Met Click Chemie aan het effect van de virale infectie Meet op Host-cel RNA Synthese

Summary

Deze methode beschrijft het gebruik van klikchemie op veranderingen in gastheercel transcriptie meten na infectie met het Rift Valley fever virus (RVFV) stam MP-12. De resultaten kunnen worden gevisualiseerd kwalitatief via fluorescentie microscopie of verkregen kwantitatief via flowcytometrie. Deze methode kan worden aangepast voor gebruik met andere virussen.

Abstract

Veel RNA virussen zijn geëvolueerd de mogelijkheid gastheercel transcriptie remmen als middel om cellulaire afweer omzeilen. Voor de studie van dergelijke virussen, is het daarom belangrijk om een ​​snelle en betrouwbare manier van meten transcriptionele activiteit in geïnfecteerde cellen. Traditioneel is transcriptie ofwel is gemeten door incorporatie van radioactieve nucleosiden zoals ^3H-uridine gevolgd door detectie via autoradiografie of scintillatietelling, of opname van gehalogeneerde uridine analogen zoals 5-bromouridine (BRU) gevolgd door detectie door immunokleuring. Het gebruik van radioactieve isotopen, vereist echter speciale apparatuur en niet haalbaar in een aantal laboratoria instellingen waarbij de detectie van bru omslachtig kan zijn en lijden aan lage gevoeligheid.

De chemie recent ontwikkelde klik, dat een koper-gekatalyseerde triazool vorming van een azide en een alkyn gaat, biedt nu een snelle en highly gevoelig alternatief voor deze twee methoden. Klikchemie is een tweestaps werkwijze waarbij ontluikende RNA wordt eerst gemerkt door incorporatie van de analoge uridine 5-ethynyluridine (EU), gevolgd door detectie van de label een fluorescent azide. Deze aziden zijn beschikbaar als verschillende fluoroforen, waardoor een breed scala van opties voor visualisatie.

Dit protocol beschrijft een methode om transcriptionele onderdrukking te meten in cellen geïnfecteerd met het Rift Valley fever virus (RVFV) stam MP-12 met behulp van click chemie. Tegelijkertijd wordt de expressie van virale proteïnen in deze cellen bepaald door klassieke intracellulaire immunokleuring. Stappen 1 tot 4 detail van een methode om transcriptionele onderdrukking visualiseren via fluorescentie microscopie, terwijl stap 5 tot 8 detail van een methode om transcriptionele onderdrukking kwantificeren via flowcytometrie. Dit protocol is eenvoudig aanpasbaar voor gebruik met andere virussen.

Introduction

Traditioneel is transcriptionele activiteit werd gemeten door incorporatie van zowel radioactieve ^{(3H-uridine) 1} of gehalogeneerde (BRU) ² nucleosiden in ontluikende RNA. Deze uridine analogen worden door cellen, omgezet in uridine-trifosfaat (UTP) via nucleoside salvage pathway, en vervolgens opgenomen in nieuw gesynthetiseerde RNA. ^3H-uridine kan worden gedetecteerd door autoradiografie, die tijdrovend of scintillatie tellen, die gespecialiseerde apparatuur vereist. Bovendien kan het gebruik van radioactieve isotopen niet praktisch zijn in een aantal laboratoria instellingen, waaronder high containment biosafety laboratoria. Bru kan worden gedetecteerd door immunokleuring met anti-bru antilichamen die hard permeabilisatie noodzakelijk kunnen de toegang van het antilichaam aan de kern of gedeeltelijke denaturatie van RNA, zoals RNA secundaire structuur kan een sterische hindering voor antilichaambinding te verzekeren.

_content "> De hier beschreven protocol maakt gebruik van de recent ontwikkelde chemie op ³ om transcriptionele activiteit te meten in cellen geïnfecteerd met de stam RVFV MP-12. Instructies chemie gebaseerd op een zeer selectieve en efficiënte koper (I)-gekatalyseerde cycloadditie reactie tussen een alkyn en een azide groep ^4,5. In dit protocol ontluikende RNA in geïnfecteerde cellen wordt eerst gemerkt door incorporatie van de uridine analoge EU. In een tweede stap wordt het opgenomen EU gedetecteerd door reactie met een fluorescerende azide. De belangrijkste voordelen van deze werkwijze zijn (1) dat zij niet het gebruik van radioactieve isotopen vereisen en (2) dat het niet hard permeabilisatie of denaturatie van RNA vereisen. met een molecuulgewicht van minder dan 50 Da, toegang van de fluorescerende azide wordt niet belemmerd door onvoldoende permeabilisatie of RNA secundaire structuur. Bovendien zijn de onderzoekers niet beperkt in hun keuze van primaire antilichamen bij het combineren van de detectie van RNA met een klasical immunostaining voor virale eiwitten.

Twee verschillende werkwijzen zijn in dit protocol: een voor visualiseren transcriptie via fluorescentiemicroscopie (stappen 1-4), en een voor het kwantificeren transcriptie door flowcytometrie (stappen 5-8). Beide methoden combineren coderen van ontluikende RNA met intracellulair immunokleuring voor virale eiwitten, die zorgt voor een verband tussen transcriptionele activiteit en virale infectie van een cel per cel basis.

De auteurs hebben met succes het protocol beschreven om transcriptionele activiteit te bepalen in cellen geïnfecteerd met de stam RVFV MP-12 ^6, cellen geïnfecteerd met verschillende MP-12 mutanten ^{7,8, 9} en cellen geïnfecteerd met virus Toscana (TOSV) ^10. De hier beschreven protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met verschillende virussen en heeft het potentieel om te worden aangepast om immunofluorescentie kleuring van specifieke virale of cellulaire eiwitten omvatten.

Protocol

Analyse van transcriptie bij fluorescentiemicroscopie

1. Infecteren cellen met MP-12 en Label ontluikende RNA met EU

1. Plaats 12-mm round dekglaasjes in 12-well weefselkweek plaat, een dekglaasje per putje.

Opmerking: Als cellen hebben moeite zich te houden aan dekglaasjes, jas met poly-L-lysine (MW ≥ 70.000) voordat u het in putten. Hiertoe dompel dekglaasjes in een steriele 0,1 mg / ml oplossing in _H2O van poly-L-lysine gedurende 5 minuten. Spoel coverslips met steriele H ₂ O en de lucht drogen gedurende minstens 2 uur.

2. Om zaad 293-cellen op dekglaasjes, voeg 5 x 10 ⁴ cellen in 1 ml groeimedium (DMEM dat 10% foetaal bovien serum, 100 U / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine) per putje. Incubeer in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO ₂ O / N.
3. Cellen infecteren met MP-12 bij een multipliciteit van infectie (moi) van 3. Ten minste twee geïnfecteerde putten: een van de twee putten zal dienen als de niet-geïnfecteerde controle, zal de ander worden behandeld met actinomycine D (ActD) bij stap 1.5 als controle voor transcriptionele onderdrukking. Verwijder groeimedium en los het virus stock zodat het totale volume toegevoegd aan elk putje wordt 200 ml. Incubeer gedurende 1 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% _CO2.

Opmerking: In plaats van het infecteren van cellen, kunnen cellen worden getransfecteerd met plasmide DNA of in vitro gesynthetiseerd RNA coderend voor een specifieke virale eiwit. Hiertoe cellen te transfecteren met een geschikt chemisch transfectie reagens volgens de instructies van de fabrikant en verdergaan naar stap 1.5 op 16 uur na transfectie. Het is raadzaam om de transfectie voorwaarden en incubatietijd optimaliseren voordat RNA etikettering en fixatie.

4. Verwijderen inoculum en voeg 1 ml vers groeimedium per well. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 uur.

ove_content ">. Opmerking: Als de aanpassing van deze protocol voor gebruik met een ander virus, is het raadzaam om een tijdsverloop experiment uit te voeren om het optimale tijdstip voor RNA etikettering en fixatie bepalen Stel dit tijdsverloop, zodat de infectie tijden zijn gespreid en al monsters kunnen worden gelabeld, gefixeerd en gekleurd op hetzelfde moment.

