetsmessige hensyn. Her beskriver vi en nylig utviklet strategi for å stimulere vaskulær vekst ved programmering stamceller til økt ekspresjon angiogenetiske faktorer in situ ved hjelp av biologisk nedbrytbare polymere nanopartikler. Spesielt vår strategi benyttet stamceller som levering kjøretøy ved å dra nytte av deres evne til å migrere mot iskemiske vev in vivo. Bruke den optimaliserte polymere vektorer, adipose-avledetstamceller ble modifisert for å overuttrykker en angiogen gen som koder for vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF). Vi har beskrevet prosesser for polymer-syntese, nanopartikkel formasjon, transfeksjon stamceller in vitro, så vel som fremgangsmåter for å validere effekten av VEGF-uttrykkende stamceller for å fremme angiogenese i et murint bakben ischemia modell.

Introduction

Det overordnede målet med denne teknikken er å fremme terapeutisk angiogenese ved hjelp av ikke-viralt programmerte stamceller overekspresjon terapeutiske faktorer på stedet av iskemi. Stamceller ble endret ex vivo første bruker biologisk nedbrytbare nanopartikler syntetisert i laboratoriet, og deretter transplantert i en murine modell av bakben iskemi å validere sitt potensial for å styrke angiogenese og vev berging.

Kontrollert vaskulær vekst er en viktig komponent i vellykket regenerering av vev, så vel som for behandling av forskjellige ischemiske sykdommer, slik som slag, ischemi, og myokardialt infarkt. Flere strategier er blitt utviklet for å fremme vaskulær vekst, inkludert vekstfaktor levering og cellebasert terapi. ^1. Til tross for effekten observert i dyresykdomsmodeller, er disse metoder fremdeles stå overfor begrensninger slik som behovet for suprafysiologiske doser for vekstfaktor levering, eller utilstrekkelig paracrineslipp ved celler alene. En mulig strategi for å overvinne de ovennevnte begrensningene er å kombinere stamcelle terapi og genterapi, hvorved stamceller er genetisk programmert ex vivo før transplantasjonen for å overuttrykker ønskelige terapeutiske faktorer. Denne tilnærmingen har blitt vist i ulike sykdomsmodeller inkludert bakben iskemi ^2, hjertesykdom ^tre, bein healing ⁴ og nerveskade ^5, osv.. Men de fleste genterapiteknikker avhengig av virale vektorer, noe som er forbundet med sikkerhetsproblemer som potensiell immunogenitet og innsettingen mutagenese. Biomaterials mediert ikke-virale gen levering kan overvinne disse begrensninger, men ofte lider av lav transfeksjon effektivitet. For å øke hastigheten på oppdagelsen av nye biomaterialer for effektiv ikke-virale genet levering, har nyere studier ansatt kombinatorisk kjemi og high-throughput screening tilnærming. Biologisk nedbrytbare polymer biblioteker slik som poly (β-amino esregistre) (PBAE) har blitt utviklet og vist, noe som førte til oppdagelsen av ledende polymerer med markant forbedret transfeksjon effektivitet sammenlignet med konvensjonelle polymere vektor kolleger. ^6-7

Heri beskrives syntesen av PBAE og verifisering av deres evne til å transfektere adipose-avledede stamceller (ADSCs) in vitro, etterfulgt av etterfølgende transplantasjon av genetisk-modifiserte ADSCs overekspresjon vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) i en murin modell av bakben iskemi . Resultatene ble evaluert ved å spore mobil skjebne ved hjelp Bioluminescens bildebehandling, vurdere vev reperfusjon ved hjelp av laser Doppler perfusjonsbilleddannende (LDPI), og bestemme angiogenese og vev berging av histologi.

