Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Стволовые Программирование Клетки для терапевтической ангиогенеза Использование биоразлагаемых полимерных наночастиц

Published: September 27, 2013 doi: 10.3791/50736
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Department of Orthopaedic Surgery, Stanford University, 2Department of Bioengineering, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

Мы описываем метод программирования стволовых клеток сверхэкспрессировать лечебных факторов для ангиогенеза помощью биоразлагаемых полимерных наночастиц. Процессы, описанные включают синтез полимера, трансфекции полученных из жировой ткани стволовые клетки в пробирке, и проверки эффективности запрограммированными стволовых клеток стимулировать ангиогенез в мышиной ишемии задней конечности модели.

Abstract

Контролируемый рост сосудов имеет решающее значение для успешной регенерации тканей и заживления ран, а также для лечения ишемических заболеваний, таких как инсульт, инфаркт или периферических артериальных заболеваний. Прямые поставки ангиогенных факторов роста имеет потенциал, чтобы стимулировать новый рост кровеносных сосудов, но часто ассоциируется с ограничениями, такими как отсутствие адресности и коротким периодом полураспада в естественных условиях. Генная терапия предлагает альтернативный подход, предоставляя гены, кодирующие ангиогенные факторы, но часто требует использования вируса, и ограничивается соображений безопасности. Здесь мы опишем недавно разработанной стратегии стимулирования роста сосудов на программирования стволовых клеток сверхэкспрессировать ангиогенные факторы на месте с помощью биоразлагаемых полимерных наночастиц. В частности наша стратегия используется стволовые клетки как средств доставки, воспользовавшись их способности мигрировать в сторону ишемических тканей в естественных условиях. Используя оптимизированные полимерные векторы, полученные из жировой тканиСтволовые клетки были модифицированы для сверхэкспрессии ангиогенный ген, кодирующий фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Мы описаны способы синтеза полимеров, формирования наночастиц, трансфекции стволовых клеток в пробирке, а также методов проверки эффективности VEGF-экспрессирующих стволовых клеток для стимуляции ангиогенеза в мышиной модели ишемии задней конечности.

Introduction

Общая цель этой техники заключается в содействии терапевтический ангиогенез с использованием не-вирусно запрограммированные стволовые клетки гиперэкспрессией лечебных факторов на месте ишемии. Стволовые клетки были изменены экс естественных первом использовании биоразлагаемые наночастицы, синтезированные в лаборатории, а затем пересадили в мышиной модели ишемии задней конечности, чтобы проверить их потенциал для повышения ангиогенез и тканей спасение.

Контролируемый рост сосудов является важным компонентом успешного регенерации тканей, а также для лечения различных ишемических заболеваний, таких как инсульт, ишемия конечностей и инфаркту миокарда. Некоторые стратегии были разработаны для содействия роста сосудов, в том числе поставки фактора роста и клеточной терапии. 1 Несмотря на эффективность наблюдается в моделях заболеваний животных, эти методы все еще ​​сталкиваются ограничений, таких как потребность в супрафизиологического доз для доставки фактора роста, или недостаточное паракринныйосвободить одними клеток. Одним из потенциальных стратегия преодоления вышеуказанных ограничений является сочетание терапии стволовых клеток и генной терапии, в результате чего стволовые клетки генетически запрограммированный экс естественных до трансплантации сверхэкспрессировать желательные лечебных факторов. Этот подход был продемонстрирован в различных моделей заболеваний, включая ишемии задней конечности 2, болезни сердца, костного 3 заживления 4 и 5 нервной травмы и др. Тем не менее, большинство методов генной терапии полагаться на вирусные векторы, которые связаны с проблемами безопасности, такие как потенциального иммуногенности и инсерционного мутагенеза. Биоматериалы опосредованные невирусный доставку генов может преодолеть эти ограничения, но часто страдают от низкой эффективности трансфекции. Чтобы ускорить открытие новых биоматериалов для эффективного невирусной доставки генов, недавние исследования использовали комбинаторной химии и высокопроизводительного скрининга подход. Биоразлагаемые полимерные библиотеки, такие как поли (β-амино эсОслабляет) (PBAE) были разработаны и просеивают, что привело к открытию ведущих полимеров с заметно улучшенной эффективности трансфекции по сравнению с обычными полимерными векторных коллегами. 6-7

