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Immunology and Infection

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Published: August 9, 2013 doi: 10.3791/50809
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, Sealy Center for Vaccine Development, Center for Biodefense and Emerging Infectious Diseases, University of Texas Medical Branch

Summary

Dieses Verfahren beschreibt die Verwendung von Klick-Chemie, um Änderungen in Wirtszelle Transkription nach der Infektion zu messen mit dem Rift Valley-Fieber-Virus (RVFV) Stamm MP-12. Die Ergebnisse können qualitativ visualisiert werden über Fluoreszenzmikroskopie oder erhalten quantitativ durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ist zur Verwendung mit anderen Viren.

Abstract

Viele RNA-Viren haben die Fähigkeit, Transkriptions-Wirtszelle als ein Mittel, um zelluläre Abwehrmechanismen zu umgehen hemmen entwickelt. Zur Untersuchung dieser Viren ist es daher wichtig, eine schnelle und zuverlässige Methode zur Messung der Transkriptionsaktivität in infizierten Zellen. Traditionell wurde die Transkription entweder durch Einbau von radioaktivem Nukleoside wie 3 H-Uridin gemessen gefolgt von einem Nachweis über Autoradiographie oder Szintillationszählung oder Integrieren halogenierten Uridin-Analoga, wie 5-Bromuridin (BRU) durch Detektion mittels Immunfärbung gefolgt. Der Einsatz von radioaktiven Isotopen, erfordert jedoch spezielle Geräte und ist nicht in einer Reihe von Labor-Einstellungen durchführbar, während die Erkennung von BrU kann mühsam sein und können von niedriger Empfindlichkeit leiden.

Die neu entwickelte Klick-Chemie, die eine Kupfer-katalysierten Triazol-Bildung aus einem Azid und einem Alkin beinhaltet, bietet jetzt eine schnelle und highly sensitive Alternative zu diesen beiden Methoden. Klick-Chemie ist ein zweistufiger Prozess, in dem im Entstehen begriffenen RNA zunächst durch den Einbau des Uridin analogen 5-Ethinyluridin (EU), durch Detektion der Markierung mit einem fluoreszierenden Azid gefolgt markiert ist. Diese Azide sind als verschiedene Fluorophore, so dass für eine breite Palette von Optionen für die Visualisierung.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Transkription Unterdrückung in Zellen mit dem Rift Valley-Fieber-Virus (RVFV) Stamm MP-12 mit Klick-Chemie infiziert zu messen. Gleichzeitig wird die Expression der viralen Proteine ​​in diesen Zellen durch klassische intrazellulären Immunfärbung bestimmt. Schritte 1 bis 4 ausführlich eine Methode zur Unterdrückung Transkriptions über Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen, während die Schritte 5 bis 8 ausführlich eine Methode zur Unterdrückung Transkriptions via Durchflusszytometrie quantifizieren. Dieses Protokoll ist leicht an die Verwendung mit anderen Viren.

Introduction

Traditionell wurde Transkriptionsaktivität durch Einbau von entweder radioaktiv (3 H-Uridin) 1 gemessen worden oder halogenierte (BRU) 2 Nukleoside in entstehenden RNA. Diese Uridin Analoga werden von Zellen aufgenommen, umgewandelt in Uridin-Triphosphat (UTP) durch das Nukleosid Salvage Pathway, und anschließend in neu synthetisierte RNA eingebaut. 3 H-Uridin durch Autoradiographie, die sehr zeitaufwändig sein kann, oder Szintillations erkannt werden Zählen, das erfordert spezielle Ausrüstung. Darüber hinaus kann die Verwendung radioaktiver Isotope nicht in einer Reihe von Laboreinrichtungen praktisch, einschließlich High-Containment biologische Sicherheit Laboratorien. BrU durch Immunfärbung mit Anti-Bru Antikörper, die die harten Permeabilisierung erfordern können, um den Zugriff des Antikörpers an den Kern oder teilweise Denaturierung von RNA, wie RNA Sekundärstruktur kann eine sterische Hinderung für die Antikörperbindung zu gewährleisten detektiert werden.

_content "> Das hier beschriebene Protokoll nutzt die kürzlich entwickelte klicken Chemie 3 bis transkriptionelle Aktivität in Zellen mit dem RVFV Stamm MP-12 infiziert zu messen. Klicken Chemie beruht auf einer sehr selektiven und effizienten Kupfer (I)-katalysierten Cycloaddition zwischen einem Alkin und einer Azid 4,5. In diesem Protokoll wird naszierenden RNA in infizierten Zellen zuerst durch Einarbeitung des Uridin analoge EU bezeichnet. In einem zweiten Schritt die inkorporierte EU durch Umsetzung mit einem Azid Fluoreszenz detektiert wird. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens sind (1), dass sie nicht die Verwendung von radioaktiven Isotopen und (2), dass es nicht erforderlich harten Permeabilisierung oder Denaturierung von RNA. mit einem Molekulargewicht von weniger als 50 Da der Zugang des fluoreszierenden Azid nicht ausreichend behindert Permeabilisierung oder RNA Sekundärstruktur. Darüber hinaus sind die Forscher nicht in der Wahl ihrer primären Antikörper begrenzt, wenn die Kombination der Detektion von RNA mit einer KlasseiCal Immunfärbung für virale Proteine.

Zwei verschiedene Verfahren werden in diesem Protokoll beschrieben: eine für die Visualisierung Transkription über Fluoreszenzmikroskopie (Schritte 1-4) und eine zur Quantifizierung der Transkription durch Durchflusszytometrie (Schritte 5-8). Beide Methoden kombinieren entstehender RNA Markierung mit einem intrazellulären Immunfärbung für virale Proteine, die für eine Korrelation zwischen Transkriptionsaktivität und Virusinfektion einer Zelle-für-Zelle-Basis ermöglicht.

Die Autoren haben sich erfolgreich verwendet das Protokoll hier beschriebenen transkriptionellen Aktivität in Zellen mit dem RVFV Stamm MP-12 6 Zellen mit verschiedenen MP-12-Mutanten 7,8, 9, und Zellen mit Toscana-Virus (TOSV) 10 infiziert infiziert zu bestimmen. Die hier beschriebene Protokoll kann leicht für die Verwendung mit verschiedenen Viren angepasst und hat das Potential, modifiziert Immunfluoreszenzfärbung spezifische virale oder zelluläre Proteine ​​umfassen werden.

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Protocol

Analyse der Transkription durch Fluoreszenzmikroskopie

1. Zellen infizieren mit MP-12 und Label-Nascent RNA mit EU

  1. Platz 12-mm runde Deckgläschen in 12-Well-Gewebekulturplatte, ein Deckglas pro Well.

Hinweis: Wenn Zellen haben Probleme Einhaltung Deckgläser, Mantel mit Poly-L-Lysin (MW ≥ 70.000), bevor sie in Brunnen. Zu diesem Zweck tauchen Deckgläser in einer sterilen 0,1 mg / ml in H 2 O aus Poly-L-Lysin für 5 min. Spülen Deckgläser mit sterilem H 2 O und der Luft trocknen für mindestens 2 Stunden.

  1. Um Saatgut 293 Zellen auf Deckgläser werden 5 x 10 4 Zellen in 1 ml Wachstumsmedium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin) pro Vertiefung. Inkubieren in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 O / N.
  2. Infect Zellen mit MP-12 mit einer Multiplizität der Infektion (moi) von 3. Mindestens zwei infizierten Wells: eine der beiden Bohrungen werden als nicht infizierte Kontrolle zu dienen, wird die andere mit Actinomycin D (ActD) im Schritt 1.5 als Kontrolle für die transkriptionelle Unterdrückung behandelt werden. Entfernen Wachstumsmedium und verdünnen das Virus Lager, so dass das Gesamtvolumen in jede Vertiefung gegeben ist 200 ml. Inkubation für 1 Stunde in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.

Hinweis: Anstelle Infizieren von Zellen, Zellen können auch mit Plasmid-DNA transfiziert werden oder in vitro synthetisierte RNA kodierend eine spezifische virale Protein. Zu diesem Zweck Transfektion von Zellen mit einem geeigneten chemischen Transfektionsreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers, und fahren bis 1,5 bei 16 Stunden nach der Transfektion Schritt. Es ist ratsam, die Transfektionsbedingungen und Inkubationszeit vor RNA-Markierung und Fixierung optimieren.

  1. Entfernen Inokulum und 1 ml frisches Wachstumsmedium pro Vertiefung. Bei 37 ° C für 15 Stunden.
ove_content ">. Hinweis: Wenn die Anpassung dieses Protokoll für die Verwendung mit einem anderen Virus, ist es ratsam, einen Zeitverlauf Experiment durchführen, um den optimalen Zeitpunkt für die RNA-Markierung und Fixierung bestimmen Richten Sie diese Zeit natürlich so, dass die Infektion Zeiten gestaffelt sind und alle Proben markiert, fixiert und gefärbt gleichzeitig.

  1. Bei 15 Stunden nach der Infektion (hpi), ersetzen Wachstumsmedium mit Medium mit 1 mM EU. Um eines der mock infizierten Brunnen, auch die 5 ug / ml ActD. Dies wird als Quelle für die transkriptionelle Unterdrückung dienen, wie ActD hemmt die DNA-abhängige RNA-Synthese. Zurück Zellen in den Inkubator.
  2. Mit 16 hpi, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Deckgläschen einmal mit 1 ml PBS (KCl 0,20 g / L, KH 2 PO 4 0,20 g / L, NaCl 8,00 g / L, Na 2 HPO 4 1,15 g / L, pH 7,4) pro Vertiefung. Fix Zellen durch Zugabe von 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) pro Vertiefung und Inkubieren für 30 min bei RT.

Hinweis: Um 4% PFA Fixierung Lösung vorzubereiten, löst 10 g Paraformaldehyd in 150 ml H 2 O auf 60 ° C auf einem beheizten Magnetrührer. In 500 ul 1 M NaOH und weiter rühren, bis die Lösung klar wird. Filter PFA-Lösung durch einen Papierfilter, um Partikel zu entfernen und hinzufügen 62,5 ml Phosphat-Puffer (77 mM NaH 2 PO 4, 287 mM Na 2 HPO 4, pH 7,4). In H 2 O bis zu einem Gesamtvolumen von 250 ml. Einfrieren bei -20 ° C in Einzel-Portionen.

  1. Waschen einmal mit 1 ml PBS pro Vertiefung. Keine Inkubationszeit für diese und alle nachfolgenden Waschschritte erforderlich. Fahren Sie direkt mit Schritt 2 fort.

Anmerkung: Es ist wichtig, um sofort mit dem Click-Reaktion fortfahren, da die RNA degeneriert, wenn zu diesem Zeitpunkt für einen längeren Zeitraum gehalten werden, ein Verlust der RNA Fluoreszenzsignal bereits beobachtet, wenn die Zellen für 1 Stunde bei 4 ° C werden . Und falls probilden einen Zeitverlauf Experiment ist, lesen Sie Label, zu beheben, und färben alle Proben gleichzeitig.

2. Klicken Reaktion auf markierten RNA-Erkennung

  1. Durchdringbar Zellen durch Zugabe von 1 ml 0,2% Triton X-100 in PBS. Inkubieren für 10 min bei RT.

Hinweis: Alle Lösungen in den Schritten 2.1 bis 2.3 müssen nucleasefreiem sein.

  1. Dreimal mit 1 ml PBS pro Vertiefung.
  2. Entfernen Deckgläser von 12-Well-Platte und Transfer in der feuchten Kammer. Cover jede Deckglas mit 50 - 100 ul Klick Färbelösung (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO 4, 20 uM fluoreszierenden Azid [Anregung / Emission maximal: 590/617 nm], 100 mM Ascorbinsäure) jeder. Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln.

Hinweis: Zur Montage der feuchten Kammer, die untere Linie einer Zellkultur oder in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm mit Kunststoff-Folie Paraffin. Die die Innenseite des Randes des dish mit feuchten Papiertüchern. Legen Sie die Deckgläser auf die Kunststoff-Folie Paraffin.

Hinweis: Achten Sie darauf, lassen Sie die Deckgläser austrocknen während diesem oder einem anderen Schritt in das Protokoll. Es ist am besten, um die Färbelösung jedem Deckglas direkt nachdem es in der feuchten Kammer platziert wurde hinzuzufügen.

Hinweis: Bereiten Sie das Click Färbelösung frisch unmittelbar vor diesem Schritt. Stammlösungen von 1,5 M Tris, pH 8,5, 100 mM CuSO 4 und 500 mM Ascorbinsäure bei 4 ° C gelagert werden Allerdings verwerfen jede Ascorbinsäure stock Lösung, die gelb geworden ist.

Hinweis: Achten Sie darauf, ein Fluorophor, die die Filter auf Ihrem Fluoreszenz-Mikroskop passt zu wählen.

  1. Entfernen Deckgläser aus der feuchten Kammer und in einen frischen 12-Well-Platte und dreimal mit 1 ml PBS pro Vertiefung.

Hinweis: Wenn kein deSchutz von viralen Proteinen gewünscht wird, Deckgläser montiert werden kann und abgebildet nach diesem Schritt (gehen Sie zu Schritt 3.3).

3. Immunfluoreszenz zu Expression viraler Proteine ​​erkennen

  1. 1 ml Blockierungspuffer (3% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS) in jede Vertiefung und Inkubieren für 30 min bei RT im Dunkeln.
  2. Entfernen Deckgläser von 12-Well-Platte, Transfer in die feuchte Kammer und decken mit 50 - 100 ul primären Antikörper (anti-RVFV, eine Art Geschenk von Dr. RB Tesh, UTMB) in Blocking-Puffer (1:500) verdünnt. Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln.

Hinweis: Bei der Anpassung dieses Protokoll für die Verwendung mit einem anderen Virus, bestimmen die optimale Verdünnung für Ihre primäre Antikörper zuerst.

Hinweis: Alternativ kann dieser Schritt O / N bei 4 ° C durchgeführt werden, in der Dunkelheit.

  1. Entfernen Deckgläser aus der feuchten Kammer und Ort wieder in 12-Well-Platte und waschendreimal mit 1 ml PBS pro Vertiefung.
  2. Entfernen Deckgläser von 12-Well-Platz, Platz in der feuchten Kammer und Deckel mit 50 - 100 ul sekundären Antikörper (anti-Maus-IgG konjugiert mit Fluoreszenzfarbstoff [Anregung / Emission maximal: 495/519 nm]) in Blocking-Puffer (1 verdünnt: 500). Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln.

Hinweis: Achten Sie darauf, einen sekundären Antikörper, der Ihre primäre Antikörper erkennen und passt die Filter auf Ihrem Fluoreszenz-Mikroskop zu wählen.

Hinweis: Falls gewünscht, 200 ng / ml DAPI können an den sekundären Antikörper Verdünnung zugesetzt werden, um Kerne zu visualisieren.

  1. Entfernen Deckgläser aus der feuchten Kammer und Ort wieder in 12-Well-Platte und dreimal mit 1 ml PBS pro Vertiefung.
  2. Montieren Deckgläser, indem ein Tropfen (ca. 15 ul) Fluoromount-G auf einen Objektträger. Tauchen Sie das Deckglas in H 2 O, entfernen überschüssiges H 2 O durch Berühren the Seite gegen ein Papiertuch und Ort Zell-Seite nach unten in den Tropfen Fluoromount-G. Air trocken für 5 min.

Hinweis: Wenn Bildgebung auf einem inversen Mikroskop, ermöglichen Fluoromount-G bei 4 ° erstarren CO / N oder bringt die Deckgläser auf die Objektträger durch Abdichten der Kante mit transparenter Nagellack.

Hinweis: Folien kann sofort abgebildet werden oder bei 4 ° C im Dunkeln bis zu einer Woche.

4. Erfassung von Daten

  1. Bild mit einem Fluoreszenz-Mikroskop.

Hinweis: Achten Sie darauf, geeignete Fluorophore, die visualisiert werden können mit Ihrem Mikroskop zu wählen. Zum Vergleich sind die folgenden die Fluorophore und Filter-Sets verwendet werden, um die Bilder in dieser Veröffentlichung gezeigt erwerben.

DAPI:
Anregung Filter: BP 330-385
Dichromatic Spiegel: DM 400
Emission Filter: LP 420

Anregung Filter: BP 460-490
Dichromatic Spiegel: DM 505
Emission Filter: LP 510

Fluorophor mit einer Anregung / Emission maximal 590/617:
Anregung Filter: BP 545-580
Dichromatic Spiegel: DM 600
Emission Filter: LP 610

Analyse der Transkription mittels Durchflusszytometrie

5. Zellen infizieren mit MP-12 und Label-Nascent RNA mit EU

  1. Seed 293-Zellen in 6-Well-Gewebekulturplatten in Wachstumsmedium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin). Inkubieren in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 bis 80 Zellen erreicht haben - 100% Konfluenz.
  2. Infect Zellen mit MP-12 mit einer MOI von 3. Mindestens zwei nicht-infizierten Vertiefungen: eine der beiden Bohrungen als nicht infizierte Kontrolle dienen soll, wird die andere mit ActD in Schritt behandelt werden5.4. Entfernen Wachstumsmedium und verdünnen das Virus Lager, so dass das Gesamtvolumen in jede Vertiefung gegeben ist 400 ul. Inkubation für 1 Stunde in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
  3. Entfernen Inokulum und 2 ml frisches Wachstumsmedium pro Vertiefung. Bei 37 ° C für 12 Stunden.

Hinweis: Falls die Anpassung dieses Protokoll für die Verwendung mit einem anderen Virus, ist es ratsam, einen Zeitverlauf Experiment, um den optimalen Zeitpunkt für die Kennzeichnung und Ernte bestimmen durchzuführen. Richten Sie diese Zeit natürlich so, dass die Infektion Zeiten gestaffelt sind und alle Proben können markiert, geerntet werden, und gefärbt in der gleichen Zeit.

  1. Bei 12 hpi, ersetzen Wachstumsmedium mit Medium mit 0,5 mM EU. Um eines der mock infizierten Brunnen, auch die 5 ug / ml ActD. Dies wird als Quelle für die transkriptionelle Unterdrückung dienen, wie ActD hemmt die DNA-abhängige RNA-Synthese. Zurück Zellen in den Inkubator.
  2. Mit 13 hpi, waschen Sie die Zellen einmal with PBS und Ernte durch Trypsinisierung von Zellen. Waschen geernteten Zellen dreimal mit PBS, enthaltend 1 mM EDTA (PBS-EDTA).

Hinweis: Bei dieser und den folgenden Schritten, nicht schleudern Zellen schneller als 500 - 1.000 xg zu Zelle Bruch zu verhindern. Zentrifuge Zellen für 1 - 2 min zur Sedimentation.

Hinweis: Wenn eine Oberfläche Immunfärbung wird nach dem Klick-Reaktion, Ernte mit einem Gummi-oder Einmalhandschuhe Polizist Zellenabstreifer statt geplant.

  1. Fix Zellen durch Resuspendieren in 1 ml 4% PFA und Inkubation für 30 min bei RT. Siehe 1.6 für Anleitungen zum 4% PFA vorzubereiten Schritt.
  2. Waschen einmal mit 1 ml PBS-EDTA pro Vertiefung. Fahren Sie direkt mit Schritt 6 fort.

Hinweis: Es ist wichtig, um sofort mit dem Klick-Reaktion gehen, da die RNA degeneriert, wenn in dieser Phase für längere Zeit gehalten. Und falls der Durchführung einer Zeit course Experiment, achten Sie darauf, zu beschriften, zu fixieren und färben alle Proben gleichzeitig.

6. Klicken Reaktion auf markierten RNA-Erkennung

  1. Durchdringbar Zellen durch Resuspension in 0,5 ml 0,2% Triton X-100 in PBS. Inkubieren für 10 min bei RT.

Hinweis: Alle Lösungen in den Schritten 6.1 bis 6.3 müssen nucleasefreiem sein.

Hinweis: Wenn Zellen nicht richtig Sediment während diesem Schritt erhöhen die Zentrifugationszeit bis 5 min. Sedimentationsverhalten einmal Zellen zu verbessern sind in FACS-Puffer (Schritt 6.4) suspendiert.

  1. Waschen Sie einmal mit 1 ml PBS.

Hinweis: Verwenden Sie keine EDTA in diesem Schritt, da dies die Cu 2 +-Ionen, die für die Klick-Reaktion chelatisieren wird.

  1. Die Zellen in 200 ul Klick Färbelösung (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO 4, 200 nM Azid mit Fluoreszenzfarbstoff [exkl. beschriftetitation / Emissionsmaximum: 650/665 nm], 100 mM Ascorbinsäure). Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln.

Hinweis: Bereiten Sie das Click Färbelösung frisch unmittelbar vor diesem Schritt. Stammlösungen von 1,5 M Tris, pH 8,5, 100 mM CuSO 4 und 500 mM Ascorbinsäure bei 4 ° C gelagert werden Allerdings verwerfen jede Ascorbinsäure stock Lösung, die gelb geworden ist.

Hinweis: Wenn Zellen verklumpen bei diesem Schritt, durch Auf-und Abpipettieren mehrmals resuspendieren.

Hinweis: Achten Sie darauf, ein Fluorophor, die von Ihrem Durchflusszytometer detektiert werden kann wählen.

Hinweis: Daneben werden eine Probe der infizierten Zellen, die nicht mit dem Klick Färbeverfahren unterworfen werden, diese werden für die Kalibrierung des Durchflusszytometers erforderlich. Verwenden Sie entweder die Hälfte der infizierten Zellen oder eine zusätzliche gut bei Schritt 5.2 infiziert. Diese control-Zellen wird in Schritt 7.1 immungefärbt werden.

  1. Waschen zweimal mit FACS-Puffer (PBS, enthaltend 1 mM EDTA und 0,5% (w / v) BSA).

Hinweis: Wenn keine Immunfärbung von viralen Proteinen gewünscht wird, Zellen analysiert werden sofort (Schritt 8 fortfahren).

7. Immunfluoreszenz zu Expression viraler Proteine ​​erkennen

  1. Die Zellen in 200 ul primären Antikörper (anti-RVFV) in FACS-Puffer (1:10.000) verdünnt und Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln.

Hinweis: Alternativ kann dieser Schritt O / N bei 4 ° C durchgeführt werden, in der Dunkelheit.

Hinweis: Auch Vorbereitung einer Probe von nicht infizierten Zellen, die an der Klick-Färbung unterzogen wurden aber nicht immungefärbt werden, werden diese für die Kalibrierung des Durchflusszytometers benötigt werden. Verwenden Sie entweder die Hälfte der Mock-infizierten Zellen oder eine zusätzliche nicht-infizierten und anSchritt 5.2.

Hinweis: Bei der Anpassung dieses Protokoll für die Verwendung mit einem anderen Virus, bestimmen die optimale Verdünnung für Ihre primäre Antikörper zuerst.

  1. Waschen Sie die Zellen zweimal in FACS-Puffer.
  2. Die Zellen in 200 ul sekundären Antikörper (anti-Maus-IgG konjugiert mit Fluoreszenzfarbstoff [Anregung / Emission maximal: 495/519 nm]), verdünnt in FACS-Puffer (1:1000) und Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln.
  3. Waschen Sie die Zellen einmal in FACS-Puffer.

Hinweis: An dieser Stelle können Zellen O / N bei 4 ° C gelagert werden in der Dunkelheit.

8. Erfassung von Daten

  1. Die Zellen in 500 ul FACS-Puffer, Transfer in 5 ml Polystyrol-Röhrchen und Analyse mit einem Durchflusszytometer. Verwenden MP-12 infizierten Zellen (kein Klick-Reaktion, Anti-RVFV Färbung nur) und Mock-infizierten Zellen (klicken Reaktion nur), um das Gerät zu kalibrieren.

Nichte: Achten Sie darauf, geeignete Fluorophore, die von Ihrem Gerät erkannt werden kann wählen. Zum Vergleich sind die folgenden die Laserlinien und Filter-Sets verwendet, um die Daten in dieser Veröffentlichung gezeigt erwerben.

Fluorophor mit einer Anregung / Emissionsspektrum 495/519:
Laser: 488 nm
Filter: 530/30

Fluorophor mit einer Anregung / Emissionsspektrum 650/665:
Laser: 640 nm
Filter: 670/20

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Representative Results

Die NSs Protein RVFV (Familie Bunyaviridae, Gattung Phlebovirus) 11 hemmt Wirtszelle allgemeine Transkription durch zwei verschiedene Mechanismen: (i) durch die Sequestrierung p44 Untereinheit des basalen Transkriptionsfaktor TFIIH 11 und (ii) durch die Förderung der proteasomalen Abbau des p62 Untereinheit TFIIH 6. Der MP-12 RVFV Impfstammes 13 hat für die Experimente in diesem Protokoll beschrieben verwendet, da MP-12-Stamm in einer Sicherheitsstufe 2 Labor gehandhabt werden kann und wird aus dem Mittel der Regel wählen Sie in den USA, die sich auf andere Wildtyp-gilt ausgeschlossen Geben RVFV Stämme. Die NSs Protein von MP-12-Stamm ist voll funktionsfähig und die Fähigkeit behält, Host Transkription 6 zu unterdrücken. Das Virus RMP12-C13type, die eine Deletion umfasst 69% der NSs Gen 14 trägt, wurde als Kontrolle Virus fehlt NSs alle Funktionen, einschließlich der Fähigkeit, Transkription unterdrücken Wirtszelle aufgenommen.

Abbildung 1 zeigt Bilder von Fluoreszenzmikroskopie erworben. In mock infizierten Zellen (1a-1d), erscheinen leuchtend roten Kerne wegen der laufenden Transkription. Da Zellen haben nur mit EU für 1 Stunde, gefolgt von sofortiger Fixierung markiert wurden, bleiben die meisten RNAs im Zellkern. Im Gegensatz dazu, wenn die Zellen mit ActD besitzen einen pharmakologisch die Transkription (Fig. 1e-1h), die rote Fluoreszenz der Kerne deutlich reduziert. Diese Fluoreszenz wird in ähnlicher Weise reduziert werden, wenn die Zellen mit MP-12 (Abb. 1n-1Q), aber nicht mit den NSs Deletionsmutante RMP12-C13type (Abb. 1i-1m) infiziert sind. Abbildung 2 zeigt auch Bilder von Fluoreszenzmikroskopie erworben, aber hier Zellen wurden mit in vitro synthetisierten mRNA statt Infektion mit lebenden Virus transfiziert worden. Wenn Zellen wurden mit GFP kodierende mRNA (Abb. 2g-2i), keine Veränderung in trans transfiziertcriptional Aktivität transfizierten Zellen (2a-2c) verglichen, wie dargestellt mit roter Fluoreszenz in den Kernen, detektiert werden kann. Nur Transfektion mit mRNA die RVFV Virulenzfaktors NSs (Abbildungen 2k-2m) führt zu einer verringerten rote Fluoreszenz.

3A zeigt quantitative Daten mittels Durchflusszytometrie erhalten. Die Daten werden als Streudiagramme mit Fluoreszenzsignal für EU-Einbau in naszierenden RNA aufgetragen auf der y-Achse und die für anti-RVFV Färbung auf der x-Achse dargestellt. Der Quadranten-Gatter so angeordnet waren, dass die Mehrheit der mock-infizierten Zellen in dem oberen linken Quadranten gelegen war, wurde die Mehrheit der ActD behandelten Zellen in der unteren linken Quadranten liegt, und die Mehrheit der infizierten Zellen wurde in der rechten Hälfte des Diagramms liegt . Wenn Zellen mit MP-12 infiziert waren, zeigten 81,5% der gesamten Zellen, oder 93% der anti-RVFV positiven Zellen, reduziert transkriptionelle Aktivität. Im Gegensatz dazu when Zellen mit RMP12-C13type infiziert wurden, zeigten 91,6% der gesamten Zellen, oder 97% der anti-RVFV positiven Zellen transkriptionelle Aktivität, die vergleichbar mit der von mock-infizierten Zellen war. 3B zeigt dieselben Daten wie Abbildung 3A in Form eines Histogramms für die Fluoreszenz-RNA Markierung mit EU-Aufnahme.

Abbildung 1
Abbildung 1. Fluoreszenzmikroskopie von Zellen mit MP-12 und RMP12-C13type. 293-Zellen infiziert waren infiziert oder mock infiziert entweder mit MP-12 oder der NSs Deletionsmutante rMP-12-C13type. Zwischen 15 und 16 hpi wurden die Zellen mit 1 mM EU gekennzeichnet. Als Kontrolle für die transkriptionelle Unterdrückung wurden mock-infizierten Zellen mit 5 mg / ml ActD gleichzeitig mit der EU Behandlung behandelt. Zellkerne werden durch DAPI-Färbung (blau), Expression viraler Proteine ​​durch Färbung mit anti-RVFV Antikörper (grün) und RNA visualisiert visualisierend durch den Nachweis des eingebauten EU mit Azid mit Fluoreszenzfarbstoff (Anregung / Emission maximal: 590/617 nm) markiert (rot).

Abbildung 2
Abbildung 2. Fluoreszenzmikroskopie von Zellen mit in vitro synthetisierten RNA entweder für GFP oder MP-12 NSs transfiziert. 293 Zellen wurden mock transfiziert, oder transfiziert mit in vitro synthetisierten RNA codiert entweder GFP oder MP-12 NSs. Zwischen 15 und 16 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit 1 mM EU gekennzeichnet. Als Kontrolle für die transkriptionelle Unterdrückung wurden mock-transfizierten Zellen mit 5 mg / ml ActD gleichzeitig mit der EU Behandlung behandelt. Die Expression von GFP durch Anfärbung mit Anti-GFP-Antikörper (gi), ist der Ausdruck NSs durch Anfärbung mit Anti-RVFV Antikörper (af, km), gefolgt von Anti-Maus-IgG, konjugiert an Fluoreszenzfarbstoff (Anregung / Emission maximum: 495/519 nm) (grün) und RNA ist sichtbar durch Nachweis des eingebauten EU mit Azid mit Fluoreszenzfarbstoff (Anregung / Emission maximale gekennzeichnet: 590/617 nm) (rot).

Abbildung 3
Abbildung 3. (A) Die durchflusszytometrische Analyse von Zellen mit MP-12 oder RMP12-C13type infiziert. Zellen wurden mock infiziert oder angesteckt entweder mit MP-12 oder RMP12-C13type. Zwischen 12 und 13 hpi wurden die Zellen mit 0,5 mM EU gekennzeichnet. Als Kontrolle für die transkriptionelle Unterdrückung wurden mock transfizierten Zellen mit 5 pg / ml ActD gleichzeitig mit der EU Behandlung behandelt. Expression der viralen Proteine ​​sichtbar gemacht durch Anfärben mit anti-RVFV Antikörper durch einen sekundären Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoff (Anregung / Emission höchstens: 495/519 nm) markiert gefolgt (anti-RVFV) und RNA ist sichtbar durch Nachweis des eingebauten EU mit Azid markiert mit Fluoreszenzfarbstoff (Anregung / Emission maximal: 650/665 nm) (RNA). Die data wird als Punktwolke dargestellt. (B) Darstellung der gleichen Daten in A als Histogramm dargestellt. Fluoreszenz-Intensität für die EU-Aufnahme auf der x-Achse aufgetragen ist, sind Zellzahlen auf der y-Achse aufgetragen. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Discussion

Die bereitgestellte Protokoll beschreibt ein Verfahren, um die Wirkung der viralen Infektion Wirtszelle die Transkription durch den Einbau des Uridin analoge EU in naszierenden RNA zu messen. Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber früheren Verfahren: schnell, empfindlich, und es muss nicht auf die Verwendung von radioaktiven Isotopen verlassen. Darüber hinaus kann das Verfahren angepasst ist, um qualitative Daten durch Fluoreszenzmikroskopie oder quantitative Daten über Durchflusszytometrie unter Verwendung im Wesentlichen der gleichen Reagenzien ergeben. Wenn mit Immunfluoreszenzfärbung für virale Antigene kombiniert, erlaubt dieses Verfahren auch die Forscher von nicht-infizierten Zellen infiziert unterscheiden.

Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Verfahren auch markiert neu synthetisierte virale RNA mit der gleichen Geschwindigkeit wie Host-Transkripte, ein Nachteil, der mit anderen Verfahren die sich auf 3 H-Uridin oder BrU Einbau geteilt wird markiert. Zumindest im Falle von RVFV MP-12-Infektion, jedoch haben wir gefunden, dass die amount von Host-Transkripte bei weitem überwiegt die Menge der viralen Transkripte und damit der Einfluss der viralen RNA an Gesamt-RNA durch diesen Test gemessen wird, vernachlässigbar. Bei der Anpassung dieses Protokoll für die Verwendung mit einem anderen Virus, können Forscher wollen viralen Transkripte identifizieren entweder durch ihre Lokalisation, durch Behandlung von infizierten Zellen mit ActD, oder wenn Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) 15. Wenn das Virus repliziert im Zytoplasma, wie MP-12, dann virale RNA kann leicht von zellulären RNA, die meist noch in den Zellkern nach 1 Stunde zur Etikettierung enthaltenen unterscheiden. Infizierte Zellen können auch mit ActD behandelt werden, um Wirtszelle Transkription unterdrücken, während virale RNA-Synthese unberührt. ActD Funktionen durch Bindung an doppelsträngige DNA 16 und damit nur hemmt die DNA-abhängige Transkription hat aber keine Auswirkung auf die virale RNA-abhängige RNA-Polymerasen.

Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, zu vermeiden,Kontamination mit Nukleasen zwischen der Permeabilisierung und dem Klick Kennzeichnung Reaktion, wie EU-markierte RNA bleibt empfindlich gegen Abbau durch RNasen 3. Darüber hinaus sollten Forscher sofort mit dem Klick Kennzeichnung Reaktion, wie längeren Inkubationszeiten zwischen Fixierung und klicken Kennzeichnung Reaktion selbst bei 4 ° C, um den Abbau von RNA führen und führen letztlich zu einem Verlust der RNA Fluoreszenzsignal. Dies ist von besonderer Bedeutung bei der Durchführung von zeitlichen Verlauf Experimente; Forscher sollten ihre Experimente so, dass alle Zellen markiert, fixiert werden kann, und gefärbt in der gleichen Zeit zu entwerfen. Glücklicherweise bleibt die RNA Fluoreszenzsignal nach dem Klick Markierungsreaktion stabil, so kann das Protokoll leicht nach diesem Schritt gestoppt werden.

Schließlich müssen die Forscher im Auge zu behalten, dass die cytopathischen Effekt (CPE) von vielen Viren wirkt sich negativ auf zelluläre RNA-Synthese auch in Ermangelung einer spezifischen Transkriptions-Unterdrückung. SieDaher muss Transkriptionsaktivität zu einem Zeitpunkt nach der Infektion zu messen, wenn die Zellen noch lebensfähig sind. Wenn ein mutiertes Virus zur Verfügung, welches die Fähigkeit fehlt, Transkription, wie RMP-12-C13type (Abbildungen 1 und 3) zu unterdrücken, kann dies ein großartiges Werkzeug bei der Bestimmung der optimalen Zeitpunkt für die Messung Transkription sein.

Bei der Planung einer großen Anzahl von Experimenten kann Forscher wollen direkte Markierung der primäre Antikörper mit einem Fluorochrom 17 betrachten, wodurch die Notwendigkeit für einen sekundären Antikörper und die Verringerung der Zeit für den Nachweis viraler Antigene erforderlich.

Zusammenfassend stellt dieses Protokoll eine schnelle und zuverlässige Möglichkeit, um den Effekt der viralen Infektion auf Wirtszelle Transkription messen. Es kann leicht für die Verwendung mit verschiedenen Viren angepasst und hat das Potential, modifiziert Immunfärbungen für bestimmte virale oder zelluläre Proteine ​​umfassen werden.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir bedanken uns bei RB Tesh für die Bereitstellung der Maus polyklonalen anti-RVFV Antiserum und M. Griffin des UTMB Durchflusszytometrie Core Facility für die Hilfe bei der Durchflusszytometrie. Diese Arbeit wurde von 5 U54 AI057156 durch die Western Regional Center of Excellence, NIH R01 AI08764301 und Mittel aus dem Center for Vaccine Sealy Development bei UTMB.BK unterstützt wurde durch den James W. McLaughlin Fellowship Fund bei UTMB.OL wurde abgestützt durch eine Maurice R. Hilleman Frühe-Phase Karriere Investigator Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-ethynyl-uridine Berry Associates PY 7563 dissolve in DMSO for 100 mM stock
12-mm round coverslips Fisherbrand 12-545-82
5 ml polystyrene tubes BD Biosciences 352058
Actinomycin D (ActD) Sigma 9415 dissolve in DMSO for 10 mM stock
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Invitrogen A-11029
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz sc-2323
CuSO4 Sigma C-8027 dissolve in H2O for 100 mM stock
DAPI Sigma D-9542 dissolve in H2O for 5 mg/ml stock
DMEM Invitrogen 11965092
FBS Invitrogen 16000044
fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) Invitrogen A10270
fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) Invitrogen A10277
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
L-ascorbic acid Sigma A-5960 dissolve in H2O for 500 mM
paper filter VWRbrand 28333-087
paraformaldehyde Sigma 158127
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
poly-L-lysine (MW ≥ 70000) Sigma P1274
Triton X-100 Sigma T-8787
Trizma base Sigma T-1503 dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5
Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056
Fluorescence Microscope e.g. Olympus IX71
Flow Cytometer e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa

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References

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Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen
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Kalveram, B., Lihoradova, O., Indran, S. V., Head, J. A., Ikegami, T. Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis. J. Vis. Exp. (78), e50809, doi:10.3791/50809 (2013).

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