Protocol

En. Polymer Synthesis

1. I et avtrekksskap, veie ut 3523 mg av butandiol diacrylate (C) og overføre til et glass scintillasjonskyvette inneholder oppsikt bar.
2. Forvarm 5-amino-1-pentanol (32) til 90 ° C for å oppløse saltet, og deretter i et avtrekksskap, veie ut 1,533 mg 32 og legge til scintillasjonsglass inneholdende C. Denne metode vil resultere i et molforhold av C: 32 = 1:1,2.
3. Umiddelbart plassere hetteglasset med begge løsninger på en røre plate. Sett røre hastighet på 600 rpm.
4. Overfør scintillasjonskyvette til en ovn innstilt på 90 ° C. Sett omrøringshastighet på 1000 rpm i 4 timer. Hvis oppstuss bar blir sittende fast, senke hastigheten. Etter 4 timer, lavere hastighet til 300 rpm og vedlikeholde ved 90 ° C i en 12 til 16 timer.
5. Tilsett 5 g av C32 til 10 ml vannfritt tetrahydrofuran (THF) i en glass scintillasjonsglass inneholdende en rørestav. Pakk inn i folie og vortex på høy til helt oppløst.
6. I en separat glass scintillasjonskyvette containing oppsikt bar, legger 10 mM Tetraethyleneglycoldiamine (122). Legg 40 ml THF.
7. Plasser begge hetteglassene (C32 og 122) på en røre plate for 5 min deretter kombinere sammen. Dekk med folie og la ved romtemperatur under omrøring ved 400 rpm i 24 timer. Sluttproduktet er betegnet C32-122.
8. Vei opp 5 x 50 ml Falcon rør for hver 5 g batch av C32-122. Merk massen av hvert rør i en notatbok.
9. Overføring 30 ml vannfri dietyleter til hver 50 ml Falcon-røret.
10. Overføring 10 ml C32-122 til hver 50 ml Falcon-røret.
11. Vortex Falconrør kraftig og sentrifuger ved 2500 rpm i 2 min. Merk: Det ekstraherte polymer vil samle seg i bunnen av røret.
12. Kast den øvre løsning og gjenta trinn 1,9 og 1,11 to ganger til.
13. Plasser de åpne rør som inneholder det ekstraherte C32-122 i eksikator og vakuum over natten. Sikre at alle rørene er beskyttet mot lys.
14. Vei alle rør som inneholder C32-122 for å bestemme den endelige masse påekstrahert polymer.
15. Oppløs den ekstraherte polymer i vannfritt DMSO ved en konsentrasjon på 100 mg / ml.
16. Oppbevar det oppløste polymer ved -20 ° C beskyttet mot lys og fuktighet.

2. Cell Seeding

1. Pre-coat bunnen av et T-150 vevskultur kolbe med 0,1% (vekt / volum) gelatin. Gelatinen bør forbli i kolben i 30 til 45 min. Den gelatin belegg hjelper heft ADSCs.
2. Aspirer gelatin fra det pre-coated T-150 kolbe.
3. Tilsett 4 x 10 ⁶ ADSCs (≤ passasje 3) til kolben i 20 ml DMEM inneholdende 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin og 10 ng / ml bFGF.
4. Plasser T-150 kolbe i inkubatoren ved 37 ° C, 5% _CO2 over natten.
5. Begynn transfeksjon prosedyren neste dag.

Tre. Nanoparticle Forberedelse og Transfection

1. Følgende prosedyre for utarbeidelse av nanopartikler som inneholder 16,1 mg plasmid DNA per1,0 x 10 ^6-celler i en polymer for å plasmid vektforhold på 30:1.
2. Fortynn plasmid-DNA (1 mg / ml, pVEGF165, Aldevron, ND, USA) til en endelig konsentrasjon på 120 mikrogram / ml i natriumacetat (25 mM) i et 15 ml Falcon-røret.
3. Fortynn C32-122 (100 mg / ml) til en sluttkonsentrasjon på 3,6 mg / ml i natriumacetat (25 mM) i en andre 15 ml Falcon-røret.
4. Kombiner innholdet i hver Falcon-rør i et enkelt 15 ml Falcon og vortex umiddelbart på høy i 10 sek.
5. La røret stå i romtemperatur i 10 min for nanopartikkeldannelse kan forekomme.
6. Mens ruger, erstatte medium i vevdyrkningskolbe med 7,8 ml fullt supplert DMEM per 1,0 x 10 ⁶ celler transfektert.
7. Overfør nanopartikkel løsning på vevskultur kolbe og vippes forover og bakover for å spre seg jevnt.
8. Plasser vevdyrkningskolbe i inkubatoren ved 37 ° C, 5% _CO2 i 4 timer.
9. Etter to timer, må du bytte nanoticle inneholder media med DMEM.
10. Etter ytterligere 2 timers inkubering ved 37 ° C, 5% _CO2, cellene er klare for in vivo injeksjon.

4. Bakben Ischemia Prosedyre

1. Alle forsøkene ble utført i samsvar med Stanford University Animal Care og bruk komité Retningslinjer og godkjent APLAC protokoller. Genererer murine modell av bakben iskemi er utført som tidligere beskrevet. ⁸ Vennligst referer til referansen for detaljerte instruksjoner. En kort beskrivelse er gitt nedenfor.
2. Plasser musen under anestesi med 1-3% dosering isofluran ved innånding og oksygenstrømningshastighet på 1 l / min. Sørg for anestesidybde ved tå klype, reduksjon i lufthastighet, og apati.
3. Fjern hår fra mageregionen og begge bakbena områder av musen med barberskum.
4. Gjør snitt på midten av mediale lår mot midtlinjen og deretter skjære gjennom overliggende fettpute til exposere lårarterie.
5. Ligere arterien på to steder: distal side (nær kneet) og proksimal side (rett distalt for inguinale ligament).
6. For å opprette ligations, skille arterie fra venen og træ en 5-0 silke sutur rundt arterien. Tie av arterien med to knuter for å gjøre ligation.
7. Fjern såre mellom de to ligation poeng.
8. Vask den kirurgiske området med PBS og deretter sy såret lukket.
9. Den anestesi kan nå fjernes. Hold muse varm før re-oppvåkning. For postoperativ behandling, kan 2-4 mg / kg Lidokain injiseres subkutant ved innsnitt området før ny oppvåkning. Videre smertebehandling kan inkludere subkutan levering av 0,05-0,1 mg / kg Buprenorfin på 12 og 24 timer. Overvåke helsetilstanden til musene en gang om dagen i sju dager ved å observere endringer i pustemønster, åpenbar smerte eller ubehag, og hudfarge.
10. Bekreft bakben iskemi med laser Doppler perfusjonsbilleddannende.

5. Cell Injeksjoner

1. Når de transfekterte celler og mus er klare, vaske transfekterte cellene med PBS, trypsinize, sentrifuger, og deretter telle.
2. Resuspender celler i en tetthet på 10 x 10. ⁶ celler per ml i PBS.
3. Cellesuspensjoner skal separeres inn i separate Eppendorf-rør til et volum på 110 pl. Dette vil sikre at hver mus mottar en lik mengde celler.
4. Plasser hver mus under anestesi (2,5% isofluran, 1 L / min oksygen flow rate).
5. Vask injeksjonsstedet med alkohol våtservietter.
6. Ved hjelp av en 27 G tuberculin sprøyte, tegne cellene opp og ned i sprøyten for å sikre en homogen suspensjon er oppnådd. Tegn opp 100 ul av cellesuspensjonen volumet i sprøyten.
7. Injisere halvcellesuspensjonen inn i lukkemuskelen regionen og deretter injisere den andre halvparten i leggmuskelen regionen. Ved injeksjon, la sprøyten på plass i minst 15-30 sek tilhindre lekkasje av cellesuspensjonen.
8. Riktig kontroller for dyrestudie omfatter: 1)-celler transfektert med et ikke-kodende plasmid (f.eks plasmid med ingen biologisk aktivitet), 2)-celler alene, og 3) PBS.
9. Når injeksjoner er fullført, fjerner du muse fra anestesi og holdes varm før muse re-våkner.

