Summary
אנו מתארים את השיטה של תאי גזע תכנות לביטוי יתר גורמים טיפוליים לאנגיוגנזה באמצעות חלקיקים פולימריים מתכלים. תהליכים שתוארו כוללים סינתזת פולימר, transfecting בתאי גזע שמקורם בשומן במבחנה, ומאמת את היעילות של תאי גזע מתוכנתים לקדם אנגיוגנזה במודל איסכמיה hindlimb עכברי.
Abstract
צמיחת כלי דם מבוקרת היא קריטית עבור התחדשות רקמות מוצלחת וריפוי פצעים, כמו גם לטיפול במחלות איסכמי כגון שבץ, התקף לב או מחלות עורקים היקפיים. מסירה ישירה של גורמי גדילת angiogenic יש הפוטנציאל לעורר צמיחת כלי דם חדשה, אבל קשורה לעתים קרובות עם מגבלות כגון חוסר המיקוד וזמן מחצית חיים קצרים בגוף חי. ריפוי גנטי מציע גישה חלופית על ידי אספקת הגנים מקודדים גורמי angiogenic, אבל לעתים קרובות דורש שימוש בוירוס, והוא מוגבל על ידי חששות בטיחות. כאן אנו מתארים את האסטרטגיה שפותחה לאחרונה לעידוד צמיחת כלי דם על ידי תאי גזע תכנות לביטוי יתר גורמי angiogenic באתרו באמצעות חלקיקים פולימריים מתכלים. באופן ספציפי את האסטרטגיה שלנו מנוצל בתאי גזע כאספקת כלי רכב על ידי ניצול של היכולת שלהם נודדות לעבר רקמות איסכמי in vivo. שימוש בווקטורים פולימריים אופטימיזציה, נגזר שומןתאי גזע שונו כדי overexpress גן angiogenic קידוד כלי דם גורם אנדותל צמיחה (VEGF). אנחנו תיארתי את התהליכים לסינתזת פולימר, היווצרות nanoparticle, transfecting תאי גזע במבחנה, כמו גם שיטות לאימות היעילות של תאי גזע המבטא-VEGF לקידום אנגיוגנזה במודל איסכמיה hindlimb עכברי.
Introduction
המטרה הכללית של טכניקה זו היא לקדם אנגיוגנזה הטיפולית שימוש בתאי גזע שאינו באופן ויראלי מתוכנת ביתר גורמים טיפוליים באתר של איסכמיה. תאי גזע שונו vivo לשעבר ראשון באמצעות חלקיקים מתכלים מסונתזים במעבדה, ולאחר מכן הושתלו במודל עכברי של איסכמיה hindlimb כדי לאמת את הפוטנציאל שלהם לשיפור אנגיוגנזה והצלה רקמות.
צמיחת כלי דם נשלט היא מרכיב חשוב של התחדשות רקמות מוצלחת, כמו גם לטיפול במחלות איסכמי שונים, כגון שבץ, איסכמיה איבר, ואוטם שריר הלב. מספר אסטרטגיות פותחו כדי לקדם את הצמיחה של כלי דם, כוללים משלוח גורם גדילה וטיפול מבוסס תאים. 1 למרות היעילות שנצפתה במודלים של בעלי החיים המחלה, שיטות אלה עדיין עומדות בפני מגבלות כגון צורך במינוני supraphysiological למסירת גורם גדילה, או לא מספיק אוטוקרינילשחרר על ידי תאים בלבד. אסטרטגיה פוטנציאלית אחד כדי להתגבר על המגבלות הנ"ל היא לשלב טיפול בתאי גזע וריפוי גנטי, לפיה תאי גזע מתוכנתים גנטי vivo לשעבר לפני השתלה לביטוי יתר גורמים טיפוליים רצויים. גישה זו באה לביטוי במודלים של מחלה שונות, כולל hindlimb איסכמיה 2, מחלות לב 3, ריפוי עצם 4 ופגיעה עצבית 5, וכו '. עם זאת, רוב טכניקות ריפוי גנטי מסתמכות על וקטורים ויראליים, אשר קשור עם חששות בטיחות, כגון immunogenicity הפוטנציאל וmutagenesis insertional. Biomaterials תיווך מסירת הגן אינו נגיפית יכול להתגבר על המגבלות האלה, אבל לעתים קרובות סובלים מיעילות transfection נמוכה. כדי לזרז את הגילוי של חומרים ביולוגיים חדשניים למסירת גן אינו נגיפית יעילה, מחקרים שנעשו לאחרונה הועסקו כימיה קומבינטורית וגישת הקרנת תפוקה גבוהה. ספריות פולימר מתכלים כגון פולי (es β-אמינוters) (PBAE) פותחו והוקרן, שהוביל לגילוי של פולימרים מובילים ביעילות transfection המשופרת במידה ניכרת בהשוואה לעמיתיהם וקטור פולימרים הקונבנציונלי. 6-7
