Summary
הקמת מודלים האנושיים של מחסום דם המוח (BBB) יכולה להועיל למחקר לתנאי מוח הקשורים לכישלון BBB. אנו מתארים כאן טכניקה משופרת להכנת מודל BBB מגע, המאפשר coculturing של האסטרוציטים אנושיים ותאי האנדותל במוח בצדדים המנוגדים של קרום נקבובי.
Abstract
מחסום דם המוח (BBB) כולל נימים במוח בלתי חדירים, אבל להתאמה אשר בחוזקה לשלוט בסביבת המוח. כישלון של BBB כבר רמז באטיולוגיה של מחלות רבות במוח, יוצר צורך בפיתוח של אדם במודלי BBB חוץ גופית על מנת לסייע במחקר קליני רלוונטי. בין דגמי BBB הרבים עד כה תיארו, סטטי (ללא זרימה), פנה למודל BBB, שם האסטרוציטים ותאי האנדותל במוח (BECs) הם cocultured בצדדים המנוגדים של קרום נקבובי, התפתחה מערכת עדיין אותנטית פשוטה כדי לדמות את BBB עם קיבולת הקרנת תפוקה גבוהה. אף על פי כן הדור של מודל כזה מציב אתגרים טכניים כמה. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת מודל BBB אדם קשר ניצול שילוב רומן של BECs האנושית הראשונית והאסטרוציטים אנושיים הונצחו. באופן ספציפי, אנחנו פירוט שיטה חדשנית לתא זריעה על מוסיף הפוך, כמו גם לציין inserטכניקות צביעת t ומדגימים כיצד אנו משתמשים במודל שלנו למחקר הקשורים ל-BBB.
Introduction
BBB הוא ממשק מיוחד בין מערכת העצבים המרכזית, מכריע אחראית לתחזוקה של עצירת דימום במוח זרימת הדם ההיקפית ו. היא כוללת תאים שונים במוח כלי הדם אנדותל (BECs) שמושפעים מבחינה תפקודית על ידי כמה מרכיבים תאיים וacellular (להלן) כדי ליצור שער חזק ודינמי אל המוח. בתנאים פיסיולוגיים BBB מגביל את המעבר של תאי דם, מרכיבי פלזמה וחומרים מזיקים, כל הפוטנציאל רעיל למערכת עצבים, למוח. במקביל, BBB סלקטיבי מחליף יוני מפתח וחומרים מזינים (גלוקוז וחומצות אמינו) ומוצרי פסולת המטבולית בין המוח ואת זרימת הדם כדי לשמור על סביבת מוח 1,2 בדיוק. בשנים האחרונות זה הופך להיות ברור כי כישלון של BBB מתרחש במגוון רחב של פתולוגיות מוח כרוניות, כגון מחלות ניווניות או הקשורים לדלקת (למשל מחלת אלצהיימר וmultiplדואר הטרשת נפוץ, בהתאמה) 3, כמו גם במצבים חריפים כמו שבץ איסכמי 4.
מאפייני BBB הייחודיים של תאי האנדותל במוח (BECs) מושרים בעיקר על ידי סביבת מוחותיהם 5, ובפרט על ידי האסטרוציטים 6,7. יש הבנה גוברת כי תאים מסוגים אחרים, כגון pericytes 8, תאי עצב ומיקרוגליה 1,3, כמו גם את הקרום במרתף 9, לתמוך BECs ויוצרים יחד יחידה תפקודית מכונה "יחידת העצבים וכלי הדם" (NVU) אשר בו זמנית זוגות עצביים דרישות חילוף חומרים לנימי אספקתם 10.
מעורבותם של BBB במצבים פתולוגיים בבסיס ניסיונות רבים לפתח מודלים BBB חוץ גופית על מנת לסייע במחקר הקשורים ל-BBB 11,12. מודלים אלה שואפים לחקות קרובים ככל האפשר במאפייני BBB vivo על פי עיקרון NVU. במבחנה 13, אדם 14, עכברוש 15, עכבר 16, ו17,18 מקורות חזיריים), יחד תרבית על קרום נקבובי עם האסטרוציטים תמיכה (בהרחבה נסקר על ידי מעדניית et al. 11 2005).
ניתן לגדל האסטרוציטים בתנאים ללא מגע ובחלק התחתון של תרבית רקמה, מופרד מBECs (טיפחה על פני השטח העליונים של הקרום) על ידי התרבות בינונית עדיין מתקשר עם BECs באמצעות גורמים מסיסים 16. בדגמים מתקדמים יותר שטוב יותר דומה למבנה האנטומי של BBB in vivo, האסטרוציטים נשמרים בתנאי התקשרות ותרבותיים ישירות בצד השני של הקרום בסמיכות לBECs 13,15,17 (איור 1). תצורה זו מאפשרת מגע פיזי בין BECs והאסטרוציטים, שהוקם כאשר פרויקט האסטרוציטיםהתהליכים שלהם דרך הקרום הנקבובי. חשוב מכך, למגע אמיתי להתרחש צריך להיות ≥ הנקבוביות 1μm בקוטר, שכן קצה רגליים astrocytic לא יכולות לעבור בגדלים קטנים יותר נקבוביות (כלומר 0.4 מיקרומטר) 14,15. יש לציין, מערכות BBB קשר הם הפגינו בחלק מהמחקרים להיות עדיף על עמיתיהם שאינם אנשי הקשר שלהם בנוגע להתנגדות שלהם טרנס אנדותל החשמלי (Teer) וערכי חדירות האנדותל של קליעים נותבים שונים 13,17,18. ממד נוסף של זרימת מדיה נוספה לאחרונה במספר במבחנה המודלים BBB ליישם כוחות גזירה לאנדותל לסימולציה קרובה יותר של כלי הדם במוח 12,19.
מכשול טכני אחת להתגבר בעת יצירת מודל BBB קשר הוא הזריעה של האסטרוציטים כנגד כוח הכבידה על פני השטח abluminal של הקרום הנקבובי. פרוטוקולים קודמים 13,20, שם האסטרוציטים היו פשוט זורעים בירידה של תקשורת על גבי בהוספת verted, אפשר פעמים זריעה קצרה בלבד (כלומר 10 דקות 13 או 2 שעות 20) שנמצאו בידיים שלנו לא הספיק לקובץ מצורף תא תקין. שימוש בשיטה בסיסית זו, תקופת התקשרות astrocyte כבר לא דורשת ניטור מתמיד של מוסיף על ידי פתיחה תכופה של החממה (גורמת לתנודות בטמפרטורה, חומציות ולחות), והוא גם נוטה לזריעת תא אחידה עקב דליפה של תקשורת הדרך הנקבוביות, במיוחד אם הנקבוביות גדולות יותר מאשר 1 מיקרומטר הם מועסקים.
כאן אנו מתארים פרוטוקול כללי להכנת מודל BBB ליצירת קשר. ההליך שלנו כולל את שיטה חלופית לתא זריעה על מוסיף הפוך, העוסק במגבלות שהוזכרו לעיל. השיטה מאפשרת לדבקות באין מפריע של האסטרוציטים על פני השטח קרום abluminal, בחממת equilibrated, במשך תקופה ארוכה של זמן. כתוצאה מכך, זריעה אחידה של האסטרוציטים מושגת אשר מגדילה את איכות מחסוםוממזער וריאציות חדירות בסיסי בין מוסיף.
ככל שהשימוש בתאים אנושיים הוא חשוב למחקר אנושי רלוונטי 21, אנחנו בנוסף להפגין במאמר זה ניצול המסוים של שילוב רומן של BECs האנושית הראשונית והנציחו את האסטרוציטים אדם להקמת מודל BBB אדם מגע עם יכולת הקרנת תפוקה גבוהה . מאז שצפו בתאים בממברנות נקבוביות יכול להיות לנו גם טכניקות קשות, פרט מכתים אשר יכול לסייע בקביעת המפגש והמורפולוגיה של תאים על הקרומים נקבוביים. לבסוף, אנו מדגימים כיצד מודל BBB האנושי שלנו יכול להיות מנוצל כדי לבחון את ההשפעה של activator plasminogen רקמות מהסוג (t-PA) - אנזים קריש קורע המשמש כאפשרות טיפול יחידה לשבץ איסכמי חריף - על BBB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבית תאים (3-7 ימים לפני אסיפת BBB)
1.1. תאי המוח אנושי כלי הדם האנדותל ראשיים (BECs)
BECs התקבלו באופן מסחרי. התאים יוצרו על ידי ניתוק dispase של רקמת קליפת המוח האנושי נורמלית ובתנאי קפוא במעבר 3 (<12 הכפלות אוכלוסייה).
- התשתית: כלי פרווה רקמות תרבות עם "פקטור קובץ מצורף" לפי הוראות היצרן.
- תחזוקה נייד: שמור על BECs בינונית מלא המכיל סרום. לניסויים, תרבות BECs במדיום סרום ללא מוחלט. לשמור על התאים ב5% CO 2 humidified, 21% O 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס
הערה: כחלופה לחומרים כימיים מיוחדים, 0.1% (w / v) פתרון לטין יכול לשמש כמגיב ציפוי תוך DMEM/F-12 תוספת 15 HEPES מ"מ, 10% (v / v) עוברי עגל בסרום (FCS), L-גלוטמין 2 מ"מ, 50 מיקרוגרם/ מיליליטר gentamycin, 20 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין ו20 מיקרוגרם / תוסף צמיחת תאי האנדותל מיליליטר ניתן להשתמש בם לצורך תחזוקת BEC. - תת culturing לניסויים: BECs מחוברות פיצול ביחס של 1:03-1:06, תלוי בזמן המיועד לשימוש הבא (3-7 ימים). לשנות את מדיום התחזוקה כל 3 ימים. השתמש BECs עד 15 מעברים.
1.2. תא אונליין SVG האדם העוברי astroglial
תאים עובריים האנושיים SVG astroglial 22 נגזרו במקור מתרבויות עיקריות של מוח העוברי של אדם הפך עם נגיף סימיאן הכפול מחסרת 40.
- תחזוקה: תרבות תאי SVG במדיום חיוני מינימאלי עם תמיסת מלח מאוזנת של ארל בתוספת 20% (v / v) FCS (אותו אחוז בסרום משמש כדי לשמור על התאים הראשוניים של הוריהם 22), 2 L-גלוטמין מ"מ, 50 / ml פניצילין U ו 50 סטרפטומיצין מיקרוגרם / מיליליטר. לשמור על התאים בhumidified 5% CO 2, 21% O 2
- תת culturing לניסויים: SVGs מחוברות פיצול ביחס של 1:05-1:10, תלוי בזמן המיועד לשימוש הבא (3-7 ימים). ההסרה של טריפסין לא נדרשה בשל התכולה הגבוהה של סרום במדיום. לשנות את המדיום כל 3 ימים. השתמש SVGs עד 20 מעברים.
2. הרכבה וCoculturing של האדם במבחנה BBB הדגם (יום 0)
הערה: האדם במודל BBB קשר מבחנה מוכן על פי פרוטוקולים שפורסמו 13,23, עם שינויים.
2.1. ציפוי של תוספות
- הנח מוסיף רקמות תרבות (6.5 מ"מ קוטר עם קרום נקבובי פוליאסטר, 3 מיקרומטר נקבובית בגודל) בבארות של צלחת 24 גם סיפקה. מעייל את פני השטח luminal של מוסיף
הערה: קרום במרתף של נימי דם במוח לא מכיל קולגן אני אבל בעיקר laminins, isoforms סוג IV קולגן, nidogens, וproteoglycans סולפט heparan 9. מסיבה זו, חלק מהחוקרים לנצל סוכני ציפוי כגון IV קולגן, פיברונקטין 13, או Matrigel (מדעי החיים BD) 16 לדוגמנות BBB יותר אותנטית.
2.2. SVGs זריעה על המשטח התחתון ממברנה (Abluminal)
- הפוך את הכנס ובעדינות שיתאים סביב השפה של הקרום הנקבובי חתיכת צינורות סיליקון אלסטי קצרה ("צינורות חיצוניים"; קוטר ~ ארוך 10 מ"מ, 8 מ"מ פנימי, 1.6 קיר מ"מ), ויוצר במהותו חדשה גם מעל פני השטח abluminal (איור 2 א).
- התחתון של בית הכנסds להיות אטום כדי למנוע דליפת תקשורת. ראשית, להכין את תקע (איור 2 א ו -2 ב) עשוי מצינורות סיליקון (שמכונים "צינור פנימי"; ~ עוד 8 מ"מ, 3.2 מ"מ קוטר פנימי, קיר 1.6 מ"מ; איור 2), אטום בקצה אחד עם קונוס איטום פלסטיק (~ 3 מ"מ ארוך; שהוכן על ידי חיתוך החלק התחתון של תגובת 0.2 מיליליטר פולימראז שרשרת (צינור PCR); איור 2). חרוט זה חותם לא רק לום צינורות הפנימי, אלא גם מרחיב את הקצה שלה להתאמה הדוקה יותר להוספה. בשלב בא, באמצעות מלקחיים סטריליות, להכניס את תקע סיליקון לתוך חלל luminal ולקדם אותה עד שהוא מגיע 1-2 מ"מ של עד ~ מן הקרום (איור 2 א).
- בשלב הבא, זרע 4 x 10 4 תאי SVG ב200 בינוני תחזוקת SVG μl (se1.2.2 ction לעיל) ישירות לתוך סיליקון היטב מעל פני השטח קרום abluminal (איור 2 א). לאפשר SVGs לדבוק לפחות 4 שעות בחממה.
הערה: כדי לשמור על סטריליות להעביר מוסיף התאסף בין שתי 6 גם צלחות (צלחת אחת הפוכה מעל אחרים; איור 2C) כדי לצמצם את החשיפה לאוויר לא מסונן במהלך ההליך. צינורות סיליקון ותקעים נשטפים באתנול וautoclaved לשימוש מאוחר יותר.
הערה: תקעי שימוש (סעיף 2.2.2) רק מוסיף עם נקבובית קרום גדלים גדול יותר מאשר 1 מיקרומטר. ממברנות בקוטר נקבובית ≤ 1 מיקרומטר לעתים רחוקות דליפה ודורשות רק ההתאמה של הצינור החיצוני סיליקון (סעיף 2.2.1). בנוסף, חלק מסוכני הציפוי אחרים מאשר קולגן אני (ראה הערה בסעיף 2.1) עלולים למנוע דליפות אפילו עד 3 מיקרומטר נקבוביות. לקבוע באופן אמפירי זה. - על מנת לפקח על מצב הדבקות של האסטרוציטים שלך, זרע במקביל ל96, גם נפח זהה סטנדרטי של תא ההשעיה astrocyte. יש גם את זה את אותו שטח פנים כמו להכניס 6.5 מ"מ (0.33 2 סנטימטר) ומאפשר הדמיה קלה יותר של תאים על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד מאשר הקרום להוסיף. כשאתה מתבונן דבקות מספקת של astrocyte בשליטה 96 היטב, האסטרוציטים לי כראוי דבקו גם על הקרום להוסיף.
- כאשר האסטרוציטים יש דבק מספיק בשליטה 96 היטב, להעביר אסיפות להכניס למכסת המנוע בתרבית הרקמה (ראה הערה לעיל) ובעדינות להסיר את צינורות סיליקון החיצוניים ותקעים. לחזור מוסיף לכיוון הרגיל (כלומר זקוף) לתוך הבארות סיפקו מכילות 800 μl / טוב של מדיום BEC תחזוקה (סעיף 1.1.2 לעיל).
2.3. זריעה של BECs ללשכת לומינל מעל האסטרוציטים
זרעי 2x10 4 BECs ב200 μl על פני השטח luminal מצופה קולגן ולהחזיר את inseRTS לתוך החממה.
2.4. Coculturing
Coculture מוסיף SVG / BEC נזרע במשך 3 ימים במדיום BEC ללא שינוי תקשורת לפני הניסויים.
3. ניסויים עם דגם BBB האנוש (יום 3)
- כדי לעורר את התאים במבחנה הכביסה הראשונים BBB על ידי החלפת כלי תקשורת abluminal וluminal עם 600 μl ובינוני BECs סרום ללא 100 μl, בהתאמה.
- לשאוב את מדיום luminal שוב ולהחליף עם של מדיום סרום ללא 100 μl עם סוכני מגרה.
הערה: אם גירוי של חדר abluminal נדרש (כדי להפעיל את במבחנה BBB מתא astrocytic), לשאוב את מדיום abluminal ולהחליף עם 600 ul של מדיום סרום ללא גירוי עם סוכנים. - לבדוק כל קבוצת ניסוי בשלושה עותקים (ומכאן, אם גירוי luminal מבוצע, אשר דורש 3 x 100 μl, אנו ממליצים על דילול מחדש סוכנים לריכוזים הסופיים שלהם ב350 μl של מדיום סרום ללא לכל קבוצה כדי למזער שגיאות pipetting בין בארות).
- בצע paracellular סטנדרטי ו / או מבחני חדירות transcellular של קליעים נותבים שכותרת 16,24 (עבור האחרונים אנו משתמשים isothiocyanate והעמסת (FITC) מצומדות אלבומין) ו / או מדידה של Teer 13,16,25 כפי שתואר לעיל.
כדי להסביר את תנודות בחדירות תחילת המחקר בין ניסויים, לנתח שינויים בביחס חדירות להוספה מצופה ללא תאים (המשמש כנקודת התייחסות לחדירות מקסימליים) ולקבוצה שטופלה ברכב תוך שימוש בנוסחה: חדירות (% ממקסימום) = ( ערך חדירות של הכנס ניסיוני - ערך חדירות ממוצע של קבוצת הרכב) / (ערך חדירות של להכניס הריק - ערך חדירות ממוצע של קבוצת הרכב) X 100.
4. ויזואליזציה של תאים בממברנות נקבוביות
NT "> הערה: תאים בלא כתם על קרומים להוסיף קשים להתבונן בניגוד שלב או התערבות ההפרש לעומת זאת מיקרוסקופיה (DIC) מאז הקרום הוא די אטום ומפריע להעברת אור כדי להתמודד עם בעיה זו פיתחנו נהלי צביעה שונים של תאים ב. מוסיף, אשר מאוד לשפר את המראה של תא על הממברנה. באופן כללי, להכתים את הקרומים להכניס ועדיין מחובר להוספה, בבארות. הקרומים יש להסירם רק בסוף ההליך מכתים למטרות הרכבה.4.1. Hematoxylin מכתים
- תקן מוסיף 4% קרים כקרח (w / v) paraformaldehyde (PFA) ב פוספט בופר סליין (PBS; 130 mM NaCl, 10 מ"מ Na 2 HPO 4, 10 מ"מ אא 2 PO 4, pH 7.2) עבור 20 דקות. לשטוף פעם ב-PBS.
- להטביע את הכנס בפתרון hematoxylin של 0.1% מאייר למשך 2 דקות.
- לשטוף בעדינות את התוסף במים ברז (על ידי השריית את כל הפרטיםERT במים ברז וכוס המכילה pipetting בעדינות את המים העודפים). להעביר את הכנס לפתרון של סקוט במים ברז (2 גר '/ ל' NaHCO 3, 20 g / L MgSO 4) ל~ 20 שניות עד שהצבע הכחול הרצוי מתפתח. שטוף את הכנס שוב במים ברז (סעיף 4.1.3). כתם eosin אופציונלי יכול להיות הציג כאן על ידי טבילה את הכנס ב1% פתרון eosin ל10 שניות ואחריו שטיפה במים ברז.
- אוויר יבש הקרום להוסיף. באמצעות אזמל (חיתוך מסביב לקצה הקרום) להסיר את הקרום ולעגן אותה בשקופית זכוכית הדמיה בהירה שדה
הערה: אם הרכבה בינוני di-N-butylphthalateinxylene (DPX) מנוצל לשטוף להכניס את עם 100% אתנול ואחריו קסילן לפני הסרת והתקנת הממברנה.
4.2. מיקרוסקופ האלקטרוני סורק (SEM)
- תקן מוסיף 4% קרים כקרח (w / v) PFA ב PBS עבור 20min. לשטוף שלוש פעמים PBS.
- פוסט לתקן את הקרומים ל30 דקות ב1% (w / vtetroxide אוסמיום) בMQH 2 O.
- שטוף מוסיף במים (סעיף 4.1.3) ולייבש בשיפוע הסלמת אתנול (50%, 70%, 90% במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן 3x עם אתנול 100% עבור 10 דקות להפסקה).
- פנק מוסיף מיובש בתערובת של hexamethyldisilazane (HMDS): אתנול (1:2 אז 2:01 במשך 5 דקות).
- פנק מוסיף עם HMDS 100% למשך 5 דקות, אוויר יבש ולאחסן בתנאים יבשים.
- להסיר את הקרום באמצעות אזמל (חיתוך מסביב לקצה הקרום). לבחון קרומים ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים.
4.3. Immunofluorescence
- תקן מוסיף 4% קרים כקרח (w / v) PFA ב PBS עבור 20 דקות, לשטוף פעם שבנאגר מלוח טריס (TBS; 50 מ"מ טריס-HCl pH 7.6, 154 mM NaCl, 0.22 מיקרומטר מסוננים).
- בצע immunostaining של התאים על הקרום להוסיף כמתואר 26 בעבר.
- להסיר את הקרום באמצעות אזמל (חיתוך מסביב לקצה הקרום) ולעלות אותו על AGשקופית ילדה עם הרכבה בינונית הקרינה. בחן את הקרום על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להקים אנושי, מודל BBB קשר שהיו לנו לטפח SVGs וBECs על ממברנות נקבוביות עם נקבובית בגודל 3 מיקרומטר, המוצג על מנת לאפשר מעבר של קצה רגליים astrocyte למגע עם תאי האנדותל 14,15,27,28. ייצוג סכמטי של המודל ליצירת קשר המלא מתואר באיור 1 (משמאל איור). האתגר הטכני העיקרי שהוצג על ידי מערכת מגע הוא הצורך זרע האסטרוציטים כנגד כוח הכבידה על פני השטח abluminal של הממברנה. אנו מצליחים במשימה זו על ידי בעיקר יצירת סיליקון נשלף גם על גבי המשטח הממברנה abluminal תוך מניעת דליפה של תקשורת עם התוספת סיליקון נוספת שהוכנסה לתוך חלל luminal (איור 2). השיטה אפשרה תקופה אופטימלית, ללא הפרעה זריעה של SVGs (לפחות 4 שעות), אשר בתורו הפכה מאוד מחובר אל פני השטח הנקבובי עם אובדן תא מינימאלי. ואכן, 3 ימים לאחר זריעת שני SVGs ואפליקצית BECsאוזני מחוברות וכיסיתי את הקרום באופן אחיד, כפי ששפט מתמונות של מוסיף מוכתם hematoxylin (ראה סעיף 4.1; איור 3 א, פנלים משמאל). בנוסף, שני סוגי התאים נשמרו סמניהם תא ספציפי על ממברנות נקבוביות (דפוס מפוזר הכתמה של חלבון חומצי fibrillary גליה ב22 SVGs וביטוי של גורם פון Willebrand בגופי Wiebel-Palade ושלפוחית cytoplasmic בBECs; איור 3 א, לוחות מימין) , נצפה על ידי immunofluorescence (סעיף 4.3). יתר על כן, מהדמית SEM (סעיף 4.2) התברר כי SVGs וBECs היו מסוגל לצמוח באופן ישיר על נקבוביות הקרום (איור 3 א, פנלי אמצע, ראשי חץ), תופעה אשר באופן מלאכותי תורמת לתפקוד המחסום הפיזי של במבחנה BBB קשר models1 3,28. מבחינה תפקודית, בנוכחות SVGs ערך אנדותל חדירות (PE) 16,24 של impro אלבומין 28 ניאוןved ~ פי 4 ביחס לBECs בלבד (p <0.01, n = 4), מ0.574 ± 0.199 x10 -3 ל0.126 ± 0.028 x10 -3 סנטימטר / דקות ללא או עם האסטרוציטים (SVGs), בהתאמה. תוצאות Pe אלבומין אלה הן שווות ערך למחקר אחר באמצעות BECs עכבר עם תאי גליומה C6 החולדה 29. פרוטוקול הזריעה שלנו בהצלחה חל גם מבודדים טרי BECs עכבר העיקרית והאסטרוציטים עכבר עיקריים גדלו על 1 מיקרומטר נקבוביות. במודל עכבר המגע הזה השגנו מכשול פיזי סביר ולהעמסת נתרן נותב הידרופילי הקטנה (Pe = 0.83 ± 0.22 x10 -3 סנטימטר / דקה, n = 3). לפיכך, שיטת הזריעה שלנו יכולה להיות מורחבת להכנת דגמי BBB ממינים אחרים.
התכונה הבסיסית ביותר של מודל BBB מגע היא היכולת של האסטרוציטים להקרין קצה רגליהם הדרך הנקבוביות הקרום לפנות פיזי לתאי אנדותל. כמה מחקרים שנעשו שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק לiDENאצדיק את האסטרוציטים תהליכים שעוברים ממשטח abluminal הקרום (שבו האסטרוציטים הם זורעים) אל פני השטח luminal, כהוכחת העיקרון כי קשר בין האסטרוציטים ו-EC סביר 14,15,27. בעקבות מחקרים אלה שצלמנו על ידי SEM קרום luminal לאחר זריעת SVGs על פני השטח abluminal. כפי שניתן לראות באיור 3 ב, astrocytic (SVG) קצה רגליים יכולים להיבחן עוברות דרך 3 מיקרומטר הנקבוביות לתוך תא luminal, המאשרות את הקשר שעלולים להתקיים בין SVGs וBECs זורעים על הנקבוביות של הממד הזה. באופן קולקטיבי, שיטת הזריעה שלנו הייתה פשוט, יעילה, והניבה מודל BBB קשר אותנטי.
יש לנו מנוצלים מודל BBB המגע האנושי שלנו כדי לחקור את ההשפעה של t-PA, סוכן fibrinolytic, על BBB. מספר המאמרים הראו כי t-PA ייתכן שתוכל לגרום לפתיחה של BBB בעירוי לווריד שלה לטיפול בשבץ איסכמי חריף 30-33. אינטראקציה זו בין t-PA וBBB עשויה לתרום לסיבוכים הקשורים לדימום thrombolysis-Induced T-PA 4,34,35 ולכן כפוף למאמצי מחקר הנוכחיים. המחקרים שלנו במבחנה אישרו כי T-PA אכן הגדיל את החדירות של BBB בשלמות ב( איור 4 א) ריכוז ואופן תלוי זמן (איור 4), שהיו שניהם בטווח פרמקולוגית רלוונטי 36,37. יתר על כן, שינויים מורפולוגיים דרמטיים של האסטרוציטים SVG יכולים להיבחן על הקרומים נקבוביים לפרסם חשיפה לt-PA (איור 4C), טוען כי תגובות astrocytic לt-PA בבסיס פתיחת BBB-Induced t-PA. חקירה בוצעה לאחר מכן זיהתה כי T-PA מגרה האסטרוציטים באמצעות הפעלה של פלסמינוגן - המצע שלה טבעי - לplasmin פרוטאז החזק ורחב טווח. יתר על כן, T-PA וplasmin נמצאו כדי להפעיל Rho-kinase (ROCK) איתות בהאסטרוציטים, ומצור של מסלול ROCK מנע פתיחת BBB-Induced T-PA 28. זוהי דוגמא טובה לאופן ניצול של דגמי BBB יכול להוביל לזיהוי של תהליכים ביולוגיים חדשים והזדמנויות טיפוליות.
איור 1. תצורות המבוססות על הכנס במבחנת המודלים BBB. ייצוגים סכמטי של חשמל סטטי (ללא זרימה) במודלים של BBB מבחנה. בדגמים בסיסיים בתאי האנדותל במוח (ECs; כתום) בתרבית לבד על קרום נקבובי (צהוב). במתקדם יותר ECs גישות cocultured עם האסטרוציטים (ירוק). ניתן לגדל האסטרוציטים גם בתנאים שאינם תנאים ליצירת קשר, בתחתית הבאר (מימין), או על פני השטח abluminal של הקרום הנקבובי בתנאי מגע (משמאל).nk "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. שיטה משופרת לזריעת astrocyte על פני הממברנה abluminal להכנת מודל BBB קשר. () insert הוא הפוך, חתיכת צינורות סיליקון ("צינורות חיצוניים") קצרה התאספו מסביב שלה ותוספת סיליקון השתלבה החלל של האור. הרכבה זו יוצרת גם על גבי משטח abluminal ומונעת תקשורת מ דולף דרך הנקבוביות. יכולים להיות שנזרעו תאים בבאר ואפשרו לדבוק באין מפריע במשך פרקי זמן ארוכים (מימין) (ב) התוספת סיליקון שהוכנו מחתיכה נוספת של צינורות סיליקון ("צינורות פנימיים"), חתמה בקצה אחד עם קונוס אטימה ה מוכנס לתוך החלל שלה. (ג) ברגע שזרע,מוסיף התאסף מועברים בין שתי 6 גם צלחות (צלחת אחת הפוכה מעל השני) כדי למזער את הסיכון לזיהום. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. ויזואליזציה של תאי האנדותל במוח (BECs) והאסטרוציטים על מיקרומטר קרום נקבובי 3) Hematoxylin (פנלים משמאל), מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM;. פנלים באמצע) ותמונות immunofluorescence (לוחות מימין) של SVGs (על פני השטח abluminal, 40,000 ל6.5 להוסיף מ"מ, פנלים העליונים) וBECs (20,000 ל6.5 להוסיף מ"מ על קולגן המצופה, פני השטח luminal, לוחות תחתון) גדלו על קרום 3 מיקרומטר נקבובי במשך 3 ימים (ללא coculturing). שני סוגי התאים מגיעים למפגש בתוך FRA הפעם לי ולשמור על תא הסמנים הספציפי שלהם (חלבון fibrillary גליה חומצי (GFAP) לSVG וגורם פון Willebrand (VWF) בגופי Wiebel-Palade לBECs, לוחות מימין) על הממברנה. חץ ראשים בפנלי SEM להראות עוד יותר את היכולת של שני סוגי התאים לגדול באופן ישיר מעל ולכסות את הנקבוביות, ואילו חצים מייצגים גרעין תא. ברים סולם על תמונות SEM מייצגים 25 מיקרומטר (למעלה) או 20 מיקרומטר (תחתון). ברים סולם על תמונות immunofluorescence מייצגים 40 מיקרומטר. (ב ') תמונות SEM של SVG קצה רגליים עוברות דרך 3 מיקרומטר הנקבוביות לluminal הודעה 3d שטח זריעה של SVGs (לבד) על פני הממברנה abluminal (BEC). תמונות אלה מאמתים את הפוטנציאל להתפתחות של קשר אמיתי בין SVGs וBECs במודל BBB האנושי שלנו. ברים סולם מייצגים 6 מיקרומטר בפנל השמאלי ו12 מיקרומטר בלוח השמאלי. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
class = "jove_content"> * לבירור נוסף של עמדת התאים עיין באיור 1 פנל משמאל,.
איור 4. activator plasminogen רקמות מסוג הגידול (t-PA) בתיווך בחדירות BBB הוא מונע על ידי שינויים מורפולוגיים של האסטרוציטים. () ריכוזי t-PA הגדלת נוספו לתא luminal של האדם במבחנה BBB וחדירות הוערכו 24 שעות מאוחר יותר על ידי מעבר של אלבומין ניאון לתוך תא abluminal. t-PA מוגבר חדירות BBB באופן תלוי ריכוז. n = 4-6 לכל קבוצות, אבל T-PA 10nm, כאשר n = 2. *** P <0.001 בהשוואה לכל קבוצות האחרות בדרך אחד ANOVA עם ניומן-Keuls פוסט הוק. (B) t-PA (1 מיקרומטר) נוספה לתא luminal של האדם בהמבחנה BBB במשך 8 שעות ו24 שעות לפני הערכת חדירות. כפי שניתן לראות, פתיחת BBB בתיווך-t-PA הייתה כבר לאחר 8 שעות גירוי משמעותי (70.26% מהמקסימום ב24 שעות), אך עלייה נוספת נצפתה ב24 שעות. n = 6, *** P <0.001, ** P <0.01compared לאפס בדרך אחד ANOVA עם ניומן-Keuls פוסט הוק. בשני (א) ו (ב), נקודות בארים / הנתונים מייצגות ממוצע ± SEM. (C) תמונות שדה בהיר נציג SVGs הצבעוני Haematoxylin (פנלים העליונים) או micrographs האלקטרונים סורק של SVGs (פנלים תחתון) על קרומים להוסיף פוליאסטר (גודל 3 מיקרומטר נקבובית) 24 הודעה שעה טיפול ברכב או T-PA (1 מיקרומטר). שינויים מורפולוגיים-Induced T-PA בולט ושיבוש של שלמות monolayer SVG ניתן לצפות, מה שמרמז כי תגובות astrocytic לt-PA בבסיס ההשפעה של t-PA בחדירות BBB. תמונות הן נציגם של שני ניסויים בלתי תלויים. ברים סולם על תמונות SEM repreנשלח 61 מיקרומטר (משמאל) או 120 מיקרומטר (מימין). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר רפואי לפתולוגיות מוח סובל קושי רב translational. באזור של שבץ איסכמי חריף, למשל, תרופות רבות אשר הראו הבטחה גדולה במודלים של בעלי חיים נכשלו במרפאת 38,39. הסיבות לתוצאות מאכזבות אלה הן מגוונות וכוללות בגידה של מערכות בדיקה קליני לתרחיש שבץ אדם וההגזמה של תוצאות שהתקבלו ממחקרים בבעלי החיים 21. אסטרטגיה אחת כדי לשפר את הערך המנבא של ממצאים קליניים אל השלב הקליני היא פיתוח נוסף של אדם במבחנת מודלים מבוסס תאים, אלה עשויים לספק כלים רבי עוצמה וחסכונית להקרנת סמים ומנגנוני רומן ולאפשר טוב יותר תוך התמקדות באפיקים קלינית רלוונטיים 21. במסגרת זו, שתוארנו כאן בפירוט את התהליך שנעשה במעבדה שלנו להקמת מודל BBB המגע אנושי, תוך ניצול שילוב רומן של אסטרו האנושי הונצחcytes (SVGs) וBECs האנושית העיקרית לבדיקה של תופעות הקשורות לאירוע מוחי.
תחת תנאים סטטיים (ללא זרימה), פנה לדגמי BBB (איור 1) דומה ביותר in vivo המבנה האנטומי ומוצגים להיות מעולה במאפייני מכשולם 13,17,18. חשוב לציין, קשר אמיתי בין BECs והאסטרוציטים מתרחש רק בממברנות בקוטר גדול יותר נקבובית (≥ 1 מיקרומטר), המאפשר מעבר של קצה רגליים astrocytic והאינדוקציה הבאה של monolayers הדוק יותר (פחות החדיר) BEC 14,15,27. עם זאת, הזריעה של האסטרוציטים במוסיפים הפוך עם גודל נקבובית גבוה יותר - האלמנט הטכני הליבה בהכנת מודל BBB קשר - מהווה אתגר כפול טכני, שכן בנוסף לנפח הבינוני המוגבל אשר ניתן להוסיף ל6.5 מ"מ ההפוך מוסיף (~ 50 ul), הקרומים הם גם נוטים לזליגה של מדיום בשל הקוטר הנקבובית הגדול שלהם. מגבלות אלה יכולים להפוך את ASTזריעת rocytic מסורבלת ולא עקבי.
הטכניקה החדשנית שלנו לזריעת האסטרוציטים על מוסיף הפוך עם 3 מיקרומטר נקבוביות מציעה פתרון פשוט אך יעיל להליך זה. על ידי יצירת סיליקון נשלף, בלתי חדיר גם על גבי משטח abluminal השתפר מאוד ביכולתם של האסטרוציטים לדבוק בהצלחה לקרום הנקבובי. זה מאפשר צמיחה אחידה של האסטרוציטים על פני השטח abluminal ומאפשר הכנה לשחזור של מספר גדול של הכנסות להקרנה בו זמנית של הרבה פרמטרים ניסוי (למשל, ההקרנה שבוצעה לאחרונה שלנו מההשפעה של חמישה plasminogen-ממריצים שונים על BBB 28). לפיכך, למרות פשטותו, שמצאנו השיטה שלנו לשפר באופן דרמטי את התפוקה ואת איכות המחקר שלנו באמצעות מודל BBB איש קשר זה. מגבלה אחת של שיטת זריעת astrocyte היא הדרישה לטיפול ידני נוסף של מוסיף, שהנמל דק (10 μממברנות מ 'עובי). טיפול מוגזם או מחוספס יכול לגרום למייקרו קרעים ונזק לממברנה. לפיכך, השימוש בצינורות סיליקון רכים וגמישים הוא חיוני כמו ההרכבה / הפירוק צריך להתבצע בכוח מינימאלי.
לגבי התפיסה הכוללת שלה, מודל BBB האנושי שלנו הוקם על בסיס פרוטוקול בעבר תאר 14,23 שמנוצלים במקור תאים אנושיים ראשוניים. למרות העליונות שלהם לדוגמנות BBB, חסרון אחד בתעסוקה של תאי מוח אנושיים העיקריים הוא חוסר היכולת לגשת באופן שגרתי רקמת מוח אנושית חי להפקה סדירה של BECs הראשונית והאסטרוציטים ו / או העלות הכרוכה בהשגתם באופן מסחרי. מכיוון שמודלי BBB רבים להחליף בהצלחה האסטרוציטים עיקריים עם האסטרוציטים הנציחו (למשל עם תאי גליומה C6 החולדה 29), זה היה סביר להעסיק האסטרוציטים SVG 22 כרומן, אפשרות בשפע וחסכונית עבור מודלים BBB אנושיים. היכולת של SVGs למשפיע לטובה על תפקוד מחסום BEC תוקף בעיקרון התאמתם ללימודי BBB. לעומת זאת, בחרנו לשמור BECs העיקרית במודל BBB לתפקיד הקריטי שלהם בBBB in vivo 1,2,9. חשוב לציין, culturing הממושך של BECs הראשונית יכול לגרום לדה לבידול והידרדרות של פנוטיפ BBB-הספציפי שלהם. זו אכן עשויה להיות ניכרת במערכת שלנו על ידי ערכי חדירות האנדותל גבוהים למדי לאלבומין. מסיבה זו, יש לנו השתמשתי במודל שלנו בעיקר באופן יחסי 28 (איור 4), תוך לקיחה בחשבון של חדירות הבסיס המוגבהת שלו. אם monolayer BEC אדם מאוד הדוק הוא רצוי תפקוד המחסום ניתן לשפר עוד יותר על ידי תוספת של חומרים כימיים כגון הידרוקורטיזון glucocorticoid 17 או AMP המחזורי עם מעכבי phosphodiesterase 13. BECs הונצחה אנושית, כגון שורת תאי hCMEC/D3 40, יכולה גם להיות מועסק על היכולת שלהם לשמור על TI טוב יותרצמתים ght לאורך זמן. עם זאת, תא קווי BEC לעתים קרובות להציג איכויות מחסום מופחתות לעומת נמוך המעבר העיקרי BECs 41,42 וצריכים להישקל בזהירות בגלל שינויים אחרים פוטנציאליים (כלומר ביטוי שינה של קולטנים על פני קרום תא).
באופן קולקטיבי, השינוי מסוג astrocytic התא (כלומר העסקת SVGs) והשיפור המהותי בפרוטוקול זריעת astrocyte שלנו הביא בדור של מודל לשחזור, קל להרכבה ואותנטית BBB מגע האנושי. בהתחשב במגבלות שלה, מערכת זו יכולה לשמש ככלי שימושי עבור במבחנה חקירה לא רק של שבץ איסכמי חריף, כפי שהודגמנו כאן 28, אלא גם של כמה פתולוגיות אחרות במוח מעורב אפנון של BBB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש מחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מענקים שהוענקו לRLM מהמועצה הלאומית לבריאות והמחקר הרפואי של אוסטרליה (מענק # 606,658).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attachment Factor | Cell-Systems Corporation | 4Z0-210 | |
| Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Complete medium | Cell-Systems Corporation | 4Z0-500 | Supplemented with CSC JetFuel |
| Complete serum-free medium | Cell-Systems Corporation | SF-4Z0-500 | Supplemented with CSC RocketFue |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Endothelial cells growth supplement (from bovine origin) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| External silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A080.016 | Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| Foetal calf serum | Lonza | 14-501F | |
| Gentamycin sulfate | Life Technologies | 15750-060 | |
| Heparin sodium | Pfizer | 1,000 U/ml | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | H4875 | |
| Human brain microvascular endothelial cells | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Internal silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A032.016 | Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Mayer’s hematoxylin solution | Amber Scientific | MH | |
| Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution | HyClone Laboratories | SH30244.01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Rat collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | Cultrex brand |
| Tissue culture inserts | Corning Life Sciences | 3472 | Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size |
References
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
- Vivien, D., Gauberti, M., Montagne, A., Defer, G., Touze, E. Impact of tissue plasminogen activator on the neurovascular unit: from clinical data to experimental evidence. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2119-2134 (2011).
- Stewart, P. A., Wiley, M. J. Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail--chick transplantation chimeras. Dev. Biol. 84, 183-192 (1981).
- Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325, 253-257 (1987).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E.
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathol. 122, 1-9 (2011).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin. Immunopathol. 31, 497-511 (2009).
- Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100, 328-335 (2006).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 59-127 (2005).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12, 1784-1792 (2012).
- Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. Eur. Pharm. Sci. 12, 215-222 (2001).
- Hurwitz, A. A., Berman, J. W., Rashbaum, W. K., Lyman, W. D. Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells. Brain Res. 625, 238-243 (1993).
- Demeuse, P., et al. Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier. J. Neurosci. Methods. 121, 21-31 (2002).
- Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab. Invest. 85, 734-746 (2005).
- Cohen-Kashi Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in vivo and in vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
- Kroll, S., et al. Control of the blood-brain barrier by glucocorticoids and the cells of the neurovascular unit. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1165, 228-239 (2009).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 312-328 (2008).
- Li, G., et al. Permeability of endothelial and astrocyte cocultures: in vitro blood-brain barrier models for drug delivery studies. Ann. Biomed. Eng. 38, 2499-2511 (2010).
- Antonic, A., Sena, E., Donnan, G., Howells, D. Human In Vitro Models of Ischaemic Stroke: a Test Bed for Translation. Transl. Stroke Res. 3, 306-309 (2012).
- Major, E. O., et al. Establishment of a line of human fetal glial cells that supports JC virus multiplication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1257-1261 (1985).
- Eugenin, E. A., Berman, J. W. Chemokine-dependent mechanisms of leukocyte trafficking across a model of the blood-brain barrier. Methods. 29, 351-361 (2003).
- Dehouck, M. P., et al. Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models. J. Neurochem. 58, 1790-1797 (1992).
- Perriere, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).
- Niego, B., Samson, A. L., Petersen, K. U., Medcalf, R. L. Thrombin-induced activation of astrocytes in mixed rat hippocampal cultures is inhibited by soluble thrombomodulin. Brain Res. 1381, 38-51 (2011).
- Ma, S. H., Lepak, L. A., Hussain, R. J., Shain, W., Shuler, M. L. An endothelial and astrocyte co-culture model of the blood-brain barrier utilizing an ultra-thin, nanofabricated silicon nitride membrane. Lab Chip. 5, 74-85 (2005).
- Niego, B., Freeman, R., Puschmann, T. B., Turnley, A. M., Medcalf, R. L. t-PA-specific modulation of a human BBB model involves plasmin-mediated activation of the Rho-kinase pathway in astrocytes. Blood. , (2012).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Niwa, M., Falus, A. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm. Res. 52, 39-40 (2003).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nat. Med. 14, 731-737 (2008).
- Yepes, M., et al. Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein. J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).
- Abu Fanne, R., et al. Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity. Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).
- Wang, X., et al. Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator. Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).
- Wang, X., et al. Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke. Stroke. 35, 2726-2730 (2004).
- Donnan, G. A., et al. How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke. Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).
- Acheampong, P., Ford, G. A. Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).
- Derex, L., Nighoghossian, N. Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).
- Garber, K. Stroke treatment--light at the end of the tunnel. Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).
- Liebeskind, D. S.
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
- Song, L., Pachter, J. S. Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).
- Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).
