Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Улучшенная способ получения человеческой клетки на основе, Связаться Модель гематоэнцефалического барьера

Published: November 12, 2013 doi: 10.3791/50934
Automatic Translation
1, 1
1Australian Centre for Blood Diseases, Monash University

Summary

Создание человека моделей гематоэнцефалический барьер (BBB) ​​может принести пользу исследования в условиях мозга, связанных с отказом BBB. Опишем здесь улучшенную методику для подготовки модели BBB контакта, что позволяет сокультивировани человеческих астроцитов и эндотелиальных клетках головного мозга на противоположных сторонах пористой мембраны.

Abstract

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) включает непроницаемые но адаптируемые капилляры мозга, которые плотно контролируют окружающую среду мозга. Выход из строя BBB была подразумеваемых в этиологии многих патологий головного мозга, создавая потребность в развитии человека в пробирке моделей BBB для оказания помощи в клинически соответствующих исследований. Среди многочисленных моделей BBB до сих пор описанных, статический (без потока), обратитесь ВВВ модель, в которой астроциты и эндотелиальных клетках головного мозга (БЭК) будут совместно культивировали на противоположных сторонах пористой мембраны, возникла как упрощенной еще аутентичной системы для моделирования BBB с высокопроизводительного скрининга мощности. Тем не менее, поколение этой модели представляет несколько технических проблем. Здесь мы опишем протокол для приготовления контакт человека BBB модели с использованием новой комбинацией первичных человеческих БЭК и увековечены человека астроцитов. В частности, мы подробно инновационный метод посева клеток на перевернутых вставками, а также указать INSERт методы окраски и примером того, как мы используем нашу модель для BBB-исследований, связанных с.

Introduction

BBB является специализированным интерфейсом между периферического кровообращения и центральной нервной системы, что особенно важно, ответственного за поддержание мозга гемостаза. Она включает в себя различные мозговые микрососудистых эндотелиальных клетках (БЭК), которые функционально зависит от нескольких клеточных и бесклеточных компонентов (ниже) с образованием жесткой и динамический шлюз в мозг. В физиологических условиях BBB ограничивает прохождение клеток крови, плазмы и компонентов вредных веществ, все потенциально нейротоксические, в мозг. Параллельно с этим BBB выборочно обменивается ключевые ионы и питательные вещества (глюкоза и аминокислоты) и продуктов обмена веществ между мозгом и циркуляции точно поддерживать среду мозга 1,2. В последние годы становится очевидным, что выход из строя BBB происходит в различных хронических патологий головного мозга, таких как нейродегенеративные или воспалительных заболеваний (например, болезни Альцгеймера и Multiplе склероз, соответственно) 3, а также в острых заболеваний, как ишемический инсульт 4.

Уникальные свойства BBB эндотелиальных клетках головного мозга (БЭК) в значительной степени индуцируется их головного среды 5, и, в частности, астроциты 6,7. Существует понимание того, что другие сотовые типы, такие как перицитами 8, нейронов и микроглии 1,3, а также базальная мембрана 9, поддерживает БЭК и образуют вместе функциональный блок называется "нервно-сосудистого аппарата" (NVU), который одновременно пары нейронных метаболические требования к их поставщикам капилляров 10.

Участие BBB в патологических ситуациях лежит в основе многочисленных попытки развить в пробирке моделей BBB для оказания помощи в BBB-исследований, связанных с 11,12. Эти модели направлены, чтобы имитировать как можно ближе в естественных условиях BBB характеристик в соответствии с принципом НВУ. Экстракорпоральное 13 человека 14, крысы 15, мыши 16 и свиных 17,18 происхождения), культивировали на пористую мембрану вместе со вспомогательными астроцитов (широко рассмотрены Deli и др.. 2005 11).

Астроциты могут быть выращены в бесконтактных условий в нижней части культуре ткани также, отделенной от БЭК (культивируемых на верхней поверхности мембраны) по культуральную среду еще общении с БЭК с помощью растворимых факторов 16. В более продвинутых моделей, которые лучше напоминают анатомическое строение ГЭБ в естественных условиях, астроциты ведутся в условиях контакта и культивируют непосредственно на противоположной стороне мембраны в непосредственной близости от БЭК 13,15,17 (рис. 1). Такая конфигурация позволяет физический контакт между БЭК и астроцитов, устанавливается, когда астроциты проектих процессы через пористую мембрану. Важно отметить, что для настоящего контакта, чтобы произойти поры должны быть ≥ 1 мкм в диаметре, так как астроцитарных конечные ноги не могут пройти через меньших размеров пор (т.е. 0,4 мкм) 14,15. Примечательно, что контакт BBB системы демонстрируются в некоторых исследованиях, превосходит их бесконтактных коллегами в отношении их транс-эндотелиальной электрического сопротивления (Тир) и эндотелиальных значений проницаемости различных индикаторов 13,17,18. Дополнительный аспект медиапотока недавно был добавлен в ряде моделей в пробирке BBB применить усилия сдвига к эндотелию к более тесному моделирования сосудистой мозговой 12,19.

Одним из технических препятствие преодолеть при создании модели контакт ВВВ является посев астроцитов против силы тяжести на abluminal поверхности пористой мембраны. Предыдущие протоколы 13,20, где астроциты были просто посеянные в капле СМИ на вершине инпреобразуется вставка, разрешается раз только короткая посева (т.е. 10 мин 13 или 2 часа 20), которые были найдены в наших руках, чтобы быть недостаточно для надлежащего прикрепления клеток. Используя этот базовый метод, период больше привязанность астроцитов требуется постоянный мониторинг вставок по частого открывания инкубатора (причинение колебания температуры, рН и влажности), а также склонны к неравномерному посева клеток вследствие утечки СМИ через поры, особенно если используются поры, размер которых превышает 1 мкм.

Здесь мы описываем общий протокол для подготовки модели контакт BBB. Наша процедура включает альтернативный способ посева клеток на перевернутых вставками, в которой рассматриваются вышеупомянутые ограничения. Способ позволяет спокойно прилипание астроцитов на abluminal поверхности мембраны, в равновесном инкубаторе в течение длительного периода времени. В результате равномерный посев астроцитов достигается который повышает качество барьернойи минимизирует базальные изменения проницаемости между вставками.

Поскольку использование человеческих клеток имеет важное значение для исследования человеческой релевантных 21, мы дополнительно продемонстрировать в этой статье с ростом удельной загрузки новой комбинации первичных человеческих БЭК и увековечил человека астроциты для создания контакта человека BBB модели с высокопроизводительного скрининга мощности . С просмотра клеток на пористых мембран может быть трудно, мы также методы окраски детали, которые могут помочь в определении слияния и морфологии клеток на пористых мембран. Наконец, мы примером того, как наша человеческая модель BBB могут быть использованы для изучения влияния тканевого типа активатора плазминогена (ТАП) - сгусток перебора фермент, который служит в качестве единственного варианта лечения острого ишемического инсульта - на BBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Культура клеток (3-7 дней до BBB Ассамблеи)

1.1. Первичные элементы Человеческий мозг Микрососудистой эндотелия (БЭК)

БЭК были коммерчески получены. Клетки были произведены диспаза диссоциации нормальной человеческой коры головного мозга ткани и при условии, замораживали при прохождении 3 (<12 удвоений популяции).

  1. Субстрат: Пальто ткани культуры суда с "Приложение фактор", как в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Обслуживание Сотовый: Поддержание БЭК в содержащей сыворотку полной среде. Для экспериментов, культуры БЭК в полной среде без сыворотки. Поддержание клетки в увлажненной 5% CO 2, 21% O 2 инкубаторе при температуре 37 ° С
    Примечание: В качестве альтернативы специализированных реагентов, 0,1% (вес / объем) желатин решение может служить в качестве реагента для нанесения покрытия в то время как DMEM/F-12, дополненной 15 мМ HEPES, 10% (об / об) фетальной сыворотки теленка (FCS), 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/ Мл гентамицина, 20 мкг / мл гепарина и 20 мкг / мл рост эндотелиальных клеток добавка может быть использована для обеспечения БЭК.
  3. Суб-культивирования для экспериментов: Сплит сливающиеся БЭК в соотношении от 1:3 до 1:06, в зависимости от предполагаемого времени для следующего использования (3-7 дней). Измените обслуживания среду каждые 3 дня. Используйте БЭК до 15 пассажей.