במסמך זה, אנו מתארים את הסינתזה של PBAE והאימות של היכולת שלהם transfect תאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs) במבחנה, ואחרי ההשתלה הבאה של ADSCs גנטי שונה overexpressing כלי דם גורם אנדותל צמיחה (VEGF) במודל עכברי של איסכמיה hindlimb . התוצאות הוערכו על ידי מעקב אחר גורל תא באמצעות הדמיה פליטת אור, הערכת reperfusion רקמות באמצעות ההדמיה זלוף לייזר דופלר (LDPI), וקביעת ההצלה אנגיוגנזה ורקמה על ידי היסטולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פולימר סינתזה
- במנדף, לשקול את 3,523 מ"ג של diacrylate butanediol (C) ולהעביר לבקבוקון נצנץ זכוכית המכיל בר ומערבב.
- טרום חום 5-אמינו-1-pentanol (32) ל90 ° C לsolubilize מלח, ולאחר מכן במנדף, לשקול את 1,533 מ"ג 32 ולהוסיף לבקבוקון הנצנץ המכיל ג שיטה זו תגרום ליחס טוחנת של C: 32 = 1:1.2.
- מייד מניח את הבקבוקון המכיל את שני הפתרונות על גבי צלחת ומערבבים. הגדר את מהירות ומערבבים ב600 סל"ד.
- העבר את בקבוקון הנצנץ לתנור ב90 ° C. מהירות ערבוב מוגדר 1,000 סל"ד במשך 4 שעות. אם בר והמערבב נתקע, להנמיך את המהירות. לאחר 4 שעות, מהירות נמוכה יותר כדי 300 סל"ד ולשמור על 90 מעלות צלזיוס עוד שעה 12-16.
- הוסף 5 גרם של C32 ל10 מיליליטר של tetrahydrofuran נטול מים (THF) בבקבוקון נצנץ זכוכית המכיל בר ומערבב. עוטף בנייר כסף ועל מערבולת גבוהה עד שהיא נמסה באופן מלא.
- בconta בקבוקון נצנץ זכוכית נפרדining בר ומערבב, מוסיף 10 מ"מ של Tetraethyleneglycoldiamine (122). הוסף 40 מיליליטר של THF.
- הנח שני הבקבוקונים (C32 ו122) על צלחת ומערבבים במשך 5 דקות לאחר מכן לשלב ביחד. כסה בנייר כסף ומשאיר בטמפרטורת חדר תוך ערבוב ב400 סל"ד 24 שעות. המוצר הסופי נקרא C32-122.
- לשקול את 5 x 50 צינורות מיליליטר פלקון עבור כל אצווה 5 גרם של C32-122. שים לב למסה של כל צינור במחברת.
- העברת 30 מיליליטר של אתר diethyl נטול מים לכל צינור פלקון 50 מיליליטר.
- העברה 10 מיליליטר של C32-122 לכל צינור פלקון 50 מיליליטר.
- צינורות פלקון וורטקס במרץ אז צנטריפוגות ב 2,500 סל"ד במשך 2 דקות. הערה: הפולימר המופק יאסוף בבסיס של הצינור.
- מחק את הפתרון העליון וחזור על שלבים 1.9 ו1.11 עוד פעמיים.
- מניחים את הצינורות הפתוחים המכילים C32-122 חולצו בייבוש וואקום הלילה. ודא כי כל הצינורות מוגנים מפני אור.
- לשקול את כל הצינורות המכילים C32-122 כדי לקבוע את המסה הסופית שלפולימר שחולץ.
- ממיסים את הפולימר המופק בDMSO נטול מים בריכוז של 100 מ"ג / מיליליטר.
- אחסן את הפולימר המומס ב -20 ° C המוגנים מפני אור ולחות.