6. Bioluminesens Imaging

1. Til å begynne Bioluminescens imaging (BLI), anesthetize mus som beskrevet ovenfor.
2. Vask injeksjonsstedet med alkohol våtservietter.
3. Ved hjelp av insulinsprøyte, belastning 100 ul av 15 mg / ml D-luciferin (substratet for ildflue luciferase). Hold underlaget vekk fra lyset.
4. For å utføre intraperitoneale injeksjoner, holder mus ved huden på ryggen til å trekke sin fremre skin stram. Sett nålen intraperitonealt i mageregionen og injisere 100 mL av underlaget.
5. Plasser musen i IVIS luciferase bildebehandling kammer under narkose.
6. Når bildet er ervervet, markere regionen av interesse å måle luciferase signal. I dette tilfellet markere iskemiske lemmer på celle-injeksjonsstedet.
7. Fortsett å måle luciferase-signalet hver 3-5 min inntil signalet når en topp, og begynner å avta. Dette er verdien som benyttes for sammenligning på tvers av mus og over flere tidspunkter.
8. Når den er fullført, fjerner mus fra kammeret og anestesi. Hold mus varm før re-oppvåkning.

7. Laser Doppler perfusjonsbilleddannende

1. Laser Doppler perfusjon ble utført som tidligere beskrevet. ⁸ Fremgangsmåten er kort beskrevet her.
2. Før Doppler musen skal være ren barbert på de områdene liggende begge bakbena og mageregionen for å hindre gjenstand grunn til håret.
3. Når forberedt til Doppler bilde, mouse bør bedøvet som beskrevet ovenfor.
4. Varm musen til 36 ° C på en kokeplate, mens overvåking kroppstemperatur ved rektal termometer.
5. Plasser musen på en ikke-reflekterende sort overflate og holde bedøvet av nesen membran. Musen plasseres i den dorsale overflate med sine lemmer eksponert jevnt.
6. Plasser laser Doppler sensor ca 15 cm over musen og rett laserpeker fra sensoren mot lysken regionen av musen.
7. Når musen og Doppler sensor er i posisjon, kan bildene bli tatt utnytte LDPIwin programvaren ved å trykke på Start-knappen.
8. Relative perfusjon målinger kan tas ved å angi begge bakbena (iskemisk og ikke-iskemisk) som region av interesse (ROI). Forholdet mellom midlere perfusjon av ischemiske til den ikke-iskemiske bakben vil indikere relative perfusjon.

8. Tissue Harvest-prosedyre

1. Når forberedt på å høste mus tissue for histologi og / eller biokjemisk behandling, bør musen avlives. Her blir musen avlivet ved å utsette 5% isofluran i 3-5 min, og deretter euthanizing musen ved cervikal dislokasjon.
2. Skjær overliggende huden rundt bakben periferisk ved den distale mageregionen og proksimalt til bakben. Huden er kuttet fra den ventrale til de dorsale flater, slik at huden kan trekkes tilbake over bakben til foten.
3. Ved å trekke huden tilbake, kunne lem bli amputert ved å benytte stump disseksjon saks til å klippe ved bekken og femur joint.
4. To hoved vev er tatt for analyse: mediale adductor musklene og gastrocnemius muskler.
5. For histologi, bygge inn en eller begge vev i optimal skjæretemperatur (OCT) for frysesnitt.
6. For biokjemisk analyse, samle en eller begge vevene til et 1,5 ml Eppendorf-og senk inn i et bad av flytende nitrogen i minst 2 min. Prøvene kan værelagret ved -80 ° C for fremtidig behandling.

