Summary
שיטה זו מתארת את השימוש בכימיה לחץ כדי למדוד שינויים בשעתוק תא מארח לאחר הדבקה בנגיף קדחת הבקעה (RVFV) מתח MP-12. תוצאות יכולות להיות דמיינו איכותית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או הושגו כמותית באמצעות cytometry הזרימה. שיטה זו ניתנת להתאמה לשימוש עם וירוסים אחרים.
Abstract
רבים וירוסי RNA התפתחו היכולת לעכב שעתוק תא מארח כאמצעי לעקוף את ההגנות של סלולריות. לצורך המחקר של וירוסים אלה, ולכן חשוב לנו בצורה מהירה ואמינה למדידת פעילות תעתיק בתאים נגועים. באופן מסורתי, שעתוק כבר נמדד גם על ידי שילוב של נוקלאוזידים רדיואקטיביים כגון H-3 uridine אחרי גילוי דרך autoradiography או נצנץ ספירה, או שילוב של תולדות אנלוגים uridine כגון 5-bromouridine (BRU) ואחריו גילוי דרך immunostaining. השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים, לעומת זאת, דורש ציוד מיוחד ולא ריאלי במספר הגדרות מעבדה, תוך זיהוי של ברו יכול להיות מסורבל ועלול לסבול מרגישות נמוכה.
הכימיה לחץ שפותחה לאחרונה, הכוללת היווצרות triazole נחושת קטליזאטור מיזיד וalkyne, החברה מספקת מהירה וhighlחלופה רגישה Y לשתי השיטות הללו. לחץ כימיה היא תהליך שלב שני שבו RNA המתהווה הוא שהכותרת ראשונה על ידי שילוב של אנלוגי uridine 5 ethynyluridine (איחוד אירופי), ואחריו גילוי של התווית עם אזיד ניאון. azides האלה זמינים בכמה fluorophores שונה, המאפשר מגוון רחב של אפשרויות לשם ויזואליזציה.
פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת דיכוי שעתוק בתאים נגועים בנגיף קדחת בקעת (RVFV) מתח MP-12 באמצעות לחץ כימיה. במקביל, ביטוי של חלבונים נגיפיים בתאים אלה נקבע על ידי immunostaining תאי הקלסית. שלבי 1 עד 4 פירוט שיטה לדמיין דיכוי תעתיק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ואילו שלבי 5 עד 8 פירוט שיטה לכמת דיכוי תעתיק באמצעות cytometry הזרימה. פרוטוקול זה הוא להתאמה בקלות לשימוש עם וירוסים אחרים.
Introduction
באופן מסורתי, פעילות תעתיק כבר נמדד באמצעות שילוב של שני רדיואקטיבי (H-3 uridine) 1 או הלוגנים (BRU) 2 נוקלאוזידים לרנ"א המתהווה. אנלוגים uridine אלה נלקחו על ידי תאים, הוסבו uridine-אדנוזין (UTP) דרך מסלול ההצלה nucleoside, ושולבו לאחר מכן לתוך RNA מסונתז חדש. ניתן לאתר 3 H-uridine ידי autoradiography, שיכול להימשך זמן רב, או נצנץ ספירה, אשר דורש ציוד מיוחד. יתר על כן, השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים לא יכולים להיות מעשי במספר הגדרות מעבדה, כולל מעבדות בטיחות ביולוגיות הכלה גבוהה. ניתן לאתר באמצעות ברו immunostaining עם נוגדנים נגד ברו, אשר עשוי לדרוש permeabilization הקשה כדי להבטיח גישה של הנוגדן לגרעין או denaturation החלקית של רנ"א, כמבנה המשני RNA עשוי להיות הפרעה סטרית לכריכת נוגדנים.
_content "> הפרוטוקול המתואר כאן מנצל את הכימיה לחץ פיתחה לאחרונה לחץ כימיה 3 למדידת פעילות תעתיק בתאים נגועים בזן RVFV MP-12. מסתמכת על נחושת סלקטיבי והיעילה ביותר (אני)-catalyzed תגובת cycloaddition בין alkyne ו מחצית אזיד 4,5. בפרוטוקול זה, RNA המתהווה בתאים נגועים שכותרתו ראשונה באמצעות שילוב של uridine האנלוגי האיחוד האירופי. בשלב שני, האיחוד האירופי Incorporated הוא זוהה באמצעות תגובה עם אזיד ניאון. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם (1) שהיא אינה דורשת את השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים ו( 2) שהיא אינה דורשת permeabilization הקשה או denaturation של רנ"א. עם משקל מולקולרי של פחות מ -50 דא, גישה של אזיד הניאון לא הקשתה על ידי מספיק permeabilization או RNA מבנה המשני. יתר על כן, חוקרים אינם מוגבלים בבחירתם של נוגדנים עיקריים כאשר שילוב זיהוי של RNA עם כיתהimmunostaining iCal לחלבונים ויראליים.שתי שיטות שונות מתוארות בפרוטוקול זה: אחת להמחשת שעתוק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (צעדים 1-4), ואחד לכימות שעתוק באמצעות cytometry זרימה (שלבים 5-8). שתי שיטות אלה משלבות תיוג של רנ"א המתהווה עם immunostaining תאי לחלבונים נגיפיים, המאפשר למתאם בין פעילות תעתיק וזיהום ויראלי על בסיס תא אחר תא.