В данном случае мы описали синтез PBAE и проверки их способности для трансфекции полученных из жировой ткани стволовые клетки (ADSCs) в пробирке с последующим последующей трансплантации генетически модифицированных ADSCs гиперэкспрессией фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в мышиной модели ишемии задней конечности . Результаты оценивались путем отслеживания судьбы клеток использованием изображений биолюминесценции, оценки тканей реперфузию помощью лазерного доплеровского перфузии (LDPI), и определения ангиогенез и тканей спасение по гистологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Полимер Синтез

  1. В вытяжной шкаф, отвешивать 3523 мг бутандиолдиглицидилового диакрилата (C) и трансфер в стеклянной сцинтилляционный флакон, содержащий мешалки.
  2. Нагреть 5-амино-1-пентанол (32) до 90 ° С, чтобы растворить соль, то в вытяжном шкафу, взвесить 1533 мг 32 и добавить в сцинтилляционный флакон, содержащий этот метод С приведет в молярном соотношении из C: 32 = 1:1,2.
  3. Сразу же место флакона оба решения на магнитной мешалки. Установить скорость перемешивания при 600 оборотах в минуту.
  4. Перенести сцинтилляционный флакон с печи при 90 ° С Установка скорости перемешивания в 1000 оборотах в минуту в течение 4 часов. Если мешалку застревает, снизить скорость. Через 4 ч, более низкая скорость до 300 оборотов в минуту и ​​поддерживать при 90 ° С в течение еще 12-16 часов.
  5. Добавить 5 г C32 в 10 мл безводного тетрагидрофурана (ТГФ) в стекл нный сцинтилл ционный флакон, содержащий мешалку. Оберните в фольгу и вихря на высокой до полного растворения.
  6. В отдельном стекло сцинтилляционный флакон Контаining мешалкой, добавить 10 мМ Tetraethyleneglycoldiamine (122). Добавить 40 мл ТГФ.
  7. Положите обе ампул (C32 и 122) на магнитной мешалки в течение 5 мин затем объединить вместе. Обложка в фольгу и оставить при комнатной температуре при перемешивании при 400 оборотах в минуту в течение 24 часов. Конечный продукт называется C32-122.
  8. Взвесить 5 х 50 мл Сокол труб для каждого 5 г партии C32-122. Обратите внимание на массу каждой трубы в записной книжке.
  9. Передача 30 мл безводного диэтилового эфира по 50 мл каждого сокола трубки.
  10. Передача 10 мл C32-122 в каждой 50 мл трубки Сокол.
  11. Vortex Сокол труб энергично затем центрифуге при 2500 оборотов в минуту в течение 2 мин. Примечание: Извлеченный полимер будет собирать на базе трубки.
  12. Откажитесь от верхнего решение и повторите шаги 1,9 и 1,11 еще два раза.
  13. Поместите открытые пробирки, содержащие извлеченный C32-122 в эксикаторе и вакууме в течение ночи. Убедитесь, что все трубы защищены от света.
  14. Взвесьте все пробирки, содержащие C32-122 для определения окончательного массуизвлекается полимер.
  15. Растворить извлеченный полимер в безводном ДМСО в концентрации 100 мг / мл.
  16. Хранить растворенного полимера при -20 ° С в защищенном от света и влаги.