Representative Results

Ved å blande sammen de positivt ladede polymer (C32-122), og negativt ladede DNA plasmid selv setter sammen til nanopartikler. Nanopartikkel formasjonen kan bli bekreftet gjennom elektroforese analyse dvs. complexation mellom C32-122 og plasmid DNA vil hindre mobilisering av DNA under elektroforese. Polymeren tjener som en reagens for å lette transfeksjon forbedret opptak av DNA i målcellene og den påfølgende ekspresjon av kodende proteiner (figur 2). Celler kan bli transfektert med noen terapeutiske gener eller reporter-DNA slik som grønt fluorescerende protein (GFP) for å legge til rette for hurtig optimalisering av polymere vektor design og transfeksjon betingelser med høy virkningsgrad ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) og fluorescens-mikroskopi (figur 3). For ADSCs, er en effektivitet over 20% hensiktsmessig.Ytelsene.

For å lette sporing av cellens skjebne etter transplantasjonsjon, kan cellene være stabilt transduseres med luciferase, som tillater sanntids overvåking av celle levedyktighet og distribusjon in vivo ved hjelp av ikke-invasiv Bioluminescens imaging (BLI). BLI avbildning viste høy intensitet luminescens signal fra hind lem (figur 4, venstre panel), som indikerer at implanterte celler forble ved injeksjonsstedet i løpet av flere dager, og vi ønsker ikke observere synlige celle migrering mot andre vev eller organer i løpet av 21 dager. Celle signal generelt redusert overtid og varte opp til 14 dager (Figur 4, høyre panel), noe som tyder på at de fleste transplanterte cellene er tilgjengelig for overekspresjon terapeutiske faktorer for inntil to uker.

Doppler er et nyttig verktøy som muliggjør sanntidsovervåking av blod reperfusjon til iskemisk lem. Det venstre panel av Fig. 5 er et representativt bilde av blodstrøm etter induksjon av ischemi. Det mørke området indikerer successful blokkering av blodstrøm etter operasjonen. Det høyre panelet på figur 5 illustrerer fullstendig reperfusjon av lem 14 dager etter behandling med transfekterte celler.

De teknikker som er beskrevet ovenfor tillater sanntids-kvantifisering, og bør kombineres med ytterligere end-point-analyser for å undersøke grundig terapeutisk effekt. Muskel vev som har fått transplantert celler kan høstes ved ulike tidspunkt for genekspresjon og histologiske analyser. RT-PCR kan brukes til å kvantifisere gene expression in hind lem for å bekrefte genetisk oppregulering i transfekterte celler i flere dager etter transplantasjon. Figur 6 viser VEGF-ekspresjon i den un-behandlede lem, injisert med PBS eller injisert med VEGF uttrykker ADSCs . Resultatene bekrefter VEGF oppregulering i ikke-virale transfekterte celler fire dager etter transplantasjon, videre gi bevis av transplanterte celle overlevelse.

Histologisk farging tillater direkte visualisering av vev morfologi og graden av vev gjenfødelse. Histologisk analyse for blodkartettheten kan være kombinert med dopplerbildedata for å evaluere effekten av blod reperfusjon (fig. 7). Tissue morfologi flekker som H & E og Masson er Trikrom stainings er nyttige for å vurdere graden av vev regenerering eller nekrose. Vellykket nylig regenerert muskelvev er karakterisert ved muskelceller med sentralt plasserte kjerner, mens det nekrotiske vev viser ofte betydelige vev fibrose eller økt antall inflammatoriske celler slik som makrofager.

Figur 1. Skjematisk illustrerer syntesen av poly (β-amino)-ester (PBAE)-baserte vektor C32-122. (A) Acrylated avsluttet C32-Ac ble dannet av en Michael addisjonsreaksjon mellom en monomer med diacrylate endegrupper (C) og en monomer med primære amin-endegruppe (32). (B) Slutt-modifisert PBAE polymerer kan dannes ved tilsetning av amin-terminerte monomerer for transfeksjon forbedret effektivitet. (C) Tetraethyleneglycoldiamine (122) ble valgt som terminal amin monomer. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Skjematisk for dannelse av biologisk nedbrytbare polymere nanopartikler, og deres påfølgende celle opp-tar prosessen for proteinekspresjon.