1.2. SVG человека плода астроглиальных сотовый строки

SVG плодов человека астроглиальных клеток 22 были первоначально получены из первичных культурах мозга плода человека, трансформированной репликации с дефицитом обезьяньего вируса 40.

  1. Техническое обслуживание: Культура SVG клеток в минимальной основной среде с сбалансированный солевой раствор Эрла, дополненной 20% (объем / объем) ФТС (такой же процент сыворотка используется для поддержания их родительских первичных клеток 22), 2 мМ L-глутамина, 50 Ед / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина. Поддержание клетки в увлажненной 5% CO 2, 21% O 2
  2. Суб-культивирования для экспериментов: Сплит сливающиеся SVGS в соотношении от 1:5 до 1:10, в зависимости от предполагаемого времени для следующего использования (3-7 дней). Удаление трипсина не требуется благодаря высокому содержанию сыворотки в среде. Изменение среды каждые 3 дня. Используйте SVGs до 20 пассажей.

2. Сборка и сокультивировани из человека в пробирке BBB модели (день 0)

Комментарий: человеку в пробирке модель контакт BBB готовится в соответствии с опубликованными протоколами 13,23, с изменениями.

2.1. Покрытие вставками

  1. Поместите ткань-культуры вставки (6,5 мм в диаметре с полиэфирной пористую мембрану, 3 мкм пор по размерам) в лунки поставляемого 24-луночный планшет. Coat просвета поверхность вставок на ночь в увлажненной 37 ° C инкубаторе с крысиным коллагеном I (20 мкг / см 2; 50 мкл 132 мкг/ Мл коллагена I в 0,02%-ной уксусной кислотой в Milli-Q воды (MQH 2 O)). Промывают один раз вставок (оба из abluminal и просвета стороне) с MQH 2 O для удаления остаточной кислоты.
    Примечание: базальной мембраны капилляров головного мозга не содержит коллаген я, но в основном ламинины, коллаген типа IV изоформы, nidogens и гепарансульфат протеогликаны 9. По этой причине, некоторые исследователи используют покрытия вещества, такие как коллаген IV, фибронектина 13 или Матригель (BD Biosciences) 16 для более подлинного моделирования BBB.

2.2. Посев SVGS на нижней (Abluminal) поверхности мембраны

  1. Переверните вставку и осторожно подходят по краю пористой мембраны короткий кусок упругой силиконовой трубки ("внешняя трубка"; ~ 10 мм, 8 мм с внутренним диаметром 1,6 мм стенки), создавая по сути новый значительно выше abluminal поверхности (рис. 2а).
  2. Нижняя часть вставки в девичествеспуск быть закрыты, чтобы избежать утечки в СМИ. Во-первых, подготовить пробку (рис. 2а и 2b), изготовленный из силиконовой трубки (называемые "внутренние трубки"; длиной ~ 8 мм, 3,2 мм внутренний диаметр, 1.6 мм стенка; фиг.2В), запечатанной на одном конце с пластмассовым уплотнительным конусом (~ 3 мм длиной; подготовлен путем разрезания дно 0,2 мл полимеразной цепной реакции (ПЦР) трубки; рис. 2В). Этот конус не только герметизирует внутренний просвет трубок, но и расширяет свой ​​край для более плотного монтажа в вставки. Далее, используя стерильного пинцета, вставьте силиконовую пробку в полость просвета и заранее его, пока он не достигнет последнюю ~ 1-2 мм от мембраны (рис. 2A).
  3. Затем семена 4 х 10 4 SVG клеток в 200 мкл SVG поддерживающую среду (SEводств 1.2.2 выше) непосредственно в силикона намного выше abluminal поверхности мембраны (рис. 2А). Разрешить SVGs придерживаться по крайней мере 4 ч в инкубаторе.
    Примечание: Чтобы поддерживать стерильность транспортировки собранные вставки между двумя 6-луночных планшетах (одна пластина перевернутой по отношению к другому; фиг.2С) сведения к минимуму воздействия нефильтрованного воздуха во время процедуры. Силиконовые трубы и пробки промывают в этаноле и обрабатывали в автоклаве для последующего использования.
    Примечание: Используйте вилки (раздел 2.2.2) только для пластин с мембранной поры размером более 1 мкм. Мембраны с диаметром пор ≤ 1 мкм редко утечки и требуют лишь установку внешнего трубки силиконовой (раздел 2.2.1). Кроме того, некоторые агенты покрытия, кроме коллагена I (см. примечание к п. 2.1) может предотвратить неплотности даже через 3 мкм поры. Определить это опытным путем.
  4. В целях контроля за соблюдением состояние ваших астроцитов, семян параллельно встандартный 96-а идентичны объем клеточной взвеси астроцитов. Это хорошо имеет такую ​​же площадь поверхности, как 6,5 мм Вставка (0,33 см 2) и обеспечивает более легкое визуализацию клеток путем фазово-контрастной микроскопии, чем вставки мембраны. При наблюдении достаточное сцепление астроцитов в контроле 96-луночный, астроциты были адекватно придерживались также вставки мембраны.
  5. Когда астроциты были достаточно придерживаться в управлении 96-а, передать вставки сборок в капот культуры ткани (см. примечание выше) и аккуратно извлеките внешний трубки силиконовые и заглушки. Вернуться вставки в нормальное (то есть в вертикальном положении) ориентации в поставляемых лунки, содержащие 800 мкл / лунку БЭК поддерживающую среду (раздел 1.1.2 выше).

2.3. Посев БЭК в просвета палаты выше астроцитов

Семенной 2x10 4 БЭК в 200 мкл на коллагена покрытием поверхности просвета и вернуть INSEРТС в инкубаторе.

2.4. Сокультивировани

Сокультивирования на SVG / БЭК-сеяных вставки для 3 дней в БЭК среде без смены носителя до экспериментов.

3. Эксперименты с моделью человека BBB (День 3)

  1. Чтобы стимулировать в пробирке BBB первой стирки клетки, заменив abluminal и просвета СМИ с 600 мкл и 100 мкл сыворотки BECS среды, соответственно.
  2. Аспирируйте просвета среду снова и заменить 100 мкл сыворотки среде с стимулирующих агентов.
    Примечание: Если стимуляция abluminal камеры не требуется (для активации в пробирке BBB от астроцитов ящиком), аспирации abluminal среду и заменить 600 мкл бессывороточной среде с стимулирующие агенты.
  3. Проверьте каждой экспериментальной группы в трех экземплярах (отсюда, если просвета стимуляция выполняется, которая требует 3 х 100 мкл, мы рекомендуем разбавления повторно агенты в их конечные концентрации в 350 мкл бессывороточной среде в каждой группе, чтобы свести к минимуму ошибки пипетирования между лунками).
  4. Выполнять стандартные парацеллюлярной и / или проницаемости трансцеллюлярного анализы меченых индикаторов 16,24 (для последнего мы используем изотиоцианат флуоресцеина (FITC-конъюгированные) альбумин) и / или измерение Тир 13,16,25 как описано выше.

Для учета колебаний базового проницаемости между экспериментами, анализировать изменения в проницаемости по отношению к покрытой вставки без клеток (который служит в качестве эталона для максимальной проницаемости) и к обработанной носителем группы по формуле: проницаемости (% от макс) = ( значение проницаемости экспериментальной вставки - среднее значение проницаемость группы транспортного средства) / (значение проницаемость пустой вставкой - среднее значение проницаемость группы транспортного средства) X 100.