2. Сотовый Посев

  1. Предварительное покрытие основание Т-150 тканевой культуральной колбе с 0,1% (вес / объем) желатин. Желатин должен оставаться в колбе в течение 30-45 мин. Желатин покрытие помогает адгезии ADSCs.
  2. Аспирируйте желатин из предварительно покрытых Т-150 колбы.
  3. Добавить 4 × 10 6 ADSCs (≤ пассаж 3) в колбу на 20 мл DMEM, содержащей 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 10 нг / мл BFGF.
  4. Поместите Т-150 колбу в инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% CO 2 в течение ночи.
  5. Начните процедуру трансфекции на следующий день.

3. Наночастиц Подготовка и Трансфекцию

  1. Ниже приведены инструкции для получения наночастиц, содержащих 16,1 мкг плазмидной ДНК за1.0 х 10 6 клеток на полимере в плазмиды весовое соотношение 30:1.
  2. Развести плазмидной ДНК (1 мг / мл, pVEGF165, Aldevron, ND, USA) в конечной концентрации 120 мкг / мл в ацетата натрия (25 мМ) в 15 мл сокола трубки.
  3. Развести c32-122 (100 мг / мл) в конечной концентрации 3,6 мг / мл в ацетата натрия (25 мМ) в 15 мл втором сокола трубки.
  4. Объединить содержимое каждой пробирки Фалкон в единый 15 мл трубки сокола и вихря сразу на высокой в ​​течение 10 сек.
  5. Пусть трубка сидеть при комнатной температуре в течение 10 мин для формирования наночастиц, чтобы произойти.
  6. Хотя инкубации, заменить среды в культуре ткани колбу с 7,8 мл полностью дополненной DMEM за 1,0 х 10 6 клеток, трансфицированных.
  7. Перенести наночастиц решение тканевой культуральной колбы и наклон вперед и назад, чтобы равномерно распределить.
  8. Место культуры колбу тканей в инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% CO 2 в течение 4 часов.
  9. Через 2 часа, замените наночастицычастица, содержащая носитель с DMEM.
  10. После дальнейшего 2 ч инкубации при 37 ° С, 5% СО 2, клетки готовы к естественных инъекции в.

4. Задних конечностей Процедура Ишемия

  1. Все эксперименты проводились в соответствии с Стэнфордского университета уходу и использованию животных комитета Руководства и утвержденных протоколов APLAC. Генерация мышиной модели ишемии задней конечности выполняется, как описано выше. 8 См. задания для подробных инструкций. Краткое описание приводится ниже.
  2. Место мыши под анестезией 1-3% дозы изофлураном при вдыхании и скорости кислорода потока 1 л / мин. Убедитесь глубины анестезии на носок щепотку, уменьшение частоты дыхания, и летаргии.
  3. Удалить волосы от региона в животе и обеих областях задних конечностей мыши с кремом для бритья.
  4. Сделать надрез в центре медиальной бедра к средней линии, а затем прорезать вышележащих жировой ткани к эксПоставим бедренную артерию.
  5. Лигируют артерии на двух площадках: дистальной сайта (близко к колену) и проксимального сайта (только дистальнее паховой связки).
  6. Для создания лигирования, отделить артерию из вены и нити 5-0 шелковой нити вокруг артерии. Галстук с артерию с двумя узлами, чтобы сделать перевязку.
  7. Удалить артерию между двумя точками лигирования.
  8. Вымойте хирургическую область с PBS, а затем сшивать разрез закрыт.
  9. Анестезия теперь могут быть удалены. Держите в тепле мыши, пока пробуждению. Для послеоперационного ухода, 2-4 мг / кг лидокаина может быть введен подкожно в область разреза до повторного пробуждения. Далее обезболивание может включать подкожный доставку 0,05-0,1 мг / кг бупренорфина в 12 и 24 часов. Мониторинг состояния здоровья мышей раз в день в течение семи дней, наблюдая изменения в паттерна дыхания, явной боли или дистресса, и цвет кожи.
  10. Подтверждение ишемии задней конечности лазерным Доплера перфузии.