5. Op 15 uur na infectie (hpi), vervang groeimedium met medium dat 1 mM EU. Om een ​​van de mock geïnfecteerde putten, ook 5 ug / ml ActD voegen. Dit zal dienen als controle voor transcriptionele onderdrukking, zoals ActD remt DNA-afhankelijke RNA-synthese. Cellen terug in de incubator.
6. Op 16 hpi, verwijder het medium en een keer was de dekglaasjes met 1 ml PBS (KCl 0,20 g / L, KH ₂ PO ₄ 0,20 g / L, NaCl 8,00 g / L, Na ₂ HPO ₄ 1,15 g / L, pH 7,4) per putje. Fix cellen door toevoeging van 1 ml van 4% paraformaldehyde (PFA) per putje en het incuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Opmerking: Voor 4% PFA fixatie oplossing te bereiden, los 10 g paraformaldehyde in 150 ml H ₂ O verwarmd tot 60 ° C op een verwarmde magneetroerder. Voeg 500 ul van 1 M NaOH en blijf roeren totdat de oplossing helder wordt. Filter PFA oplossing door een papieren filter om deeltjes te verwijderen en voeg 62,5 ml fosfaatbuffer (77 mM NaH ₂ PO _4, 287 mM Na ₂ HPO _4, pH 7,4). Voeg H ₂ O tot een totaal volume van 250 ml. Bevriezen bij -20 ° C in aliquots eenmalig gebruik.

7. Was eenmaal met 1 ml PBS per well. Geen incubatietijd voor deze en alle daaropvolgende wasstappen. Gaat u direct naar stap 2.

Opmerking: Het is belangrijk om onmiddellijk met de click reactie, zoals de RNA degenereert indien bewaard in dit stadium voor langere tijd, een verlies van de RNA fluorescentiesignaal bestaat reeds als cellen gedurende 1 uur bij 4 ° C . Evenzo, als perde vorming van een tijdsverloop experiment, moet u het etiket, repareren, en vlekken alle monsters tegelijk.

2. Klik op Reactie op Detect gelabelde RNA

1. Permeabilize cellen door toevoeging van 1 ml 0,2% Triton X-100 in PBS. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Opmerking: Alle oplossingen in stappen 2,1-2,3 moeten nuclease vrij.

2. Spoel driemaal met 1 ml PBS per well.
3. Verwijder de dekglaasjes van 12-well plaat en de overdracht in de vochtige kamer. Bedek elk dekglaasje met 50 - 100 ul klik kleuring oplossing (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM _CUSO4, 20 uM fluorescerende azide [excitatie / emissie maximaal: 590/617 nm], 100 mM ascorbinezuur) elk. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.

Opmerking: Om de vochtige kamer, lijn assembleren de bodem van een celkweek of een petrischaal met een diameter van 10 cm met plastic folie paraffine. Bekleed de binnenkant van de rand van de dish met vochtige papieren handdoeken. Plaats de dekglaasjes op de plastic paraffine folie.

Opmerking: Wees voorzichtig niet te laten de dekglaasjes uitdrogen tijdens deze of een andere stap in het protocol. Het beste is om de kleuroplossing elk dekglaasje direct nadat deze is geplaatst in de vochtige kamer voegen.

Opmerking: Maak de klik kleuroplossing verse onmiddellijk voorafgaand aan deze stap. Voorraadoplossingen van 1,5 M Tris pH 8,5, 100 mM _CUSO4 en 500 mM ascorbinezuur kunnen bij 4 ° C worden bewaard Echter, moet u alle ascorbinezuur voorraad oplossing die geel is geworden.

Opmerking: Zorg ervoor dat u een fluorofoor die overeenkomt met de filters op uw fluorescentiemicroscoop selecteren.

4. Verwijder de dekglaasjes van vochtige kamer en plaats in een frisse 12-well plaat en drie keer wassen met 1 ml PBS per well.

Opmerking: Als er geen debescherming van virale eiwitten gewenst, dekglaasjes worden gemonteerd afgebeeld na deze stap (ga naar stap 3.3).

3. Immunofluorescentie tot Expressie van virale eiwitten Detect

1. Voeg 1 ml blokkerende buffer (3% (w / v) runderserumalbumine (BSA) in PBS) aan elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
2. Verwijder de dekglaasjes van 12-well plaat, overdracht in vochtige kamer en dek af met 50 - 100 ul van primair antilichaam (anti-RVFV, een soort geschenk van dr. RB Tesh, UTMB) verdund in het blokkeren van buffer (1:500). Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.

Opmerking: Bij de aanpassing van het protocol voor gebruik met een ander virus, de optimale verdunning van het primaire antilichaam eerste.

Opmerking: Als alternatief kan deze stap worden uitgevoerd O / N bij 4 ° C in het donker.