Figur 3. Menneske adipose-avledet stamceller overekspresjon grønt fluorescerende protein (GFP). Transfection ble utført ved hjelp av polymere nanopartikler dannet ved hjelp av C32-122 og GFP DNA plasmid. Skala bar: 200 mikrometer.

Figur 4. Representant Bioluminescens imaging (BLI) data av muse lemmer i dag 0 (venstre panel) og dag 14 (høyre panel) etter injeksjon av GFP-luciferase positive adipose-avledet stamceller inn i mus med bakbena.

Figur 5. Representative Doppler-bilder som viser induksjon av ischemi på den ene siden av murine bakben ved dag 0 (venstre panel), og vellykket reperfusjon blod 14 dager etter injeksjon av VEGF-overekspresjon adipose-avledede stamceller (høyre panel).

Figur 6. For å bekrefte celle overlevelse og overekspresjon av kodede terapeutiske faktorer i situ, kan vev høstes fra for genet uttr injeksjonsstedetession analyser. RT-PCR bekreftet vellykket oppregulering av VEGF, det kodede terapeutisk protein, i den behandlede gruppe (ADSC-VEGF) 4 dager etter celle injeksjon, mens ingen ekspresjon ble påvist i PBS kontrollen.

Figur 7. Representant immunhistokjemiske bildet viser kapillær tetthet av anti-CD31 flekker på 28 dager etter at den kirurgiske prosedyren Scale bar:. 100 mikrometer.

Discussion

Her rapporterer vi en metode for å programmere voksne stamceller til økt ekspresjon av terapeutiske faktorer ved hjelp av ikke-virale, biologisk nedbrytbare nanopartikler. Denne plattformen er spesielt nyttig for behandling av sykdommer hvor stamceller kan selvsagt hjemmet, slik som ischemi og kreft. ^9-10 Videre tillater den ikke-virale gen levering plattform for transient overekspresjon av terapeutiske forhold, som er egnet for de fleste vev regenerering og såret helbredende prosesser. Den transfeksjon Prosessen er avhengig av effektiv DNA inntreden i celler, og generelt fungerer godt i aktivt-delende celletyper, men ikke også i ikke-delende celler. Den transfeksjon effektiviteten av PBAE polymerer kan variere fra celletype til celle-type, og bør optimaliseres hver for seg, og kan bli undersøkt ytterligere kjemiske strukturmodifiseringer for å oppnå optimal transfeksjon effektivitet i spesielle målrettede cellepopulasjoner. ^11-12 Celler transfektert med den ovenfor beskrevne metode vanligvis resulterer in forbigående genuttrykk og proteinutskillelse i to uker, med maksimal genuttrykk oppnådd rundt dag 2-4. For dyreforsøk, er ADSCs med transfeksjon effektivitet over 20% anses egnet. Det anbefales å utføre FACS analyse hver gang en prosess parameter er endret for å opprettholde konsistens (f.eks ny gruppe med polymerer, plasmider eller celler).