5. Сотовые Инъекции

  1. Когда трансфицированные клетки и мышей готовы, мыть трансфицированных клеток с PBS, Trypsinize, центрифуге, а затем в счет.
  2. Ресуспендируют клеток при плотности 10 × 10 6 клеток на мл в PBS.
  3. Клеточные суспензии должны быть разделены на отдельные пробирки Эппендорфа в объеме 110 мкл. Это гарантирует, что каждая мышь получает одинаковое количество клеток.
  4. Место каждого мышь под наркозом (2,5% изофлуран, скорость потока 1 л / мин кислорода).
  5. Очистите место инъекции спиртовыми салфетками.
  6. Используя туберкулиновые шприцы 27 G, рисовать клетки вверх и вниз в шприц для обеспечения получения однородной суспензии достигается. Составление 100 мкл объема клеточной суспензии в шприц.
  7. Введите половину суспензии клеток в область приводящей мышцы, а затем вводить другую половину в области икроножных мышц. По инъекционных, оставьте шприц на месте, по крайней мере 15-30 с допредотвратить утечку клеточной суспензии.
  8. Собственные средства управления для исследования животных включают в себя: 1) клетки, трансфицированные плазмидой некодирующей (например плазмиды, не биологической активности), 2) в одиночку клетки и 3) PBS.
  9. При инъекции являются полными, удалить мышь от наркоза и не согреться, пока мыши повторных просыпается.

6. Биолюминесценция изображений

  1. Чтобы начать биолюминесценции томографии (BLI), анестезию мышей, как описано выше.
  2. Очистите место инъекции спиртовыми салфетками.
  3. Использование инсулина шприц, нагрузка 100 мкл 15 мг / мл D-люциферин (подложки для люциферазы светлячка). Держите субстрат от света месте.
  4. Для выполнения внутрибрюшинные инъекции, держать мышей на коже спине тянуть их передней кожи тугой. Вставьте иглу внутрибрюшинно в брюшной области и ввести 100 мкл субстрата.
  5. Наведите в изображающего люциферазы камеры IVIS под наркозом.
  6. Когда изображение приобрел, отметьте область интереса для измерения сигнала люциферазы. В этом случае отметить ишемизированной конечности в месте инъекции клеток.
  7. Продолжить для измерения сигнала люциферазы каждые 3-5 минут, пока сигнал не достигает пика и начинает снижаться. Это значение используется для сравнения по мышей и в течение нескольких временных точках.
  8. После завершения удаления мышей из камеры и анестезии. Хранить мышей теплой до повторного пробуждения.

7. Лазерная доплеровская перфузии

  1. Перфузии лазерной доплеровской выполняется, как описано выше. 8 Процедура кратко описано здесь.
  2. До допплер мышь должна быть чисто выбрит на участках вышележащих оба задних конечностей и брюшной области, чтобы предотвратить артефакт из-за волос.
  3. Когда готовы Доплера изображения, мусебе должны быть под наркозом, как описано выше.
  4. Теплый мышь, чтобы 36 ° С на горячей плите в то время как мониторинг температуры тела на ректального термометра.
  5. Наведите курсор мыши над антибликовым черной поверхности и держать под наркозом на носовом обтекателе. Мышь должны быть размещены на его спинной поверхности с его члены подвергаются равномерно.
  6. Поместите датчик лазерного доплеровского примерно 15 см выше мыши и направляя лазерный указатель от датчика к паховой области мыши.
  7. При наведении курсора мыши и датчик Доплера находятся в положении, изображения могут быть приняты с использованием программного обеспечения LDPIwin, нажав кнопку Пуск.
  8. Измерения Относительные перфузии может быть размещено с указанием оба задних конечностей (ишемическая и неишемическая) как области интересов (ROI). Отношение средней перфузии ишемическая к неишемической задней конечности укажет относительную перфузии.