3. Verwijder de dekglaasjes van vochtige kamer en plaats terug in 12-well plaat en wassendrie maal met 1 ml PBS per putje.
4. Verwijder de dekglaasjes van 12-well plaats, plaats in de vochtige kamer en dek af met 50 - 100 ul van secundair antilichaam (anti-muis IgG geconjugeerd met fluorescente kleurstof [excitatie / emissie maximaal: 495/519 nm]) verdund in het blokkeren van buffer (1: 500). Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.

Opmerking: Zorg ervoor dat u een secundair antilichaam dat uw primaire antilichaam kan herkennen en past de filters op uw fluorescentiemicroscoop selecteren.

Opmerking: Indien gewenst, kan 200 ng / ml DAPI worden toegevoegd aan het secundaire antilichaam verdunning kernen visualiseren.

5. Verwijder de dekglaasjes van vochtige kamer en plaats terug in 12-well plaat en drie keer wassen met 1 ml PBS per well.
6. Monteren dekglaasjes door het plaatsen van een druppel (ca. 15 pl) van Fluoromount-G op een objectglaasje. Dompel de dekglaasje in H ₂ O, verwijder overtollige H ₂ O door het aanraken van the kant tegen een papieren handdoek, en plaats cel-kant naar beneden in de druppel Fluoromount-G. Lucht drogen gedurende 5 minuten.

Opmerking: Als beeldvorming op een omgekeerde microscoop, zodat Fluoromount-G te stollen bij 4 ° CO / N of brengt de dekglaasjes om de microscoop dia door het afdichten van de rand met transparante nagellak.

Opmerking: Dia kan onmiddellijk worden afgebeeld of opgeslagen bij 4 ° C in het donker gedurende een week.

4. Overname van gegevens

1. Beeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Opmerking: Zorg ervoor dat geschikte fluoroforen die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van uw microscoop te selecteren. Ter referentie, de volgende zijn de fluoroforen en filter sets gebruikt om de afbeeldingen in deze publicatie te verwerven.

DAPI:
Excitatiefilter: BP 330-385
Dichromatic spiegel: 400 DM
Emissiefilter: LP 420

Excitatiefilter: BP 460-490
Dichromatic spiegel: 505 DM
Emissiefilter: LP 510

Fluorofoor met een excitatie / emissie maximum van 590/617:
Excitatiefilter: BP 545-580
Dichromatic spiegel: 600 DM
Emissiefilter: LP 610

Analyse van transcriptie bij flowcytometrie

5. Infecteren cellen met MP-12 en Label ontluikende RNA met EU

1. Seed 293 cellen in 6-well weefselkweek plaat in groeimedium (DMEM dat 10% foetaal runderserum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine). Incubeer in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% _CO2 totdat cellen 80 bereikt - 100% confluentie.
2. Cellen infecteren met MP-12 bij een moi van 3. Ten minste twee geïnfecteerde putjes: een van de twee putjes zal dienen als de niet-geïnfecteerde controle, de andere behandeld met ActD in stap5.4. Verwijder groeimedium en verdun het virus voorraad, zodat het totale volume toegevoegd aan elk putje wordt 400 ul. Incubeer gedurende 1 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% _CO2.
3. Verwijderen inoculum en voeg 2 ml vers groeimedium per well. Incubeer bij 37 ° C gedurende 12 uur.

Opmerking: Als het protocol aanpassen voor gebruik met een ander virus, is het raadzaam om een tijdsverloop experiment om het optimale tijdstip te bepalen voor het coderen en oogsten voeren. Zet dit tijdsverloop waardoor de infectie tijd worden gespreid en alle monsters kunnen worden gelabeld, geoogst en gekleurd tegelijkertijd.

4. Op 12 hpi, vervang groeimedium met medium dat 0,5 mM EU. Om een ​​van de mock geïnfecteerde putten, ook 5 ug / ml ActD voegen. Dit zal dienen als controle voor transcriptionele onderdrukking, zoals ActD remt DNA-afhankelijke RNA-synthese. Cellen terug in de incubator.
5. Op 13 hpi, wassen cellen eenmaal verstandh PBS en oogst door behandeling met trypsine van cellen. Wassen geoogste cellen driemaal met PBS bevattende 1 mM EDTA (PBS-EDTA).

Opmerking: Tijdens deze en volgende stappen, niet cellen gecentrifugeerd sneller dan 500 - 1000 xg naar cel breuk te voorkomen. Centrifugeer cellen voor 1 - 2 min. aan sediment.