Sammenlignet med kommersielt tilgjengelige transfeksjon reagenser så som PEI og Lipofectamine 2000, som er ikke-nedbrytbare, de PBAE polymerer som brukes i den rapporterte plattformen ovenfor, er biologisk nedbrytbare og mer egnet for klinisk oversettelse. Gitt at slike polymere vektorer er hydrolytisk nedbrytbare ¹³ og lysfølsom, bør forsiktighet utvises for å lagre PBAE polymerer ordentlig (-20 ° C, i mørket, med tørkemiddel) for å hindre uønsket hydrolyse og degradering. De resulterende polymerene har en fordeling av molekylvekten, og gelfiltrerings-kromatografi (SEC) may bli utført for å ytterligere rense PBAEs med økt transfeksjon effektivitet. ^14. Det anbefales også å utføre kjernemagnetiske resonans-(NMR) på hvert trinn i polymersynteseprotokoll. NMR bør utføres for å bekrefte dannelsen av C32 fra sine enkeltkomponenter og igjen for å bekrefte vellykket tillegg av slutten capping grupper dvs. 122. Merk: etter tilsetning av endeen grupper, bør de akrylat-grupper forsvinner fra NMR-spektrum. Tilstedeværelsen av overskudd av amin-terminerte monomerer i det endelige polymer kan føre til økt celle toksisitet, derfor er det viktig å tilstrekkelig å vaske endelige polymer i dietyleter for å sørge for fjernelse av overskytende monomerer. Som nevnt ovenfor, kan SEC også anvendes for å fremme renheten til sluttproduktet.

I motsetning til mange virusbasert genet levering plattformer, vil ikke polymerbasert genet levering system som brukes her ikke integrere i vertsgenomet, og dermed unngå den potensielle risikoen for innsett mutagenesis og immunogenisitet. ^15-16

I den beskrevne fremgangsmåten, blir cellene transplantert uten sortering direkte etter transfeksjon prosess, som består av en blanding av celler overekspresjon som koder for proteiner og un-transfekterte celler. Denne prosedyren tillater minimal ex vivo manipulering av cellene, og vil trolig være mer klinisk oversett gitt redusert tid, kostnad og sjansene for forurensning. Celler kan også bli renset videre å velge transfekterte celler bare for ytterligere å øke nivået av overekspresjon av terapeutiske faktorer in situ.

Effekten av programmerte stamceller for angiogenese bør undersøkes ved hjelp av en kombinasjon av analyser for å grundig asses resultatene på flere nivåer, inkludert mobilnettet, morfologisk og fysiologisk. Bioluminesens bildebehandling muliggjør sanntids overvåking av overlevelse og distribusjon av transplanterte cellene over tid. Genuttrykk analyser fra harvsert vev tillate verifisering av celleoverlevelse og genetisk oppregulering av kodede faktorer in situ. Histologiske flekker muliggjør direkte visualisering av blodåre tetthet, betennelse og vev gjenfødelse. Det bør bemerkes at økt blodkaret tetthet ikke alltid fører til vellykket blod reperfusjon, som den nydannede fartøy kan være umodne og ikke-funksjonelle. Derfor er det viktig å vurdere den fysiologiske funksjon av nylig genererte fartøy ved hjelp av laser-Doppler perfusjonsbilleddannende. Mens metodene ovenfor fokus på å bruke adipose-avledet stamceller til å fremme angiogenese i et bakben iskemi modell, er begrepet programmering celler som narkotika levering kjøretøy bredt gjeldende. Plattformen kan enkelt tilpasses til å programmere andre celletyper for overekspresjon terapeutiske faktorer som er relevante for behandling av andre sykdommer som kreft og muskel-og skjelettsykdommer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10082
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B
1,4-Butanediol Diacrylate (90 %)	Sigma Aldrich	411744	Acronym: C
5-amino-1-pentanol (97 %)	Alfa Aesar	2508-29-4	Acronym: 32
Tetraethyleneglycoldiamine >99 %)	Molecular Biosciences	17774	Acronym: 122
Sodium Acetate	G-Biosciences	R010
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14190-144
Tetrahyofuran Anhydrous (>99.9 %)	Sigma Aldrich	401757
Diethyl Ether Anhydrous (>99 %)	Fisher Scientific	E138-4
DMSO Anhydrous (>99.9 %)	Sigma Aldrich	276855
Gelatin	Sigma Aldrich	G9391
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200
D-luciferin	GoldBio
Optimal Cutting Temperature (O.C.T)	Tissue-Tek	4583
Rat anti-Mouse CD31	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 594 anti-rat IgG	Invitrogen	A11007