8. Ткань Урожай Порядок

  1. Когда готовы урожай мыши тисподать в суд за гистологии и / или биохимической переработки, мышь должна быть умерщвлены. Здесь, мышь эвтаназии путем воздействия на 5% изофлуран в течение 3-5 мин, а затем эвтаназии мышь смещением шейных позвонков.
  2. Разрежьте покрывающий кожу вокруг задних конечностей по окружности на дальнем регионе в животе и приближенную к задней конечности. Кожа будет вырезана из вентральной в спинных поверхностей, таких, что кожа может быть стянуть назад на задней конечности к подножию.
  3. После натяжения кожи спины, конечностей может быть ампутирована, используя тупые ножницы рассечение сократить на тазовой и бедренной сустава.
  4. Две основные ткани взяты для анализа: медиальной мышцы приводящей и икроножных мышц.
  5. Для гистологии, вставлять одну или обе ткани в оптимальной температуре резания (ОКТ) для cryosectioning.
  6. Для биохимического анализа, собирают одну или обе ткани в 1,5 мл Eppendorf и погрузить в ванну с жидким азотом в течение по крайней мере 2 мин. Образцы могут бытьхранили при -80 ° С в течение последующей обработки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

При смешивании вместе, положительно заряженный полимер (C32-122) и отрицательно заряженные плазмидной ДНК самосборки в наночастицы. Формирование наночастиц может быть подтверждено путем анализа электрофореза т.е. комплексообразование между C32-122 и ДНК плазмиды помешает мобилизации ДНК во время электрофореза. Полимер выступает в качестве реагента для трансфекции, чтобы облегчить усиленное поглощение ДНК в клетки-мишени и последующую экспрессию кодирующих белки (рис. 2). Клетки могут быть трансфицировали любых терапевтических генов или ДНК-репортера, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP), чтобы облегчить быструю оптимизацию полимерных вектор дизайн и трансфекции условиях с высокой эффективностью с помощью сортировки флуоресцентно-активированном ячейку (FACS) и флуоресцентной микроскопии (рис. 3). Для ADSCs, эффективность выше 20% считается подходящим.

Для облегчения слежения за судьбы клетки после трансплантацииТион, клетки могут быть стабильно трансдуцировали люциферазы, которая позволяет в реальном времени мониторинг жизнеспособности и распределения клеток в живом организме с помощью неинвазивной биолюминесценции изображений (BLI). Томография BLI показали высокую интенсивность люминесценции сигнал от задней конечности (рис. 4, левая панель), указывая, что имплантированные клетки оставались в месте инъекции в течение нескольких дней, и мы не наблюдаем заметное миграцию клеток к другим тканей или органов в течение 21 дней. Сигнал сотового вообще снизилась сверхурочно и продолжалась до 14 дней (рис. 4, справа), предполагая, что наиболее пересаженные клетки доступны для гиперэкспрессией лечебных факторов на срок до 2-х недель.

Допплер является полезным инструментом, который позволяет осуществлять мониторинг в режиме реального времени реперфузии крови к ишемической конечности. На левой панели фиг.5 является представителем изображение кровотока после индукции ишемии. Темная область указывает Successful блокирование кровотока после операции. В правой части фиг.5 иллюстрирует полную реперфузии конечности 14 дней после обработки трансфицированных клеток.

Способы, описанные выше, позволяют в режиме реального времени количественную, и должны быть соединены с дополнительным конечная точка анализирует тщательно изучить терапевтическую эффективность. Мышечных тканей, которые получили трансплантированные клетки могут быть собраны в различные моменты времени для экспрессии генов и гистологических анализов. RT-PCR может быть использован для количественной оценки экспрессии генов в задней конечности, чтобы подтвердить генетический повышающей регуляции в трансфицированных клетках несколько дней после трансплантации. Фиг.6 показывает VEGF выражение в не-обработанной конечности, инъецированных PBS инъецировали или VEGF выражения ADSCs . Результаты подтверждают VEGF активацию в невирусных трансфекции клеток четыре дня после трансплантации, далее что свидетельствует о пересаженной выживаемости клеток.

Histoloческие окрашивание позволяет прямой визуализации морфологии ткани и степени регенерации тканей. Гистологический анализ для плотности кровеносных сосудов могут быть связаны с данными Доплера изображений, чтобы помочь оценить эффективность реперфузии крови (рис. 7). Ткань морфология окрашивание таких как H & E и TriChrome окрашивания Массона полезны для оценки степени регенерации тканей или некроза. Успешно вновь генерируемого мышечная ткань характеризуется мышечных клеток с центрально расположенными ядрами, тогда как некротических тканей часто показывают существенное фиброз тканей или повышенное количество воспалительных клеток, таких как макрофаги.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схему, иллюстрирующую синтез поли (β-амино) эфир (PBAE) на основе вектор C32-122. (A) акрилатные прекращается C32-Ac был сформирован реакции присоединения Михаэля между мономера с diacrylatе концевые группы (С) и мономер с первичной конечной амин группы (32). (B) Конец модифицированные полимеры PBAE может быть сформирован путем добавления мономеров с концевыми аминогруппами для повышения эффективности трансфекции. (С) Tetraethyleneglycoldiamine (122) была выбрана в качестве терминала мономера амина. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2
Рисунок 2. Схема формирования биоразлагаемых полимерных наночастиц и их последующее клеток до-взять процесс экспрессии белка.

Рисунок 3
Рисунок 3. Человеческие полученные из жировой ткани стволовые клетки экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP). Трансфекция проводили с использованием полимерных наночастиц, сформированных с помощью C32-122 и плазмиду GFP ДНК. Масштабные баг: 200 мкм.

Рисунок 4
Рисунок 4. Представитель изображений биолюминесценции (BLI) данные конечностей мыши на день 0 (слева) и 14-й день (правая панель) после инъекции GFP-люциферазы положительные полученных из жировой ткани стволовые клетки в задней конечности мыши.

Рисунок 5
Рисунок 5. Типичные доплеровские изображения, демонстрирующие индукции ишемии на одной стороне задней конечности мышей на день 0 (слева) и успешно реперфузией крови через 14 дней после инъекции VEGF с гиперэкспрессией полученные из жировой ткани стволовые клетки (справа).

Рисунок 6
Рисунок 6. Чтобы подтвердить выживаемость клеток и сверхэкспрессию закодированных лечебных факторов в месте, ткани могут быть собраны из места инъекции для генной выражЭссионе анализов. RT-PCR подтвердил успешную повышающей регуляции VEGF, закодированный терапевтический белок, в обработанной группе (ADSC-VEGF) 4 дней после инъекции клеток, в то время как не выражение не было обнаружено в контроле PBS.

Рисунок 7
Рисунок 7. Представитель иммуногистохимическое изображение демонстрируя плотности капилляров анти-CD31 окрашивания через 28 дней после операции Шкала бар:. 100 мкм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы сообщаем метод для программирования взрослые стволовые клетки сверхэкспрессировать лечебных факторов с использованием не-вирусные, биоразлагаемые наночастицы. Эта платформа является особенно полезным при лечении заболеваний, где стволовые клетки могут естественно дом, например, ишемии и рака. 9-10 Кроме того, не-вирусной доставки генов платформа позволяет переходного сверхэкспрессии лечебных факторов, который подходит для большинства регенерации тканей и раны процессы заживления. Процесс трансфекции зависит от эффективного входа ДНК в клетки, и вообще хорошо работает в активно-разделительных типов клеток, но не так хорошо, не связанных с делящихся клеток. Эффективность трансфекции PBAE полимеров может варьировать от типа клеток к типу клеток, и должна быть оптимизирована индивидуально, и дальнейшие модификации химической структуры могут быть изучены для достижения оптимальной эффективности трансфекции в конкретных целевых клеточных популяций. 11-12 Клетки, трансфицированные способом, описанным выше как правило, приводит ян переходных экспрессии генов и секрецию белка в течение двух недель, с экспрессии генов, достигнутого пика около 2-4 день. Для экспериментов на животных, ADSCs с эффективности трансфекции выше 20% считаются пригодными. Рекомендуется проводить анализ Facs каждый раз, когда параметр процесса изменяется в целях обеспечения согласованности (например новая партия полимеров, плазмиды или клеток).

По сравнению с коммерчески доступных реагентов трансфекции, такие как PEI и Липофектамином 2000, которые не являются разлагаемые полимеры, используемые в PBAE отчетный платформе выше являются биологически и больше подходит для клинического перевода. Учитывая, что такие полимерные векторы гидролитически разложению 13 и чувствительна к свету, следует проявлять осторожность, чтобы сохранить PBAE полимеры правильно (-20 ° C, в темноте, с осушителем) для предотвращения нежелательного гидролиза и деградации. Полученные полимеры имеют распределение молекулярной массы, и гель-хроматографии (SEC) май быть выполнены для дальнейшей очистки PBAEs с повышенной эффективностью. 14 трансфекции Кроме того, рекомендуется выполнить ядерного магнитного резонанса (ЯМР) на каждом этапе протокола синтеза полимера. ЯМР должны быть выполнены, чтобы подтвердить образование C32 от ее отдельных компонентов и снова для подтверждения успешного добавление конце укупорки группы, то есть 122. Примечание: после добавления блокирующее конец группах, акрилатные группы должны исчезнуть из спектра ЯМР. Присутствии избытка мономеров с концевыми аминогруппами в конечном полимере могут привести к повышенной токсичности клеток, поэтому важно, чтобы адекватно мыть конечного полимера в диэтиловом эфире, чтобы обеспечить удаление избытка мономеров. Как упоминалось выше, SEC также могут быть использованы для дальнейшего чистоты конечного продукта.

В отличие от многих вирусных платформ доставки генов, полимер на основе системы доставки генов используется здесь не интегрируется в геном хозяина, что позволяет избежать потенциального риска для инсерционного мutagenesis и иммуногенность. 15-16

В описанной выше процедуре, клетки трансплантируют без сортировки непосредственно после процесса трансфекции, который содержит смесь клетками, сверхэкспрессирующими, кодирующих белки, и не-трансфицированных клеток. Эта процедура позволяет уменьшить Экс Vivo манипуляции с клетками, и, вероятно, будет более клинически переводимые учитывая сокращение времени, стоимости и шансы заражения. Клетки также могут быть дополнительно очищают, чтобы выбрать трансфекции клеток только в целях дальнейшего повышения уровня избыточной экспрессии терапевтических факторов в месте.

Эффективность программируемых стволовых клеток для ангиогенеза должны быть рассмотрены с использованием комбинации анализов, чтобы тщательно ослов результаты на нескольких уровнях, включая клеточные, морфологические и физиологические. Томография Биолюминесценция позволяет осуществлять мониторинг в режиме реального времени выживания и распространения трансплантированных клеток с течением времени. Экспрессия генов анализы из HARVЗаинтересованные ткани позволяют проверку выживаемости клеток и генетической повышающей регуляции кодированных факторов на месте. Гистологическое окрашивание позволяет прямой визуализации плотности кровеносных сосудов, воспаления и регенерации тканей. Следует отметить, что повышенная плотность кровеносных сосудов не всегда приводит к успешной реперфузией крови, как новообразованные сосуды могут быть незрелыми и нефункциональные. Поэтому важно оценить физиологическую функцию вновь созданные сосудов с помощью перфузии лазерного доплеровского. Хотя приведенные выше упором на использование полученных из жировой ткани стволовые клетки стимулировать ангиогенез в модели ишемии задней конечности методы, концепция программирования клеток, как средств доставки лекарств широко применима. Платформа может быть легко адаптирована для программирования других типов клеток для гиперэкспрессией лечебных факторов, которые важны для лечения других заболеваний, таких как рак и заболеваний опорно-двигательного.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Авторы хотели бы выразить признательность Американская Ассоциация Сердца Национальной Грант Ученый развития (10SDG2600001), Стэнфордский Bio-X Междисциплинарный инициатива программу, и Стэнфорд ученых-медиков исследовательской программы для финансирования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 11965
Fetal Bovine Serum Invitrogen 10082
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15070
Basic Fibroblast Growth Factor Peprotech 100-18B
1,4-Butanediol Diacrylate (90 %) Sigma Aldrich 411744 Acronym: C
5-amino-1-pentanol (97 %) Alfa Aesar 2508-29-4 Acronym: 32
Tetraethyleneglycoldiamine >99 %) Molecular Biosciences 17774 Acronym: 122
Sodium Acetate G-Biosciences R010
Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14190-144
Tetrahyofuran Anhydrous (>99.9 %) Sigma Aldrich 401757
Diethyl Ether Anhydrous (>99 %) Fisher Scientific E138-4
DMSO Anhydrous (>99.9 %) Sigma Aldrich 276855
Gelatin Sigma Aldrich G9391
Trypsin-EDTA Invitrogen 25200
D-luciferin GoldBio
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Tissue-Tek 4583
Rat anti-Mouse CD31 BD Pharmingen 550274
Alexa Fluor 594 anti-rat IgG Invitrogen A11007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deveza, L., Choi, J., Yang, F. Therapeutic angiogenesis for treating cardiovascular diseases. Theranostics. 2, 801-814 (2012).
  2. Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3317-3322 (2010).
  3. Mangi, A. A., et al. Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts. Nat Med. 9, 1195-1201 (2003).
  4. Lee, J. Y., et al. Enhancement of bone healing based on ex vivo gene therapy using human muscle-derived cells expressing bone morphogenetic protein 2. Hum. Gene Ther. 13, 1201-1211 (2002).
  5. Park, K. I., et al. Neural stem cells may be uniquely suited for combined gene therapy and cell replacement: Evidence from engraftment of Neurotrophin-3-expressing stem cells in hypoxic-ischemic brain injury. Exp. Neurol. 199, 179-190 (2006).
  6. Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Acc Chem Res. 41, 749-759 (2008).
  7. Yang, F., et al. Gene delivery to human adult and embryonic cell-derived stem cells using biodegradable nanoparticulate polymeric vectors. Gene Ther. 16, 533-546 (2009).
  8. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. J. Vis. Exp. , e1035 (2009).
  9. Ceradini, D. J., et al. Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1. Nat. Med. 10, 858-864 (2004).
  10. Kidd, S., et al. Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging. Stem Cells. 27, 2614-2623 (2009).
  11. Sunshine, J., et al. Small-molecule end-groups of linear polymer determine cell-type gene-delivery efficacy. Adv. Mater. 21, 4947-4951 (2009).
  12. Sunshine, J. C., Akanda, M. I., Li, D., Kozielski, K. L., Green, J. J. Effects of base polymer hydrophobicity and end-group modification on polymeric gene delivery. Biomacromolecules. 12, 3592-3600 (2011).
  13. Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(β-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
  14. Eltoukhy, A. A., et al. Effect of molecular weight of amine end-modified poly(beta-amino ester)s on gene delivery efficiency and toxicity. Biomaterials. 33, 3594-3603 (2012).
  15. Glover, D. J., Lipps, H. J., Jans, D. A. Towards safe, non-viral therapeutic gene expression in humans. Nat. Rev. Genet. 6, 299-310 (2005).
  16. Dave, U. P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Gene therapy insertional mutagenesis insights. Science. 303, 333 (2004).

Tags

Пустое значение выпуск 79 стволовые клетки животные модели биоинженерия (общий) ангиогенез биологически невирусный генная терапия
Стволовые Программирование Клетки для терапевтической ангиогенеза Использование биоразлагаемых полимерных наночастиц
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Keeney, M., Deveza, L., Yang, F.… More

Keeney, M., Deveza, L., Yang, F. Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles. J. Vis. Exp. (79), e50736, doi:10.3791/50736 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter