Summary
血液脳関門（BBB）のヒトモデルの確立は、BBBの障害に関連する脳条件の研究に利益をもたらすことができる。ここでは、多孔質膜の両側に、ヒト星状細胞および脳内皮細胞の共培養を可能に接触BBBモデルを調製するための改善された技術が記載されている。
Abstract
血液脳関門（BBB）は、しっかりと脳環境を制御する不透過性はなく適応脳毛細血管を含む。 BBBの障害は、臨床的に関連の研究を助けるために、インビトロ BBBモデルにおいてヒトの開発の必要性が生じ、多くの脳の病態の病因に暗示されている。これまでに説明した数々のBBBモデル、（フローなし）静的な中では、星状細胞および脳内皮細胞（BECは）は、多孔質膜の両側に共培養されたBBBモデルを連絡し、シミュレートするために、簡略化され、まだ本格的なシステムとして登場ハイスループットスクリーニング能力を有するBBB。それにもかかわらず、このようなモデルの生成は、いくつかの技術的な課題を提示。ここでは、一次ヒトBECはと不死化ヒトアストロサイトの新規な組み合わせを利用したコンタクト人間BBBモデルの製造のためのプロトコルを記述します。具体的には、詳細な反転インサート上の細胞播種のための革新的な方法だけでなく、inserを指定T染色技術と、我々は、BBB関連の研究のための我々のモデルをどのように使用するかを例示している。
Introduction
BBBは、末梢血液循環および脳止血の維持に決定的に責任が中枢神経系との間の特殊なインタフェースである。それは、機能的に脳内にしっかりと動的ゲートウェイを形成するために（下記参照）、いくつかの細胞性および無細胞成分によって影響される別個の脳微小血管内皮細胞（前記下部電極）を含む。生理的条件下でBBBは、脳内に、血液細胞、血漿成分と有害物質、すべての潜在的に神経毒性の通過を制限する。並行して、BBBを選択的に脳および脳正確に環境を維持するために、1,2の循環の間にキーイオンおよび栄養素（グルコースおよびアミノ酸）および代謝老廃物を交換する。近年、BBBの障害が神経変性または炎症関連疾患（ 例えば、アルツハイマー病およびmultiplのような慢性の脳の病理の多様で起こることが明らかになってきているEは3だけでなく、虚血性脳卒中4のような急性状態で）それぞれ硬化症。
脳内皮細胞（BECは）の固有のBBB特性は、主にそれらの脳環境5によって誘導され、特にアストロサイト6,7によってれる。これと同時に「神経血管装置」（NVU）と呼ばれるような周皮8、ニューロンとミクログリア1,3だけでなく、基底膜9、サポートBECはなどの他の細胞型、という機能ユニットを一緒になって成長して理解することがありますカップル彼らの供給毛細血管10への神経代謝要求。
病理学的状況でのBBBの関与は、BBB関連の研究11,12を支援するためにin vitro BBBモデルで開発する多くの試みの下にある。これらのモデルは、NVU原理に従って生体 BBB特性にできるだけ近くを模倣することを目指しています。 インビトロ 13から、人間の14、ラット15、マウス16、およびブタ17,18起点）タイトジャンクションを形成する前記下部電極の単層上に多孔質膜上で培養し、一緒支えるアストロサイトに依存して広範囲にデリら 2005 11）によって検討。
星状細胞は、培養培地がまだ可溶性因子を介して前記下部電極16と通信することによって、（膜の上面上で培養）前記下部電極から分離されたウェルの組織培養の底面上に非接触状態で増殖させることができる。より良い生体内で BBBの解剖学的構造に似ている、より高度なモデルでは、アストロサイトが直接前記下部電極13,15,17（ 図1）に近接した膜の反対側に接触条件で培養で維持されています。この構成は、確立され、前記下部電極とアストロサイトとの間の物理的な接触を可能にするときアストロサイトプロジェクト多孔質膜を通って、そのプロセス。アストロサイトのエンドフィートは小さい細孔サイズ（ すなわち 0.4ミクロン）14,15を通過することができないため、重要なのは、発生する真の接触のための細孔は、直径1μmのを≥必要があります。注目すべきことに、コンタクトBBBシステムは、それらの経内皮電気抵抗（TEER）および種々のトレーサー13,17,18の内皮透過性値に関して、それらの非接触型対応物よりも優れていることがいくつかの研究で実証されている。メディアフローの追加の次元が最近、脳血管系12,19の近いシミュレーションに内皮にせん断力を加えるためのin vitro BBBモデルの数に追加されました。
