Summary
Oprichting van menselijke modellen van de bloed-hersenbarrière (BBB) kan profiteren onderzoek naar hersenen voorwaarden in verband met BBB mislukking. We beschrijven hier een verbeterde techniek voor de bereiding van een contact BBB model dat coculturing menselijke astrocyten en brein endotheelcellen maakt aan de tegenovergestelde zijden van een poreus membraan.
Abstract
De bloed-hersenbarrière (BBB) bestaat uit ondoordringbare maar aanpasbare hersenen haarvaten die streng te controleren, de hersenen milieu. Niet de BBB is geïmpliceerd in de etiologie van vele hersenen pathologieën, noopt tot de ontwikkeling van humane in vitro modellen BBB helpt bij klinisch relevante onderzoek. Onder de talrijke BBB modellen dusver beschreven, een statische (zonder stroom), contact BBB model, waarbij astrocyten en de hersenen endotheelcellen (BEC) worden gekweekt samen aan weerszijden van een poreus membraan, ontwikkeld tot een vereenvoudigde, doch authentieke systeem het simuleren BBB met high throughput screening capaciteit. Toch is de generatie van dergelijk model geeft weinig technische uitdagingen. Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van een contact menselijk BBB model gebruik te maken van een nieuwe combinatie van primaire menselijke Becs en onsterfelijke, menselijke astrocyten. Concreet, we detail een innovatieve methode voor cel-zaaien op omgekeerde inserts evenals specificeren insertiet kleurtechnieken en illustreren hoe we ons model voor BBB-gerelateerd onderzoek.
Introduction
De BBB is een gespecialiseerde interface tussen de perifere bloedsomloop en het centrale zenuwstelsel, cruciaal verantwoordelijk voor het onderhoud van hersenen hemostase. Het bestaat uit verschillende hersenen microvasculaire endotheelcellen (BEC) die functioneel worden beïnvloed door enkele cellulaire en acellulaire componenten (hieronder) om een strakke en dynamische gateway in de hersenen vormen. Onder fysiologische omstandigheden de BBB beperkt de doorgang van bloedcellen, plasma componenten en schadelijke stoffen, alle potentieel neurotoxische, in de hersenen. Tegelijkertijd heeft de BBB wisselt selectief sleutel ionen en voedingsstoffen (glucose en aminozuren) en metabolische afvalproducten tussen de hersenen en de circulatie naar de hersenen milieu 1,2 nauwkeurig te behouden. De laatste jaren is het steeds duidelijk dat de mislukking van BBB voorkomt in een verscheidenheid van chronische hersen aandoeningen zoals neurodegeneratieve en inflammatoire ziekten (Alzheimer en multiple sclerose, respectievelijk) 3, en bij acute aandoeningen zoals ischemische beroerte 4.
De unieke eigenschappen BBB hersenen endotheelcellen (BEC) worden grotendeels veroorzaakt door de omgeving cerebrale 5, en met name door astrocyten 6,7. Er is een groeiend besef dat andere celtypen, zoals pericyten 8, neuronen en microglia 1,3, en de basale membraan 9, ondersteunt BEC en samen een functionele eenheid zogenaamde "neurovasculaire eenheid" (NVU) die tegelijkertijd koppels neuronale metabole eisen aan hen leveren, haarvaten 10.
De betrokkenheid van de BBB in pathologische situaties ten grondslag talrijke pogingen om de ontwikkeling van in vitro BBB-modellen ten behoeve van BBB-gerelateerd onderzoek 11,12. Deze modellen doel zo dicht mogelijk na te bootsen in vivo BBB kenmerken volgens het beginsel NVU. In vitro 13, menselijk 14, 15 rat, muis 16, en varkens 17,18 afkomst), gekweekt op een poreus membraan alsmede ondersteunend astrocyten (uitgebreid beoordeeld door Deli et al.. 2005 11).
Astrocyten kunnen worden gekweekt in contactloze omstandigheden op de bodem van een weefselkweek goed gescheiden van BEC (gekweekt op het bovenoppervlak van het membraan) van het kweekmedium Nog communiceren met BEC via oplosbare factoren 16. In meer geavanceerde modellen die beter te lijken de anatomische structuur van de BBB in vivo worden astrocyten in contact gehouden omstandigheden gekweekt en direct aan de andere zijde van het membraan dicht bij BEC 13,15,17 (figuur 1). Deze configuratie maakt het mogelijk fysiek contact tussen Becs en astrocyten, opgericht als astrocyten projecthun processen door het poreuze membraan. Belangrijk, voor een echt contact te komen de poriën dient ≥ 1 urn in diameter, omdat astrocytaire end-voeten niet kan passeren kleinere poriën (dwz 0,4 micrometer) 14,15. Met name worden contact BBB systemen aangetoond in sommige studies superieur aan hun contactloze tegenhangers over hun trans endotheliale elektrische weerstand (TEER) en endotheliale permeabiliteit van verschillende tracers 13,17,18 te zijn. Een extra dimensie van doorstroming werd onlangs toegevoegd in een aantal in vitro BBB modellen afschuifkrachten toepassing op het endotheel nauwere simulatie van de hersenen vasculatuur 12,19.
Een technische hindernis te overwinnen bij het genereren van een contact BBB model is het zaaien van astrocyten tegen de zwaartekracht op het abluminale oppervlak van het poreuze membraan. Eerdere protocollen 13,20, waar astrocyten eenvoudigweg werden gezaaid in een druppel media bovenop een inomgezet insert, alleen toegestaan korte zaaien tijden (dwz 10 min 13 of 2 uur 20), die werden gevonden in onze handen onvoldoende voor een goede hechting van cellen te zijn. Uitgaande van deze eerste methode, een langer astrocyten bevestiging vereist constante monitoring van de inserts door frequent openen van de incubator (waardoor schommelingen in temperatuur, pH en vocht) en is ook gevoelig voor ongelijkmatige zaaien van cellen door lekkage van media door de poriën, met name indien poriën groter dan 1 micrometer in dienst zijn.
We beschrijven hier een algemeen protocol voor de bereiding van een contact BBB-model. Onze werkwijze omvat een alternatieve werkwijze voor cel-enten op omgekeerde inserts, welke de bovenvermelde beperkingen richt. De werkwijze maakt ongestoorde hechting van astrocyten op het abluminale membraanoppervlak, per evenwicht incubator voor langere tijd. Hierdoor wordt een gelijkmatige zaaien van astrocyten bereikt die barrière kwaliteit toeneemten minimaliseert basale doorlaatbaarheid verschillen tussen de inserts.
Aangezien het gebruik van menselijke cellen is belangrijk voor het menselijk-relevant onderzoek 21, we bovendien aantonen in dit artikel het specifieke gebruik van een nieuwe combinatie van primaire menselijke Becs en onsterfelijke, menselijke astrocyten voor de oprichting van een contact menselijk BBB-model met een high throughput screening capaciteit . Sinds het bekijken van cellen op poreuze membranen kan moeilijk zijn, we ook detail kleuring technieken die kunnen helpen bij het bepalen van samenloop en cel morfologie op de poreuze membranen. Tenslotte hebben we een voorbeeld hoe onze menselijke BBB model kan worden gebruikt om het effect van weefsel-type plasminogeen activator (t-PA) onderzoeken - een stolsel busting enzym dat als enige behandelingsoptie voor acute ischemische beroerte - de BBB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Culture (3-7 dagen voor BBB Vergadering)
1.1. Primaire Human Brain microvasculaire endotheelcellen (Becs)
Becs werden commercieel verkregen. De cellen werden door Dispase dissociatie van normale menselijke hersenen cortex weefsel en ontvangen van doorgang 3 (<12 populatie verdubbelingen) bevroren.
- Substratum: Jas weefselkweek schepen met "Attachment Factor" volgens de instructies van de fabrikant.
- Onderhoudscel: Handhaaf Becs in serumbevattend compleet medium. Voor experimenten, cultuur Becs in volledige serum-vrij medium. Houd de cellen in een bevochtigde 5% CO2, 21% O2 incubator bij 37 ° C
Opmerking: Als alternatief voor gespecialiseerde reagentia, 0,1% (w / v) gelatine oplossing kan dienen als een bekleding reagens tijdens DMEM/F-12 aangevuld met 15 mM HEPES, 10% (v / v) foetaal kalfsserum (FCS), 2 mM L-glutamine, 50 ug/ Ml gentamycine, 20 ug / ml heparine en 20 pg / ml endotheelcellen groei supplement kan worden gebruikt voor BEC onderhoud. - Sub-kweken voor experimenten: Split confluente BEC in een verhouding van 1:03-01:06, afhankelijk van het beoogde tijd gebruiken (3-7 dagen). Verander het onderhoud medium om de 3 dagen. Gebruik Becs tot 15 passages.
1.2. SVG foetale astrogliale Cell-lijn
SVG humane foetale astroglial cellen 22 werden oorspronkelijk afkomstig van primaire, humane foetale hersenen getransformeerd met replicatie-deficiënte simianvirus 40.
- Onderhoud: Culture SVG-cellen in minimaal essentieel medium met Earle's gebalanceerde zoutoplossing, aangevuld met 20% (v / v) FCS (zelfde serum percentage dat hun ouderlijke primaire cellen 22 te handhaven), 2 mM L-glutamine, 50 U / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine. Houd de cellen in een bevochtigde 5% CO2, 21% O2
- Sub-kweken voor experimenten: Split confluente SVGs in een verhouding 1:5 tot 1:10, bij afhankelijk van de beoogde tijd gebruiken (3-7 dagen). Verwijdering van trypsine is niet vereist vanwege het hoge gehalte aan serum in het medium. Verander het medium om de 3 dagen. Gebruik SVGs tot 20 passages.
2. Montage en Coculturing van de mensenrechten in vitro BBB Model (dag 0)
Commentaar: Het menselijke in vitro contact BBB model wordt bereid volgens de gepubliceerde protocollen 13,23, met wijzigingen.
2.1. Coating van Inserts
- Plaats weefselkweek inserts (6,5 mm in diameter met polyester poreus membraan, 3 urn poriegrootte) in de putjes van de geleverde 24-wells plaat. Smeer het luminale oppervlak van de inserts
Opmerking: basale membraan van de hersenen haarvaten bevat geen collageen I, maar vooral lamininen, collageen type IV isovormen, nidogens en heparansulfaatproteoglycanen 9. Daarom sommige onderzoekers gebruiken bekledingsmiddelen zoals collageen IV, fibronectine 13 of Matrigel (BD Biosciences) 16 voor een authentieke BBB modellering.
2.2. Zaaien SVGs aan de onderzijde (abluminale) membraanoppervlak
- Keren de insert en zachtjes passen rond de rand van het poreuze membraan een kort stuk van elastische siliconen slang ("externe slang"; ~ 10 mm lang, 8 mm inwendige diameter, 1,6 mm wand), waardoor in wezen een nieuw ruim boven de abluminale oppervlak (Figuur 2A).
- De onderkant van het inzetstuk needs te dichten media lekkage te voorkomen. Maak eerst een plug (figuur 2A en 2B) uit een siliconenslang (zogenaamde "interne tubing"; ~ 8 mm lang, 3,2 mm inwendige diameter, 1,6 mm wand; Figuur 2B), afgedicht aan een einde met een kunststof afdichtconus (~ 3 mm lang, bereid door het snijden van de bodem van een 0,2 ml polymerasekettingreactie (PCR) buis; Figuur 2B). Deze conus sluit niet alleen de interne buis lumen, maar breidt de rand strakkere passend in het inzetstuk. Vervolgens wordt met behulp van een steriele pincet, steek de siliconen plug in de luminale holte en vooraf het tot het up-to ~ 1-2 mm van het membraan (Figuur 2A) bereikt.
- Vervolgens zaad 4 x 10 4 SVG-cellen in 200 pi SVG onderhoud medium (sectie 1.2.2 hierboven) direct in de siliconen ruim boven de abluminale membraanoppervlak (Figuur 2A). Laat SVGs te houden gedurende ten minste 4 uur in de incubator.
Opmerking: Om de steriliteit te handhaven transporteren geassembleerd inzetstukken tussen twee 6-well platen (een plaat omgekeerd via andere, figuur 2C) blootstelling aan ongefilterde lucht tijdens de procedure te minimaliseren. Silicone buisjes en pluggen worden gewassen in ethanol en geautoclaveerd voor later gebruik.
Opmerking: Gebruik pluggen (paragraaf 2.2.2) alleen voor wisselplaten met membraanporie maten groter dan 1 micrometer. Membranen met poriën met een diameter ≤ 1 micrometer zelden lekken en vereisen slechts de montage van de externe siliconenslangen (paragraaf 2.2.1). Bovendien hebben sommige andere dan collageen coating agents I (zie toelichting paragraaf 2.1) kunnen lekkage te voorkomen, zelfs door 3 um poriën. Bepaal deze empirisch. - Om de hechting staat van uw astrocyten bewaken, zaad in parallel ineen standaard 96-well een identiek volume van de astrocyten cel-suspensie. Deze goed heeft dezelfde oppervlakte als de 6,5 mm inzetstuk (0,33 cm2) en maakt gemakkelijker visualisatie van cellen door fase-contrast microscopie dan de insert membraan. Wanneer u voldoende hechting van de astrocyten nemen in de controlegroep 96-well, de astrocyten hebben adequaat ook gehandeld op grond van de insert membraan.
- Wanneer astrocyten voldoende in de controlegroep 96-goed hebben gehandeld, de overdracht van de insert vergaderingen om de weefselkweek kap (zie opmerking hierboven) en verwijder voorzichtig de externe silicone slangen en stekkers. Terug inzetstukken aan de normale (dus rechtop) oriëntatie in de meegeleverde putjes die 800 ul / putje van BEC onderhoud medium (punt 1.1.2 hierboven).
2.3. Zaaien van Becs in de Luminal kamer boven de Astrocytes
Zaad 2x10 4 Becs in 200 ul op de collageen gecoate luminale oppervlak en de terugkeer van de inserts in de incubator.
2.4. Coculturing
Coculture de SVG / BEC-geplaatste inserts voor 3 dagen in BEC medium zonder wisselen van materiaal voor experimenten.
3. Experimenteren met de Human BBB Model (dag 3)
- Om de in vitro BBB eerste wasbeurt cellen te stimuleren door het vervangen van de luminale en abluminale media met 600 ul en 100 ul serumvrij medium BEC, respectievelijk.
- Zuig het medium luminale telkens vervangen door 100 ul serumvrij medium met stimulerende middelen.
Opmerking: als stimulatie van de abluminale kamer wordt vereist (de in vitro BBB activeren van de astrocytaire compartiment), zuig het abluminale medium en vervangen door 600 ul serumvrij medium met stimulerende middelen. - Test elke experimentele groep in drievoud (vandaar, indien luminaal stimulatie wordt uitgevoerd, waarvan 3 x 100 ul vereist, raden we het verdunnen van de re middelen hun eindconcentraties in 350 gl serumvrij medium per groep pipetteerfouten tussen putjes minimaliseren).
- Voer standaard paracellulaire en / of transcellulair permeabiliteit testen van gelabelde tracers 16,24 (de laatste we fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerd albumine) en / of meting van TEER 13,16,25 zoals eerder beschreven.
Doorlaatbaarheid (% van max) = (: Ter compensatie van schommelingen in uitgangswaarde tussen permeabiliteit experimenten, veranderingen in permeabiliteit ten opzichte van een beklede insert zonder cellen (die dient als referentie voor maximale permeabiliteit) en de met drager behandelde groep met de formule analyseren permeabiliteit waarde van experimentele insert - gemiddelde permeabiliteit waarde van het voertuig groep) / (permeabiliteit waarde van de blanco insert - gemiddelde permeabiliteit waarde van de groep voertuig) X 100.
4. Visualisatie van cellen op poreuze membranen
nt "> Reactie: ongekleurde cellen op insert membranen zijn moeilijk waar te nemen door fase-contrast of differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie, omdat het membraan is vrij ondoorzichtig en interfereert met lichttransmissie Om te gaan met dit probleem ontwikkelden we verschillende kleuringen van cellen op. inserts, die sterk verbeteren cel verschijning op het membraan. algemeen vlekken het inzetstuk membranen terwijl nog aan het inzetstuk in de putjes. De membranen mag alleen worden verwijderd aan het einde van de kleuring procedure voor montage doeleinden.4.1. Hematoxylin kleuring
- Bevestig inzetstukken met ijskoude 4% (w / v) paraformaldehyde (PFA) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, 130 mM NaCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2PO 4, pH 7,2) gedurende 20 minuten. Was eenmaal in PBS.
- Dompel het inzetstuk in 0,1% Mayer's hematoxyline oplossing gedurende 2 minuten.
- Voorzichtig wassen de insert met kraanwater (door onderdompeling de insert in een bekerglas met kraanwater en de pipet voorzichtig het overtollige water uit). Breng de insert Scott's kraanwater oplossing (2 g / L NaHCO3, 20 g / L MgSO4) voor ~ 20 seconden totdat de gewenste blauwe kleur ontstaat. Was het inzetstuk opnieuw met kraanwater (paragraaf 4.1.3). Een optionele eosinekleuring kan hier worden ingevoerd door dompelen van de insert in 1% eosine-oplossing gedurende 10 seconden gevolgd door een kraan water wassen.
- Lucht-drogen de insert membraan. Met behulp van een scalpel (snijden rond het membraan rand) verwijder het membraan en monteer het op een glasplaatje voor bright-field imaging
Opmerking: Als di-N-butylphthalateinxylene (DPX) fixeermiddel wordt gebruikt was het inzetstuk 100% ethanol gevolgd door xyleen alvorens en monteren membraan.
4.2. Scanning Electron Microscope (SEM)
- Bevestig inzetstukken met ijskoude 4% (gew / vol) PFA in PBS gedurende 20 minuten. Was drie keer in PBS.
- Post-fix de membranen gedurende 30 min in 1% (w / v) Osmiumtetroxide in MQH 2 O.
- Was inserts in water (paragraaf 4.1.3) en dehydrateren in een escalerende ethanol gradiënt (50%, 70%, 90% gedurende 5 min elk, vervolgens 3x met 100% ethanol gedurende 10 min per interval).
- Behandel gedehydrateerd inzetstukken met een mengsel van hexamethyldisilazaan (HMDS): ethanol (01:02 daarna 02:01 gedurende 5 min).
- Behandel inzetstukken 100% HMDS gedurende 5 min, drogen en opslag onder gedroogde omstandigheden.
- Verwijder het membraan met behulp van een scalpel (snijden in het membraan rand). Onderzoek membranen door scanning elektronenmicroscopie.
4.3. Immunofluorescentie
- Bevestig inzetstukken met ijskoude 4% (gew / vol) PFA in PBS gedurende 20 minuten, eenmaal wassen in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 154 mM NaCl, 0,22 urn gefiltreerd).
- Voer immunokleuring van de cellen in het insert membraan zoals eerder beschreven 26.
- Verwijder het membraan met behulp van een scalpel (snijden rond het membraan rand) en plak hem op aglass dia met fluorescentie montage medium. Onderzoek membraan door fluorescentie microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om menselijk contact BBB model moesten we SVGs en BEC op poreuze membranen cultiveren met een 3 micrometer poriegrootte, aangetoond passage van astrocyten end-voeten mogelijk voor contact met endotheelcellen 14,15,27,28 stellen. Een schematische weergave van de volledige contactmodel wordt geïllustreerd in figuur 1 (linker afbeelding). De belangrijkste technische uitdaging van een contactsysteem is de noodzaak om astrocyten zaad tegen de zwaartekracht op het abluminale oppervlak van het membraan. We hebben deze taak opgevolgd door hoofdzakelijk creëren van een verwijderbare silicone goed bovenop het abluminale membraanoppervlak en voorkomt lekkage van medium met een extra siliconenplug ingebracht in de luminale holte (figuur 2). Werkwijze toegestane optimaal, ononderbroken zaaien gedurende SVG (minimaal 4 uur), waardoor werd sterk gehecht aan het poreuze oppervlak met minimale celverlies. Inderdaad, 3 dagen na zaaien zowel SVGs en Becs appeared samenvloeiing en had betrekking op de membraan uniforme, zoals beoordeeld door beelden van-hematoxyline gekleurde inzetstukken (zie paragraaf 4.1, figuur 3A, links panelen). Bovendien, beide celtypen handhaafden hun cel-specifieke markers op poreuze membranen (een diffuus kleuringspatroon van gliale fibrillaire zure eiwit in SVGs 22 en expressie van von Willebrand factor in Wiebel-Palade lichaampjes en cytoplasmatische blaasjes in Becs, figuur 3A, rechts panelen) , waargenomen door immunofluorescentie (paragraaf 4.3). Voorts van SEM beeldvorming (4.2) bleek dat SVGs en BEC rechtstreeks kan groeien over het membraan poriën (Figuur 3A, tussenruiten, pijlpunten), een fenomeen dat kunstmatig bijdraagt aan de fysieke barrièrefunctie van in vitro waren BBB contact modellen1 3,28. Functioneel, in aanwezigheid van SVGs de endotheliale permeabiliteit waarde (Pe) 16,24 TL albumine 28 Improved ~ 4-voudig ten opzichte van BEC alleen (P <0,01, n = 4), van 0,574 ± 0,199 x10 -3 tot 0,126 ± 0,028 x10 -3 cm / min zonder of met astrocyten (SVG), respectievelijk. Deze albumine Pe resultaten zijn vergelijkbaar met een andere studie met behulp van muis Becs met rat C6 glioma cellen 29. Onze zaaien protocol werd met succes toegepast ook om vers geïsoleerde primaire muis Becs en primaire muis astrocyten geteeld op 1 um poriën. In deze muis contact model verkregen we een redelijke fysieke barrière voor de kleine hydrofiele tracer natriumfluoresceïne (P = 0,83 ± 0,22 x10 -3 cm / min, n = 3). Derhalve kunnen onze zaaien werkwijze verlengd bereiding van BBB modellen van andere species.
De meest fundamentele eigenschap van een contact BBB model is het vermogen van astrocyten tot de uiteindelijke poten uitsteken door het membraan poriën fysiek contact endotheelcellen. Een aantal studies maakten gebruik van scanning elektronenmicroscopie, om de identificatietify astrocyten processen die overgaan van de abluminale membraanoppervlak (waar astrocyten zijn gezaaid) aan het luminale oppervlak, als een bewijs van het principe dat het contact tussen astrocyten en EG is aannemelijk 14,15,27. Na deze onderzoeken we afgebeeld door SEM het luminale membraan na zaaien SVGs op het abluminale oppervlak. Zoals getoond in figuur 3B, kan astrocytaire (SVG) end-voeten worden opgemerkt dat door 3 um poriën in het luminale compartiment bevestigt dat contact kan mogelijk zijn tussen SVGs en BEC gezaaid op poriën van deze dimensie. Collectief, was onze zaaien methode eenvoudig, efficiënt, en leverde een authentiek contact BBB-model.
Wij hebben onze menselijke contact BBB model gebruikt om het effect van t-PA, een fibrinolyticum staand, op de BBB. Een aantal artikelen hebben gesuggereerd dat t-PA in staat tot het openen van de BBB induceren tijdens de intraveneuze toediening voor de behandeling van acute ischemische beroerte 30-33. Deze interactie tussen t-PA en de BBB kunnen bijdragen aan de bloeding complicaties in verband met t-PA-geïnduceerde trombolyse 4,34,35 en is dus een onderwerp voor de huidige onderzoeksinspanningen. Onze studies in vitro bevestigd dat t-PA de permeabiliteit van de intacte BBB inderdaad toegenomen concentratie-(figuur 4A) en tijdsafhankelijke wijze (figuur 4B), die zowel binnen een farmacologisch relevante gedeelte 36,37 waren. Bovendien zou dramatische morfologische veranderingen van SVG astrocyten worden waargenomen op de poreuze membranen na blootstelling aan t-PA (Figuur 4C), hetgeen suggereert dat astrocytaire reacties op t-PA grondslag t-PA geïnduceerde BBB opening. Verder onderzoek vastgesteld dat t-PA stimuleert astrocyten via activatie van plasminogeen - het natuurlijke substraat - in de krachtige en breed-spectrum protease plasmine. Voorts t-PA en plasmine bleken Rho-kinase (ROCK) signalering in astrocyten en blokkade activeer van de ROCK route verhinderd t-PA-geïnduceerde BBB opening 28. Dit is een goed voorbeeld van hoe het gebruik van BBB-modellen kunnen leiden tot identificatie van nieuwe biologische processen en therapeutische mogelijkheden.
Figuur 1. Plaats-gebaseerde configuraties van in vitro modellen BBB. Schematische weergaven van statische (zonder stroom) in vitro BBB modellen. In basismodellen hersenen endotheelcellen (EC; oranje) zijn alleen gekweekt op een poreus membraan (geel). In meer geavanceerde benaderingen EC worden gekweekt samen met astrocyten (groen). Astrocyten worden geteeld contactloze omstandigheden op de bodem van de put (rechts), of op het abluminale oppervlak van het poreuze membraan contactomstandigheden (links).nk "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Een verbeterde methode voor astrocyten zaaien op het abluminale membraanoppervlak voor de bereiding van een contact BBB-model. (A) De insert wordt omgekeerd, een kort stukje silicone slang ("externe slang") is samengesteld rond de omtrek en een siliconen plug gemonteerd in het luminale holte. Dit samenstel maakt een goed bovenop het abluminale oppervlak en voorkomt media lekt door de poriën. Cellen kunnen worden gezaaid in de put en te hechten ongestoord gedurende langere tijd (rechts) (B) De siliconenplug wordt bereid uit een stuk siliconenslang ("interne tubing"), gesloten aan een uiteinde met een afdichtende conus die wordt ingebracht in de holte. (C) Na gezaaid, degeassembleerd inserts worden tussen twee 6-well platen getransporteerd (een plaat omgekeerd boven de andere) om het risico op besmetting te minimaliseren. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Visualisatie van de hersenen endotheelcellen (BEC) en astrocyten op een 3 urn poreus membraan A) hematoxyline (linker panelen), scanning elektronenmicroscoop (SEM;. Tussenruiten) en immunofluorescentie afbeeldingen (rechter panelen) van SVG (op het abluminale oppervlak, 40.000 per 6,5 mm insert, top panelen) en Becs (20.000 per 6,5 mm insert op het collageen I-gecoat, luminale oppervlak, bodem panelen) zijn gekweekt op een 3 micrometer poreus membraan voor 3 dagen (zonder coculturing). Beide celtypen bereiken samenvloeiing binnen deze tijd frame en onderhouden van hun cel-specifieke markers (gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) voor SVG en von Willebrand factor (vWF) in Wiebel-Palade lichaampjes voor Becs, rechts panelen) op het membraan. Arrow hoofden in de SEM-panelen verder tonen het vermogen van beide celtypen om direct over groeien en dekken de poriën, terwijl de pijlen geven celkernen. Schaalbalken op SEM beelden vertegenwoordigen 25 micrometer (boven) of 20 micrometer (onder). Schaalbalken op immunofluorescentie beelden vertegenwoordigen 40 micrometer. (B) SEM beelden van SVG end-voeten die door 3 um poriën in de luminale (BEC) oppervlak 3D na zaaien van SVG (alleen) op de abluminale membraanoppervlak. Deze beelden valideren van de mogelijkheden voor de ontwikkeling van echt contact tussen SVGs en Becs in onze menselijke BBB-model. Schaalbalken vertegenwoordigen 6 micrometer op het linkerpaneel en 12 micrometer op het rechter paneel. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 4. weefsel-type plasminogeen activator (t-PA)-gemedieerde toename BBB permeabiliteit wordt door morfologische veranderingen van astrocyten. (A) Toenemende t-PA-concentraties werden toegevoegd aan de luminale ruimte van de menselijke in vitro BBB en permeabiliteit werd bepaald 24 uur later door de passage van fluorescerende albumine in de abluminale kamer. t-PA verhoogde BBB permeabiliteit in een concentratie-afhankelijke wijze. n = 4-6 voor alle groepen maar t-PA 10 nM, waarbij n = 2. *** P <0,001 vergeleken met alle andere groepen met een eenweg ANOVA met Newman-Keuls post hoc. (B) t-PA (1 uM) werd aan de luminale ruimte van de menselijke toegevoegdvitro BBB voor 8 uur en 24 uur voor permeabiliteit assessment. Zoals getoond, t-PA-gemedieerde BBB opening reeds aanzienlijke 8 uur na stimulatie (70,26% van het maximum bij 24 uur) maar een verdere toename werd waargenomen bij 24 uur. n = 6, *** p <0,001, ** p <0.01compared tot nul door een weg ANOVA met Newman-Keuls post hoc. In beide (A) en (B), bars / datapunten geven het gemiddelde ± SEM. (C) Vertegenwoordiger bright-field beelden van Haematoxyline gebeitst SVGs (bovenste panelen) of scanning electronenmicroscoop van SVG (onderste panelen) op polyester insert membranen (3 um poriegrootte) 24 uur na de behandeling met het voertuig of t-PA (1 uM). Uitgesproken t-PA geïnduceerde morfologische veranderingen en verstoring van de SVG monolaag integriteit kan worden waargenomen, wat suggereert dat astrocytaire reacties op t-PA ten grondslag de werking van t-PA op BBB permeabiliteit. Afbeelding zijn representatief voor twee onafhankelijke experimenten. Schaalbalken op SEM beelden vertegenverzonden 61 micrometer (links) of 120 micrometer (rechts). Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medisch onderzoek naar hersenen pathologieën lijdt veel translationeel moeite. Op het gebied van acute ischemische beroerte, bijvoorbeeld veel geneesmiddelen die grote belofte in diermodellen bleek niet in de kliniek 38,39. De redenen voor deze teleurstellende resultaten zijn divers en omvatten ontrouw van de preklinische testsystemen om de menselijke beroerte scenario en overwaardering van de resultaten verkregen uit dierproeven 21. Een strategie om de voorspellende waarde van preklinische bevindingen verbetering van de klinische fase bijkomende ontwikkeling van menselijke cellen gebaseerde in vitro modellen, deze kunnen krachtige en rendabele instrumenten voor het screenen van nieuwe geneesmiddelen en mechanismen en zou men meer aandacht voor klinisch-relevante wegen 21. Binnen deze context beschreven we hier in detail het proces uitgevoerd in ons laboratorium voor de oprichting van een menselijk contact BBB model gebruik te maken van een nieuwe combinatie van menselijke vereeuwigd astrocyten (SVG) en humane primaire Becs voor onderzoek van slag gerelateerde fenomenen.
Onder statische omstandigheden (zonder stroom), contact BBB-modellen (figuur 1) lijken best de in vivo anatomische structuur en worden getoond superieur te zijn in hun barrière-eigenschappen 13,17,18. Belangrijk is, echt contact tussen Becs en astrocyten treedt alleen op membranen met grotere poriën diameter (≥ 1 micrometer), die passage van astrocytaire end-voeten en daaropvolgende inductie van strengere (minder doorlaatbaar) BEC monolagen 14,15,27 toestaan. De zaaien van astrocyten op omgekeerde inzetstukken met hogere poriegrootte - de kern technisch element bij de bereiding van een contact BBB model - vormt een dubbele technische uitdaging, omdat naast het beperkte medium volume dat kan worden toegevoegd aan de geïnverteerde 6,5 mm inserts (~ 50 ul), de membranen ook gevoelig voor lekkage drager vanwege hun grote poriediameter. Deze beperkingen kunnen de ast makenrocytic zaaien onhandig en inconsistent.
Onze innovatieve techniek voor het zaaien astrocyten op omgekeerde inzetstukken met 3 um poriën biedt een eenvoudige maar effectieve oplossing voor deze procedure. Door een afneembare ondoordringbare siliconen en bovenop het abluminale oppervlakken die sterk verbeterd de astrocyten vermogen om succesvol hechten aan het poreuze membraan. Dit maakt uniforme groei van astrocyten op het abluminale oppervlak en maakt reproduceerbare bereiding van een groot aantal inzetstukken voor gelijktijdig screenen van vele experimentele parameters (bijvoorbeeld de recent uitgevoerde onderzoek van het effect van vijf verschillende plasminogeen-activatoren de BBB 28). Vandaar dat, ondanks zijn eenvoud, vonden we onze methode om drastisch verbeteren van de doorvoer en de kwaliteit van ons onderzoek het gebruik van dit contact BBB-model. Een beperking van onze astrocyten zaaien methode is de eis voor extra manuele behandeling van de inserts, die dunne haven (10 μm dik) membranen. Buitensporige of ruwe behandeling kan micro-tranen en schade aan het membraan veroorzaken. Vandaar het gebruik van zachte en flexibele siliconen slang is essentieel omdat de montage / demontage moet worden uitgevoerd met minimale kracht.
Met betrekking tot haar totale concept, werd onze menselijke BBB model opgesteld op basis van een eerder beschreven protocol 14,23 die oorspronkelijk gebruikt primaire menselijke cellen. Ondanks hun superioriteit voor BBB modelleren, een nadeel van de werkgelegenheid van primaire menselijke hersencellen is het onvermogen om routinematig toegang tot live-menselijk hersenweefsel voor regelmatige productie van primaire Becs en astrocyten en / of de kosten die betrokken zijn bij hen in de handel te verkrijgen. Aangezien veel BBB-modellen met succes primaire astrocyten te vervangen door vereeuwigd astrocyten (bijvoorbeeld met een rat C6 glioma cellen 29), was het redelijk om SVG astrocyten in dienst 22 als een roman, overvloedig en kosteneffectieve optie voor menselijke BBB-modellering. Het vermogen van SVGs aanpositieve invloed op de BEC barrièrefunctie gevalideerd in principe hun geschiktheid voor BBB-studies. In tegenstelling, hebben we gekozen om de primaire Becs in onze BBB-model voor hun cruciale rol in de BBB in vivo 1,2,9 houden. Belangrijk, kan langdurig kweken van primaire BEC leiden tot dedifferentiatie en verslechtering van hun BBB-specifieke fenotype. Dit is inderdaad duidelijk aanwezig zijn in ons systeem door een vrij hoge endotheliale permeabiliteit waarden voor albumine. Daarom hebben we ons model voornamelijk gebruikt in relatieve wijze 28 (figuur 4), rekening houdend met de verhoogde basale permeabiliteit. Als een zeer strakke menselijke BEC monolaag gewenst de barrièrefunctie kan verder worden verbeterd door toevoeging van chemicaliën zoals glucocorticoïde hydrocortisone 17 of cyclische AMP fosfodiesterase remmers met 13. Onsterfelijke, menselijke Becs, zoals de hCMEC/D3 cellijn 40, kan ook gebruik worden om hun vermogen om ti beter handhavenght kruispunten in de tijd. Toch BEC cellijnen vaak gereduceerd barrière-eigenschappen weer te geven in vergelijking met laag-passage primaire Becs 41,42 en moet zorgvuldig worden overwogen vanwege andere mogelijke veranderingen (dwz veranderde expressie van celoppervlak receptoren).
Collectief, onze wijziging van het astrocytaire celtype (dat wil zeggen de tewerkstelling van SVG) en de aanzienlijke verbetering van de astrocyten zaaien protocol resulteerde in het genereren van een reproduceerbaar, gemakkelijk te monteren en authentieke menselijke contact BBB-model. Rekening houdend met zijn beperkingen, kan dit systeem dienen als een nuttig hulpmiddel voor in-vitro-onderzoek niet alleen van acute ischemische beroerte, zoals we geïllustreerd hier 28, maar ook van diverse andere hersenen pathologieën waarbij modulatie van de BBB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door subsidies toegekend aan RLM van de National Health and Medical Research Council of Australia (subsidie # 606658).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attachment Factor | Cell-Systems Corporation | 4Z0-210 | |
| Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Complete medium | Cell-Systems Corporation | 4Z0-500 | Supplemented with CSC JetFuel |
| Complete serum-free medium | Cell-Systems Corporation | SF-4Z0-500 | Supplemented with CSC RocketFue |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Endothelial cells growth supplement (from bovine origin) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| External silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A080.016 | Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| Foetal calf serum | Lonza | 14-501F | |
| Gentamycin sulfate | Life Technologies | 15750-060 | |
| Heparin sodium | Pfizer | 1,000 U/ml | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | H4875 | |
| Human brain microvascular endothelial cells | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Internal silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A032.016 | Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Mayer’s hematoxylin solution | Amber Scientific | MH | |
| Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution | HyClone Laboratories | SH30244.01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Rat collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | Cultrex brand |
| Tissue culture inserts | Corning Life Sciences | 3472 | Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size |
References
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
- Vivien, D., Gauberti, M., Montagne, A., Defer, G., Touze, E. Impact of tissue plasminogen activator on the neurovascular unit: from clinical data to experimental evidence. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2119-2134 (2011).
- Stewart, P. A., Wiley, M. J. Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail--chick transplantation chimeras. Dev. Biol. 84, 183-192 (1981).
- Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325, 253-257 (1987).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E.
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathol. 122, 1-9 (2011).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin. Immunopathol. 31, 497-511 (2009).
- Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100, 328-335 (2006).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 59-127 (2005).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12, 1784-1792 (2012).
- Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. Eur. Pharm. Sci. 12, 215-222 (2001).
- Hurwitz, A. A., Berman, J. W., Rashbaum, W. K., Lyman, W. D. Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells. Brain Res. 625, 238-243 (1993).
- Demeuse, P., et al. Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier. J. Neurosci. Methods. 121, 21-31 (2002).
- Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab. Invest. 85, 734-746 (2005).
- Cohen-Kashi Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in vivo and in vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
- Kroll, S., et al. Control of the blood-brain barrier by glucocorticoids and the cells of the neurovascular unit. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1165, 228-239 (2009).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 312-328 (2008).
- Li, G., et al. Permeability of endothelial and astrocyte cocultures: in vitro blood-brain barrier models for drug delivery studies. Ann. Biomed. Eng. 38, 2499-2511 (2010).
- Antonic, A., Sena, E., Donnan, G., Howells, D. Human In Vitro Models of Ischaemic Stroke: a Test Bed for Translation. Transl. Stroke Res. 3, 306-309 (2012).
- Major, E. O., et al. Establishment of a line of human fetal glial cells that supports JC virus multiplication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1257-1261 (1985).
- Eugenin, E. A., Berman, J. W. Chemokine-dependent mechanisms of leukocyte trafficking across a model of the blood-brain barrier. Methods. 29, 351-361 (2003).
- Dehouck, M. P., et al. Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models. J. Neurochem. 58, 1790-1797 (1992).
- Perriere, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).
- Niego, B., Samson, A. L., Petersen, K. U., Medcalf, R. L. Thrombin-induced activation of astrocytes in mixed rat hippocampal cultures is inhibited by soluble thrombomodulin. Brain Res. 1381, 38-51 (2011).
- Ma, S. H., Lepak, L. A., Hussain, R. J., Shain, W., Shuler, M. L. An endothelial and astrocyte co-culture model of the blood-brain barrier utilizing an ultra-thin, nanofabricated silicon nitride membrane. Lab Chip. 5, 74-85 (2005).
- Niego, B., Freeman, R., Puschmann, T. B., Turnley, A. M., Medcalf, R. L. t-PA-specific modulation of a human BBB model involves plasmin-mediated activation of the Rho-kinase pathway in astrocytes. Blood. , (2012).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Niwa, M., Falus, A. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm. Res. 52, 39-40 (2003).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nat. Med. 14, 731-737 (2008).
- Yepes, M., et al. Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein. J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).
- Abu Fanne, R., et al. Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity. Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).
- Wang, X., et al. Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator. Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).
- Wang, X., et al. Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke. Stroke. 35, 2726-2730 (2004).
- Donnan, G. A., et al. How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke. Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).
- Acheampong, P., Ford, G. A. Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).
- Derex, L., Nighoghossian, N. Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).
- Garber, K. Stroke treatment--light at the end of the tunnel. Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).
- Liebeskind, D. S.
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
- Song, L., Pachter, J. S. Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).
- Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).