Opmerking: Als een oppervlak immunostaining is gepland na de klik reactie, oogst met een rubberen politieman of wegwerp celschraper plaats.

6. Fix cellen door resuspenderen in 1 ml van 4% PFA en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Zie stap 1.6 voor instructies over hoe te bereiden 4% PFA.
7. Was eenmaal met 1 ml PBS-EDTA per well. Gaat u direct naar stap 6.

Opmerking: Het is belangrijk om direct door te gaan met de klik reactie, zoals de RNA degenereert als het wordt bewaard in dit stadium voor langere tijd. Evenzo, als het uitvoeren van een tijd course experiment, er zeker van te labelen, repareren en vlekken op alle monsters tegelijk.

6. Klik op Reactie op Detect gelabelde RNA

1. Permeabilize cellen door resuspenderen in 0,5 ml 0,2% Triton X-100 in PBS. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Opmerking: Alle oplossingen die gebruikt worden in de stappen 6,1-6,3 moeten nuclease vrij te zijn.

Opmerking: Als cellen niet goed sediment tijdens deze stap, verhogen de tijd centrifugeren 5 minuten. Sedimentatiegedrag zal verbeteren in een keer cellen worden gesuspendeerd in FACS-buffer (stap 6.4).

2. Was eenmaal met 1 ml PBS.

Opmerking: EDTA niet gebruiken in deze stap, omdat dit zal cheleren de ^{Cu2 +-ionen} die noodzakelijk zijn voor de click reactie.

3. Resuspendeer cellen in 200 pi klik kleuring oplossing (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM _CUSO4, 200 nM azide gelabeld met fluorescerende kleurstof [excitation / emissie maximaal: 650/665 nm], 100 mM ascorbinezuur). Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.

Opmerking: Maak de klik kleuroplossing verse onmiddellijk voorafgaand aan deze stap. Voorraadoplossingen van 1,5 M Tris pH 8,5, 100 mM _CUSO4 en 500 mM ascorbinezuur kunnen bij 4 ° C worden bewaard Echter, moet u alle ascorbinezuur voorraad oplossing die geel is geworden.

Opmerking: Als cellen samenklonteren tijdens deze stap, resuspendeer door en neer te pipetteren meerdere malen.

Opmerking: Zorg ervoor dat u een fluorofoor die kan worden gedetecteerd door uw flowcytometer selecteren.

Opmerking: Bereid ook een monster van geïnfecteerde cellen die niet zijn onderworpen aan de klik kleuring procedure, die nodig zijn voor de kalibratie van de flowcytometer. Gebruik ofwel de helft van de geïnfecteerde cellen of voorzien van een extra goed geïnfecteerd bij stap 5.2. Deze concontrole cellen worden immunologisch bij stap 7.1.

4. Was tweemaal met FACS buffer (PBS met 1 mM EDTA en 0,5% (w / v) BSA).

Opmerking: Indien geen immunokleuring van virale eiwitten gewenst is, kunnen cellen worden meteen geanalyseerd (door naar stap 8).

7. Immunofluorescentie tot Expressie van virale eiwitten Detect

1. Resuspendeer cellen in 200 ul van primair antilichaam (anti-RVFV) verdund in FACS buffer (1:10.000) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.

Opmerking: Als alternatief kan deze stap worden uitgevoerd O / N bij 4 ° C in het donker.

Opmerking: Bereid ook een monster van geïnfecteerde cellen die werden blootgesteld aan de klik kleuringsprocedure maar niet immunologisch, zullen deze nodig zijn voor de kalibratie van de flowcytometer. Gebruik ofwel de helft van de mock geïnfecteerde cellen of voorzien van een extra niet-geïnfecteerde goed opstap 5.2.

Opmerking: Bij de aanpassing van het protocol voor gebruik met een ander virus, de optimale verdunning van het primaire antilichaam eerste.

2. Was tweemaal cellen in FACS buffer.
3. Resuspendeer cellen in 200 pl secundair antilichaam (anti-muis IgG geconjugeerd met fluorescente kleurstof [excitatie / emissie maximum: 495/519 nm]) verdund in FACS buffer (1:1000) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
4. Was de cellen eenmaal in FACS buffer.

Opmerking: Op dit punt, kunnen cellen worden opgeslagen O / N bij 4 ° C in het donker.