コンタクトBBBモデルを生成する際に克服する一つの技術的な障害は、多孔質膜の反管腔側表面上の重力に抗して星状細胞の播種である。アストロサイトは、単に内の一番上のメディアの落下に播種した前回のプロトコル13,20、verted挿入、許される唯一の短い播種回適切な細胞の付着のためには不十分であることが私たちの手で発見された（ すなわち 、10分13または2時間20）。この基本的な方法を用いて、より長いアストロ装着期間は、特に、（温度、pH、湿度の変動を引き起こす）インキュベーターの頻繁な開口部によってインサートの常時監視を必要とし、また、孔を通る媒体の漏れに起因する不均一な細胞播種する傾向がある細孔場合が1μmよりも大きいが使用される。
ここでは、コンタクトBBBモデルの製造のための一般的なプロトコルを記載している。我々の手順は、上述の制限に対処反転インサート上の細胞播種のための代替の方法を含む。この方法は、長時間にわたって、平衡化したインキュベーター中、反管腔側膜表面上への星状細胞の乱されない付着を可能にする。その結果、星状細胞の均一な播種は、バリア品質を向上が達成されると挿入の間、基礎透過性の変動を最小限に抑えることができます。
ヒト細胞の使用は、人間が関連する研究21のために重要であるとして、我々は、さらに、この記事で初代ヒトBECは、新規な組み合わせの具体的な利用を実証し、ハイスループットスクリーニング能力との接触人間BBBモデルの確立のための人間のアストロサイトを不死化。多孔性膜上に細胞を観察すると、多孔質膜上に合流し、細胞形態の決定を補助することができる困難で、また我々の詳細を染色技術とすることができるからである。 BBB上 - 急性虚血性脳卒中のための唯一の治療選択肢となって血栓破裂酵素 - 最後に、私たちは私たち人間のBBBモデルは、組織型プラスミノーゲン活性化因子の影響（T-PA）を調べるために利用することができる方法の例である。
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Protocol
1。細胞培養（前はBBB総会に3〜7日）
1.1。初代ヒト脳微小血管内皮細胞（BECは）
BECは、商業的に入手した。細胞を、正常なヒト脳皮質組織のディスパーゼ解離によって生成され、通路3（<12回の集団倍加）で凍結提供された。
- 基層 ：メーカーの指示に従って「接着因子」とコート組織培養容器。
- 細胞の維持 ：血清含有完全培地中で前記下部電極を維持します。実験のために、完全無血清培地での培養BECは。加湿5％CO 2で細胞を維持し、37℃で21％O 2インキュベーター
注 ：DMEM/F-12を15mMのHEPES、10％（v / v）ウシ胎児血清（FCS）を補充しながら、特殊な試薬に代わるものとして、0.1％（w / v）のゼラチン溶液をコーティング試薬として働くことができる、 2mMのL-グルタミン、50μgの/ mlのゲンタマイシン、20μg/ mlのヘパリン、および20μg/ mlの内皮細胞増殖サプリメントは、BECのメンテナンスのために使用することができる。 - 、1:6 1:3の割合で分割コンフルエントBECは、次の使用を目的とし、時間（3-7日）に応じて、次の実験のために継代培養 。 3日ごとに維持培地を変更します。 15の通路に前記下部電極を使用してください。
1.2。 SVGのヒト胎児アストログリア細胞株
SVGヒト胎児アストログリア細胞22は、本来複製欠損シミアンウイルス40で形質転換したヒト胎児脳の初代培養に由来した。
- メンテナンス ：20％（v / v）のFCS（それらの親の一次細胞22を維持するために使用されるのと同じ血清百分率）、2mMのL-グルタミン、50 U / mlのペニシリンを補充したアールの平衡塩溶液で最小必須培地中で培養SVG細胞および50μg/ mlのストレプトマイシン。加湿した5％CO 2、21％O 2中で細胞を維持する
- 次の使用を目的とし、時間（3-7日）に応じて、1:5〜1:10の比率で分割コンフルエントSVGs： 実験のために継代培養 。トリプシンの除去により、培地中の血清の高含量に必要とされない。 3日ごとに培地を変更します。 20継代まで使用SVGs。
2。ヒトにおける体外 BBBモデルの組み立てと共培養（0日目）
コメント ： 体外接触BBBモデルにおける人間は変更を加えて、公開されたプロトコル13,23に従って製造されている。
2.1。インサートのコーティング
- 付属24ウェルプレートのウェルに組織培養インサート（ポリエステル多孔質膜と、直径6.5ミリメートル、3ミクロンの細孔サイズ）を配置します。コートインサートの管腔側表面
注意：脳の毛細血管の基底膜にはコラーゲンが含まれていない私が、主にラミニン、コラーゲンIV型アイソフォーム、ナイドジェン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカン9。このため、一部の研究者は、そのようなより本物BBBモデリングのためのコラーゲンIV、フィブロネクチン13、またはマトリゲル（BDバイオサイエンス）16のようなコーティング剤を利用する。
2.2。下側（反管）膜表面に播種SVGs
- インサートを反転し、静かに多孔質膜の縁の周りに弾性シリコンチューブ（「外部チューブ ";〜10ミリメートル、長、8ミリメートル、内径、1.6ミリメートルの壁）の短い部分に合わせて、基本的によく反管腔側表面上に新しいを作成する（ 図2A）。
- 挿入旧姓の下dsは、メディアの漏れを回避するために密封される。 プラスチック封止コーンと一端で封止さ、まず、（ 図2B;;約8 mmの長さ、3.2ミリメートル、内径1.6mmの壁「内部チューブ」と呼ばれる）シリコーンチューブからなるプラグ（ 図2Aおよび2B）を調製（〜3ミリメートル長い; 0.2ミリリットル、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）チューブの底部切断することによって調製し; 図2B）が 、 このコーンは、内部管腔を密封するだけでなく、インサートへの緊密な嵌合のためにその縁部を広げるだけでなく。それは、膜からのアップまで約1〜2ミリメートル（ 図2A）に達するまで、次の、滅菌ピンセットを使用して、管腔内、あらかじめ、その中にシリコン栓を挿入します。
- 次に、200μlのSVG維持培地中に4×10 4 SVG細胞（播種それctionの上記1.2.2）直接でなく反管腔側膜表面上のシリコン（ 図2A）に変換する。 SVGsはインキュベーター内に少なくとも4時間、接着させる。
注：（他の上で倒立1プレートと、 図2C）2 6ウェルプレートの間で組み立てを挿入無菌輸送を維持するために、手順の間、フィルタリングされていない空気への曝露を最小限にするために。シリコーンチューブとプラグをエタノール中で洗浄し、後の使用のためにオートクレーブする。
注：のみ膜の細孔を持つインサート用プラグ（2.2.2項）を使用して、1ミクロンよりも大きいサイズ。 1ミクロン≤孔径を有する膜はほとんど漏れていないため、外部シリコンチューブ（セクション2.2.1）の試着のみを必要とする。また、コラーゲン以外のコーティング剤は、I（2.1項の注を参照）でも、3ミクロンの孔を通して漏出を防ぐことができます。経験的にこれを決定する。 - あなたの星状細胞の付着状態を監視するために、中に並列に播種アストロサイト細胞懸濁液の標準的な96ウェルの同一ボリューム。このウェルを6.5ミリメートルインサートと同じ表面積（0.33 cm 2）を有し、インサート膜よりも位相差顕微鏡による細胞の可視化を容易に可能にする。あなたがコントロール内のアストロサイトの十分な接着性を観察すると、96ウェル、アストロサイトが適切に挿入膜にも付着している。
- アストロサイトは十分にコントロールに付着した場合には、96ウェル、組織培養フードに挿入アセンブリを転送します（上記の注を参照）、静かに外付けシリコンチューブやプラグを外します。 800μL/ウェルのBEC維持培地（上記のセクション1.1.2）を含む供給ウェルに、通常の（ つまり直立）の向きに挿入を返します。
2.3。アストロサイト上の管腔チャンバー内に前記下部電極の播種
200μl中シード2×10 4 BECはコラーゲンコート腔側表面上及びInSeにを返すインキュベーターにRTS。
2.4。共培養
実験の前に培地交換せずにBEC培地中で3日間、SVG / BECシードの挿入を共培養。
3。人間BBBモデルを用いた実験（3日目）
- それぞれ、600μlの無血清BECは培地100μlで反管腔側とメディアを交換することによってin vitroでの BBB最初の洗浄細胞を刺激する。
- 再び腔側媒体を吸引し、刺激剤との無血清培地100μlで交換してください。
注意：反管室の刺激が必要な場合（アストロサイトのコンパートメントからのin vitro BBBを活性化するために）、反管メディアを吸引し、刺激剤との無血清培地の600 ULと交換してください。 - 管腔の刺激は、3×100μlのを必要とする、実行される場合、したがって（三連で、各実験群を試験する、我々は、再を希釈することをお勧めウェル間のピペット誤差を最小限に群あたり無血清培地を350μl）中のそれらの最終濃度に薬剤。
