Vi presenterar ett protokoll för utredning av effluxpumpar från Pseudomonas aeruginosa in vitro. Detta protokoll gör det möjligt för alstringen av en robust, reversibel och avstämbar protongradient inuti liposommembranet och därför bör kunna anpassas till varje membranprotein aktiveras av protomotive kraft.
Det är en växande vetenskaplig behovet av tillförlitliga verktyg för övervakning av membranprotein transport. Vi presenterar en metod som leder till upplösning av effluxpumpar från gramnegativa bakterier Pseudomonas aeruginosa i en biomimetisk miljö som gör det möjligt för en noggrann undersökning av deras verksamhet av transporter. Tre förutsättningar är uppfyllda: sektionering i ett lipidic miljö, användning av ett relevant index för transport, samt generering av en proton gradient. Den membranprotein transportören återställs till liposomer tillsammans med bacteriorhodopsin, ett ljusaktiverat protonpump som genererar en proton gradient som är robust och reversibel och avstämbara. Aktiviteten för proteinet som härletts från de pH-variationer som förekommer i liposomen, med användning PYRANIN, ett pH-beroende fluorescerande sond. Vi beskriver en steg-för-steg-förfarande där membranproteinrening, liposombildning, protein beredning och transport enNALYS behandlas. Även om de var särskilt utformade för en RND transportör, kan de beskrivna metoderna eventuellt anpassas för användning med andra membranprotein transportör aktiveras av en proton gradient.
Integrerade membranproteiner utgöra upp till 30% av de gener som kodas i eukaryota genom. De delar avgörande roller såsom gate hållning (receptorer), som transporterar näringsämnen, joner eller skadliga ämnen (transportörer) eller behålla av genomsläppligheten över membrandubbelskikt (kanaler) bland alla levande celler 1. Utflödespumpar har en central roll i resistens mot antibiotikabehandling 2. I gramnegativa bakterier Pseudomonas aeruginosa, som är skyddad av ett yttre membran, är uttransportörer organiserat som trepartssystemet där MexB, effluxpumpen belägen i det inre membranet, fungerar tillsammans med MexA, ett periplasmiskt protein och OprM, en yttermembrankanalen. Den cytoplasma inre membranproteinet fungerar som en energiberoende pump med bred substratspecificitet. Det yttre membranproteinet fungerar som en porin medan den tredje en är belägen i det periplasmatiska utrymmet och tros stabilisera hela komplexet <supp> 3. I det följande fokuserar vi på utformningen av en funktionell analys för MexA MexB församling.
Strukturell information har ackumulerats under de senaste fem åren tack vare röntgenbestämning av den homologa protein AcrB från Escherichia coli 4-7. Även om det är helt klart viktigt att koppla informationen med dynamiska och kinetiska data, utforma en funktionell analys för denna transportör är en verklig utmaning 8. I själva verket måste de membranproteiner bibehållas i ett membranliknande miljö och en sluten avdelning måste upprätthållas för en vektoriell transport av substratet som skall uppnås.
Beredning av membranproteiner i proteoliposomer har utförligt presenteras och omdömet (se Rigaud och Levy 9). Sådana protokoll möjliggöra övervakning av membranproteiner aktivitet, till exempel genom följande substraten över liposommembranet. I detta fall uppstår begränsningar från ettvailability titrerbar substrat (fluorescerande, radioaktiv osv.) och av det faktum att mycket ofta dessa substrat är hydrofoba och har en tendens att passera membranen oberoende av närvaron av transportören. Som ett alternativ kan man följa de spektroskopiska variationer av ett rapporterande färgämne känslig för kemiska förändringar som sker till följd av transporter. Såsom angivits ovan protoner energize transport via MexB. Därför är ett relevant alternativ för att övervaka spektroskopiska variationer av en pH-känslig rapportering färgämne för att följa pH-variationer på grund av proton-driven substrattransport. Valet av ett fluorescerande färgämne undviker alla artefaktuella effekter på grund av den hydrofoba naturen hos substratet.
En ytterligare svårighet är den generation av en proton-gradient. Flera protokoll finns i litteraturen. Bland dem är användningen av valinomycin teknik utbrett men vi har visat att det är jobbigt att utföra 10-11. Dessutom är detinte reproducerbar och det är inte reversibel. Vi har tillgripit användningen av bacteriorhodopsin (BR), ett ljusaktiverat protonpump från Halobacter salinarium, en halofiliskt marina gramnegativa obligat aerob archaeon. Detta protein coreconstituted i liposomer med MexB och, vid belysning, pumpar BR protoner inuti liposomerna och därmed skapar ApH (sur invändigt) som behövs av proteinet för att transportera substratet 12 till 13.
Vi beskriver en beredning förfarande utformat för att analysera membranproteintransport. När etablerade, leder protein rekonstitueringsproceduren till mätningar som är mycket reproducerbara. Dock kommer de exakta betingelserna för rekonstituering av proteinet varierar från ett protein till det andra. Mycket omsorg måste tas för att optimera följande parametrar: i) kvaliteten på reningen (renhet och avsaknad av aggregerat material), ii) effektivitet tvättmedels solubiliserande steg (när det är möjligt, bör låg cmc tvättmedel att föredra eftersom de är lättare att få kvitt); iii) desorption av detergenten (det är exempelvis möjligt att kombinera användningen av polystyrenpärlor med en dialyssteget men detta kan påverka hastigheten för desorption, en kritisk parameter för den efterföljande aktiviteten hos proteinet, se ref [ 9]), iv) lipid rekonstitution (den kemiska naturen hos den lipid, lipid till proteinförhållande, närvaron av ytterligare amphiphiles är kritiska parametrar som måste varieras och optimeras). Förutom temperatur och inkubationstid påverkar alla dessa frågor.
Kvalitetskontroll är alltså primordial vid varje steg av beredning. Ur denna synvinkel är ljusspridning en mycket lämplig teknik eftersom den är snabb, icke-förstörande, och det kräver endast 20 | il av provet vid en koncentration i det mikromolära området. När proteoliposomer bildas, är sukrosgradient också till stor hjälp eftersom det öppnar vägen för en systematisk kontroll av beredning: kvalitativa (är proteinet verkligen inbäddad i liposommembranet) och kvantitativ (hur många protein i en liposomer). Det senare skulle kunna åtgärdas genom att exakt mäta protein-och fetthalter.
Vår analys är inte beroende titreringen av substratet i sig och detta undviker oroliga överväganden rörande möjliga artefaktuella passiv diffusion av molekylen på grund av hydrofoba uppdelning i membranen. Analysen utnyttjar egenskaper pyranin som en tillförlitlig och kvantitativ sond för att övervaka pH-förändringar. Våra resultat överensstämmer med resultat som erhållits med ett annat förfarande där protongradient bildning utfördes med hjälp av valinomycin 10, men det tillåter en mer robust och reproducerbar lutning 11. Dessutom kan den protongradient vara exakt avstämda, helt enkelt genom att variera koncentrationen av bufferten (för ytterligare detaljer se Verchere et al. 12).
I det förfarande som en kontrollmätning utförs först i frånvaro av substrat (detta ger tillgång till den passiva proteinets aktivitet). Den faktiska membranprotein transportöraktivitet mäts sedan efter det att substratet har lagts till i samma kyvett. Detta är verkligen en tillgång eftersom experimentet kan anses vara en verklig, icke tvetydigt, substrat-inducerad utfall.
ent "> Protokollet kunde anpassas till hög-medelhög genomströmning (exempelvis 96-brunnar mätningar) automatisering eftersom belysa provet utlöser reaktionen. Automation och parallellisering skulle bestå i att förbereda en stor sats av proteoliposome, och dispense portioner i en 96 -brunnars platta. Substrat (och också möjliga inhibitorer) skulle sedan tillsättas och efter inkubering i mörker under 45 min plattan skulle utsättas för illuminerande / pyranin fluorescens mätcykler på en mikroplattläsare.För ytterligare information om protokoll, är läsarna uppmanas att läsa Verchere et al. 12,13
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av Agence Nationale de la Recherche (projekt ANR-2010-BLAN-1535) och genom ett bidrag från Region Ile-de-France (DIM-Malinf 110058).
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850375C |
Cholesterol | Sigma Aldrich | C8667 |
Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93427 |
Valinomycin | Invitrogen | V-1644 |
Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid) | Invitrogen | H-348 |
DDM (n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside) | Affymetrix | D310LA |
Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes) | Avanti Polar Lipids | 610000 |
Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 |
Econo-Pac Chromatography empty column | Biorad | 732-1010 |
Desalting columns | Bio-Rad | 54805 |
Dynamic light scattering instrument | Wyatt Technology | DynaPro NanoStar |
Fluorometer JASCO FP-6200 | JASCO | 6816-J002A |