نقدم بروتوكول للتحقيق في المختبر المضخات هروب رأس المال من الزائفة الزنجارية. هذا البروتوكول يسمح لتوليد قوية، عكسها، والانضباطي التدرج بروتون داخل الغشاء الحويصلية، وبالتالي يجب أن تكون قابلة للتكيف مع أي بروتين الغشاء تنشيط من قبل قوة protomotive.
هناك حاجة العلمية الناشئة عن أدوات موثوقة لرصد غشاء النقل البروتين. نقدم منهجية تؤدي إلى إعادة تشكيل مضخات هروب رأس المال من البكتيريا سالبة الجرام الزائفة الزنجارية في بيئة بيوميمتيك التي تسمح لإجراء تحقيق دقيق لنشاطهم النقل. يتم استيفاء ثلاثة شروط مسبقة: تحاوز في بيئة شحمي، استخدام مؤشر ذات الصلة للنقل، وتوليد التدرج بروتون. يتم إعادة تشكيل غشاء نقل البروتين في الجسيمات الشحمية جنبا إلى جنب مع جرثومي، وضوء تنشيط مضخة البروتون الذي يولد التدرج بروتون الذي هو قوي وكذلك عكسها والانضباطي. واستخلص من نشاط البروتين من اختلافات درجة الحموضة التي تحدث داخل الحويصلية، وذلك باستخدام pyranin، التحقيق الفلورسنت التي تعتمد على درجة الحموضة. وصفنا خطوة بخطوة الإجراء حيث تنقية البروتين غشاء، وتشكيل الحويصلية، البروتين إعادة، والنقل وnalysis يتم معالجتها. على الرغم من أنها تم تصميمها خصيصا لنقل التجمع الوطني الديمقراطي، يحتمل أن تتكيف الأساليب المذكورة للاستخدام مع أي نقل البروتين غشاء أخرى تنشط بها التدرج بروتون.
بروتينات الغشاء لا يتجزأ تمثل ما يصل إلى 30٪ من الجينات المشفرة في الجينوم حقيقية النواة. إلا أنهما يشتركان أدوار محورية مثل حفظ بوابة (مستقبلات)، ونقل المواد المغذية، الأيونات أو المركبات الضارة (النقل) أو الحفاظ على نفاذية الغشاء عبر طبقات ثنائية (قنوات) بين جميع الخلايا الحية 1. مضخات هروب رأس المال دورا رئيسيا في المقاومة ضد العلاج بالمضادات الحيوية 2. في البكتيريا سالبة الجرام الزائفة الزنجارية، والتي هي محمية من قبل الغشاء الخارجي، ويتم تنظيم نقل هروب رأس المال كما نظم الثلاثي حيث MexB، مضخة هروب رأس المال الموجود في الغشاء الداخلي، يعمل جنبا إلى جنب مع MexA، وهو بروتين محيط بالجبلة، وOprM، و قناة الغشاء الخارجي. يعمل بروتين الغشاء الداخلي حشوية كما مضخة تعتمد على الطاقة مع خصوصية الركيزة واسعة. يعمل بروتين الغشاء الخارجي باعتباره porin بينما هو ثلث الموجود في الفضاء محيط بالجبلة ويعتقد لتحقيق الاستقرار في مجمع كامل <sتصل> 3. في ما يلي، ونحن نركز على تصميم مقايسة وظيفية للجمعية MexA MexB.
التي تراكمت لديها المعلومات الهيكلية على مدى 5 سنوات الماضية وذلك بفضل تقرير الأشعة السينية من AcrB البروتين مثلي من الإشريكية القولونية 4-7. على الرغم من أنه من الواضح أن مهمة لزوجين هذه المعلومات مع البيانات الديناميكية والحركية، وتصميم مقايسة وظيفية لهذا نقل هو التحدي الحقيقي 8. في الواقع، لا بد من الحفاظ على غشاء بروتينات في بيئة الغشائي ويجب المحافظة على حجرة مغلقة لنقل اتجاهي من الركيزة التي ينبغي تحقيقها.
تم عرض إعادة تشكيل بروتينات الغشاء في proteoliposomes على نطاق واسع، واستعرضت (انظر ريغو وليفي 9). تسمح هذه البروتوكولات لرصد البروتينات الغشاء النشاط، على سبيل المثال عن طريق اتباع ركائز عبر الغشاء الحويصلية. في هذه الحالة تنشأ من القيود علىvailability من ركائز المعايرة (الفلورسنت، والإشعاعية، الخ.) وعن حقيقة أن في كثير من الأحيان هذه هي ركائز مسعور وتميل لعبور الأغشية بغض النظر عن وجود نقل. كبديل، يمكن للمرء متابعة التغيرات الطيفية من صبغة الإبلاغ حساسة للتغيرات الكيميائية التي تحدث نتيجة النقل. كما ذكر أعلاه، البروتونات تنشيط النقل عبر MexB. وبالتالي، خيارا ذات الصلة لرصد التغيرات الطيفية من صبغة حساسة لدرجة الحموضة التقارير لمتابعة تغيرات درجة الحموضة بسبب النقل الركيزة يحركها البروتون. اختيار صبغة الفلورسنت يتجنب أي آثار مصطنعة نظرا لطبيعة مسعور من الركيزة.
وثمة صعوبة أخرى هي جيل من التدرج بروتون. عدة بروتوكولات يمكن العثور عليها في الأدب. فيما بينها، واستخدام تقنية valinomycin على نطاق واسع ولكن أظهرنا أنه مملة لأداء 10-11. وعلاوة على ذلك فمنلا استنساخه وليس عكسها. نحن لجأت الى استخدام جرثومي (BR)، وضوء تنشيط مضخة البروتون من Halobacter salinarium، وسلبية الغرام البحرية تلزم archaeon الهوائية المحبة للملوحة. وcoreconstituted هذا البروتين في الجسيمات الشحمية مع MexB، وعند الإضاءة، ومضخات البروتونات داخل غرفة واحدة من الجسيمات الشحمية ويخلق ΔpH (الحمضية داخل) البروتين التي يحتاجها لنقل الركيزة 12-13 بالتالي.
وصفنا إجراء إعادة تصميم لمعايرة غشاء النقل البروتين. بمجرد إنشائها، فإن الإجراء إعادة البروتين يؤدي إلى القياسات التي هي استنساخه جدا. ومع ذلك، فإن الظروف الدقيقة لإعادة تشكيل البروتين تختلف من البروتين واحدة إلى أخرى. يجب توخي الحذر كثيرا في تحقيق الاستفادة المثلى من المعلمات التالية: ط) جودة تنقية (النقاء وعدم وجود مواد مجمعة)؛ ب) كفاءة الخطوة المنظفات solubilizing (عندما يكون ذلك ممكنا، ينبغي تفضيل منخفضة المنظفات CMC لأنها أسهل للحصول على التخلص من)؛ ج) الامتزاز من المنظفات (هو على سبيل المثال من الممكن الجمع بين استخدام الخرز البوليسترين مع خطوة لغسيل الكلى ولكن هذا قد يؤثر على معدل الامتزاز، معلمة حرجة للنشاط اللاحقة من البروتين، انظر المرجع [ 9])؛ د) إعادة الدهن (الطبيعة الكيميائية للدهون، والدهون إلى نسبة البروتين، وجود amphiph إضافيةديزيل هي المعايير الضرورية التي يجب أن تكون متنوعة والأمثل). في درجة الحرارة وفترة حضانة بالإضافة إلى ذلك تؤثر على كل هذه القضايا.
مراقبة الجودة وبالتالي البدائية في كل خطوة من إجراء إعادة. من وجهة النظر هذه، تشتت الضوء هي تقنية مريحة للغاية لأنها سريعة، غير تدميري، وأنه لا يتطلب سوى 20 ميكرولتر من عينة في التركيز على مجموعة مكرومولي. مرة واحدة تتشكل proteoliposomes، والتدرج السكروز هو أيضا من مساعدة كبيرة لأنه يفتح الطريق نحو التحقق المنهجي من إعادة: النوعية (هو البروتين جزءا لا يتجزأ من الواقع في غشاء الحويصلية)، وكذلك الكمية (كم من البروتين في الحويصلية واحد). وهذا الأخير سوف تعالج عن طريق قياس بالضبط البروتين والدهون تركيزات.
لا تعتمد على مقايسة لدينا المعايرة الركيزة نفسها وهذا يتجنب الاعتبارات بعدم الارتياح بشأن احتمال نشر السلبي مصطنعة من الجزيء بسبب تقسيم مسعور في الأغشية. مقايسة يستغل خصائص pyranine باعتباره التحقيق موثوقة والكمية لرصد التغيرات ودرجة الحموضة. نتائجنا تتفق مع النتائج التي تم الحصول عليها مع إجراء آخر حيث تم إجراء تشكيل بروتون التدرج باستخدام valinomycin 10، ولكن لأنها تتيح التدرج أكثر قوة واستنساخه 11. بالإضافة إلى ذلك، التدرج بروتون يمكن ضبطها على وجه التحديد، وذلك ببساطة من خلال تغيير التركيز من المخزن المؤقت (لمزيد من التفاصيل انظر Verchere وآخرون 12).
في الإجراء يتم إجراء قياس التحكم الأول في غياب الركيزة (هذا يتيح الوصول إلى النشاط السلبي من البروتين). ثم يتم قياس البروتين غشاء نقل النشاط الفعلي بعد إضافة الركيزة في نفس كفيت. هذا هو حقا أحد الأصول لأن التجربة يمكن اعتباره، نتائج حقيقية، وغير غامضة الناجم عن الركيزة.
الأنف والحنجرة "> بروتوكول يمكن أن تتكيف مع إنتاجية عالية ومتوسطة (على سبيل المثال 96 بئرا القياسات) أتمتة بسبب إلقاء الضوء على عينة يطلق فإن رد الفعل. أتمتة والموازاة تتمثل في إعداد دفعة كبيرة من proteoliposome، والاستغناء مأخوذة في 96 الآبار لوحة. ركائز (وكذلك مثبطات ممكن) ستضاف فيما بعد وبعد الحضانة في الظلام لمدة 45 دقيقة لوحة سيتعرض للدورات قياس مضان الإضاءة / pyranine على قارئ صفيحة ميكروسكوبية.للحصول على معلومات إضافية بشأن البروتوكول، مدعوون القراء لقراءة Verchere آخرون 12،13
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذه الدراسة من قبل الوكالة الوطنية دي لا بحوث (مشروع ANR-2010-1535-بلان) وبمنحة من منطقة إيل دو فرانس (DIM-Malinf 110058).
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850375C |
Cholesterol | Sigma Aldrich | C8667 |
Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93427 |
Valinomycin | Invitrogen | V-1644 |
Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid) | Invitrogen | H-348 |
DDM (n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside) | Affymetrix | D310LA |
Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes) | Avanti Polar Lipids | 610000 |
Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 |
Econo-Pac Chromatography empty column | Biorad | 732-1010 |
Desalting columns | Bio-Rad | 54805 |
Dynamic light scattering instrument | Wyatt Technology | DynaPro NanoStar |
Fluorometer JASCO FP-6200 | JASCO | 6816-J002A |