- 前述したように、および/ またはTEER 13,16,25の測定（後者のために我々は、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合アルブミンを使用）標準傍細胞および/ または標識トレーサー16,24の経細胞透過性アッセイを行う。
透過性（最大の％）=（ベースライン透磁率の変動を考慮するために、実験の間、（最大の透過性の基準となる）細胞を含まないコーティングされた挿入物および式を用いて、ビヒクル処置群に対する相対透磁率の変化を分析実験的なインサートの透過値 - ブランクインサートの車群の平均透過性値）/（透磁率 - ビークル群の平均透過性値）×100。
4。多孔質膜上での細胞の可視化
NT "> コメント ：挿入膜上の未染色細胞は、膜が非常に不透明であり、光の透過を妨害するので、位相差や微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡によって観察することは困難である我々は上の細胞の種々の染色手順を開発し、この問題に対処するため。大幅膜上のセルの外観を向上させる。まだウェルズ、インサートに付属している。膜のみ取り付ける目的で、染色手順の終了時に削除する必要がある一般的には、挿入膜を染色挿入、。4.1。ヘマトキシリン染色
- 20分間、リン酸緩衝化生理食塩水（130mMのNaCl、10mMののNa 2 HPO 4、10mMのNaH 2 PO 4、pH7.2のPBS）中の（w / v）のパラホルムアルデヒド（PFA）の氷冷4％インサートを固定する。 PBSで一度洗浄します。
- 2分間0.1％マイヤーのヘマトキシリン液に挿入水没。
- 優しくインを沈めることによって（水道水でインサートを洗う）水道水を含有する、穏やかに過剰の水をピペッティングビーカーにERT。希望の青色が発生するまで約20秒間スコットの水道水の溶液（2g / Lの炭酸水素ナトリウム、20グラム/ LのMgSO 4）に挿入を転送します。水道水（セクション4.1.3）で再度挿入を洗ってください。任意エオシン染色は、水道水洗浄、続いて10秒間、1％エオシン溶液にインサートを浸漬することによりここに導入することができる。
- 挿入膜を空気乾燥させます。膜を除去し、明視野イメージングのためのガラススライドにマウントし（膜カッティングエッジの周り）メスを用いて
注意：ジ-n-butylphthalateinxylene（DPX）封入剤を利用する場合は、膜を除去してマウントする前にキシレンが続き、100％エタノールで挿入を洗う。
4.2。走査型電子顕微鏡（SEM）
- 20分間、PBS中のPFA（w / v）の氷冷した4％のインサートを固定します。 PBS中で3回洗浄する。
- W / V（1％の30分のための膜をポスト修正MQH 2 Oに）四酸化オスミウム
- 洗浄は、水（セクション4.1.3）に挿入し、エスカレートエタノール勾配（50％、70％、5分ごとに、90％、区間ごとに10分間、100％エタノールで、次いで3×）で脱水する。
- エタノール（1:2、その後5分間2:1）：ヘキサメチルジシラザン（HMDS）の混合物で脱水挿入を扱う。
- 乾燥条件下では5分、空気乾燥して保存するため、100％のHMDSで挿入を扱う。
- （膜エッジの周りカット）メスを用いて膜を除去します。走査型電子顕微鏡により膜を調べる。
4.3。免疫蛍光
- トリス緩衝生理食塩水（;フィルタリング50mMトリス-HCl pH7.6の、154のNaCl、0.22ミクロンTBS）で一度洗って、20分間、PBS中のPFA（w / v）の氷冷した4％のインサートを固定します。
- 以前に26を説明したように、挿入膜上で細胞の免疫染色を行ってください。
- （膜エッジの周りカット）メスを用いて膜を除去してAGにマウント蛍光封入剤で少女のスライド。蛍光顕微鏡により膜を調べてください。
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Representative Results
人間を確立するために、BBBモデルに連絡し、我々は、内皮細胞14,15,27,28と接触するアストロサイトのエンドフィートの通過を可能にするために示され、3ミクロンの細孔径を有する多孔質膜上SVGsと前記下部電極を育成しなければならなかった。完全な接触モデルの概略図を図1（図示の左側）に示されている。コンタクトシステムによって提示された主要な技術的な課題は、膜の反管腔側表面に重力に逆らって、星状細胞をシードする必要があることである。我々は、管腔内に挿入された追加のシリコーンプラグ（ 図2）媒体の漏洩を防止しつつ、主に管腔側膜表面の上に取り外し可能なシリコーンウェルを作成することによって、このタスクに成功した。この方法は、順番に強く、最小の細胞損失を有する多孔質表面に付着されるようになったSVGsの最適な、途切れない播種期間（最低4時間）、許可された。実際、3日SVGsとBECはアプリの両方を播種後ヘマトキシリン染色された挿入物の画像から判断されるよう（; 図3A、左パネルのセクション4.1を参照）、コンフルエント耳付き、均一に膜をカバーした。さらに、両方の細胞型は、（SVGs 22とWiebel·パラディ体および前記下部電極における細胞質小胞におけるvon Willebrand因子の発現におけるグリア線維性酸性タンパク質の拡散染色パターン、 図3A、右パネル）多孔質膜上での細胞特異的マーカーを維持、免疫蛍光（セクション4.3）で観察した。さらに、SEM像から（セクション4.2）、それはSVGsとBECは、膜の細孔（ 図3A、中央のパネル、矢印の頭）、人為的に生体外 BBBの物理的なバリア機能に貢献する現象の上に直接成長させることができたことが明らかになった連絡先は、3,28を models1。機能的には、28インプロ蛍光アルブミンの16,24 SVGsの存在内皮透過値（PE）中一人でBECはへ〜4倍 と比較してVED（P <0.01であり、n = 4）、0.574±0.199×10 -3 0.126±0.028×10 -3センチメートル/分のないかと、星状細胞（SVGs）へ、それぞれから。これらのアルブミンPeの結果は、ラットC6グリオーマ細胞29とマウスのBECはを使用して別の研究に匹敵する。当社の播種プロトコルは、成功したばかりの単離された初代マウスBECは1μmの細孔を上に成長させたマウスの主アストロサイトにも適用した。このマウス接触モデルでは、小さな親水性トレーサーフルオレセインナトリウムのための合理的な物理的な障壁を得た（Peが = 0.83±0.22×10 -3センチメートル/分であり、n = 3）。したがって、我々の播種方法は、他の種からBBBモデルの調製のために拡張することができる。
接触BBBモデルの最も基本的な特徴は、物理的に内皮細胞と接触する膜孔を通じてエンド足を投影するアストロサイトの機能です。 iDENは、走査電子顕微鏡を利用したいくつかの研究tifyはアストロサイトとECとの接触が14,15,27もっともらしいことを原理の証明として、管腔側表面に（アストロサイトは播種する）反管腔側膜表面からのパスのプロセスをアストロサイト。これらの研究に続いて、我々は反管腔側表面にSVGsを播種後、SEMによって腔膜をイメージした。 図3Bに示すように、星状細胞（SVG）エンド足が管腔コンパートメントに3μmの孔を通過し観察することができ、その連絡先を確認することは、潜在的SVGsと前記下部電極との間に存在することができ、この次元の細孔に播種した。まとめると、我々の播種方法は、単純、効率的であり、本格的な接触BBBモデルを得た。
我々は、BBBに、T-PA、線維素溶解剤の効果を調査するために私たち人間の接触BBBモデルを利用している。記事の数は、t-PAは、急性虚血性脳卒中の治療のために30〜33の静脈内投与時のBBBの開放を誘導することが可能であり得ることを示唆している。のt-PAとBBBの間のこの相互作用は、T-PAに誘導される血栓溶解4,34,35に関連する出血性合併症に寄与し、したがって、現在の研究努力の対象である場合があります。 インビトロでの我々の研究は、t-PAが実際に薬理学的に関連する範囲36,37内の両方であった濃度（ 図4A）及び時間依存的（ 図4B）、無傷のBBB透過性を増加することを確認した。また、SVGのアストロサイトの劇的な形態変化は、多孔質膜がt-PAに対するアストロサイトの応答は、T-PAに誘導されるBBB開口部の下にあることを示唆している、のt-PA（ 図4C）への曝露をポストに観察することができた。強力かつ広域スペクトルプロテアーゼプラスミンに - その天然の基質 - その後の調査は、t-PAはプラスミノーゲンの活性化を介してアストロサイトを刺激することを確認した。さらに、T-PAおよびプラスミンは、Rhoキナーゼ（ROCK）アストロサイトにおけるシグナリング、および封鎖を活性化することが見出された ROCK経路のT-PAに誘導されるBBBの開口部28を防いだ。これは、BBBモデルの利用が新たな生物学的プロセスおよび治療機会の特定につながる可能性が方法の良い例です。
図1。 in vitroの BBBモデルの挿入ベースの構成。 体外 BBBモデルでの （フローなし）のスタティックの概略図。基本的なモデルでは脳内皮細胞（EC、オレンジ）（黄）多孔質膜に単独で培養する。より高度なアプローチでのECにアストロサイト（緑）と共培養されています。星状細胞は、非接触状態で、ウェルの底部（右側）に、又は多孔質膜の反管腔側表面上の接触条件（左）のいずれかで成長させることができる。NK」>拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。コンタクトBBBモデルを調製するための管腔外膜表面上の星状細胞播種のための改良された方法。（A）インサートを反転させて、シリコンチューブ（「外部チューブ」）の短い部分は、その周囲の周りに組み立てられ、シリコーンプラグに嵌め込ま管腔側キャビティ。このアセンブリは、反管腔側表面の上にうまく作成され、細孔を通って漏れるのメディアを防ぐことができます。細胞がウェルに播種し（右側）（B）シリコーンプラグは封止コーンと一端で密封されたシリコーンチューブ（「内部チューブ」）の別の部分から調製される長時間静置付着させることができるその空洞内に挿入されている。（C）は一度、播 種組み立てインサートは、汚染の危険性を最小限にするために（1プレートは、他の上で倒立）2 6ウェルプレートの間で輸送される。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。 。脳内皮細胞（BECは）と3μmの多孔質膜A）ヘマ トキシリン（左パネル）、走査型電子顕微鏡（SEM でのアストロサイトの視覚化 、反管腔側表面の中央のパネル）とSVGsの免疫蛍光画像（右パネル）（40,000 6.5ミリメートルあたりの挿入、トップパネル）と前記下部電極（共培養することなく、3日間（）のために3ミクロンの多孔質膜上に成長した2万6.5あたりのミリコラーゲンIコートした上で挿入、管腔側表面、下のパネル）。両方の細胞型は、この時間をfra内でコンフルエンスに達する私とは、膜上の（BECは、右のパネルのためのWiebel-パラディ体中のSVGおよびフォンヴィレブランド因子（VWF）のためのグリア線維性酸性タンパク質（GFAP））、それらの細胞特異的マーカーを維持する。矢印は、細胞核を表し、一方、さらに、直接上に成長し、孔を覆うように、両方の細胞型の能力を示すSEMパネルに頭を矢印。 SEM像のスケールバーは25μmで（上）または20ミクロン（下）を表す。免疫蛍光画像のスケールバーは40μmで表す。（B）管腔（BEC）反管腔側膜表面上SVGs（単独）の表面の3D播種後に3ミクロンの孔を通過したSVGのエンドフィートのSEM像を。これらの画像は、私たち人間のBBBモデルにおけるSVGsと前記下部電極との間に真の接触の開発の可能性を検証します。スケールバーは、左側のパネルと右パネルには12μmで6程度を表しています。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。 BBB透過性の組織型プラスミノーゲン活性化因子（t-PA）媒介性増加は、星状細胞の形態学的変化によって駆動される。（A）の増加のt-PAの濃度は、インビトロ BBB におけるヒトの管腔チャンバーに加え、透磁率が24時間後に評価した。後で反管室への蛍光アルブミンの通過による。のt-PAは、濃度依存的にBBB透過性を増加させた。 N =すべてのグループの4-6が、T-PA 10nMの、n = 2である。 *** P <0.001、他の全ての群と比較して、ニューマン-クールズ事後に分散分析（B）のt-PA（1μM）は、 人間の管チャンバーに添加した1経由で透過性の評価の前に8時間および24時間BBBを体外。示されているように、T-PA媒介BBBの開口部は、すでにかなりの8時間後の刺激（24時間で最大の70.26パーセント）であったが、さらなる増加が24時間で観察された。 N = 6、*** P <0.001、** P <1の方法ニューマン-クールズ事後でANOVAによりゼロに0.01compared。 （A）及び（B）の両方において、バー/データ点は平均±SEMを表す。ポリエステルインサート膜上ヘマトキシリン染色SVGsの（C）代表的な明視野像（上のパネル）またはSVGsの走査電子顕微鏡写真（下部パネル） （3ミクロンの孔サイズ）車両またはt-PA（1μM）で24時間後の処置。発音のt-PAに誘導される形態学的変化やSVG単層の完全性の破壊は、t-PAに対するアストロサイトの応答がBBBの透過性にt-PAの効果の根底にあることを示唆し、観察することができる。画像は、2つの独立した実験の代表である。 SEM像のスケールバーはREPRE61ミクロン（左）または120ミクロン（右）を送りました。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
脳の病理への医学研究は、多くの翻訳困難を抱えている。急性虚血性脳卒中の領域では、例えば、動物モデルにおいて非常に有望であった多くの薬剤は、臨床38,39に失敗しました。これらの不本意な結果の理由は多様であり、人間のストロークシナリオおよび動物実験21から得られた結果の過大評価に前臨床試験システムの不倫が含まれています。臨床段階に前臨床調査結果の予測値を改善するための一つの戦略は、 ヒト細胞ベースのin vitroモデルの追加開発で、これらは新薬とメカニズムをスクリーニングするための強力かつ費用対効果の高いツールを提供し、臨床的に意義のある道に焦点を当て、より良い可能性があり21。このような状況の中で、我々はここでは詳細に記載されたヒト不死化アストロの新規な組み合わせを利用し、人間の接触BBBモデルの確立のために我々の研究室で行われ、プロセスcytes（SVGs）や脳卒中に関連した現象の検査のためのヒト初代BECは。
（フローなし）静的条件の下では、（ 図1）最高のin vivoでの解剖学的構造に似ているのBBBモデルに連絡し、そのバリア性13,17,18に優れていることが示されている。重要なのは、BECはアストロサイト間の真の接触はアストロサイトのエンドフィートと緊密な（透過性が低い）BEC単層14,15,27のその後の誘導の通過を可能にする、より大きな細孔径（≥1程度）、を有する膜で発生します。しかしながら、高い細孔サイズを有する反転インサート上の星状細胞の播種 - 接触BBBモデルの調製におけるコア技術的要素は、 - 限定された媒体の体積に加えて、反転さ6.5ミリメートルに添加することができるので、二重の技術的な課題を提示インサート（〜50μlの）膜はまた、それらの大孔径と媒体の漏れを起こしやすい。これらの制限は、ASTを行うことができますrocytic播種ぎこちないと矛盾する。
3ミクロンの孔が反転インサート上でアストロサイトを播種するための当社の革新的な技術は、この手順のためのシンプルで効果的なソリューションを提供しています。反管腔側表面の上だけでなく、取り外し可能な、不浸透性のシリコンを作成することによって、我々は非常に成功して多孔質膜に付着するアストロサイトの能力を向上させた。これは反管腔側表面のアストロサイトの均一な成長を可能にし、（例えば、BBB 28に5異なったプラスミノーゲン活性化因子の効果の我々の最近行われたスクリーニング）多くの実験パラメータを同時にスクリーニングするための多数の挿入の再現性のある製造を可能にする。したがって、そのシンプルさにもかかわらず、我々は劇的にこの接触BBBモデルを使用して私たちの研究のスループットと品質を向上させる手法を発見した。私たちの星状細胞の播種方法の一つの限界は、薄い港インサート（10μの余分な手作業の要件であるM厚）の膜。過剰または乱暴な取り扱いは、マイクロ涙と膜に損傷を引き起こす可能性があります。組立/分解が最小限の力で実行されなければならないように、従って、軟質で柔軟なシリコーンチューブの使用が必須である。
その全体的な概念については、私たち人間のBBBモデルは当初、初代ヒト細胞を利用して、先に記述されたプロトコル14,23に基づいて設立されました。 BBBモデリングのための彼らの優位性にもかかわらず、一次ヒト脳細胞の雇用の一つの欠点は、日常的に、一次BECはアストロサイトおよび/または商業的にそれらを得るに関わるコストの定期的な生産のために生きたヒト脳組織にアクセスすることができないことである。多くのBBBモデルが正常（ラットC6グリオーマ細胞29など）不死化星状細胞と初代星状細胞を置換するので、新規な、ヒトBBBモデリングのための豊富でかつ費用対効果の高いオプションとしてSVG星状細胞22を採用することは妥当であった。へSVGsの能力正に原理的にBBB研究のためのそれらの適合性を検証しBECバリア機能に影響を与える。対照的に、我々は、 生体内で 1,2,9 での BBBでの重要な役割のための私達のBBBモデルのプライマリ前記下部電極を維持することにしました。重要なのは、原発BECは物の長期培養は脱分化し、そのBBB固有の表現型の劣化につながることができます。これは確かに、アルブミンのためのかなり高い内皮透過性の値によって我々のシステムでは明らかである。この理由から、我々は考慮に上昇し、その基礎透過性を考慮して、主に相対的に28（ 図4）に我々のモデルを使用している。非常にタイトなヒトBEC単層が所望される場合、バリア機能はさらに、グルココルチコイド、ヒドロコルチゾン17またはホスホジエステラーゼ阻害剤13を有する環状AMPなどの化学物質を添加することによって改善することができる。例えばhCMEC/D3細胞株40不死化ヒト前記下部電極は、また、より良いtiのを維持する能力のために使用することができる時間をかけてGHTジャンクション。しかし、BEC細胞株は、多くの場合、低通路プライマリ前記下部電極41,42と比較して低減バリア品質を表示し、注意深くための他の潜在的な変化（細胞表面受容体の発現の変化、すなわち ）を考慮する必要がある。
総称して、アストロサイト細胞型（SVGs すなわち雇用）とアストロサイトの播種プロトコルへの実質的な改善の我々の修正は、再現可能な組み立てが容易と真正ヒト接触BBBモデルの生成をもたらした。念頭に置いて、その限界を保有する、このシステムは、我々がここで28を例示したように、急性虚血性脳卒中のだけでなく、in vitroでの研究のための有用なツールとして機能するだけでなく、BBBの調節を含むいくつかの他の脳病理のことができます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、オーストラリア国立保健医療研究評議会（助成金＃606658）からRLMに授与の補助金によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attachment Factor | Cell-Systems Corporation | 4Z0-210 | |
| Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Complete medium | Cell-Systems Corporation | 4Z0-500 | Supplemented with CSC JetFuel |
| Complete serum-free medium | Cell-Systems Corporation | SF-4Z0-500 | Supplemented with CSC RocketFue |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Endothelial cells growth supplement (from bovine origin) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| External silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A080.016 | Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| Foetal calf serum | Lonza | 14-501F | |
| Gentamycin sulfate | Life Technologies | 15750-060 | |
| Heparin sodium | Pfizer | 1,000 U/ml | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | H4875 | |
| Human brain microvascular endothelial cells | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Internal silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A032.016 | Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Mayer’s hematoxylin solution | Amber Scientific | MH | |
| Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution | HyClone Laboratories | SH30244.01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Rat collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | Cultrex brand |
| Tissue culture inserts | Corning Life Sciences | 3472 | Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size |
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