החוקרים השתמשו בהצלחה בפרוטוקול שתואר כאן כדי לקבוע פעילות תעתיק בתאים נגועים בזן RVFV MP-12 6, התאים נגועים במוטציות שונות MP-12, 9, 7,8 ותאים נגועים בנגיף טוסקנה (TOSV) 10. ניתן להתאים הפרוטוקול המתואר כאן בקלות לשימוש עם וירוסים שונים ויש לו את הפוטנציאל להיות שונה כדי לכלול מכתים immunofluorescence של חלבונים נגיפיים או סלולריים ספציפיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניתוח של שעתוק על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי
1. להדביק תאים עם RNA המתהווה ייבל עם איחוד אירופי MP-12 ו
- מקום coverslips 12 מ"מ עגול לצלחת תרבית רקמת 12 גם, שאחד coverslip בכל טוב.
הערה: אם יש לי תאי צרות דבקות coverslips, מעיל עם פולי-L-ליזין (MW ≥ 70,000) לפני הצבת בבארות. למטרה זו, coverslips לצלול בפתרון מ"ג / מ"ל 0.1 סטרילי בH 2 O של פולי-L-ליזין למשך 5 דקות. יש לשטוף coverslips עם סטרילי H 2 O ואוויר יבש לפחות שעה 2.
- לזרע 293 תאים על coverslips, להוסיף 5 x 10 4 תאים במדיום גידול 1 מ"ל (DMEM המכיל 10% בסרום שור עוברי, 100 U / ml פניצילין ו100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין) בכל טוב. דגירה בחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 O / נ
- להדביק תאים עם MP-12 בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 3. לכלול לפחות שני בארות נגועים: אחת משתי הבארות תשמש כשליטה נגוע, אחרים יטופל בactinomycin D (ActD) בצעד 1.5 כשלט לדיכוי תעתיק. הסר את מדיום גידול ולדלל את מניות הווירוס, כך שהנפח הכולל הוסיף גם הוא לכל 200 מ"ל. דגירה במשך שעה 1 בחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
הערה: במקום להדביק תאים, יכולים גם להיות transfected תאים עם DNA פלסמיד או במבחנה מסונתזת RNA קידוד חלבון נגיפי ספציפי. למטרה זו, עם transfect תאים מגיב transfection כימי מתאים בהתאם להוראות היצרן והמשך לשלב 1.5 ב16 transfection ההודעה HR. רצוי לייעל את תנאי transfection וזמן דגירה לפני התיוג וקיבוע רנ"א.
- הסר את הבידוד ולהוסיף צמיחה בינונית טרי 1 מ"ל לכל טוב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות.
- בגיל 15 לאחר זיהום שעה (HPI), להחליף את מדיום גידול עם מדיום המכיל 1 מ"מ איחוד אירופי. לאחת מהבארות נגועות מדומה, גם להוסיף 5 מיקרוגרם / ActD מ"ל. זה ישמש כשלט לדיכוי תעתיק, כפי ActD מעכב סינתזת RNA-DNA תלויה. חזור תאים לחממה.
- בגיל 16 HPI, להסיר את המדיום ולשטוף את coverslips פעם אחת עם 1 מיליליטר PBS (KCl 0.20 גר '/ ל', KH 2 PO 4 0.20 גר '/ ל', NaCl 8.00 גר '/ ל', Na 2 HPO 4 1.15 גר '/ ל', pH 7.4) בכל טוב. תקן את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) לכל טוב ודוגר במשך 30 דקות ב RT.
> שים לב: כדי להכין 4% PFA פתרון קיבעון, לפזר paraformaldehyde G 10 בH 2 O 150 מ"ל מחומם ל 60 מעלות צלזיוס בstirrer מגנטי מחומם. הוסף 500 μl של 1M NaOH ולהמשיך לבחוש עד שהפתרון הופך ברור. פתרון סינון PFA דרך נייר סינון כדי להסיר את החלקיקים ולהוסיף 62.5 מ"ל פוספט חיץ (77 מ"מ אא 2 PO 4, 287 מ"מ Na 2 4 HPO, pH 7.4). הוסף H 2 O עד נפח כולל של 250 מ"ל. להקפיא ב -20 ° C בaliquots שימוש יחיד.
