Summary
Vi presentiamo un protocollo per lo studio in vitro delle pompe di efflusso da Pseudomonas aeruginosa. Questo protocollo consente la generazione di un robusto, reversibile e regolabile gradiente protonico all'interno della membrana del liposoma e quindi dovrebbe essere adattabile a qualsiasi proteina di membrana eccitato dalla forza protomotive.
Abstract
C'è un bisogno emergente scientifico di strumenti affidabili per il monitoraggio del trasporto delle proteine di membrana. Presentiamo una metodologia che porta alla ricostituzione di pompe di efflusso da batteri Gram-negativi Pseudomonas aeruginosa in un ambiente biomimetico che consente una accurata indagine della loro attività di trasporto. Siano soddisfatte tre condizioni preliminari: compartimentazione in un ambiente lipidico, l'uso di un indice rilevante per i trasporti, e la generazione di un gradiente protonico. Il trasportatore proteina di membrana viene ricostituito in liposomi insieme con batteriorodopsina, una pompa protonica attivato dalla luce che genera un gradiente protonico che sia robusto e reversibile e regolabile. L'attività della proteina è dedotto dalle variazioni di pH che si verificano all'interno del liposoma, utilizzando pyranin, una sonda fluorescente pH-dipendente. Descriviamo una procedura passo-passo dove purificazione di proteine di membrana, la formazione di liposomi, proteine ricostituzione, e un trasportonalisi sono rivolte. Anche se sono stati progettati specificamente per un trasportatore RND, i metodi descritti potrebbero potenzialmente essere adattati per l'uso con qualsiasi altra proteina di membrana trasportatore alimentato da un gradiente protonico.
Introduction
Proteine integrali di membrana rappresentano fino al 30% dei geni codificati in genomi eucariotici. Essi condividono un ruolo fondamentale come mantenimento del cancello (recettori), trasporto di nutrienti, ioni o composti nocivi (trasportatori) o il mantenimento della permeabilità attraverso doppi strati di membrana (canali) tra tutte le cellule viventi 1. Efflux pompe hanno un ruolo centrale nella resistenza contro la terapia antibiotica 2. Nei batteri Gram-negativi Pseudomonas aeruginosa, che è protetto da una membrana esterna, trasportatori di efflusso sono organizzati come sistemi tripartito dove MexB, la pompa di efflusso si trova nella membrana interna, funziona in combinazione con Mexa, una proteina periplasmatico, e OprM e delle canale membrana esterna. La proteina citoplasmatica membrana interna agisce come una pompa energia-dipendente con un'ampia specificità di substrato. La proteina di membrana esterna funge porina mentre il terzo si trova nello spazio periplasmatico ed è pensato per stabilizzare l'intero complesso Informazioni strutturali ha accumulato negli ultimi cinque anni grazie alla determinazione di raggi X della proteina AcrB omologa da Escherichia coli 4-7. Anche se è chiaramente importante accoppiare queste informazioni con i dati dinamici e cinetici, la progettazione di un saggio funzionale per questo trasportatore è una vera sfida 8. Infatti, le proteine di membrana devono essere mantenuti in un ambiente membranosa e un vano chiuso devono essere mantenuti per un trasporto vettoriale di substrato da raggiungere. Ricostituzione di proteine di membrana in proteoliposomi è stato ampiamente presentato e recensito (vedi Rigaud e Levy 9). Tali protocolli consentono il monitoraggio della membrana proteine attività, ad esempio seguendo i substrati attraverso la membrana del liposoma. In questo caso le limitazioni derivano dal unvailability di substrati titolabili (fluorescente, radioattivi, ecc.) e dal fatto che molto spesso questi substrati sono idrofobi e hanno la tendenza ad attraversare le membrane indipendentemente dalla presenza del trasportatore. In alternativa, si può seguire le variazioni spettroscopiche di un colorante notifica sensibile ai cambiamenti chimici che si verificano a seguito di trasporto. Come detto sopra, i protoni energizzare il trasporto via MexB. Quindi, un'opzione rilevante è quello di monitorare le variazioni spettroscopiche di una segnalazione colorante sensibile al pH di seguire le variazioni di pH dovute al trasporto substrato protone-driven. La scelta di un colorante fluorescente evita qualsiasi effetto artefatti dovuti alla natura idrofoba del substrato. Un'ulteriore difficoltà è la generazione di un gradiente protonico. Diversi protocolli sono disponibili in letteratura. Tra questi, l'uso della tecnica valinomicina è molto diffusa ma abbiamo dimostrato che è noioso per eseguire 10-11. Inoltre ènon riproducibile e non è reversibile. Abbiamo ricorso all'uso di batteriorodopsina (BR), una pompa protonica fotoattivabile da Halobacter Salinarium, un halophilic marino Gram-negativi obbligato archaeon aerobico. Questa proteina è coreconstituted nei liposomi con MexB e, sotto illuminazione, BR pompe protoni all'interno dei liposomi e quindi crea il ΔpH (acido all'interno) necessario per la proteina di trasporto del substrato 12-13.
Protocol
1. Proteine produzione e purificazione
- MEXA, MexB da Pseudomonas aeruginosa
- Trasforma i plasmidi che ospitano i geni MEXA e MexB in E. coli ceppo di produzione (ad esempio C43 DE3). Piatto su LB Agar supplementato con l'antibiotico appropriato. Scegli una singola colonia per inoculare un precoltura O / N. La mattina dopo, inoculare il precoltura in 1 L di LB e di crescere a 37 ° C sotto agitazione (240 rpm).
- Una volta che le cellule hanno raggiunto la fase esponenziale (OD 600 = 0,6-0,8) inducono con 1 mM IPTG. Eseguire di induzione per 2-3 ore a 30 ° C sotto agitazione.
- Centrifugare le cellule (9.000 xg per 20 min) e risospendere in 30 ml Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mm.
- Distruggere le cellule utilizzando una pressa francese (10.000 psi, 4 pass). Eliminare le celle continue e corpi di inclusione per centrifugazione a 9.000 xg per 20 min.
- Membrane pellet 1 ora a 100.000 xg e resuspend ciascun pellet in 30 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolo 20% (w / v), imidazolo 10 mM, NaCl 500 mM.
- Determinare la concentrazione totale di proteine di membrana utilizzando il saggio colorimetrico BCA e solubilizzare le membrane O / N con 2% maltoside dodecil (DDM) in un volume finale determinata in modo tale detergente: proteina è 1:1,5 (w / w).
- Ultracentrifuga a 100.000 xg per 1 ora di disfarsi del materiale non solubilizzato e aggregati.
- Incubare il supernatante per 2 ore a 4 ° C con una resina al nichel (Mexa purificazione) o una resina di cobalto (MexB purificazione) equilibrata con Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolo 5% (w / v), imidazolo 10 mM, NaCl 500 mm, DDM 0,2%.
- Versare la resina in una colonna vuota. Raccogliere il flusso attraverso.
- Lavare la resina con 50 ml di Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolo 20% (w / v), imidazolo 10 mM, NaCl 500 mM, DDM 0,2%, poi con 25 ml di Bis-Tris 10 mM pH 6, glicerolo 5% (w / v), imidazolo 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM.
- Eluire il protein con 20 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolo 5% (w / v), imidazolo 300 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM.
- Concentrare la proteina di un dispositivo di ultrafiltrazione fino a 3 ml e il carico su una colonna dissalazione equilibrata con un buffer libero-imidazolo. Poco prima di ricostituzione (vedi sotto), Ultracentrifuge le proteine solubilizzate (100.000 xg per 20 min) per sbarazzarsi di lipidi e proteine unsolubilized. Poi ancora alla concentrazione della proteina di 0,3 ml.
- Batteriorodopsina da Halobacter Salinarium
- Crescere le cellule Salinarium Halobacter sotto illuminazione a 37 ° C per 10 giorni in un mezzo di crescita liquido contenente NaCl 4 M, MgSO4 150 mM, citrato 10 mM, KCl 30 mM, estratto di lievito 5 g / L, e peptone 5 g / L.
- Distruggere le cellule da dialisi contro acqua deionizzata.
- Purificare la membrana viola su un 30-40% (w / v) gradiente di saccarosio (100.000 xg per 17 hr).
- Solubilizzare la sospensione membrana con 2% octylglucoside per 24 ore a 37 ° C (volume per la solubilizzazione per risospendere membrana a 2:1 (w / w) di detergenti: rapporto di proteina). Stimare la concentrazione di BR solubilizzato con ε (570 nm) = 54.000 M -1 cm -1. Poco prima di ricostituzione (vedi sotto), Ultracentrifuge BR solubilizzato (100.000 xg per 20 min) per sbarazzarsi di lipidi e proteine unsolubilized.
Nota: Le membrane native sono naturalmente arricchite in BR quindi non è necessario ulteriore purificazione.
2. Preparazione di proteoliposomi
- Formazione di liposomi: Mettere 400 ml di DOPC disciolti in cloroformio (25 mg / ml) in un bicchiere di vetro e aggiungere 1,5 mg di colesterolo memorizzato come polvere. Asciugarle appena prima manipolazione sotto un vapore di azoto o sotto vuoto per almeno 1 ora in un bicchiere di vetro. Il DOPC: rapporto molare colesterolo è 3.3:1.
- Dopo che si sono asciugati, idratare i lipidi di 1 ml di HEPES 25 mM pH 7,K 2 SO 4 100 mM, MgCl 2 2 mM, 2 mM pyranine. La sospensione dovrebbe apparire torbida in questa fase.
- Riscaldare la soluzione per 10 minuti a 37 ° C. Ultrasuoni per 10 min a 40 W con 30 sec impulsi, 30 cicli di pausa sec a RT. La sospensione dovrebbe apparire chiaro in questa fase.
- Per ottenere una popolazione monodisperse di liposomi, eseguire due cicli di estrusione e per ogni ciclo, passare la sospensione di liposomi attraverso il filtro almeno 11x. Per il primo ciclo, utilizzare una dimensione dei pori di membrana di 200 nm e per il secondo ciclo, utilizzare una dimensione dei pori di membrana di 100 nm. Misure di scattering di luce dinamici possono essere eseguite in questa fase per verificare l'omogeneità della sospensione.
- Proteine incorporazione
Principio: membrana proteine possono essere ricostituiti in liposomi per effetto solubilizzante dei detergenti. Liposomi detergente-solubilizzati vengono incubati con la proteina di membrana detergente-solubilizzato e formazione del proteoliposomes è innescato da una rapida eliminazione del detergente con perle di polistirene 9.- Aggiungere 28 mg di Triton X-100 (0,56% finale) e incubare O / N a 4 ° C (la temperatura di solubilizzazione può essere adattato alla proteina studiata).
- Aggiungere il detersivo proteina-solubilizzato (BR, MexB e Mexa) ai liposomi solubilizzate e incubare 15 min a 4 ° C. Aggiungere le proteine per la sospensione di liposomi solubilizzato i seguenti rapporti (w / w): lipidi / MexB = 20, MexB / MEXA = 2.5, e lipidi / BR = 30.
- Aggiungere perle di polistirene ad un 30:1 branelli: rapporto detergente (w / w, considerando il peso totale di detersivo, compreso detersivo aggiunto con le proteine purificate) e incubare 5 ore, al buio (a causa della BR) a temperatura ambiente sotto leggera mescolando. Prima di questa procedura, attivare i biobeads con metanolo ed etanolo incubazione e ampiamente lavare con acqua.
- Purificare la proteina proteoliposomi e substrati gratuitamente utilizzando un PD-10colonna dissalazione equilibrata con HEPES pH 25 mM 7, K 2 SO 4 e 100 mM MgCl 2 2 mM.
- Conservare le proteoliposomi a 18 ° C al buio per un massimo di 2-3 settimane.
- Valutazione dell'efficacia ricostituzione su gradiente di saccarosio.
Per controllare che sia il MexB e BR sono stati ricostituiti in liposomi, purificare la sospensione proteoliposome su un gradiente di saccarosio discontinuo.- Depositarsi delicatamente i proteoliposomi su un gradiente cinque strati di saccarosio (60%, 20%, 10%, 5% e 2,5%, w / v).
- Ultracentrifuga per 17 ore a 100.000 xg (con l'accelerazione minima e decelerazione).
- Raccogliere accuratamente le varie frazioni gradiente (in particolare le interfacce tra ogni strato di saccarosio) e analizzarli su SDS-PAGE (10%) con Coomassie colorazione o Western blotting. Proteine aggregate si trovano nella parte inferiore del tubo, mentre, proteine detergenti-solubilizzato nonincorporated si trovano nella parte superioreil tubo. Proteoliposomi e liposomi sono disponibili all'indirizzo interfacce saccarosio corrispondenti alla loro densità intrinseca. Liposomi vuoti sono recuperate più in alto nel gradiente rispetto alle proteoliposomi.
3. Fluorescenza di misura
- Effettuare misure di fluorescenza a 25,0 ° C usando un spettrofluorimetro consentendo misure a doppia lunghezza d'onda (lampada Xe, 150 W). Periodi di illuminazione alternativi (per attivare BR con lunghezze d'onda di eccitazione / emissione di 550 nm / 550 nm) e misure di fluorescenza con lunghezze d'onda di eccitazione / emissione di 455 nm / 509 nm per 2 secondi per misurare la fluorescenza pyranine. Impostare eccitazione e di emissione larghezze di banda di 5 nm. Effettuare le misure in presenza di 50 nM valinomicina per impedire la formazione di un potenziale di membrana ΔΨ inverso.
Nota: Infatti, poiché il BR pompe protoni, ci sono più cariche positive all'interno del liposoma che all'esterno. Questa caricagradiente può essere eliminata utilizzando valinomicina, che è un K + ionoforo selettiva. Una volta aggiunto alla valinomicina liposomi sospensione, come una molecola idrofobica, inserirà nella membrana del liposoma, passivamente trasportare K +, e quindi dissipare il potenziale ΔΨ membrana.
Representative Results
Il test consiste nel monitorare pyranine fluorescenza in funzione del tempo, mentre viene generato un gradiente protonico. A questo scopo, i campioni sono sottoposti, in alternativa all'illuminazione (quindi protoni di pompaggio dalla BR è attivato) e poi a fluorescenza misurazione con l'eccitazione e l'emissione lunghezze d'onda della pyranine (λ ex = 455 nm e λ em = 509 nm).
La Figura 1 mostra un controllo rappresentativo ottenute con il test, in assenza di Mexa / MexB, verificare che il gradiente protonico generato dalla BR è reversibile. Dopo un ciclo di acidificazione, proteoliposomi vengono tenuti al buio per 45 minuti in modo che il BR di smettere di pompare protoni (protoni diffondono lentamente e passivamente attraverso doppi strati lipidici dopo il loro gradiente di concentrazione). Dopo questo tempo di recupero, l'attivazione di BR è possibile, semplicemente illuminando di nuovo la stessa sospensione.
Figura 2corrisponde ad una misura effettiva trasporto. Un controllo negativo con proteine liposomi gratuite mostra che, come previsto, il pH è costante su di illuminazione (Figure 2A e 2B, cerchi arancioni). Tuttavia, proteoliposomi contenenti BR nelle loro membrane non pompa protonica, quindi il pH all'interno diminuisce liposomi e un gradiente stabile è costruito (Figure 2A e 2B, piazze viola). Triangoli grigi e diamanti rossi (Figura 2A) rappresentano pH all'interno di proteoliposomi contenenti BR e MexB, in presenza o in assenza di Hoechst 33342, rispettivamente. Osserviamo un'attività substrato-indipendente dove il gradiente di protoni è solo parzialmente dissipata dal MexB contro-trasporto. Noi attribuiamo questa osservazione ad una attività basale di MexB.
Al fine di testare l'effetto di Mexa sull'attività di MexB, Mexa stato aggiunto alla ricostituzione, prima in assenza di qualsiasi substrato (
. Figura 1 Reversibilità del gradiente protonico costruito da illuminazione BR: Pyranine fluorescence di proteoliposomi BR misurati in funzione del tempo. Da 0-15 min, BR pompe protoni a seguito dell'attivazione luce. Da 15-60 min, proteoliposomi vengono incubati al buio, durante questo tempo, protoni passivamente muovono fuori dei liposomi fino a pH intravesicular e pH extravesicular sono uguali. Dal 60-75 min, BR è ancora funzionante e pompe di protoni su illuminazione.
. Figura 2 Transport saggio: pyranine fluorescenza, convertito nel corrispondente variazioni di pH, in funzione del tempo A) pH all'interno dei liposomi di controllo (cerchi arancione); pH all'interno di proteoliposomi contenenti BR nella membrana (quadrati viola); pH all'interno. di proteoliposomi contenenti BR, e MexB nella membrana senza Hoechst 33342 (rosso diamonds); pH interno del proteoliposomi contenenti BR e MexB nella membrana con Hoechst 33342 (triangoli grigi) B) pH all'interno dei liposomi di controllo (cerchi arancioni);. pH all'interno del proteoliposomi contenenti BR nella membrana (piazze viola); pH interno di proteoliposomi contenenti BR, MexB e MEXA nella membrana, senza Hoechst 33342 (diamanti blu); pH interno del proteoliposomi contenenti BR, MexB e MEXA nella membrana con Hoechst 33342 (triangoli verdi).
Discussion
Descriviamo una procedura di ricostituzione progettato per saggiare trasporto delle proteine di membrana. Una volta stabilita, la procedura di ricostituzione proteina causa di misure che sono molto riproducibili. Tuttavia, le condizioni esatte per ricostituire la proteina variano da una proteina all'altra. Molta cura deve essere presa per ottimizzare i seguenti parametri: i) qualità della purificazione (purezza e l'assenza di materiale aggregato); ii) l'efficienza della fase di detersivo solubilizzante (quando possibile, partire detersivo CMC dovrebbe essere preferito perché sono più facili da ottenere liberati); iii) desorbimento del detersivo (è ad esempio possibile combinare l'uso di perle di polistirene con una fase di dialisi ma puo influenzare la velocità di desorbimento, un parametro critico per la successiva attività della proteina, vedi rif [ 9]); iv) ricostituzione lipidica (la natura chimica del lipide, il lipide rapporto proteina, la presenza di ulteriori amphiphiles sono parametri critici che devono essere varia e ottimizzati). In aggiunta la temperatura e il tempo di incubazione influenzare tutti questi problemi.
Il controllo di qualità è quindi primordiale in ogni fase della procedura di ricostituzione. Da questo punto di vista, dispersione della luce è una tecnica molto conveniente perché è rapida, non distruttiva, e richiede solo 20 ml di campione ad una concentrazione nel range micromolare. Una volta formati i proteoliposomi, gradiente di saccarosio è anche di grande aiuto perché apre la strada alla verifica sistematica della ricostituzione: qualitativa (è la proteina effettivamente incorporato nella membrana del liposoma) e quantitativa (quante proteine in un liposoma). Questi ultimi sarebbero trattate misurando precisamente la proteina e concentrazioni lipidiche.
Il nostro test non si basa sulla titolazione del substrato stesso e questo evita considerazioni disagio per quanto riguarda possibili diffusione passiva artefatta di la molecola causa di partizionamento idrofobico nelle membrane. Il test sfrutta le proprietà di pyranine come sonda affidabile e quantitativa per modifiche monitoraggio del pH. I nostri risultati sono in accordo con i risultati ottenuti con un altro procedimento in cui la formazione gradiente protonico è stato eseguito utilizzando valinomicina 10, ma consente una più robusta e riproducibile gradiente 11. Inoltre, il gradiente protonico può essere regolato con precisione, semplicemente variando la concentrazione del tampone (per maggiori dettagli si veda Verchere et al. 12).
Nella procedura una misurazione di controllo viene eseguita prima in assenza del substrato (questo dà accesso all'attività passiva della proteina). L'attuale attività del trasportatore proteina di membrana viene misurata dopo il substrato è stato aggiunto nella stessa cuvetta. Questo è veramente un bene perché l'esperimento può essere considerato un autentico, risultato, non ambiguo substrato indotta.
ent "> Il protocollo potrebbe essere adattato per il throughput medio-alta (ad esempio 96-pozzetti misurazioni) automatizzazione perché illuminando il campione innesca la reazione. Automazione e parallelizzazione consisterebbe nel preparare una grande serie di proteoliposome, e nel dispensare aliquote in 96 -pozzetti piastra. Substrati (e anche possibili inibitori) sarebbero poi aggiunti e dopo incubazione al buio per 45 minuti il piatto sarebbe stato sottoposto a cicli di misurazione della fluorescenza illuminazione / pyranine su un lettore di micropiastre.Per ulteriori informazioni sul protocollo, i lettori sono invitati a leggere Verchere et al. 12,13
Disclosures
Non c'è nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dalla Agence Nationale de la Recherche (progetto ANR-2010-BLAN-1535) e da una sovvenzione da Région Ile-de-France (DIM-Malinf 110058).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C8667 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93427 | |
| Valinomycin | Invitrogen | V-1644 | |
| Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid) | Invitrogen | H-348 | |
| DDM (n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside) | Affymetrix | D310LA | |
| Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes) | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 | |
| Econo-Pac Chromatography empty column | Biorad | 732-1010 | |
| Desalting columns | Bio-Rad | 54805 | |
| Dynamic light scattering instrument | Wyatt Technology | DynaPro NanoStar | |
| Fluorometer JASCO FP-6200 | JASCO | 6816-J002A |
References
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