2. זריעת תאים
- טרום מעיל הבסיס של בקבוק תרבות רקמת T-150 עם ג'לטין 0.1% (wt / כרך). ג'לטין צריך להישאר בבקבוק במשך 30-45 דקות. ציפוי ג'לטין עוזר הידבקות של ADSCs.
- ג'לטין לשאוב מהבקבוק T-150 המצופה מראש.
- הוסף 4 x 10 6 ADSCs (≤ קטע 3) לבקבוק ב20 מיליליטר של DMEM המכיל 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו10 ng / ml bFGF.
- מניחים את בקבוק T-150 בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לילה.
- תתחיל בהליך transfection ביום המחרת.
3. Nanoparticle הכנה וTransfection
- ההליך הבא הוא עבור ההכנה של חלקיקים המכילים DNA פלסמיד 16.1 מיקרוגרם ל1.0 x 10 6 תאים בפולימר לפלסמיד יחס משקל של 30:1.
- לדלל פלסמיד דנ"א (1 מ"ג / מיליליטר, pVEGF165, Aldevron, ND, ארה"ב) לריכוז סופי של 120 מיקרוגרם / מיליליטר בנתרן אצטט (25 מ"מ) בצינור פלקון 15 מיליליטר.
- לדלל C32-122 (100 מ"ג / מיליליטר) לריכוז סופי של 3.6 מ"ג / מיליליטר בנתרן אצטט (25 מ"מ) בצינור פלקון שני 15 מיליליטר.
- לשלב את התוכן של כל צינורות פלקון לתוך צינור אחד 15 מיליליטר בז ומערבולת באופן מיידי על גבוה עבור 10 שניות.
- בואו הצינור לשבת בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות להיווצרות nanoparticle להתרחש.
- בעוד דוגרים, להחליף בינוני בבקבוק תרבות רקמות עם DMEM בתוספת 7.8 מיליליטר מלא ל1.0 x 10 6 תאים transfected.
- מעביר את פתרון nanoparticle לבקבוק תרבית הרקמה ולהטות קדימה ואחורה כדי להתפשט באופן שווה.
- מניחים את הבקבוק בתרבית רקמה בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 4 שעות.
- לאחר 2 שעות, החלף את nanoparticle מכיל תקשורת עם DMEM.
- בעקבות דגירה 2 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, התאים מוכנים in vivo הזרקה.
4. Hindlimb איסכמיה נוהל
- כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות אוניברסיטת סטנפורד הטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש ופרוטוקולי APLAC אושרו. יצירת המודל העכברי של איסכמיה hindlimb מתבצע כפי שתואר לעיל. 8 אנא עיינו בהתייחסות להוראות מפורטות. תיאור קצר מסופק בהמשך.
- מניחים את העכבר תחת הרדמה עם 1-3% isoflurane מינון על ידי שאיפה וקצב זרימת חמצן של 1 ליטר / דקה. ודא עומק הרדמה על ידי קמצוץ הבוהן, ירידה בקצב נשימה, ועייפות.
- להסיר שיער מאזור הבטן ושני אזורי hindlimb של העכבר עם קצף גילוח.
- לעשות חתך במרכז המדיאלי ירך לכיוון קו האמצע ולאחר מכן חתך את כרית שומן שמעליה לשעברלהוות עורק הירך.
- ולקשור את העורק בשני אתרים: אתר הדיסטלי (קרוב לברכיים) ואתר הפרוקסימלי (דיסטלי רק לרצועה מפשעתי).
- כדי ליצור ligations, להפריד את העורק מהווריד וחוט תפר משי 5-0 סביב העורק. לקשור את העורק עם שני קשרים כדי להפוך את קשירה.
- הסר את העורק בין שתי נקודות קשירה.
- שטוף את אזור הניתוח עם PBS ולאחר מכן תפר את החתך נסגר.
- ניתן להסיר בהרדמה עכשיו. שמור חם העכבר עד ההתעוררות מחודשת. לטיפול שלאחר ניתוח, ניתן להזריק 2-4 מ"ג / קילוגרם לידוקאין תת עורי באתר החתך לפני מחדש התעוררות. ניהול כאב נוסף עשוי לכלול משלוח תת עורית של 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם עצירות ב12 ו24 שעות. לנטר את מצב בריאותם של העכברים פעם ביום למשך שבעה ימים על ידי התבוננות שינויים בדפוס נשימה, כאב או מצוקה גלוי, וצבע עור.
- לאשר איסכמיה hindlimb ידי ההדמיה זלוף דופלר לייזר.
5. זריקות תא
- כאשר תאי transfected והעכברים מוכנים, לשטוף תאי transfected עם PBS, trypsinize, צנטריפוגה, ולאחר מכן לספור.
- Resuspend תאים בצפיפות של 10 x 10 6 תאים למ"ל ב-PBS.
- השעיות תא צריכה להיות מופרדות לתוך צינורות Eppendorf נפרדים בהיקף של 110 μl. זה יבטיח כי כל עכבר מקבל כמות שווה של תאים.
- מניחים כל עכבר תחת הרדמה (isoflurane 2.5%, קצב זרימת L 1 / חמצן דק ').
- נקה את אזור ההזרקה עם מגבוני אלכוהול.
- ניצול מזרק טוברקולין 27 G, לצייר את התאים למעלה ולמטה לתוך המזרק כדי להבטיח השעיה הומוגנית מושגת. צייר את תא ההשעיה הנפח 100 μl לתוך המזרק.
- הזרק מחצית ההשעיה התא לאזור השרירים adductor ואז מזריק את החצי השני לאזור שריר שוק. לאחר הזרקה, השאר את המזרק במקום לפחות 15-30 שניות ללמנוע דליפה של ההשעיה התא.
- בקרות נאותות למחקר בבעלי החיים כוללות: 1) תאים transfected עם פלסמיד ללא קידוד (למשל פלסמיד ללא פעילות ביולוגית); 2) תאים לבד: 3) PBS.
- כאשר זריקות הושלמו, הסר את העכבר מההרדמה ולהתחמם עד מחדש Awakes העכבר.
6. הדמיה פליטת אור
- כדי להתחיל הדמיה פליטת אור (BLI), להרדים עכברים כפי שתואר לעיל.
- נקה את אזור ההזרקה עם מגבוני אלכוהול.
- מזרק ניצול אינסולין, 15 D-וציפרין מ"ג / מיליליטר (המצע לגחלילית בלוציפראז) עומס 100 μl. שמור על מצע מהאור.
- כדי לבצע זריקות intraperitoneal, להחזיק עכברים בעור הגב שלהם כדי למשוך את העור הקדמי שלהם מתוח. הכנס מחט intraperitoneally לאזור הבטן ולהזריק של מצע 100 μl.
- מניחים את העכבר בחדר ההדמיה לוציפראז IVIS תחת הרדמה.
- כאשר התמונה שנרכשה, לסמן את האזור של עניין על מנת למדוד את אות לוציפראז. במקרה זה, תסמן את איבר איסכמי באתר תא ההזרקה.
- המשך למדוד את אות לוציפראז כל דקות 3-5 עד האות מגיע לשיא ומתחיל לרדת. זהו הערך מנוצל להשוואה על פני עכברים ועל פני כמה נקודות זמן.
- כאשר יושלמו, להסיר את העכברים מהאולם וההרדמה. שמור על עכברים חמים עד ההתעוררות מחודשת.
7. לייזר דופלר זלוף הדמיה
- ההדמיה זלוף דופלר הלייזר מתבצעת כפי שתואר לעיל. 8 ההליך מתואר כאן בקצרה.
- לפני דופלר הדמיה העכבר צריך להיות נקי ומגולח באזורים שמעל שניהם hindlimbs ואזור הבטן כדי למנוע חפץ בשל שיער.
- כשהכין לתמונת דופלר, mouצריך להיות מורדם se כפי שתואר לעיל.
- לחמם את העכבר כדי 36 ° C על צלחת חמה תוך ניטור טמפרטורת גוף על ידי מדחום רקטלי.
- הנח את העכבר על משטח שחור שאינו רעיוני ולשמור בהרדמה על ידי חרטום. העכבר צריך להיות ממוקם על פני השטח הגבי שלה עם איבריה החשופים באופן שווה.
- מקם את חיישן הלייזר דופלר בערך 15 ס"מ מעל העכבר ולכוון את מצביע הלייזר מהחיישן כלפי אזור המפשעה של העכבר.
- כאשר סמן העכבר וחיישן דופלר נמצאים בעמדה, ניתן למצוא תמונות של ניצול תוכנת LDPIwin ידי לחיצה על הכפתור 'התחל'.
- מדידות זלוף יחסית יכולים להילקח על ידי המצביע על שתי hindlimbs (איסכמי וללא איסכמי) כאזור של אינטרסים (ROI). היחס של זלוף הממוצע של איסכמי לhindlimb אינו איסכמי יציין זלוף היחסי.
8. רקמת קציר נוהל
- כאשר מוכן tis עכבר קצירלתבוע היסטולוגיה ו / או עיבוד ביוכימיים, צריך להיות מורדמים בעכבר. הנה, את העכבר הוא מורדמים על ידי החשיפה לisoflurane 5% ל3-5 דקות, ולאחר מכן הרדמת חסד העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
- חותכים את העור שמעל מקיף את hindlimb circumferentially באזור הדיסטלי הבטן ופרוקסימלי לhindlimb. העור נחתך מהגחון למשטחי הגב, כך שהעור יכול להיות אסוף מעל hindlimb לכף הרגל.
- על מושך את עור גב, הגפיים יכולים להיות קטועים על ידי ניצול מספריים לנתיחה בוטים לחתוך במפרק האגן וירך.
- שתי רקמות עיקריות נלקחות לניתוח: שרירי adductor המדיאלי ושרירי הגסטרוקנמיוס.
- לבדיקת רקמות, כדי לשבץ את הרקמות אחת או בשתי בטמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) לcryosectioning.
- לאנליזה ביוכימית, לאסוף רקמות אחד או שני למיליליטר Eppendorf 1.5 ולצלול לתוך אמבט של חנקן נוזלי לפחות 2 דקות. הדגימות יכולות להיותמאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס במשך עיבוד עתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר ערבוב יחד, הפולימר החיובי טיעונים (C32-122) וטעון שלילי עצמי מרכיב פלסמיד דנ"א לתוך חלקיקים. היווצרות Nanoparticle ניתן לאשר באמצעות ניתוח אלקטרופורזה כלומר complexation בין C32-122 ופלסמיד דנ"א ימנע התגייסות של ה-DNA באלקטרופורזה. הפולימר משמש כמגיב transfection כדי להקל על ספיגה משופרת של ה-DNA לתוך תאי היעד ואת הביטוי הבא של חלבוני קידוד (איור 2). ניתן transfected תאים עם כל גנים טיפוליים או DNA כתב כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כדי להקל על אופטימיזציה מהירה של תנאים פולימריים וקטור עיצוב וtransfection עם יעילות גבוהה באמצעות תא הקרינה המופעל מיון (FACS) ומיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 3). לADSCs, יעילות מעל 20% נחשבת מתאימה.
כדי להקל על מעקב אחר ההודעה transplanta-גורל התאtion, תאים ניתן transduced ביציבות עם לוציפראז, המאפשר ניטור בזמן אמת של כדאיות תא והפצת in vivo באמצעות הדמיה פליטת אור לא פולשנית (BLI). ההדמיה BLI הראתה אות הארה בעוצמה גבוהה מהגפיים האחורי (איור 4, פנל משמאל), מצביעה על כך שתאים מושתלים נשארים במקום ההזרקה במשך כמה ימים, ואנחנו לא שומרים נדידת תאים מורגשת לכיוון רקמות או איברים אחרים במהלך 21 ימים. אות תא באופן כללי ירידה בשעות נוספת ונמשכה עד 14 ימים (איור 4, פנל מימין), טוענת כי תאים המושתלים ביותר זמינים עבור overexpressing גורמים טיפוליים לתקופה של עד 2 שבועות.
ההדמיה דופלר היא כלי שימושי המאפשר ניטור של reperfusion דם בזמן אמת לאיבר איסכמי. הלוח השמאלי של איור 5 הוא תמונה מייצגת של זרימת דם בעקבות אינדוקציה של איסכמיה. האזור החשוך מציין הצלחהחסימת sful של זרימת דם לאחר הניתוח. הלוח השמאלי של איור 5 מדגים reperfusion של הגפה שלם 14 ימים לאחר טיפול עם תאי transfected.
הטכניקות שתוארו לעיל מאפשרות כימות בזמן אמת, וצריכה להיות בשילוב עם נקודת סיום נוספת מנתח לבחון את היעילות הטיפולית באופן יסודי. רקמות שריר שקיבלו תאים מושתלים יכולות להיות שנקטפו בנקודות זמן שונות לביטוי הגנים וניתוחים היסטולוגית. RT-PCR יכול לשמש כדי לכמת ביטוי גנים בגפיים האחורי כדי לאשר עד ויסות גנטית בתאי transfected כמה ימים לאחר השתלה. איור 6 ניתן לראות ביטוי VEGF באיבר בלתי טופל, מוזרק עם PBS או מוזרק עם VEGF להביע ADSCs . התוצאות מאשרות גברת ביטוי VEGF בתאי transfected לא ויראלי ארבעה ימים לאחר השתלה, המספקות ראיות להישרדות תא מושתלת נוסף.
Histoloמכתים gical מאפשר הדמיה ישירה של מורפולוגיה ותואר של התחדשות רקמות רקמות. ניתוח היסטולוגית לצפיפות כלי דם יכול להיות בשילוב עם נתוני ההדמיה דופלר כדי לסייע להעריך את היעילות של reperfusion דם (איור 7). מכתים מורפולוגיה רקמות כגון H & E וstainings Trichrome של מסון הוא שימושיים להערכת מידת התחדשות רקמות או נמק. רקמת שריר בהצלחה זה עתה מחדש מאופיינת בתאי שריר עם גרעינים במיקום מרכזי, ואילו רקמות נמקים לעתים קרובות להראות סיסטיק רקמות משמעותי או מספר מוגבר של תאים דלקתיים כגון מקרופאגים.
איור 1. סכמטי הממחיש את הסינתזה של פולי אסתר (β-אמינו) (PBAE) מבוססת וקטור C32-122. () Acrylated הסתיים C32-Ac הוקם על ידי תגובה בנוסף מייקל בין מונומר עם diacrylatקבוצות סוף הדואר (C) ומונומר עם קבוצה העיקרית קצה אמין (32). (ב) יכולים להיווצר פולימרים PBAE-End שונה על ידי הוספת מונומרים הופסקו אמין ליעילות transfection משופרת. (C) Tetraethyleneglycoldiamine (122) נבחר כמונומר האמין המסוף. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 2. סכמטי של היווצרות חלקיקים פולימריים מתכלים, והתא הבא שלהם למעלה לקחת תהליך לביטוי חלבון.
איור 3. תאי גזע אנושיים שמקורם בשומן overexpressing חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). Transfection בוצע באמצעות חלקיקים פולימריים נוצרו באמצעות C32-122 ופלסמיד ה-GFP-DNA. תואר ראשון בקנה מידהr: 200 מיקרומטר.
איור 4. נתוני הדמיה פליטת אור נציג (BLI) של הגפיים העכבר ביום 0 (משמאל פנל) ויום 14 (פנל מימין) לאחר הזרקת תאי שמקורם בשומן חיובי GFP-לוציפראז גזע לhindlimb העכבר.
איור 5. נציג תמונות דופלר הוכחת אינדוקציה של איסכמיה בצד אחד של hindlimb העכברי ביום: 0 (פנל משמאל), וreperfusion דם המוצלח 14 ימים לאחר ההזרקה של תאי overexpressing-VEGF-נגזר שומן גזע (פנל מימין).
איור 6. כדי לאשר את הישרדות תא וביטוי היתר של גורמים טיפוליים מקודדים באתר, ניתן לקצור רקמות מאתר ההזרקה לexpr הגןession מנתח. RT-PCR אישר את תקנה מוצלחת של VEGF, החלבון הטיפולי המקודד, בקבוצה שטופלה (ADSC-VEGF) 4 ימים לאחר הזרקת התאים, בעוד שאין ביטוי זוהה בשליטת PBS.
איור 7. תמונת immunohistochemical נציג הוכחת צפיפות נימים על ידי צביעה נגד CD31 ב28 ימים לאחר ההליך הכירורגי בר סולם:. 100 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מדווחים שיטה לתכנת תאי גזע בוגרים לביטוי יתר גורמים טיפוליים באמצעות חלקיקים שאינם נגיפיים, מתכלים. פלטפורמה זו שימושית במיוחד לטיפול במחלות בו תאי גזע באופן טבעי יכולים בבית, כגון איסכמיה וסרטן. 9-10 כמו כן, פלטפורמת מסירת הגן אינו נגיפית מאפשרת לביטוי יתר חולף של גורמים טיפוליים, אשר מתאים למרבית ההתחדשות ופצע הרקמות תהליכי ריפוי. תהליך transfection תלוי בכניסת ה-DNA יעילה לתאים, ובאופן כללי עובד היטב בסוגים באופן פעיל, חלוקת תא, אך לא כמו גם בתאים שאינם מתחלקים. יעילות transfection של הפולימרים PBAE עשויה להשתנות מסוג התא לסוג תא, וצריך להיות מותאם באופן אינדיבידואלי, ושינויי מבנה כימי נוספים עשויים להיחקר על מנת להשיג יעילות transfection אופטימלית באוכלוסיות תאים ממוקדים ספציפיות. 11-12 תאים transfected עם השיטה שתוארה לעיל בדרך כלל תוצאות in ביטוי חולף גן ואת הפרשת חלבון במשך שבועיים, עם ביטוי גני השיא שהושג סביב היום 2-4. לניסויים בבעלי חיים, ADSCs עם יעילות transfection מעל 20% נחשבים מתאים. מומלץ לבצע ניתוח FACS בכל פעם פרמטר תהליך הוא שונה על מנת לשמור על עקביות (אצווה למשל חדש של פולימרים, פלסמידים או תאים).
בהשוואה לחומרים הכימיים המסחרית הזמינים transfection כגון PEI וLipofectamine 2000, שהם אינם מתכלים, הפולימרים PBAE השתמשו בפלטפורמה שדווחה לעיל מתכלים ומתאימים יותר לתרגום קליני. בהתחשב בכך שוקטורי פולימרים כאלה הם hydrolytically מתכלה 13 ורגיש לאור, יש לנקוט זהירות כדי לאחסן פולימרים PBAE כראוי (-20 מעלות צלזיוס, בחושך, עם יבוש) כדי למנוע הידרוליזה והשפלה לא רצויות. יש פולימרים וכתוצאה מחלוקת המשקל מולקולרי, וכרומטוגרפיה הדרת גודל מ '(ה-SEC)איי להתבצע לטהר נוסף PBAEs עם יעילות transfection המוגבר. 14 מומלצת גם לבצע בתהודה מגנטית גרעינית (NMR) בכל שלב בפרוטוקול סינתזת פולימר. NMR יש לבצע כדי לאשר את הקמתה של C32 מהרכיבים הבודדים שלה ושוב כדי לאשר תוספת מוצלחת של סוף מכסת קבוצות כלומר 122. הערה: לאחר תוספת של קבוצות קצה מכסת, קבוצות Acrylate צריכה להיעלם מספקטרום NMR. הנוכחות של מונומרים הופסקו אמין עודפת בפולימר הסופי יכולה להוביל לרעילות תא גדלה, ולכן חשוב לשטוף כראוי פולימר סופי באתר diethyl כדי להבטיח הסרת מונומרים עודפים. כאמור, ה-SEC עשוי לשמש גם כדי לקדם את טוהר המוצר הסופי.
בניגוד לפלטפורמות מסירת הגן מבוסס נגיפיות רבות, מערכת מסירת גן המבוסס על הפולימרים המשמשת כאן לא להשתלב בגנום המארח, ובכך למנוע את הסיכון הפוטנציאלי למ 'insertionalutagenesis וimmunogenicity. 15-16
בהליך המתואר, תאים מושתלים ללא מיון ישירות לאחר תהליך transfection, המכיל תערובת של תאי overexpressing חלבוני קידוד ותאי transfected בלתי. הליך זה מאפשר vivo מניפולציה מינימאלית לשעבר של התאים, והוא צפוי להיות יותר מבחינה קלינית לתרגום ניתנו צמצום זמן, עלות וסיכויים לזיהום. תאים יכולים להיות גם מטוהרים נוספים כדי לבחור תאי transfected רק כדי לשפר את רמת ביטוי היתר של גורמים טיפוליים באתר נוסף.
יעילותם של תאי גזע מתוכנתים לאנגיוגנזה יש לבחון באמצעות שילוב של מבחני כדי להעריך לעומק את התוצאות במספר הרמות כולל סלולארי, מורפולוגיות ופיזיולוגיות. הדמיה פליטת אור מאפשרת ניטור של ההישרדות וההפצה של תאים מושתלים לאורך זמן בזמן אמת. ביטוי גני ניתוחים מהארוורקמות ested לאפשר אימות של הישרדות תא ועד ויסות גנטית של גורמים מקודדים באתרם. צביעה היסטולוגית מאפשרת הדמיה ישירה של צפיפות כלי דם, דלקות והתחדשות רקמות. יש לציין כי צפיפות כלי דם מוגברת לא תמיד מובילה לreperfusion דם המוצלח, ככולים שהוקמו זה עתה יכולים להיות לא בוגרים ולא פונקציונלי. לכן, חשוב להעריך את התפקוד הפיזיולוגי של כלי שנוצרו זה עתה באמצעות ההדמיה זלוף דופלר הלייזר. בעוד שהשיטות לעיל מתמקד בשימוש בתאי גזע שמקורם בשומן כדי לקדם אנגיוגנזה במודל איסכמיה hindlimb, הרעיון של תאי תכנות כמו רכב משלוח סמים הוא החלים רחב. הפלטפורמה עשויה להיות מותאמת בקלות לתכנת סוגי תאים אחרים לoverexpressing גורמים טיפוליים שרלוונטיים לטיפול במחלות אחרות, כגון סרטן ומחלות השלד והשרירים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר איגוד לב האמריקאי הלאומי מדען הפיתוח גרנט (10SDG2600001), סטנפורד Bio-X הבינתחומי יוזמת תכנית, וחוקרי הרפואה של אוניברסיטת סטנפורד תכנית מחקר למימון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10082 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
| 1,4-Butanediol Diacrylate (90 %) | Sigma Aldrich | 411744 | Acronym: C |
| 5-amino-1-pentanol (97 %) | Alfa Aesar | 2508-29-4 | Acronym: 32 |
| Tetraethyleneglycoldiamine >99 %) | Molecular Biosciences | 17774 | Acronym: 122 |
| Sodium Acetate | G-Biosciences | R010 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
| Tetrahyofuran Anhydrous (>99.9 %) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| Diethyl Ether Anhydrous (>99 %) | Fisher Scientific | E138-4 | |
| DMSO Anhydrous (>99.9 %) | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G9391 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| D-luciferin | GoldBio | ||
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) | Tissue-Tek | 4583 | |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rat IgG | Invitrogen | A11007 |
References
- Deveza, L., Choi, J., Yang, F. Therapeutic angiogenesis for treating cardiovascular diseases. Theranostics. 2, 801-814 (2012).
- Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3317-3322 (2010).
- Mangi, A. A., et al. Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts. Nat Med. 9, 1195-1201 (2003).
- Lee, J. Y., et al. Enhancement of bone healing based on ex vivo gene therapy using human muscle-derived cells expressing bone morphogenetic protein 2. Hum. Gene Ther. 13, 1201-1211 (2002).
- Park, K. I., et al. Neural stem cells may be uniquely suited for combined gene therapy and cell replacement: Evidence from engraftment of Neurotrophin-3-expressing stem cells in hypoxic-ischemic brain injury. Exp. Neurol. 199, 179-190 (2006).
- Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Acc Chem Res. 41, 749-759 (2008).
- Yang, F., et al. Gene delivery to human adult and embryonic cell-derived stem cells using biodegradable nanoparticulate polymeric vectors. Gene Ther. 16, 533-546 (2009).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Ceradini, D. J., et al. Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1. Nat. Med. 10, 858-864 (2004).
- Kidd, S., et al. Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging. Stem Cells. 27, 2614-2623 (2009).
- Sunshine, J., et al. Small-molecule end-groups of linear polymer determine cell-type gene-delivery efficacy. Adv. Mater. 21, 4947-4951 (2009).
- Sunshine, J. C., Akanda, M. I., Li, D., Kozielski, K. L., Green, J. J. Effects of base polymer hydrophobicity and end-group modification on polymeric gene delivery. Biomacromolecules. 12, 3592-3600 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(β-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Eltoukhy, A. A., et al. Effect of molecular weight of amine end-modified poly(beta-amino ester)s on gene delivery efficiency and toxicity. Biomaterials. 33, 3594-3603 (2012).
- Glover, D. J., Lipps, H. J., Jans, D. A. Towards safe, non-viral therapeutic gene expression in humans. Nat. Rev. Genet. 6, 299-310 (2005).
- Dave, U. P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Gene therapy insertional mutagenesis insights. Science. 303, 333 (2004).