- שטפי פעם עם 1 מיליליטר PBS בכל טוב. זמן דגירה לא נדרש לכך ואת כל צעדים לשטוף לאחר מכן. פנה מייד לצעד 2.
הערה: חשוב להמשיך מייד עם התגובה לחץ, כמו רנ"א מתנוון אם כל הזמן בשלב זה לתקופות ממושכות של זמן: הפסד של אות הקרינה RNA כבר ניתן לראות אם תאים נשמרים במשך שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס . בדומה לכך, אם לכלגיבוש ניסוי כמובן זמן, כדי להיות בטוח תווית, לתקן, ולהכתים את כל הדגימות באותו הזמן.
2. לחץ על תגובה לזיהוי תווית RNA
- Permeabilize תאים על ידי הוספת 1 מ"ל 0.2% טריטון X-100 ב PBS. דגירה במשך 10 דקות ב RT.
הערה: כל פתרונות המשמשים בשלבים 2.1-2.3 צריכים להיות nuclease ללא תשלום.
- לשטוף שלוש פעמים עם 1 מיליליטר PBS בכל טוב.
- הסר coverslips מצלחת 12 היטב ולהעביר לתוך תא לח. כיסוי כל coverslip עם 50 - פתרון 100 μl לחץ מכתים (100 מ"מ טריס pH 8.5, 1 מ"מ CuSO 4, 20 מיקרומטר יזידו ניאון [מרבי עירור / פליטה: 590/617 ננומטר], חומצה אסקורבית 100 מ"מ) כל אחד. דגירה במשך שעה 1 ב RT בחושך.
הערה: כדי להרכיב את התא, הקו הלח התחתון של תרבית תאים או צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ עם סרט פרפין פלסטיק. מרפד את החלק הפנימי של הקצה של דיsh עם מגבות נייר לחות. הנח את coverslips על סרט פרפין הפלסטיק.
הערה: היזהר שלא לתת את coverslips להתייבש בזה או בכל שלב אחר בפרוטוקול. עדיף להוסיף את הפתרון מכתים לכל coverslip ישירות לאחר שהושם בתא הלח.
שימו לב: הכן לחץ מכתים פתרון הטרי מייד לפני הצעד הזה. פתרונות מניות של 1.5 מ 'טריס pH 8.5, 100 מ"מ CuSO 4, וחומצה אסקורבית 500 מ"מ ניתן לאחסן ב 4 ° C. עם זאת, להשליך כל פתרון מניות חומצה אסקורבית שהפך צהובה.
שים לב: הקפד לבחור fluorophore התואם את המסננים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי שלך.
- הסר coverslips מחדר והמקום לח לתוך צלחת 12 גם טרי ולשטוף שלוש פעמים עם 1 מיליליטר PBS בכל טוב.
הערה: אם אין דהtection של חלבונים נגיפיים הוא רצוי, יכולה להיות מותקנת coverslips וצלמה לאחר שלב זה (המשך לשלב 3.3).
3. Immunofluorescence כדי לזהות ביטוי של חלבונים נגיפיים
- הוסף 1 מ"ל של חיץ חסימה (3% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA) ב-PBS) זה טוב ודגירה במשך 30 דקות ב RT בחושך.
- הסר coverslips מצלחת 12 היטב, העברה לתא לח ולכסות עם 50 - 100 μl של נוגדן ראשוני (אנטי RVFV, מתנה מסוג ד"ר RB Tesh, UTMB) דילול בחסימת המאגר (1:500). דגירה במשך שעה 1 ב RT בחושך.
שים לב: כאשר התאמת פרוטוקול זה לשימוש בוירוס שונה, לקבוע את הדילול האופטימלי לנוגדן הראשוני שלך ראשון.
הערה: לחלופין, ניתן לבצע את הצעד הזה O / N ב 4 ° C בחושך.
- הסר coverslips מחדר והמקום לח בחזרה לתוך צלחת 12 היטב ולשטוףגם לשלוש פעמים עם 1 מיליליטר PBS.
- הסר coverslips ממקום 12 גם, מקום לתא וכיסוי לח עם 50 - 100 μl של נוגדנים משני (אנטי עכבר IgG מצומדות לצבע פלואורסצנטי [מרבי עירור / פליטה: 495/519 ננומטר]) דילול בחסימת המאגר (1: 500). דגירה במשך שעה 1 ב RT בחושך.
שים לב: הקפד לבחור את נוגדנים משני שיכול לזהות את הנוגדן הראשוני שלך ותואם את המסננים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי שלך.
הערה: אם תרצה, ניתן להוסיף 200 ng / ml DAPI לדילול הנוגדנים משני כדי להמחיש גרעינים.
- הסר coverslips מהחדר והמקום לח בחזרה לתוך צלחת 12 היטב ולשטוף שלוש פעמים עם 1 מיליליטר PBS בכל טוב.
- הר coverslips על ידי הצבת טיפה אחת (CA. Μl 15) של Fluoromount-G לשקופית מיקרוסקופ. טובלים את coverslip לH 2 O, להסיר עודפי H 2 O על ידי הנגיעה ה צד נגד דואר מגבת נייר, ומקום תאים בצד למטה לירידה של Fluoromount-G. אוויר יבש למשך 5 דקות.
הערה: אם הדמיה במיקרוסקופ הפוכה, לאפשר Fluoromount-G לבסס על 4 מעלות CO / N או להדביק את coverslips לשקופית מיקרוסקופ על ידי איטום הקצה עם לק השקוף.
הערה: יכולות להיות צילמו שקופיות באופן מיידי או מאוחסנות על 4 מעלות צלזיוס בחושך לתקופה של עד שבוע.
4. רכישת נתונים
- תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
שים לב: הקפד לבחור fluorophores המתאים שניתן דמיין באמצעות מיקרוסקופ שלך. לקבלת הפניה, להלן fluorophores וערכות מסנן המשמש לרכישת התמונות המוצגות בפרסום זה.
DAPI:
מסנן עירור: BP 330-385
Dichromatic מראה: DM 400
פליטת מסנן: LP 420
S = "jove_content"> Fluorophore עם מקסימום עירור / פליטה של 495/519:
מסנן עירור: BP 460-490
Dichromatic מראה: DM 505
פליטת מסנן: LP 510
Fluorophore עם מקסימום עירור / פליטה של 590/617:
מסנן עירור: BP 545-580
Dichromatic מראה: DM 600
פליטת מסנן: LP 610
ניתוח של שעתוק על ידי הזרימה cytometry
5. להדביק תאים עם RNA המתהווה ייבל עם איחוד אירופי MP-12 ו
- 293 תאי זרע לתוך צלחת תרבית רקמה 6 היטב במדיום גידול (DMEM המכיל 10% בסרום שור עוברי, 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין). דגירה בחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד תאים יגיעו ל -80 - 100% confluency.
- להדביק תאים עם MP-12 במשרד פנים של 3. תכלול לפחות שתי בארות נגועים: אחת משתי הבארות תשמש שליטה נגוע, אחרים יטופל בActD בצעד5.4. הסר את מדיום גידול ולדלל את מניות הווירוס, כך שהנפח הכולל מתווסף גם כל הוא 400 μl. דגירה במשך שעה 1 בחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- הסר את הבידוד ולהוסיף 2 מדיום גידול טרי מ"ל לכל טוב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
הערה: אם התאמת פרוטוקול זה לשימוש עם וירוס אחר, רצוי לבצע ניסוי כמובן זמן כדי לקבוע את נקודת הזמן האופטימלית עבור תיוג וקציר. הגדר את מהלך הזמן הזה, כך שפעמי הזיהום הם מעד ויכולים להיות מתויגים כל הדגימות, שנקטפו, ומוכתם באותו הזמן.
- בגיל 12 HPI, להחליף מדיום גידול המכיל בינונית עם 0.5 מ"מ איחוד אירופי. לאחת מהבארות נגועות מדומה, גם להוסיף 5 מיקרוגרם / ActD מ"ל. זה ישמש כשלט לדיכוי תעתיק, כפי ActD מעכב סינתזת RNA-DNA תלויה. חזור תאים לחממה.
- בגיל 13 HPI, לשטוף תאי פעם שנינותשעות PBS וקציר על ידי trypsinization של תאים. שטוף תאים שנקטפו שלוש פעמים עם PBS המכיל 1 mM EDTA (PBS-EDTA).
הערה: במהלך פעולות אלה ולאחר מכן, לא צנטריפוגות תאים מהר יותר מאשר 500 - 1000 XG כדי למנוע שבירת תא. צנטריפוגה תאים 2 - 1 דקות למשקעים.
הערה: אם immunostaining פני השטח מתוכנן בעקבות לחץ התגובה, הקציר באמצעות שוטר גומי או מגרד תא הפנוי במקום.
- תקן את התאים על ידי resuspending ב 1 מ"ל של PFA 4% ו דגירה במשך 30 דקות ב RT. עיין בשלב 1.6 להוראות כיצד להכין PFA 4%.
- שטפי פעם עם 1 מיליליטר PBS-EDTA בכל טוב. להמשיך מייד לשלב 6.
הערה: חשוב להמשיך מייד עם התגובה לחץ, כמו רנ"א מתנוון אם כל הזמן בשלב זה לתקופות ממושכות של זמן. באופן דומה, אם ביצוע ג זמןניסוי ourse, הקפד תווית, לתקן ולהכתים את כל הדגימות באותו הזמן.
6. לחץ על תגובה לזיהוי תווית RNA
- Permeabilize תאים על ידי resuspending ב0.5 מ"ל של 0.2% טריטון X-100 ב PBS. דגירה במשך 10 דקות ב RT.
הערה: כל פתרונות המשמשים בשלבים 6.1-6.3 צריכים להיות nuclease ללא תשלום.
הערה: אם תאים אינם משקעים כראוי במהלך שלב זה, להגדיל את זמן צנטריפוגה עד 5 דקות. התנהגות שקיעה תשפר פעם אחת תאים תלויים בFACS חיץ (שלב 6.4).
- שטפי פעם עם 1 מיליליטר PBS.
הערה: אל תשתמש בEDTA בשלב זה כמו זה chelate Cu 2 + היונים ההכרחי לתגובת לחץ.
- תאי Resuspend ב 200 פתרון מכתים לחץ μl (100 מ"מ טריס pH 8.5, 1 מ"מ CuSO 4, 200nm אזיד מסומן עם פלורסנט לצבוע [excמקסימום itation / פליטה: 650/665 ננומטר], חומצה אסקורבית 100 מ"מ). דגירה במשך שעה 1 ב RT בחושך.
שימו לב: הכן לחץ מכתים פתרון הטרי מייד לפני הצעד הזה. פתרונות מניות של 1.5 מ 'טריס pH 8.5, 100 מ"מ CuSO 4, וחומצה אסקורבית 500 מ"מ ניתן לאחסן ב 4 ° C. עם זאת, להשליך כל פתרון מניות חומצה אסקורבית שהפך צהובה.
הערה: אם תאי גוש ביחד במהלך שלב זה, resuspend ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
שים לב: הקפד לבחור fluorophore שיכול להיות מזוהה על ידי cytometer הזרימה שלך.
הערה: ניתן גם להכין דגימה אחת של תאים נגועים שאינם כפופים להליך מכתים לחץ, אלה יהיו צורך בכיול של cytometer הזרימה. כך או להשתמש במחצית מהתאים הנגועים או לכלול נוסף נגוע גם בשלב 5.2. קון אלהתאי Trol יהיו immunostained בשלב 7.1.
- שטוף פעמיים עם FACS חיץ (PBS המכיל 1 mM EDTA ו 0.5% (w / v) BSA).
הערה: אם אין immunostaining של חלבונים נגיפיים הוא רצוי, ניתן לנתח תאים באופן מיידי (המשך לשלב 8).
7. Immunofluorescence כדי לזהות ביטוי של חלבונים נגיפיים
- תאי Resuspend ב 200 μl של נוגדן ראשוני (אנטי RVFV) דילול בFACS חיץ (1:10,000) ודגירה עבור שעה 1 ב RT בחושך.
הערה: לחלופין, ניתן לבצע את הצעד הזה O / N ב 4 ° C בחושך.
הערה: ניתן גם להכין דגימה אחת של תאים נגועים בו היו נתונים להליך מכתים לחץ אבל לא immunostained, אלה יהיו צורך בכיול של cytometer הזרימה. כך או להשתמש במחצית מהתאים הנגועים או המדומים כוללים גם נגוע נוספות בצעד 5.2.
שים לב: כאשר התאמת פרוטוקול זה לשימוש בוירוס שונה, לקבוע את הדילול האופטימלי לנוגדן הראשוני שלך ראשון.
- לשטוף את התאים פעמיים בחיץ FACS.
- תאי Resuspend ב 200 μl של נוגדנים משני (אנטי עכבר IgG מצומדות לצבע פלואורסצנטי [מרבי עירור / פליטה: 495/519 ננומטר]) בדילול מלא FACS חיץ (1:1,000) ודגירה עבור שעה 1 ב RT בחושך.
- לשטוף את התאים פעם אחת בחיץ FACS.
הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן תאי O / N ב 4 ° C בחושך.
8. רכישת נתונים
- Resuspend תאים ב500 FACS חיץ, העברת μl לתוך 5 מ"ל צינורות קלקר ולנתח באמצעות cytometer זרימה. השתמש MP-12 תאים נגועים (אין תגובה מכתים קליק, אנטי RVFV בלבד) ותאים נגועים מדומים (לחץ על תגובה בלבד) כדי לכייל את המכשיר.
לאדואר: הקפד לבחור fluorophores המתאים שיכול להיות מזוהה על ידי המכשיר שלך. לקבלת הפניה, להלן קווי לייזר ומערכות סינון ששמשו לרכישה את הנתונים המוצגים בפרסום זה.
Fluorophore עם ספקטרום עירור / פליטה של 495/519:
לייזר: 488 ננומטר
מסנן: 530/30
Fluorophore עם ספקטרום עירור / פליטה של 650/665:
לייזר: 640 ננומטר
מסנן: 670/20
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
החלבון של NSS RVFV (משפחת Bunyaviridae, Phlebovirus סוג) 11 מעכב שעתוק כללי תא מארח באמצעות שני מנגנונים נפרדים: (א) על ידי sequestering מקטע P44 של גורם השעתוק הבסיסי TFIIH 11 ו (ב) על ידי קידום השפלה proteasomal של p62 מקטע של 6 TFIIH. MP-12 זן תרכיב RVFV 13 שימש במשך הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה מאז-12 MP מתח יכול להיות מטופלים במעבדת בטיחות ביולוגית ברמת 2 והוא לא נכלל בשלטון בחר הסוכן בארה"ב, אשר חל על פרוע אחרות הקלד זני RVFV. חלבון NSS של זן MP-12 הוא מתפקד במלואה ושומר לעצמה את היכולת לדכא שעתוק מארח 6. וירוס rMP12-C13type, אשר נושא מחיקה הכוללת 69% של גן NSS 14, כבר נכלל כוירוס חסר שליטה בכל פונקציות NSS, כולל היכולת לדכא שעתוק תא מארח.
class = "jove_content"> איור 1 מציג תמונות שנרכשו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בתאים נגועים מדומים (איורים 1 א-1D), גרעינים מופיעים אדום בוהק בשל שעתוק מתמשך. מאחר ותאים סומנו בתווית עם איחוד אירופי בלבד עבור שעה 1, ואחרי קיבוע מיידי, רוב RNAs יישאר בגרעין. לעומת זאת, כאשר טופלו תאים עם ActD לעכב שעתוק (איורים 1E-1H) פרמקולוגית, הקרינה האדומה של גרעינים מצטמצמת במידה ניכרת. הקרינה זו מצטמצמת באופן דומה כאשר תאים נגועים MP-12 (איורים 1N-1Q), אך לא עם NSS מחיקת מוטציה rMP12-C13type (האיורים 1i-1M). איור 2 מראה גם תמונות שנרכשו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אבל כאן תאים כבר transfected עם ה-mRNA במבחנה המסונתזת במקום הידבקות בנגיף חי. כאשר תאים היו transfected עם GFP קידוד ה-mRNA (איורים 2G-2i), לא חל שינוי בטראנספעילות criptional בהשוואה לתאי untransfected (איורים 2 א, 2 ג), כדמיין ידי הקרינה אדומה בגרעינים, ניתן לאתר. transfection רק עם קידוד mRNA NSS הגורם ארסיות RVFV (איורים 2k-2m) תוצאות בירידת הקרינה אדומה.
איור 3 א מציג נתונים כמותיים המתקבלים על ידי cytometry הזרימה. הנתונים מיוצגים כחלקות פיזור עם אות ניאון לאיחוד אירופי ההתאגדות לרנ"א המתהווה זממה על ציר ה-Y, וכי לצביעה נגד RVFV זממה על ציר x. הרבע השערים היו בכך שהרוב המכריע של תאים נגועים מדומים היה ממוקם ברבע השמאלי העליון, רוב התאים שטופלו ActD היה ממוקם ברבע השמאלי התחתון, ואת רוב התאים שנדבקו היה ממוקם במחצית הימנית של העלילה . כאשר תאים נדבקו MP-12, 81.5% מתאים בסך הכל, או 93% מתאים חיוביים אנטי RVFV, הראו פעילות תעתיק מופחתת. לעומת זאת, wheתאי n היו נגועים בrMP12-C13type, 91.6% מתאים בסך הכל, או 97% מתאים חיוביים אנטי RVFV, הראו פעילות תעתיק שהיה דומה לזה של תאים נגועים מדומים. 3B איור מתאר את אותם נתונים כמו איור 3 א בצורה של היסטוגרמה לקרינת RNA תיוג עם האיחוד האירופי התאגדות.
