编程干细胞的治疗性血管新生使用可生物降解高分子纳米微球

Summary

我们描述了编程干细胞的方法，使用可生物降解的聚合物纳米颗粒以过表达的治疗因子的血管生成。所述工艺包括聚合物的合成，转染脂肪来源的干细胞在体外和验证编程的干细胞的功效，以促进血管生成的小鼠后肢缺血模型。

Abstract

控制血管生长是成功的组织再生和伤口愈合，以及用于治疗局部缺血性疾病，如中风，心脏发作，或外周动脉疾病的关键。直接输送的血管生成生长因子具有刺激新血管生长的潜力，但通常与诸如缺乏靶向和半衰期短的体内的局限性有关。基因治疗提供了一种替代的方法通过提供基因编码血管生成因子，但常常需要使用病毒，并通过安全的担忧限制。在这里，我们描述了最近开发的战略，刺激血管生长，通过编程的干细胞使用可生物降解的聚合物纳米粒子以过度血管生成因子原位 。特别是我们的战略，利用其迁移往体内缺血组织能力优势利用干细胞作为运载工具。采用优化的聚合载体，脂肪来源干细胞被修饰而过表达的血管生成的基因，编码血管内皮生长因子（VEGF）。我们描述了用于聚合物的合成中，纳米粒子的形成， 在体外转染的干细胞，以及用于验证的VEGF表达干细胞的功效在鼠后肢缺血模型中促进血管生成的方法的过程。

Introduction

这项技术的总体目标是使用非病毒编程干细胞过表达治疗因素在缺血的部位，以促进治疗性血管新生。用在实验室中合成的可生物降解的纳米颗粒的干细胞进行了修改， 先体外后体内 ，然后再移植到后肢缺血的小鼠模型来验证他们的潜在增强血管生成和组织打捞。

控制血管生长是成功的组织再生的重要组成部分，以及用于治疗各种缺血性疾病，如中风，肢体局部缺血和心肌梗死。多种策略已经被开发，以促进血管生长，包括生长因子递送和基于细胞的疗法^。1尽管在动物疾病模型中观察到的功效，这些方法仍然面临如需要超生理剂量的生长因子递送的限制，或没有足够的旁分泌单靠细胞释放。为克服上述限制的一个潜在策略是结合干细胞治疗和基因治疗，其中的干细胞是基因体内之前的前向移植编程以过表达所需的治疗因子。这种方法已被证明在多种疾病模型包括后肢缺血^2，心脏疾病^3，骨愈合⁴和神经损伤^5， 等等 。然而，大多数的基因治疗技术依赖于病毒载体，这是与安全性问题，例如潜在的免疫原性和插入突变相关联。生物材料介导的非病毒基因递送可以克服这些限制，但通常从低转染效率受到影响。要加快新型生物材料的发现为有效的非病毒基因传递，最近的研究采用组合化学和高通量筛选方法。可生物降解聚合物的库，如聚（β-氨基ES字符）（PBAE）已开发和筛选，从而导致了与显着增强的转染效率比传统的聚合物载体同行领先的聚合物的发现^。6-7

本文中，我们描述PBAE的合成和验证其转染脂肪来源的干细胞（ADSC中） 在体外能力，其次是基因修饰脂肪干细胞在后肢缺血的小鼠模型中过量表达血管内皮生长因子（VEGF）的后续的移植。该结果由追踪细胞命运利用生物发光成像，采用激光多普勒血流灌注成像（LDPI）评估组织灌注，并确定血管生成和组织打捞组织学评价。