8. Overname van gegevens

1. Resuspendeer cellen in 500 pi FACS buffer, overdracht in 5 ml polystyreen buizen en analyseren met behulp van een flowcytometer. Gebruik MP-12 geïnfecteerde cellen (geen klik reactie, anti-RVFV alleen kleuring) en mock-geïnfecteerde cellen (klik enige reactie) om het instrument te kalibreren.

Niete: Zorg ervoor dat geschikte fluoroforen die kunnen worden gedetecteerd door het instrument te selecteren. Ter referentie, de volgende zijn de laserlijnen en filter sets gebruikt om de in deze publicatie gegevens te verkrijgen.

Fluorofoor met een excitatie / emissiespectrum van 495/519:
Laser: 488 nm
Filter: 530/30

Fluorofoor met een excitatie / emissiespectrum van 650/665:
Laser: 640 nm
Filter: 670/20

Representative Results

De NSS eiwit van RVFV (Bunyaviridae familie, genus Phlebovirus) ¹¹ remt gastheercel algemene transcriptie via twee verschillende mechanismen: (i) door het sekwestreren p44 subeenheid van de basale transcriptiefactor TFIIH ¹¹ en (ii) bevordering van de proteasomale afbraak van p62 subeenheid van TFIIH ^6. De RVFV MP-12 vaccinspanning ¹³ is gebruikt voor de in dit protocol beschreven experimenten sinds MP-12 stam kan worden behandeld in een bioveiligheidsniveau 2 laboratorium en wordt uitgesloten van de select-agent regel in de VS, die van toepassing is op andere wilde- Typ RVFV stammen. De NSS eiwit van MP-12 stam is volledig functioneel en het vermogen behoudt om gastheer transcriptie ⁶ onderdrukken. Het virus RMP12-C13type, die een deletie omvat 69% van de NSS-gen ¹⁴ draagt, is opgenomen als controle virus dat alle NSs functies, inclusief de mogelijkheid om gastheercel transcriptie onderdrukken.

Figuur 1 toont beelden verkregen met behulp van fluorescentie microscopie. In mock geïnfecteerde cellen (figuren 1a-1d), kernen lijken helder rood vanwege aanhoudende transcriptie. Omdat cellen alleen gelabeld met EU 1 uur, gevolgd door onmiddellijke fixatie meeste RNA blijven de kern. Daarentegen, wanneer cellen zijn behandeld met ActD tot farmacologisch transcriptie (figuur 1e-1h) remmen de rode fluorescentie van kernen wordt duidelijk verminderd. Deze fluorescentie wordt eveneens verlaagd wanneer de cellen geïnfecteerd met MP-12 (Figuren 1n-1q), maar niet met de NSS deletiemutant RMP12-C13type (Figuren 1i-1m). Figuur 2 toont ook beelden die door fluorescentiemicroscopie, maar hier cellen werden getransfecteerd met in vitro gesynthetiseerde mRNA plaats van infectie met levend virus. Wanneer de cellen werden getransfecteerd met GFP mRNA codeert (figuur 2g-2i), geen verandering in transcriptional activiteit vergeleken met getransfecteerde cellen (figuren 2a-2c), zoals gevisualiseerd door rode fluorescentie in de kernen, kan worden gedetecteerd. Alleen transfectie met mRNA coderend voor het RVFV virulentie factor NSs (figuren 2k-2m) resulteert in een verminderde rode fluorescentie.

Figuur 3A toont kwantitatieve gegevens verkregen door flow cytometrie. De gegevens worden weergegeven als spreidingsdiagrammen met fluorescent signaal voor EU inbouw in wording RNA uitgezet op de y-as en die voor anti-RVFV kleuring uitgezet op de x-as. Het kwadrant poorten waren zo ingesteld dat de meerderheid van de mock geïnfecteerde cellen was gelegen in het kwadrant linksboven, werd de meerderheid van ActD behandelde cellen zich in het kwadrant linksonder, en de meerderheid van de geïnfecteerde cellen was gelegen in de rechterhelft van het perceel . Wanneer cellen werden geïnfecteerd met MP-12, 81,5% van de totale cellen, of 93% van de anti-RVFV positieve cellen vertoonden verminderde transcriptionele activiteit. In tegenstelling, when-cellen werden geïnfecteerd met RMP12-C13type, 91,6% van de totale cellen, of 97% van de anti-RVFV positieve cellen vertoonden transcriptionele activiteit die vergelijkbaar is met mock geïnfecteerde cellen was. Figuur 3B toont dezelfde gegevens als figuur 3A in de vorm van een histogram van fluorescentie RNA labelen met de EU-integratie.