איור 1. מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים נגועים עם 293 תאי MP-12 וrMP12-C13type. היו מדומה נגוע או נגוע או MP-12 או מחיקת NSS המוטציה RMP-12-C13type. בין 15 ל 16 HPI, תאים תויגו עם 1 מ"מ איחוד אירופי. כביקורת על דיכוי תעתיק, טופלו תאים נגועים מדומים עם 5 מ"ג / מ"ל ActD במקביל לטיפול באיחוד האירופי. גרעינים הם דמיינו דרך מכתים DAPI (כחול), ביטוי של חלבונים נגיפיים הוא מדמיין על ידי צביעה עם נוגדנים נגד RVFV (ירוק), ו-RNA הוא לדמייןד על ידי זיהוי של האיחוד האירופי המשולב עם אזיד שכותרתו עם צבע פלואורסצנטי (מקסימום עירור / פליטה: 590/617 ננומטר) (אדום).
איור 2. מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאי transfected עם RNA במבחנה מסונתזת לאו GFP או NSS MP-12. 293 תאים היו מדומה transfected, או transfected עם מסונתזת במבחנה רנ"א לקידוד או GFP או NSS MP-12. בין 15 ל 16 שעות posttransfection, תאים תויגו עם 1 מ"מ איחוד אירופי. כביקורת על דיכוי תעתיק, טופלו תאי transfected מדומים עם 5 מ"ג / מ"ל ActD במקביל לטיפול באיחוד האירופי. הביטוי של ה-GFP הוא מדמיין על ידי צביעה עם נוגדן אנטי GFP (GI), הביטוי של NSS הוא מדמיין על ידי צביעה עם נוגדנים נגד RVFV (AF, ק"מ) ואחריו אנטי עכבר IgG מצומדות לצבע פלואורסצנטי (עירור / פליטה maximuמ ': 495/519 ננומטר) (ירוק), ו-RNA הוא דמיינו ידי זיהוי של האיחוד האירופי המשולב עם אזיד שכותרתו עם צבע פלואורסצנטי (מקסימום עירור / פליטה: 590/617 ננומטר) (אדום).
איור 3. (א) ניתוח תזרים cytometric של תאים נגועים בMP-12 או rMP12-C13type. תאים נגועים היו מבוים, או נגוע או MP-12 או rMP12-C13type. בין 12 ל 13 HPI, תאים תויגו עם 0.5 מ"מ איחוד אירופי. כביקורת על דיכוי תעתיק, טופלו תאי transfected מדומים עם 5 מיקרוגרם / מ"ל ActD במקביל לטיפול באיחוד האירופי. ביטוי של חלבונים נגיפיים הוא מדמיין על ידי צביעה עם נוגדנים נגד RVFV אחריו נוגדנים משני שכותרתו עם צבע פלואורסצנטי (מקסימום עירור / פליטה: 495/519 ננומטר) (אנטי RVFV) ו-RNA הוא דמיינו ידי זיהוי של האיחוד האירופי המשולב עם אזיד שכותרתו עם צבע פלואורסצנטי (מקסימום עירור / פליטה: 650/665 ננומטר) (RNA). DATמיוצג כעלילת פיזור. (ב) ייצוג של אותם הנתונים שמוצג כבהיסטוגרמה. עוצמת הקרינה לאיחוד האירופי היא ההתאגדות זממה על ציר x, ספירת תאים נרשמות על ציר ה-Y. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול סיפק מתאר שיטה למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בשעתוק תא מארח באמצעות שילוב של uridine האנלוגי האיחוד האירופי לרנ"א המתהווה. לשיטה זו מספר יתרונות על פני שיטות קודמות: הוא מהיר, רגיש, ושאינו מסתמך על השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים. יתר על כן, ניתן להתאים את השיטה להניב נתונים איכותניים דרך מיקרוסקופ פלואורסצנטי או נתונים כמותיים באמצעות cytometry הזרימה באמצעות את אותם חומרים כימיים. בשילוב עם מכתים immunofluorescence לאנטיגנים נגיפיים, שיטה זו גם מאפשרת לחוקר לנקוט בהבחנה נגועה מהתאים נגועים.
חשוב לציין כי שיטה זו גם מתייגת רנ"א הנגיפי מסונתז חדש באותו קצב כפי שמתייג תמלילים מארחים, חסרון אשר משותף עם שיטות אחרות הנשענות על 3 H-uridine או התאגדות ברו. לפחות במקרה של זיהום RVFV MP-12, לעומת זאת, מצאנו כי אמוUNT של תמלילי מארחות על ידי עולה בהרבה על הסכום של תמלילים נגיפיים, ולכן השפעתו של רנ"א הנגיפי על רנ"א הכל נמדד על ידי assay זה היא זניחה. כאשר התאמת פרוטוקול זה לשימוש עם וירוס אחר, חוקרים מומלץ לזהות תעתיקים נגיפיים או דרך הלוקליזציה שלהם, באמצעות טיפול בתאים נגועים עם ActD, או אף הכלאה באתרו ניאון (דגים) 15. אם הקצב שכפול הנגיף בציטופלסמה, כגון MP-12, ולאחר מכן ניתן להבחין בקלות מרנ"א הנגיפי RNA הסלולרי, שעדיין בעיקר כלול בגרעין לאחר שעה 1 של תיוג. יכולים גם להיות מטופלים עם תאים נגועים ActD לדכא שעתוק תא מארח תוך השארת סינתזת רנ"א נגיפית מעושה. פונקציות ActD באמצעות קשירה גדילי הדנ"א כפול 16, ולכן רק מעכבת שעתוק דנ"א תלוי אך אין לה השפעה על polymerases RNA RNA תלויה ויראליות.
