利用可生物降解的聚合物纳米颗粒编程干细胞以实现治疗性血管生成

摘要

我们描述了一种利用可生物降解的聚合物纳米颗粒使干细胞过表达促血管生成治疗因子的方法。所述过程包括聚合物合成及转染脂肪来源的干细胞 体外以及在小鼠后肢缺血模型中验证程序化干细胞促进血管生成的疗效。

摘要

可控的血管生长对于成功的组织再生和伤口愈合至关重要，同时也可用于治疗缺血性疾病，如中风、心肌梗死或外周动脉疾病。直接递送促血管生成生长因子具有刺激新生血管形成的能力，但常伴随缺乏靶向性和半衰期短等局限性 体内基因治疗通过递送编码促血管生成因子的基因提供了一种替代策略，但通常需要使用病毒载体，且受限于安全性问题。本文描述了一种新近开发的策略，即通过编程干细胞使其过表达促血管生成因子，从而刺激血管生长。 原位 利用可生物降解的聚合物纳米颗粒。具体而言，我们的策略利用干细胞作为递送载体，借助其向缺血组织迁移的能力 体内. 利用优化的聚合物载体，对脂肪来源的干细胞进行修饰，使其过表达编码血管内皮生长因子（VEGF）的促血管生成基因。我们描述了聚合物合成、纳米颗粒形成及干细胞转染的操作流程 体外以及用于验证表达 VEGF 的干细胞在小鼠后肢缺血模型中促进血管生成功效的方法。

引言

该技术的总体目标是利用非病毒方法改造的干细胞，在缺血部位过表达治疗因子，以促进治疗性血管生成。干细胞经过修饰 离体 首先使用实验室合成的可生物降解纳米颗粒，随后在小鼠后肢缺血模型中进行移植，以验证其促进血管生成和组织挽救的潜力。

可控的血管生长是成功实现组织再生的重要组成部分，同时也对治疗多种缺血性疾病（如中风、肢体缺血和心肌梗死）具有重要意义。目前已开发出多种促进血管生长的策略，包括生长因子递送和基于细胞的治疗。¹ 尽管在动物疾病模型中观察到了疗效，但这些方法仍存在一些局限性，例如需要超生理剂量的生长因子递送，或细胞单独作用时旁分泌释放不足。克服上述局限性的一种潜在策略是将干细胞治疗与基因治疗相结合，即对干细胞进行基因工程改造 离体 在移植前过表达理想的治疗因子。该策略已在包括后肢缺血在内的多种疾病模型中得到验证²，心脏病³骨愈合⁴ 和神经损伤⁵, 等等然而，大多数基因治疗技术依赖病毒载体，存在潜在免疫原性和插入突变等安全问题。基于生物材料的非病毒基因递送方法可能克服这些局限，但常面临转染效率低下的挑战。为了加快发现可用于高效非病毒基因递送的新型生物材料，近期研究采用了组合化学与高通量筛选策略。已开发并筛选了可降解聚合物文库，如聚(β-氨基酯)(PBAE)，由此鉴定出若干先导聚合物，其转染效率较传统聚合物....

方案

1. 聚合物合成

1. 在通风橱中，称取 3,523 mg 丁二醇二丙烯酸酯（C），转移至含有搅拌子的玻璃闪烁瓶中。
2. 将 5-氨基-1-戊醇（32）预热至 90 °C 以溶解其盐形式，然后在通风橱中称取 1,533 mg 的 32，并加入含有 C 的闪烁瓶中。此方法将得到 C 与 32 的摩尔比为 1:1.2。
3. 立即将含有两种溶液的闪烁瓶置于搅拌器上，设置搅拌速度为 600 rpm。
4. 将闪烁瓶转移至设定为 90 °C 的烘箱中，以 1,000 rpm 搅拌 4 小时。若搅拌子卡住，可降低转速。4 小时后，将转速降至 300 rpm，并在 90 °C 下继续维持 12–16 小时。
5. 在含有搅拌子的玻璃闪烁瓶中，加入 5 g C32 和 10 ml 无水四氢呋喃（THF）。用铝箔包裹后，高速涡旋至完全溶解。
6. 在另一个含有搅拌子的玻璃闪烁瓶中，加入 10 mM 四乙二醇二胺（122），再加入 40 ml THF。
7. 将两个闪烁瓶（C32 和 122）同时置于搅拌器上搅拌 5 分钟，然后将两者混合。用铝箔包裹，于室温下以 400 rpm 搅拌 24 小时。最终产物称为 C32-122。
8. 为每批 5 g 的 C32-122 准备 5 个 50 ml Falcon 离心管并称重。在实验记录本中记录每个离心管的质量。
9. 向每个 50 ml Falcon 离心管中加入 30 ....

结果

将带正电荷的聚合物（C32-122）与带负电荷的DNA质粒混合后，二者可自组装形成纳米颗粒。可通过电泳分析验证纳米颗粒的形成。 即 C32-122 与质粒 DNA 之间的复合物将阻止 DNA 在电泳过程中的迁移。该聚合物作为转染试剂，可促进 DNA 更高效地进入靶细胞，并实现编码蛋白的后续表达。图2）。可将细胞转染任何治疗基因或报告DNA（如绿色荧光蛋白（GFP）），结合荧光激活细胞分选（FACS）和荧光显微镜技术，高效快速优化聚合物载体设计及转染条件。图3对于ADSCs，转染效率高于20%被认为较为理想。

为了便于追踪移植后细胞的命运，可将细胞稳定转导表达荧光素酶，从而通过非侵入性生物发光成像（BLI）在活体内实时监测细胞的存活状态和分布情况。in vivo 生物发光成像显示，来自后肢的发光信号强度较高（图4，左图），表明植入的细胞在数天内仍保留在注射部位，在21天的观察期内未发现细胞向其他组织或器官明显迁移。总体而言，细胞信号随时间逐渐减弱，.......

讨论

本文报道了一种利用非病毒性、可生物降解的纳米颗粒使成体干细胞过表达治疗因子的编程方法。该技术平台特别适用于干细胞可自然归巢的疾病治疗，如缺血性疾病和癌症。^9-10 此外，非病毒基因递送平台可实现治疗因子的瞬时过表达，适用于大多数组织再生和伤口愈合过程。转染过程依赖于DNA高效进入细胞，在一般情况下，该方法在活跃分裂的细胞类型中效果良好，但在非分裂细胞中效果较差。PBAE聚合物的转染效率因细胞类型而异，需针对不同细胞类型 individually 优化，还可进一步探索化学结构修饰，以在特定靶向细胞群体中实现最佳转染效率。^11-12 采用上述方法转染的细胞通常可实现为期两周的瞬时基因表达与蛋白分泌，基因表达峰值出现在第2至4天左右。对于动物实验，建议选用转染效率高于20%的ADSCs。每次改变实验参数时，均建议进行FACS分析，以保持实验一致性。例如 新的聚合物、质粒或细胞批次

与市面上可获得的非可降解转染试剂（如PEI和Lipofectamine 2000）相比，上述报道平台所使用的PBAE聚合物具有可生物降解性，更适用于.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Invitrogen	11965
胎牛血清	Invitrogen	10082
青霉素/链霉素	Invitrogen	15070
碱性成纤维细胞生长因子	Peprotech	100-18B
1,4-丁二醇二丙烯酸酯 (90 %)	Sigma Aldrich	411744	缩写: C
5-氨基-1-戊醇 (97 %)	Alfa Aesar	2508-29-4	缩写: 32
四乙烯五胺 >99 %)	Molecular Biosciences	17774	缩写: 122
乙酸钠	G-Biosciences	R010
磷酸盐缓冲液	Invitrogen	14190-144
无水四氢呋喃 (>99.9 %)	Sigma Aldrich	401757
无水乙醚 (>99 %)	Fisher Scientific	E138-4
无水DMSO (>99.9 %)	Sigma Aldrich	276855
明胶	Sigma Aldrich	G9391
胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200
D-荧光素	GoldBio
最佳切割温度包埋剂 (O.C.T)	Tissue-Tek	4583
大鼠抗小鼠CD31抗体	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 594 标记的抗大鼠IgG抗体	Invitrogen	A11007