Figuur 1. Fluorescentie microscopie van cellen geïnfecteerd met MP-12 en RMP12-C13type. 293-cellen werden mock geïnfecteerd of geïnfecteerd met ofwel MP-12 of de NSS deletiemutant rMP-12-C13type. Tussen 15 en 16 hpi, werden cellen gelabeld met 1 mM EU. Als controle voor transcriptionele onderdrukking, werden onecht geïnfecteerde cellen behandeld met 5 mg / ml ActD gelijktijdig met de EU behandeling. Kernen gevisualiseerd door DAPI kleuring (blauw), expressie van virale eiwitten gevisualiseerd door kleuring met anti-RVFV antilichamen (groen) en RNA visualiserend door detectie van de opgenomen EU azide gelabeld met fluorescente kleurstof (excitatie / emissie maximum: 590/617 nm) (rood).

Figuur 2. Fluorescentiemicroscopie van cellen getransfecteerd met in vitro gesynthetiseerde RNA voor zowel GFP of MP-12 NSS. 293-cellen mock getransfecteerd of getransfecteerd met in vitro gesynthetiseerde RNA coderend voor zowel GFP of MP-12 NSS. Tussen 15 en 16 uur na de transfectie, werden cellen gelabeld met 1 mM EU. Als controle voor transcriptionele onderdrukking, werden schijn-getransfecteerde cellen behandeld met 5 mg / ml ActD gelijktijdig met de EU behandeling. De expressie van GFP wordt gevisualiseerd door kleuring met anti-GFP antilichaam (gi), de expressie van NSS gevisualiseerd door kleuring met anti-RVFV antilichamen (af, km) gevolgd door anti-muis IgG geconjugeerd met fluorescente kleurstof (excitatie / emissie maximum: 495/519 nm) (groen), en RNA wordt gevisualiseerd door detectie van de opgenomen EU met azide gelabeld met fluorescerende kleurstof (excitatie / emissie maximaal: 590/617 nm) (rood).

Figuur 3. (A) Flowcytometrische analyse van cellen geïnfecteerd met MP-12 of RMP12-C13type. Cellen waren mock geïnfecteerd of geïnfecteerd met ofwel MP-12 of RMP12-C13type. Tussen 12 en 13 hpi, werden cellen gelabeld met 0,5 mM EU. Als controle voor transcriptionele onderdrukking, werden schijn-getransfecteerde cellen behandeld met 5 ug / ml ActD gelijktijdig met de EU behandeling. Expressie van virale eiwitten gevisualiseerd door kleuring met anti-RVFV antilichamen gevolgd door een secundair antilichaam gelabeld met fluorescente kleurstof (excitatie / emissie maximum: 495/519 nm) (anti-RVFV) en RNA gevisualiseerd door detectie van de opgenomen EU azide gelabeld met fluorescerende kleurstof (excitatie / emissie maximaal: 650/665 nm) (RNA). De DAT-een wordt voorgesteld als een scatterplot. (B) Vertegenwoordiging van dezelfde gegevens getoond in A als een histogram. Fluorescentie intensiteit EU opname is uitgezet op de x-as Telling van de cellen uitgezet op de y-as. hier grotere afbeelding te bekijken .

Discussion

De protocol beschrijft een methode om het effect van virale infecties aan gastheercel transcriptie gemeten via incorporatie van de uridine analoge EU in wording RNA. Deze werkwijze heeft verschillende voordelen ten opzichte van eerdere methoden: het is snel, gevoelig, en niet afhankelijk van het gebruik van radioactieve isotopen. Verder kan de werkwijze worden aangepast om kwalitatieve gegevens opleveren door fluorescentiemicroscopie of kwantitatieve gegevens via stroomcytometrie door toepassing van vrijwel dezelfde reagentia. In combinatie met immunofluorescentie kleuring voor virale antigenen, deze werkwijze kan ook de onderzoeker differentiëren besmet door geïnfecteerde cellen.