בעת ביצוע פרוטוקול זה, זה הוא קריטי כדי למנועזיהום עם nucleases בין permeabilization ותגובת תיוג קליק, כמו האיחוד האירופי שכותרתו RNA נשאר רגיש להשפלה על ידי RNases 3. יתרה מזאת, חוקרים צריכים לפנות מייד לתגובת תיוג קליק, כפעמי דגירה ממושכות בין קיבעון ולחצו על תיוג תגובה, אפילו על 4 מעלות צלזיוס, לגרום להשפלתו של רנ"א וסופו של דבר יגרום לאובדן של אות הקרינה רנ"א. זוהי דאגה מיוחדת בעת ביצוע ניסויים בזמן כמובן, חוקרים צריכים לתכנן את הניסויים שלהם, כך שיכולים להיות שכותרתו את כל התאים, קבועים, ומוכתם באותו הזמן. למרבה המזל, אות הקרינה RNA נותרת יציבה לאחר תגובת התיוג לחץ, כך בפרוטוקול בקלות ניתן לעצור לאחר שלב זה.
לבסוף, חוקרים צריכים לזכור כי השפעת cytopathic (CPE) הנגרמת על ידי וירוסים רבים משפיעה לרעה על סינתזת RNA הסלולרית גם בהיעדרו של כל דיכוי תעתיק ספציפי. זהלכן חשוב למדוד פעילות תעתיק בזיהום שלאחר זמן שבו תאים עדיין בת קיימא. אם וירוס מוטציה זמין שחסר את היכולת לדכא שעתוק, כגון RMP-12-C13type (איורים 1 ו -3), זה יכול להיות כלי נהדר בקביעת נקודת הזמן האופטימלית למדידת שעתוק.
כאשר מתכננים מספר רב של ניסויים, חוקרים ייתכן שירצו לשקול תיוג ישיר של הנוגדן הראשוני שלהם עם fluorochrome 17, ובכך למנוע את הצורך בנוגדנים משני והפחתת הזמן הנדרש לצורך זיהוי של אנטיגנים נגיפיים.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק דרך מהירה ואמינה למדידת ההשפעה של זיהום ויראלי בשעתוק תא מארח. זה יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם וירוסים שונים ויש לו את הפוטנציאל להיות שונה כדי לכלול immunostainings לחלבונים נגיפיים או סלולריים ספציפיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו מודים RB Tesh למתן העכבר polyclonal אנטי RVFV נסיוב ומ 'גריפין של מתקן Core cytometry זרימת UTMB לעזרה עם cytometry הזרימה. עבודה זו נתמכה על ידי 5 U54 AI057156 באמצעות המרכז האזורי המערבי של אקסלנס, מענק NIH R01 AI08764301, ומימון ממרכז Sealy לפיתוח חיסון בUTMB.BK נתמכה על ידי מלגת קרן מקלפלין וו ג'יימס בUTMB.OL נתמכה על ידי פרס מוריס הילמן ר 'בשלב מוקדם בקריירה חוקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ethynyl-uridine | Berry Associates | PY 7563 | dissolve in DMSO for 100 mM stock |
| 12-mm round coverslips | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | dissolve in DMSO for 10 mM stock |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | dissolve in H2O for 100 mM stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | dissolve in H2O for 5 mg/ml stock |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-5960 | dissolve in H2O for 500 mM |
| paper filter | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-lysine (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescence Microscope | e.g. Olympus IX71 | ||
| Flow Cytometer | e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa |
References
- Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
- Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies. Cytometry. 14, 455-458 (1993).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Kalveram, B., et al. Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR. Virology. , (2012).
- Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation. PLoS One. 7, e45730 (2012).
- Lihoradova, O. A., et al. Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus. PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181 (2013).
- Kalveram, B., Ikegami, T. Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase. J. Virol. , (2013).
- Schmaljohn, C., Nichol, S. In Fields Virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams and Wilkins. 1741-1789 (2007).
- Le May, N., et al. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development. J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH). J. Vis. Exp. , e4002 (2012).
- Reich, E., Goldberg, I. H.
- Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).