Protocol

1。高分子合成

1. 在通风橱中，称出3,523毫克丁二醇酯（C），并转移到装有搅拌棒玻璃闪烁瓶中。
2. 预热5 - 氨基-1 - 戊醇（32）到90℃以溶解盐，然后在通风橱中，称出1533毫克32，并添加到含有C.这种方法的闪烁瓶中，将导致以摩尔比的C：32 = 1:1.2。
3. 马上含有这两种解决方案的小瓶放置到一个搅拌盘。以600rpm设定搅拌速度。
4. 在闪烁瓶中转移到烘箱设定在90℃。设定搅拌速度为1000 rpm离心4小时。如果搅拌棒卡住，降低速度。 4小时后，降低速度至300rpm，并在90℃下保持12-16小时。
5. 添加5克C32的在装有搅拌棒玻璃闪烁小瓶10毫升无水四氢呋喃（THF）。包装在铝箔和涡高至完全溶解。
6. 在一个单独的玻璃闪烁瓶中CONTA伊宁搅拌棒，加10毫Tetraethyleneglycoldiamine的（122）。加入40毫升THF。
7. 广场上的轰动板两个小瓶（C32和122）5分钟，然后结合在了一起。覆盖箔片并在室温下以400rpm的转速进行24小时搅拌离开。最终产物被称作C32-122。
8. 称取5×50毫升猎鹰管，每次5克配料C32-122。注意，在笔记本每个管的质量。
9. 转移30ml无水乙醚中，以每次50ml Falcon管中。
10. 转让10毫升C32-122至每次50毫升猎鹰管。
11. 涡猎鹰管大力然后离心2500转2分钟。注意：该提取的聚合物将收集在试管的底部。
12. 弃去上层溶液，并重复步骤1.9和1.11的2次以上。
13. 将含有该提取C32-122在干燥器和真空通宵开放的管子。确保所有管避光。
14. 称取含C32-122所有的管子，以确定最终质量提取的聚合物。
15. 溶解在无水DMSO提取的聚合物在100毫克/毫升的浓度。
16. 溶解的聚合物储存在-20℃下避光，防潮保护。

2。细胞接种

1. 预涂一个T-150细胞培养瓶中用0.1％（重量/体积）明胶的基极。明胶应该留在烧瓶中30-45分钟。明胶涂层有助于脂肪干细胞的黏附。
2. 抽吸明胶从预涂层的T-150烧瓶中。
3. 添加4×10 ⁶个脂肪干细胞（≤通道3），以含10％FBS，1％青霉素/链霉素和10毫微克/毫升的bFGF烧瓶中在20ml的DMEM。
4. 将T-150烧瓶中，在培养箱中在37℃，5％CO ₂中过夜。
5. 开始转染过程中的第二天。

3。纳米粒子的制备和转染

1. 下面的程序是含有纳米粒子每16.1微克质粒DNA的制备1.0×10 ⁶细胞在聚合物质粒30:1重量比。
2. 稀释质粒DNA（1毫克/毫升，pVEGF165，Aldevron，ND，USA），以在15毫升Falcon管中120微克/毫升的乙酸钠（25毫摩尔）的终浓度。
3. 稀C32-122（100毫克/毫升），以在第二15毫升Falcon管中3.6毫克/毫升的乙酸钠（25毫摩尔）的终浓度。
4. 结合各Falcon管中的内容为紧接高，持续10秒单只15毫升猎鹰管和旋涡。
5. 让所述管在室温下放置10分钟，对纳米颗粒的形成发生。
6. 同时孵化，在组织培养瓶中，7.8毫升完全补充的DMEM每1.0×10 ⁶细胞转染更换培养基。
7. 转移的纳米颗粒溶液到组织培养烧瓶中，并向前倾斜或向后移动，以均匀地分散。
8. 放置在组织培养瓶中在培养箱中在37℃，5％CO ₂的4小时。
9. 2小时后，更换纳米颗粒ticle包含与DMEM培养基。
10. 以下进一步的2小时温育，在37℃，5％CO ₂中，细胞准备用于体内注射。

4。后肢缺血过程

1. 所有实验均按照斯坦福大学动物护理和使用委员会的指导方针和APLAC认可的协议进行的。产生后肢缺血的小鼠模型中进行，如前所述^。8请参考详细说明参考。一个简短的描述如下。
2. 通过吸入和1升/分钟氧气流量将鼠标在麻醉下用1-3％剂量的异氟醚。按捏脚趾，降低呼吸频率，昏睡确保麻醉深度。
3. 从鼠标剃须膏的腹部和后肢两个方面消除头发。
4. 使切口在大腿内侧向中线结构居中，然后通过覆脂肪垫EX切工造成股动脉。
5. 结扎动脉在两个站点：远端部位（靠近膝盖）和近端部位（只是远至腹股沟韧带）。
6. 要创建结扎，从静脉分离动脉，穿入动脉周围5-0丝线缝合。摘下领带动脉有两个结，使结扎。
7. 卸下两个结扎点之间的动脉。
8. 用PBS冲洗手术区，然后缝合切口闭合。
9. 麻醉现在可以移除。按住鼠标热情，直到重新觉醒。对于手术后的护理，2-4毫克/公斤利多卡因可在皮下切口部位注射前重新觉醒。更多的痛苦管理人员可包括皮下交付0.05-0.1毫克/公斤丁丙诺啡在12和24小时。通过观察在改变呼吸方式，明显的疼痛或痛苦，和肤色监测小鼠每天一次的健康状况七天。
10. 通过激光多普勒血流灌注成像确认后肢缺血。

5。细胞注射

1. 当转染的细胞和小鼠都准备好了，洗转染的细胞用PBS，胰蛋白酶消化，离心，再算上。
2. 重悬的细胞以每毫升10×10 ⁶细胞在PBS中的浓度。
3. 细胞悬浮液应在110微升体积被分离成单独的Eppendorf管中。这将确保各小鼠接收单元的量相等。
4. 将每个鼠在麻醉下（2.5％异氟烷，1升/分钟氧气流量）。
5. 清洁注射部位用酒精擦拭。
6. 利用一个27政结核菌素注射器，向上和向下绘制细胞进入注射器，以确保均匀的悬浮液来实现。制定100μl的细胞悬浮液体积的入注射器。
7. 注入一半的细胞悬液放入收肌区域，然后将另一半注入小腿肌肉区域。注射后，留在原地的注射器，至少15-30秒，以防止细胞悬浮液的泄漏。
8. 适当的控制，对于动物研究包括：1）转染的非编码的质粒（ 例如质粒，无生物学活性）的细胞，2）单独的细胞，以及3）的PBS中。
9. 当注射完成后，从麻醉中取出鼠标和御寒，直到鼠标重新醒来。

6。生物发光成像

1. 开始生物发光成像（BLI），麻醉上述老鼠。
2. 清洁注射部位用酒精擦拭。
3. 使用胰岛素注射器，负载100微升15毫克/毫升的D-荧光素（底物为萤火虫荧光素酶）。保持基板避光保存。
4. 要执行腹腔注射，通过它们的背部皮肤保持老鼠拉其前皮肤拉紧。针插入腹腔入腹部，并注入100微升底物。
5. 将鼠标放置在荧光素酶的IVIS成像腔麻醉下。
6. 当获取的图像，标记感兴趣区域来测量荧光素酶的信号。在这种情况下，标记的细胞注射部位的缺血肢体。
7. 继续下去，直到信号达到峰值并开始下降来测量荧光素酶信号每隔3-5分钟。这是用于跨越小鼠和在几个时间点的比较值。
8. 当完成时，从所述腔室和麻醉取出小鼠。养老鼠温暖，直到重新觉醒。

7。激光多普勒灌注成像

1. 激光多普勒灌注成像是如先前所述进行^。8的步骤，这里将简要说明。
2. 在此之前多普勒成像鼠标应该是刮得干净的区域覆盖两个后肢和腹部，防止工件因头发。
3. 当准备多普勒图像，谅解备忘录如上所述，本质上应该被麻醉。
4. 保暖鼠标至36°C上，而由直肠温度计监测体温热板。
5. 将鼠标上的非反射的黑色表面，并通过鼻锥保持麻醉。鼠标应放在其背水面，其四肢暴露均匀。
6. 定位激光多普勒传感器约15厘米以上的小鼠和从对小鼠的腹股沟区域中的传感器将激光指针。
7. 当鼠标和多普勒传感器的位置，图像可以采取利用LDPIwin软件按开始按钮。
8. 相对灌注测量可以采取通过指示两个后肢（缺血性和非缺血性）作为利益区（ROI）。局部缺血的非缺血后肢的平均灌注的比率将指示相对灌注。

8。组织收获过程

1. 当准备收获鼠标那朵控告的组织学和/或生化处理，鼠标应该安乐死。这里，鼠标是通过暴露于5％异氟醚为3-5分钟，然后通过颈脱位安乐死的小鼠处以安乐死。
2. 切割沿圆周方向包围后肢在远端腹部区域和近端后肢上覆皮。皮肤是从腹侧切向背侧表面，使得皮肤能够被拉回在后肢的足。
3. 当提拉肌肤背部，四肢可以利用钝性分离剪刀剪开在骨盆与股骨关节截肢。
4. 两个主要的组织被用于分析：内侧内收肌和腓肠肌肌肉。
5. 对于组织学，在最佳切割温度（OCT）为cryosectioning嵌入一个或两个组织。
6. 用于生化分析，收集一个或两个组织到一个1.5ml离心并浸没入液氮浴中至少2分钟。样品可以是储存于-80℃以备将来处理。

Representative Results

在混合在一起时，带正电荷的聚合物（C32-122）和带负电的DNA质粒自组装成纳米颗粒。纳米粒子的形成可通过电泳分析得到证实，即 C32-122和质粒DNA之间的络合作用将防止在电泳过程中动员的DNA。该聚合物可作为转染试剂，以促进DNA的增强吸收到靶细胞和编码蛋 ​​白质的后续表达（ 图2）。细胞可被转染的任何治疗性基因或报道DNA，例如绿色荧光蛋白（GFP），以方便使用荧光激活细胞分选（FACS）和荧光显微镜（ 图3）的聚合物载体的设计和转染条件下具有高效率的快速优化。对于脂肪干细胞，在20％以上的效率被认为是合适的。

为了便于细胞命运后transplanta跟踪化，细胞可稳定转导的荧光素酶，其允许细胞活力和分布在体内实时监控使用非侵入性生物发光成像（BLI）。 BLI成像显示高强度的发光信号从后肢（ 图4，左图），这表明植入的细胞仍然在注射部位过好几天了，我们不超过21的过程中观察到明显的细胞迁移对其他组织或器官天。在一般的细胞信号减少加班，历时14天（ 图4，右图），这表明大多数移植的细胞可用于治疗过度表达的因素长达2周。

多普勒成像是使血液再灌注的实时监控到缺血肢体的有用工具。 图5的左侧面板中的血流量下诱导缺血的形象代表。暗区表示更迭在手术后血流的sful阻塞。 图5的右侧面板显示与转染细胞治疗14天后，肢体完整的再灌注。

上述技术允许实时量化，并应加上额外的端点分析，以彻底检查治疗效果。已收到移植细胞肌肉组织可以在基因表达和组织学分析不同时间点收获。 RT-PCR可用于定量基因表达的后肢，确认基因上调在转染细胞中几天后移植。 图6示出了未经处理的肢血管内皮生长因子的表达，注射PBS或注射VEGF表达脂肪干细胞。结果证实VEGF上调的非病毒转染的细胞4天移植后，还提供移植细胞的存活的证据。

Histological染色使得组织形态和组织再生的程度直接可视化。可以加上多普勒成像数据的组织学分析，血管密度，以帮助评估血液再灌注的疗效（ 图7）。组织形态染色，如H＆E和马松三色染色是评价组织再生或坏死的程度是有用的。成功新再生的肌肉组织的特征是肌肉细胞与位于中央的细胞核，而坏死组织常常表现出实质性的组织纤维化或炎症细胞如巨噬细胞的数量增加。

图1。示意性示出了合成聚（β-氨基酸）酯（PBAE）基于矢量C32-122（A）的丙烯酸封端C32-AC通过用diacrylat的单体之间的迈克尔加成反应形成的e结束组（C）和与伯胺端基（32）的单体。 （B）的末端改性PBAE聚合物可通过加入胺封端的单体，以提高转染效率来形成。 （C）Tetraethyleneglycoldiamine（122）被选为终端胺单体。 点击这里查看大图 。

图2。原理形成可生物降解聚合物纳米粒子，其随后的细胞的摄取过程中蛋白的表达。

图3。人脂肪源性干细胞过表达的绿色荧光蛋白（GFP）转染，用使用C32-122和GFP的质粒DNA形成聚合物纳米颗粒进行。规模BA记：200微米。

图4。鼠标四肢在第0天（左图）和注射GFP的荧光素酶阳性脂肪来源的干细胞到小鼠后肢后14天（右图）为代表的生物发光成像（BLI）的数据。

图5。代表多普勒图像展示缺血诱导的小鼠后肢在第0天（左图）的一侧，而成功的血液再灌注注射血管内皮生长因子过度表达的脂肪来源的干细胞（右图）后14天。

图6。来确认细胞的存活和编码的治疗因素原位表达，组织可以从注射部位为基因expr的收获易讯网络分析，RT-PCR证实成功上调血管内皮生长因子，编码的治疗性蛋白，治疗组（ADSC-VEGF），细胞注射后第4天的，而没有表达，在PBS对照进行检测。

图7。代表性免疫组化图像展示毛细血管密度由抗-CD31染色，在28天的外科手术后比例尺：100μm左右。

Discussion

在这里，我们报告一个编程成体干细胞利用非病毒，可生物降解纳米粒子过度治疗因素的方法。此平台可用于治疗疾病，其中的干细胞可以自然的家，如局部缺血和癌症中特别有用^。9-10此外，非病毒基因递送平台允许对治疗因素，这是适用于大多数组织再生和伤口瞬时表达愈合过程。转染过程取决于有效的DNA进入细胞时，一般在积极分裂的细胞类型，在非分裂细胞的效果很好，但不为好。 PBAE聚合物的转染效率可以从细胞类型而有所不同细胞类型，并且应该被单独优化，并且进一步的化学结构修饰，可以探索实现特定目标细胞群的最佳转染效率^。11-12转染的细胞用上述方法通常会导致我Ñ​​瞬时基因表达和蛋白分泌的两周，大约有2-4天达到高峰基因的表达。对于动物实验中，脂肪干细胞，用20％以上的转染效率被认为是合适的。我们建议进行FACS分析每一个工艺参数是为了保持一致性（ 如新一批的聚合物，质粒或细胞）改变时间。

相比于市售的转染试剂诸如PEI和阳离子脂质体2000，它是不可降解的，在上述报道的平台中使用的PBAE的聚合物是可生物降解的和更适合于临床的翻译。由于这种聚合物载体是可水解降解¹³和光敏感，应采取谨慎存储PBAE适当的聚合物（-20°C，在黑暗中，用干燥剂），以防止不必要的水解和降解。所得到的聚合物具有分子量分布，和尺寸排阻色谱法（SEC）的米唉进行进一步净化PBAEs与提高转染效率^。14它还建议在高分子合成协议的每个步骤进行核磁共振（NMR）。核磁共振应进行，以确认其各个组成部分形成C32，并再次确认成功除了年底的封端基团，即 122。注意：除了封端基团之后，在丙烯酸酯基团应该消失从NMR谱。过量的胺封端的单体在最终聚合物中的存在可以导致增加的细胞毒性，因此在乙醚充分洗涤最终的聚合物，以确保除去过量的单体，它是重要的。如上所述，SEC，也可以使用进一步纯度的最终产物。

与许多基于病毒的基因递送平台，这里所用的聚合物为基础的基因递送系统不整合到宿主基因组中，从而避免了对的插入米的潜在风险utagenesis和免疫原性^。15-16

在所描述的过程，将细胞移植未经转染的过程，它包含细胞过度编码的蛋白质和未转染细胞的混合物后直接排序。这个过程允许最小的离体操作的单元，并且很可能是给定的时间缩短，成本和污染的机会更多的临床平移。细胞也可以被进一步纯化，以选择转染细胞只以进一步提高治疗性因子原位表达的水平。

编程的干细胞为血管生成的功效，应使用检测的组合来彻底驴的结果在多个级别包括蜂窝，形态和生理检查。生物发光成像能够存活和移植细胞的分布随时间的实时监控。从HARV基因表达分析感兴趣的组织允许核查细胞存活和基因上调的编码因子原位 。组织学染色使血管密度，炎症和组织再生的直接可视化。应该注意的是，增加血管密度并不总是导致成功的血再灌注，为新形成的血管可以是不成熟和非功能性。因此，使用激光多普勒灌注成像来评估新生成的血管的生理功能是非常重要的。虽然上述重点用脂肪干细胞促进血管生成的后肢缺血模型的方法，编程的细胞作为药物运载工具的概念是广泛的适用性。该平台可以很容易地适应编程为过表达是相关于治疗其他疾病，如癌症和肌肉骨骼系统疾病的治疗因子的其它细胞类型。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10082
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B
1,4-Butanediol Diacrylate (90 %)	Sigma Aldrich	411744	Acronym: C
5-amino-1-pentanol (97 %)	Alfa Aesar	2508-29-4	Acronym: 32
Tetraethyleneglycoldiamine >99 %)	Molecular Biosciences	17774	Acronym: 122
Sodium Acetate	G-Biosciences	R010
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14190-144
Tetrahyofuran Anhydrous (>99.9 %)	Sigma Aldrich	401757
Diethyl Ether Anhydrous (>99 %)	Fisher Scientific	E138-4
DMSO Anhydrous (>99.9 %)	Sigma Aldrich	276855
Gelatin	Sigma Aldrich	G9391
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200
D-luciferin	GoldBio
Optimal Cutting Temperature (O.C.T)	Tissue-Tek	4583
Rat anti-Mouse CD31	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 594 anti-rat IgG	Invitrogen	A11007