Het is belangrijk op te merken dat deze methode labelt ook nieuw gesynthetiseerde virale RNA in hetzelfde tempo als het labelt gastheer transcripties, een nadeel dat wordt gedeeld met andere methoden te vertrouwen op ³ H-uridine of Bru incorporatie. Althans bij RVFV MP-12 infectie, echter hebben wij gevonden dat de amount van gastheer transcripten met veel groter dan het aantal virale transcripten, en dus de invloed van viraal RNA van totaal RNA gemeten van deze assay is verwaarloosbaar. Bij de aanpassing van dit protocol voor gebruik met een ander virus, kan onderzoekers willen virale transcripten te identificeren, hetzij door hun lokalisatie, door de behandeling van geïnfecteerde cellen met ActD, of al fluorescente in-situ hybridisatie (FISH) ^15. Als het virus repliceert in het cytoplasma, zoals MP-12, dan viraal RNA gemakkelijk worden onderscheiden van cellulair RNA, dat meestal nog aanwezig is in de kern na 1 uur van labeling. Geïnfecteerde cellen kunnen ook worden behandeld met ActD tot gastheercel transcriptie onderdrukken terwijl viraal RNA synthese beïnvloed. ActD functioneert door binding aan dubbelstrengs DNA ¹⁶ en remt daarom alleen DNA-afhankelijke transcriptie, maar heeft geen effect op viraal RNA-afhankelijke RNA polymerasen.

Bij het uitvoeren van dit protocol, is het essentieel om te voorkomencontaminatie met nucleasen tussen de permeabilisatie en de klik labelingsreactie, als EU-gelabelde RNA blijft gevoelig voor degradatie door RNases ^3. Bovendien moet onderzoekers onmiddellijk naar de klik labelingsreactie, zoals verlengde incubatietijden tussen vastlegging en klik labeling reactie zelfs bij 4 ° C, leidt tot afbraak van RNA en uiteindelijk resulteren in een verlies van RNA fluorescentiesignaal. Dit is van bijzonder belang bij het uitvoeren tijdsverloop experimenten, onderzoekers moeten hun experimenten zodat alle cellen kunnen worden gelabeld, gefixeerd en gekleurd tegelijkertijd ontwerpen. Gelukkig is de RNA fluorescentiesignaal stabiel na de klik labelingsreactie, zodat het protocol kan gemakkelijk worden stopgezet na deze stap.

Tenslotte moeten onderzoekers in gedachten houden dat het cytopathische effect (CPE) veroorzaakt door vele virussen negatieve invloed cellulair RNA synthese zelfs in afwezigheid van een specifieke transcriptionele onderdrukking. HetDaarom moeten transcriptionele activiteit te meten in een tijd na infectie wanneer cellen nog levensvatbaar zijn. Als een mutant virus is beschikbaar die het vermogen om transcriptie, zoals rMP-12-C13type (figuren 1 en 3) te onderdrukken mist, kan dit een groot hulpmiddel bij het ​​bepalen van het optimale tijdstip voor het meten van transcriptie zijn.

Wanneer zij een groot aantal experimenten zou onderzoekers willen direct merken van hun primaire antilichaam te behandelen met een fluorochroom ^17, waardoor de noodzaak voor een tweede antilichaam en het verminderen van de tijd die nodig is voor de detectie van virale antigenen.

Kortom, dit protocol geeft een snelle en betrouwbare manier om het effect van virale infecties aan gastheercel transcriptie meten. Het kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met verschillende virussen en heeft het potentieel om te worden aangepast aan immunokleuringen specifieke virale of cellulaire eiwitten omvatten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-ethynyl-uridine	Berry Associates	PY 7563	dissolve in DMSO for 100 mM stock
12-mm round coverslips	Fisherbrand	12-545-82
5 ml polystyrene tubes	BD Biosciences	352058
Actinomycin D (ActD)	Sigma	9415	dissolve in DMSO for 10 mM stock
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-11029
Bovine Serum Albumin (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO4	Sigma	C-8027	dissolve in H2O for 100 mM stock
DAPI	Sigma	D-9542	dissolve in H2O for 5 mg/ml stock
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled)	Invitrogen	A10270
fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-ascorbic acid	Sigma	A-5960	dissolve in H2O for 500 mM
paper filter	VWRbrand	28333-087
paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
poly-L-lysine (MW ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trizma base	Sigma	T-1503	dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056
Fluorescence Microscope			e.g. Olympus IX71
Flow Cytometer			e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa