Summary
우리는 녹농균에서 유출 펌프의 체외 조사에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 리포좀 막 내에서 강력한 가역 및 조정할 수있는 양성자 기울기의 생성을 허용하고 따라서 protomotive 힘에 의해 격려하는 막 단백질에 적용 할 수 있어야한다.
Abstract
세포막 단백질 수송을 모니터링하기위한 신뢰할 수있는 도구에 대한 신흥 과학적 필요가있다. 우리는 교통의 자신의 활동에 대한 정확한 조사를 위해 할 수있는 생체 모방 환경에서 그람 음성 세균 녹농균에서 유출 펌프의 재구성에 이르는 방법을 제시한다. 세 가지 전제 조건이 충족 : lipidic 환경, 교통의 해당 인덱스의 사용, 양성자 기울기의 세대 격실. 세포막 단백질 전달체 함께 박테리오로돕신 견고한뿐만 아니라 가역적 및 가변 인 양성자 구배를 생성하고 광 - 활성화 프로톤 펌프 리포좀으로 재구성된다. 단백질의 활성은 pyranin, pH에 의존하는 형광 프로브를 이용하여, 리포솜 내에서 발생 산도 변화로부터 추론된다. 우리는 단계별 절차 세포막 단백질 정제, 리포좀 형성, 단백질 재구성 및 전송을 설명(분석)가 해결됩니다. 그들은 특별히 RND 수송을 위해 고안된 것이지만, 기술 된 방법은 잠재적 양성자 구배 통전 다른 세포막 단백질 수송 체와 함께 사용하기 위해 적응 될 수있다.
Introduction
완전한 막 단백질은 진핵 생물의 게놈에 인코딩 유전자의 30 %를 나타냅니다. 그들은 같은 게이트 유지 (수용체), 영양분, 이온 또는 유해 화합물 (트랜스 포터)을 운반 또는 모든 살아있는 세포 1 사이 막 이중층 (채널)에 걸쳐 투과성의 유지 등의 중추적 인 역할을 공유 할 수 있습니다. 유출은 항생제 치료 2에 대한 저항의 중심 역할을 펌프. 그람 음성 세균의 외막에 의해 보호되는 녹농균은, 유출 운송은 MexB, 내부 막에있는 유출 펌프, MEXA, 세포질 단백질과 OprM와 함께 작동 삼자 시스템으로 구성되어 있습니다 외막 채널. 세포질 내부 막 단백질은 광범위한 기질 특이성과 에너지에 의존하는 펌프 역할을합니다. 세번째는 주변 세포질 공간에 있으며, 전체 복합체를 안정화하는 것으로 생각되는 반면 외막 단백질 포린 역할 구조 정보는 대장균 4-7에서 상동 단백질 AcrB의 X-선 결정에 지난 5 년간의 감사를 통해 축적하고있다. 그것은 분명이 수송에 대한 기능 분석을 디자인하는 동적 운동 데이터를 몇 이러한 정보에 대한 중요하지만 진정한 도전 8입니다. 실제로, 막 단백질은 멤브레인 형 환경에서 유지되어야하고 폐쇄 구획 달성 될 기판의 vectorial 전송을 위해 유지되어야한다. proteoliposomes에 막 단백질의 재구성 광범위하게 (리고 레비 9 참조) 제시 및 검토되었다. 이러한 프로토콜은 리포솜 막을 가로 질러 기판을 다음 순서 인스턴스 막 단백질 활성의 모니터링을 허용. 이 경우 제한에서 발생적정 기판 vailability (형광 방사능, 등.)과 매우 자주 이러한 기질은 소수성과 관계없이 수송의 존재의 세포막을 통과하는 경향이있다는 사실에서. 다른 방법으로, 하나는 교통의 결과로 발생하는 화학 변화에 민감보고 염료의 광학적 변화를 볼 수 있습니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 양자는 MexB를 통해 전송 전원을 공급. 따라서, 관련 옵션은 양성자 기반의 기판 이송으로 인한 산도의 변화를 수행 할 수있는 pH 민감성보고 염료의 분광 변화를 모니터하는 것입니다. 형광 염료의 선택은 기판의 소수성 성질에 따라 어떤 인공적 효과를 피한다. 추가적인 어려움 양성자 구배의 발생이다. 몇몇 프로토콜은 문헌에서 찾을 수있다. 그 중에서도 발리 노마 이신 (Valinomycin) 기술의 사용이 확대되고 있지만, 우리는 10-11을 수행하는 지루한 것으로 나타났습니다. 또한 그것은이다재현 할 수없는 그것은 되돌릴 수 없습니다. 우리는 박테리오로돕신 (BR), Halobacter의 salinarium에서 빛을 활성화 프로톤 펌프, 염성 해양 그람 음성 호기성 의무를 archaeon의 사용에 의지했다. 이 단백질은 조명에 따라, BR은 리포좀의 내부 양성자 펌프 따라서 기판 12-13을 수송하는 단백질을 필요로 (내부 산성) ΔpH를 생성, MexB와 리포좀에 coreconstituted된다.
Protocol
1. 단백질 생산 및 정제
- MEXA, 녹농균에서 MexB
- E.의 MEXA 및 MexB 유전자를 품고 플라스미드를 변환 콜라이 생산 균주 (예 C43 DE3). LB 한천 플레이트에 중간 적절한 항생제로 보충. O / N의 전 배양액을 접종하기 위해 하나의 식민지를 선택합니다. 다음 날 아침, LB의 1 L에 예비 배양을 접종하고 교반 (240 RPM)에서 37 ° C에서 성장한다.
- 세포가 기하 급수적 단계에 도달하면 (OD 600 = 0.6 ~ 0.8)을 1 mM의 IPTG로 유도한다. 교반하면서 30 ℃에서 2 ~ 3 시간 동안 유도를 수행합니다.
- 원심 분리기 세포 (20 분 9,000 XG) 30 ㎖의 트리스 - 염산하는 20 mM, pH가 8, 염화나트륨 150 mm 단위에 resuspend.
- 프랑스 언론 (10,000 PSI, 4 패스)를 사용하여 세포를 방해. 20 분 동안 9,000 XG에서 원심 분리하여 손상되지 않은 세포 봉입체를 폐기하십시오.
- 100,000 XG 및 R에서 펠렛 막 1 시간30 ㎖의 비스 - 트리스 10 mM의 pH를 7.4, 글리세롤 20 % (W / V), 이미 다졸 10 mM의 NaCl을 500 mM의 각 펠렛을 esuspend.
- BCA 비색 분석을 사용하여 전체 막 단백질 농도를 결정하고 그 세제 이렇게 결정된 최종 부피 2 % 도데 실 말토 사이드 (DDM)로 막은 O / N을 가용화 : 단백질 (w / w) 1:1.5이다.
- 비 가용화 및 집계 자료를 폐기하는 1 시간 동안 10 만 XG에 초 원심 분리기.
- 니켈 수지 (MEXA 정화) 또는 비스 - 트리스 10 mM의 pH를 7.4, 글리세롤 5 % 평형 코발트 수지 (MexB 정화)와 4 ° C에서 2 시간 동안 상층 액을 품어 (W / V), 이미 다졸 10 밀리미터, 염화나트륨 500 밀리미터, DDM 0.2 %.
- 빈 열에서 수지를 붓는다. 을 통해 흐름을 수집합니다.
- 다음 비스 - 트리스 10 mM의 pH를 7.4, 글리세롤 20 % (W / V), 이미 다졸 10 mM의 NaCl을 500 밀리미터, DDM 0.2 %, 비스 - 트리스 10 mM의 pH를 6, 글리세롤 25 ㎖와 50 ㎖로 수지를 세척 5 % (W / V), 이미 다졸 10 mM의 NaCl을 500 밀리미터, DDM 0.2 %.
- P 용출20 ㎖ 비스 - 트리스 10 mM의 pH를 7.4, 글리세롤 5 % (W / V), 이미 다졸 300 mM의 NaCl을 500 밀리미터, DDM은 0.2 %로 rotein.
- 이미 다졸없는 버퍼 평형 탈염 컬럼에 3 ㎖ 및 부하에 이르기까지 한외 여과 장치로 단백질을 집중한다. 그냥 재구성하기 전에 (아래 참조), 가용화 된 단백질 지질 및 unsolubilized 단백질을 제거하기 (20 분 10 XG)를 초 원심 분리기. 이어서 0.3 ml로 다시 농축 단백질.
- Halobacter의 salinarium에서 박테리오로돕신
- 염화나트륨 4 M, 망초 150 밀리미터, 구연산 된 10 mM, KCl을 30 ㎜, 효모 추출물 5g / L에, 그리고 펩톤 5g / L을 함유하는 액체 성장 매체에 10 일 동안 37 ° C에서 조명 아래 Halobacter의 salinarium 세포를 성장
- 탈 이온수에 대해 투석에 의해 세포를 방해.
- 30~40%에 보라색 막 (w / v)의 자당 기울기 (17 시간 동안 100,000 XG)를 정화.
- 2 % octylgluc으로 막 현탁액을 가용화37 ° C (: 단백질의 비율을 2:1 (w / w) 세제에서 막을 재현 탁하기 위해 가용화를위한 볼륨)에서 24 시간 동안 oside. ε (570 NM) = 54,000 M -1 cm -1을 사용하여 가용화 BR의 농도를 추정한다. 그냥 재구성하기 전에 (아래 참조), 지질 및 unsolubilized 단백질을 제거하는 가용화 BR (20 분 10 XG)를 초 원심 분리기.
참고 : 기본 막은 자연스럽게 그래서 더 정제가 필요하지 않습니다 BR에 충실.
2. Proteoliposomes의 준비
- 리포좀 형성 : 유리 비커에 클로로포름 (25 ㎎ / ㎖)에 용해 DOPC 400 μl를 넣고 가루로 저장 콜레스테롤의 1.5 밀리그램을 추가합니다. 유리 비커에 적어도 1 시간 동안 단지 질소, 진공 스팀에서 조작하기 전에 건조. DOPC는 : 콜레스테롤 몰비는 3.3:1이다.
- 그들은 건조 후, HEPES 25 mM의 pH를 7 1 ㎖의 지질을 수화K 2 SO 4 100 ㎜, MgCl2를 2 ㎜, pyranine 2 ㎜. 서스펜션은이 단계에서 혼탁이 나타납니다.
- 37 ℃에서 10 분 동안 용액을 가열 30 초 펄스, 실온에서 30 초 일시 정지 사이클 40 W에서 10 분 동안 초음파 처리. 서스펜션은이 단계에서 분명히 나타납니다.
- 리포좀의 단 분산 인구를 얻으려면, 압출의 2주기를 수행하고 각주기에, 적어도 11 배 필터를 통해 리포좀 현탁액을 전달합니다. 첫번째주기를 들어 200 ㎚의 막 공극 크기를 사용하고 제 2 사이클에 대한 100 ㎚의 막 공극 크기를 사용한다. 동적 광산란 측정은 현탁액의 균질성을 확인하기 위해이 단계에서 수행 될 수있다.
- 단백질 결합
원리 : 막 단백질은 세제의 용해 효과 리포좀 덕분에 재구성 할 수 있습니다. 세제 용해 리포좀은 P의 세제 용해 막 단백질과 형성과 배양roteoliposomes 폴리스티렌 비즈 9와 세제의 신속한 제거에 의해 트리거됩니다.- 트리톤 X-100 (최종 0.56 %)의 28 밀리그램을 추가하고 4 ° C (용해 온도는 단백질이 연구되고 적용 할 수 있습니다)에 O / N을 품어.
- 가용화 된 리포좀에 세제 용해 단백질 (BR, MexB 및 MEXA)를 추가하고 4 ℃에서 15 분 알을 품다 지질 / MexB = 20, MexB / MEXA = 2.5, 지질 / BR = 30 : 다음의 비율 (W / W)에서의 가용화 리포좀 현탁액에 단백질을 추가합니다.
- (정제 된 단백질을 첨가 세제를 포함한 세제의 총 중량을 고려하여 W / W,,) 세제 비율을 부드러운에서 RT에 (때문에 BR의) 어둠 속에서 5 시간을 품어 : 30:1 구슬에 폴리스티렌 비즈를 추가 교반. 이전 절차에, 메탄올, 에탄올 배양과 biobeads을 활성화하고 광범위하게 물로 씻을 것.
- PD-10을 사용하여 proteoliposomes 단백질과 무료 기판을 정화HEPES 25 mM의 pH를 7, K 2 평형 탈염 열 SO 4 100 ㎜, MgCl2를 2 ㎜.
- 최대 2 ~ 3 주 동안 어둠 속에서 18 ° C에서 proteoliposomes을 저장합니다.
- 자당 기울기의 재구성 효능 평가.
MexB 및 BR 모두 리포좀에 재구성되어 있는지 확인하기 위해 불연속 자당 기울기에 proteoliposome 서스펜션을 정화.- 부드럽게 자당의 5 층 구배에 proteoliposomes 정착 (60 %, 20 %, 10 %, 5 %, 2.5 %, w / v).
- (최소한의 가속 및 감속 속도로) 10 XG에 17 시간 동안 초 원심 분리기.
- 조심스럽게 다양한 그라데이션 분수 (자당의 각 층 사이, 특히 인터페이스)를 수집하고 쿠마시 염색 또는 웨스턴 블롯을 사용하여 SDS-PAGE (10 %)에이를 분석 할 수 있습니다. nonincorporated, 세제 용해 단백질의 맨 위에있는 동안 집계 된 단백질은 튜브의 하단에서 찾을 수 있습니다관. Proteoliposomes와 리포좀은 자신의 고유 밀도에 해당 자당 인터페이스에서 찾을 수 있습니다. 빈 리포솜은 proteoliposomes보다 그래디언트에서 멀리까지 복구됩니다.
3. 형광 측정
- 이중 파장 측정을 위해 허용하는 분광 (크세논 (Xe) 램프 150 W)를 사용하여 25.0 ° C에서 형광 측정을 수행합니다. 대체 조명 기간 (550 ㎚ / 550 ㎚의 여기 / 방출 파장 BR을 활성화하기 위해) 및 pyranine 형광을 측정하는 2 초 동안 455 ㎚ / 509 ㎚의 여기 / 방출 파장의 형광 측정. 5 nm의 여기 및 방출 대역폭을 설정합니다. 역방향 막 전위 ΔΨ의 형성을 방지하기 위해 50 nm의 발리 노마 이신 (Valinomycin)의 존재하에 측정을 수행한다.
참고 : 사실, BR은 양성자 펌프 때문에, 외부보다 리포좀 내부에 긍정적 인 책임이있다. 이 책임그라데이션은 K + 선택적 이온 운반체 인, 발리 노마 이신 (Valinomycin) 사용하여 삭제 할 수 있습니다. 일단 리포좀 현탁액에 첨가 발리 노마 이신 (Valinomycin), 소수성 분자로서, 리포솜 막에 삽입 수동적 K + 수송, 따라서 막 전위 ΔΨ을 방산한다.
Representative Results
분석은 양성자 구배가 생성되는 동안 시간의 함수로서 pyranine 형광을 모니터로 구성된다. 그 목적을 위해 샘플 (트리거 BR에 의해 따라서 양성자 펌프) 조명을 선택적으로 실시 된 후 여기 및 방출 pyranine의 파장을 이용하여 측정, 형광하는 (λ 전 = 455 nm의 및 λ EM은 509 nm의 =).
도 1은 BR에 의해 생성 된 양성자 구배 가역적임을 확인, MEXA / MexB의 부재에, 상기 분석으로 얻은 대표적인 컨트롤을 나타낸다. 산성화의 1주기 완료 후, proteoliposomes는 양성자 (양성자가 농도 구배 다음과 같은 지질 이중층에 걸쳐 천천히 수동적으로 확산) 펌핑 중지 BR에 대한 순서로 45 분 동안 어둠에 보관됩니다. 이 복구 시간 후, BR의 활성화는 단순히 다시 같은 서스펜션 조명에 의해 가능합니다.
그림 2실제 전송 측정에 해당합니다. 단백질 자유로운 리포좀과 음성 대조군은 예상대로, pH가 (도 2a 및도 2b, 오렌지 서클) 조명시 일정하다는 것을 보여준다. 그러나, 세포막에 BR을 포함 proteoliposomes, 따라서 리포좀 감소 내부의 pH와 안정된 구배가 내장되어 있습니다 (그림 2A와 2B, 보라색 사각형) 양성자 펌프 않습니다. 회색 삼각형 레드 다이아몬드 (도 2A)는 각각 존재 또는 훽스트 33342의 부재하에, BR 및 MexB 함유 proteoliposomes 내부의 pH를 나타낸다. 우리는 양성자 기울기가 부분적으로 만 MexB 카운터 수송에 의해 방출되는 기판 독립적 인 활동을 관찰합니다. 우리는 MexB의 기초 활동이 관측 때문이다.
MexB의 활성에 MEXA의 효과를 시험하기 위해, MEXA은 (제 어떠한 기판의 부재에서, 재구성에 첨가
. BR 조명에 의해 만들어진 양성자 기울기의 그림 1 가역성 : Pyranine 플로리다시간의 함수로서 측정 된 BR proteoliposomes의 uorescence. 0-15 분에서 BR 빛 활성화의 결과로 양성자 펌프. 15 ~ 60 분에서 proteoliposomes은 어둠 속에서 배양됩니다 intravesicular pH와 extravesicular pH가 동일 할 때까지이 시간 동안, 양자는 수동적으로 리포좀 밖으로 이동합니다. 60 ~ 75 분에서, BR은 여전히 기능과 조명에 양성자 펌프.
.. 그림 2 교통 분석 : pyranine 형광, 시간의 함수 제어 리포좀 (주황색 동그라미)의 내부 A) pH가 해당 산도의 변화로 변환; 막에있는 BR (보라색 사각형)를 포함 proteoliposomes 내부의 pH, 산도 내부 훽스트 33342 (빨강 D없이 막에 BR 및 MexB를 포함 proteoliposomes의. iamonds) 훽스트 33342 (회색 삼각형) B 제어 리포좀 (주황색 동그라미)의 내부)의 pH와 막에있는 BR과 MexB를 포함 proteoliposomes 내부의 pH, 막 (보라색 사각형)에 BR을 포함 proteoliposomes 내부의 pH, 산도 내부 훽스트 33342 (블루 다이아몬드)없이 막에 BR, MexB 및 MEXA를 포함 proteoliposomes의, 훽스트 33342 (녹색 삼각형)와 막에 BR, MexB 및 MEXA를 포함 proteoliposomes 내부의 pH.
Discussion
우리는 막 단백질 수송 시금 위해 설계된 재구성 절차를 설명한다. 일단 설정되면, 단백질 재구성 절차는 매우 재현성 측정에 이르게한다. 그러나 단백질을 재구성에 대한 정확한 조건은 하나의 단백질에서 다른 다릅니다. 대부분 치료는 다음과 같은 매개 변수를 최적화주의해야합니다 : 정화 (순도 및 집계 자료의 부재)의 I) 품질, 세제 용해 단계 (수의 II)의 효율성, 낮은 CMC 세제 선호한다 그들이 얻을 쉽게 때문에 ) 제거; 세제 III) 탈착 (그것이 투석 단계와 폴리스티렌 비드의 사용을 결합하지만 이것은 탈착의 비율, 단백질의 후속 활동에 대한 중요한 매개 변수에 영향을 미칠 수있는 예를 들어 가능 심판을 [참조 15]); IV) 지질 재구성 (지질의 화학적 성질, 단백질 비율 추가적인 amphiph의 존재로 지질레스)는 다양하고 최적화해야합니다 중요한 매개 변수입니다. 또한 온도와 배양 시간이 모든 문제에 영향을 미칩니다.
품질 관리는 재구성 절차의 각 단계에 따라서 원시이다. 그것은 빠른 비파괴이며, 단지 마이크로 몰 범위의 농도에서 샘플 20 ㎕를 요구하기 때문에 이러한 관점에서, 빛의 산란이 매우 편리한 기술이다. 질적 (단백질이 실제로 리포좀 막에 포함됩니다)뿐만 아니라 정량 (얼마나 많은 단백질 한 리포좀의) : proteoliposomes가 형성되면 그것을 재구성의 체계적인 검증을 향해 길을 열기 때문에, 자당 기울기는 큰 도움도. 후자 정확하게 단백질 및 지질 농도를 측정함으로써 해결 될 것이다.
우리의 분석은 기판 자체의 적정에 의존하지 않으며, 이는 가능 인공적 수동적 확산에 대한 불안 고려 피할 때문에 세포막의 소수성 분할에 분자. 분석은 모니터링 pH 변화에 대한 신뢰성 및 정량 조사로 pyranine의 속성을 이용한다. 우리의 결과는 양성자 구배 형성은 발리 노마 이신 (Valinomycin) (10)를 사용하여 실시 하였다 다른 프로 시저로 얻은 결과와 일치한다, 그러나 더 강력하고 재현성있게 구배 11. 또한, 양성자 구배 정확하게 단순히 (추가 세부 사항을 위해 Verchere 외. 12 참조) 버퍼의 농도를 변화시킴으로써 조정될 수있다.
제어 측정은 제 1 기판의 부재하에 수행되는 절차 (이는 단백질의 수동적 활동에 대한 액세스를 제공한다). 기판은 동일한 큐벳에 첨가 한 후 실제 세포막 단백질 수송 체 활성을 측정한다. 실험 진짜 비 모호, 기판 - 유도 결과로 간주 될 수 있기 때문 진정한 자산이다.
샘플을 조명하는 반응. 자동화 및 병렬화는 proteoliposome의 큰 배치를 준비 이루어져 것이다 트리거 때문에 ENT "> 프로토콜이 높은 매체 처리량 (예를 들어 96 - 웰 측정) 자동화에 적용 할 수 있으며, 96에서 분취 량을 디스 펜싱 - 웰 플레이트. 기판 (그리고 가능 억제제)을 첨가 할 것입니다 45 분 동안 어둠 속에서 부화 후 판은 마이크로 플레이트 리더에 조명 / pyranine 형광 측정주기를 실시 할 것입니다.프로토콜에 대한 자세한 내용은 독자가 Verchere 등을 읽어 초대합니다. (12, 13)
Disclosures
공개 아무것도 없다.
Acknowledgments
본 연구는 직원은 국립 드 라 공들인 (프로젝트 ANR-2010-BLAN-1535)에 의해 지역 일 레드 프랑스 (DIM-Malinf 110058을)에서 부여에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C8667 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93427 | |
| Valinomycin | Invitrogen | V-1644 | |
| Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid) | Invitrogen | H-348 | |
| DDM (n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside) | Affymetrix | D310LA | |
| Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes) | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 | |
| Econo-Pac Chromatography empty column | Biorad | 732-1010 | |
| Desalting columns | Bio-Rad | 54805 | |
| Dynamic light scattering instrument | Wyatt Technology | DynaPro NanoStar | |
| Fluorometer JASCO FP-6200 | JASCO | 6816-J002A |
References
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