4. Визуализация клеток на пористых мембран

нт "> Комментарий: неокрашенные клетки на вставки мембран трудно наблюдать на фазового контраста или дифференциального интерференционного контраста (DIC) микроскопии так как мембрана довольно непрозрачной и препятствует прохождению света Чтобы справиться с этой проблемой мы разработали различные процедуры окрашивания клеток на. вкладыши, которые значительно улучшают внешний вид клеток на мембране. Как правило, окрашивают вставки мембраны в то время как все еще прикреплены к вставке, в лунках. Мембраны должны быть удалены только в конце процедуры окрашивания для монтажа целей.

4.1. Гематоксилин Окрашивание

  1. Исправить вставки ледяным 4% (вес / объем) параформальдегида (PFA) в фосфатно-солевом буфере (PBS; 130 мМ NaCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 10 мМ NaH 2 PO 4, рН 7,2) в течение 20 мин. Промыть раз в PBS.
  2. Погрузите вставки в гематоксилин решения 0,1% Майера в течение 2 мин.
  3. Осторожно промыть вставку с водопроводной водой (путем погружения входыERT в химический стакан, содержащий водопроводной водой и осторожно пипеткой избыток воды из). Передача вставку в растворе Скотта водопроводной воды (2 г / л NaHCO 3, 20 г / л MgSO 4) в течение ~ 20 сек, пока желаемый синий цвет не развивается. Промойте вставку снова с водой из-под крана (раздел 4.1.3). Дополнительный эозином может быть введен здесь путем погружения вставку в 1% растворе эозином в течение 10 сек с последующей промывкой водопроводной водой.
  4. Высушите вставки мембраны. Использование скальпеля (режущий вокруг мембраны края) удалить мембрану и смонтировать его на предметное стекло для работы с изображениями светлого поля
    Примечание: Если используется ди-N-butylphthalateinxylene (DPX) монтаж средний мыть вставки со 100% этанола, после чего перед удалением ксилола и монтажа мембраны.

4.2. Сканирующий электронный микроскоп (SEM)

  1. Исправить вставки ледяным 4% (вес / объем) PFA в PBS в течение 20 минут. Вымойте три раза в PBS.
  2. После фиксации мембраны в течение 30 мин в 1% (вес / объем) Тетроксид осмия в MQH 2 O.
  3. Промыть пластины в воде (раздел 4.1.3) и обезвоживают в эскалации этанола градиентом (50%, 70%, 90% в течение 5 мин, затем каждой 3x со 100%-ным этанолом в течение 10 мин в интервале).
  4. Treat обезвоженные вставки смесью гексаметилдисилазана (HMDS): этанол (1:2 затем 2:01 в течение 5 мин).
  5. Лечить вставки с 100% HMDS в течение 5 мин, воздушно-сухой и магазина под сушеных условиях.
  6. Снимите мембрану с помощью скальпеля (режущий вокруг мембраны краю). Изучите мембран методом сканирующей электронной микроскопии.

4.3. Иммунофлюоресценция

  1. Исправить вставки ледяным 4% (вес / объем) PFA в PBS в течение 20 мин, мыть один раз в Трис-буферном солевом растворе (TBS, 50 мМ Трис-HCl рН 7,6, 154 мМ NaCl, 0,22 мкм фильтрованный).
  2. Выполнение иммунное окрашивание клеток на пластину мембраны, как описано выше 26.
  3. Снимите мембрану с помощью скальпеля (режущий вокруг мембраны края) и установите его на AGдевушка слайд с флуоресцентной монтажной среды. Осмотрите мембрану флуоресцентной микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для того чтобы установить человека, контакт ВВВ модель мы должны были культивировать SVGs и БЭК на пористых мембран с размером пор 3 мкм, как показано, чтобы разрешить прохождение астроцитов конечных ног для контакта с эндотелиальных клеток 14,15,27,28. Схематическое представление полной контактной модели показан на рисунке 1 (слева рисунок). Основной технической задачей, представленный контактной системы является необходимости инициализировать астроциты против силы тяжести на abluminal поверхности мембраны. Нам удалось этой задачи по созданию принципиально съемный силикон хорошо сверху abluminal поверхности мембраны, предотвращая утечку среды с дополнительным силиконовой пробкой, вставленной в полость просвета (рис. 2). Метод позволил оптимального посева, непрерывный период SVGs (по крайней мере 4 ч), что в свою очередь стал сильно прикреплен к пористой поверхности с минимальной потерей клеток. Действительно, 3 дня после посева обе SVGs и БЭК приложениеушастый Конфлюэнтные и покрыли мембрану равномерно, подтверждаемая изображений окрашенных гематоксилином вставками (см. раздел 4.1, рисунок 3А, оставленные панелей). Кроме того, оба типа клеток сохранили свои специфические клеточные маркеры на пористых мембран (диффузное окрашивание структура глиальных фибриллярного кислого белка в SVGs 22 и экспрессии фактора фон Виллебранда в Wiebel-Палада органов и цитоплазматических везикул в БЭК; фиг.3А правые панели) , наблюдается иммунофлуоресценцией (раздел 4.3). Кроме того, от визуализации SEM (раздел 4.2) стало очевидно, что SVGS и БЭК были способны расти прямо над поры мембраны (рис. 3А, средние панели, наконечники стрел), явление, которое искусственно способствует физической барьерной функции в пробирке BBB контакт models1 3,28. Функционально в присутствии SVGs величина проницаемости эндотелия (Ре) 16,24 флуоресцентного альбумин 28 Improвед ~ 4-кратный по отношению к БЭК один (P <0,01, N = 4), от 0,574 ± 0,199 x10 -3 до 0,126 ± 0,028 x10 -3 см / мин с или без астроцитов (SVGS), соответственно. Эти альбумина результаты Пе сопоставимы с другом исследовании с использованием БЭК мыши с крыса С6 клеток глиомы 29. Наш протокол посев был успешно применен и для свежих изолированных первичных БЭК мыши и первичные астроциты мыши, выращенные на 1 мкм поры. В этом мыши контактной модели были получены достаточные физического барьера для небольшого гидрофильного флуоресцеина трассировщик натрия (Ре = 0,83 ± 0,22 x10 -3 см / мин; п = 3). Таким образом, наш метод посева может быть продлен на подготовке моделей BBB из других видов.

Наиболее фундаментальная особенность модели контакт BBB является способность астроцитов в их конечных ноги проецировать через поры мембраны физически связаться эндотелиальные клетки. Несколько исследований использовали сканирующей электронной микроскопии для идентифы астроциты процессы, которые проходят от abluminal поверхности мембраны (где астроциты высевают) на поверхность просвета, как доказательство принципа, что контакт между астроциты и ЕС является правдоподобным 14,15,27. После этих исследований мы вошедшие в образ с помощью СЭМ просвета мембрану после посева SVGs на abluminal поверхности. Как показано на фиг.3В, астроцитов (SVG) конечные ноги можно было наблюдать, проходящая через 3 мкм поры в просвете отсека, подтверждая, что контакт может потенциально существовать между SVGs и БЭК высевали на поры этого размера. В совокупности, наш метод посева был простым, эффективным и принесло подлинное модель контакт ВВВ.

Мы использовали нашу человеческую модель контакт ВВВ исследовать эффект ТАП, фибринолитического агента, на BBB. Ряд статей предположили, что т-АП может быть способен индуцировать открытие BBB в процессе его внутривенного введения для лечения острого ишемического инсульта 30-33. Это взаимодействие между АПТ и ГЭБ может способствовать кровотечений, связанных с ТАП-индуцированной тромболизиса 4,34,35 и, таким образом, предметом нынешних усилий научно-исследовательских. Проведенные исследования в пробирке подтверждает, что т-АП действительно повысило проницаемость неповрежденной BBB в концентрации (фиг.4А) и время-зависимым образом (фиг. 4В), которые были оба в фармакологически соответствующем диапазоне 36,37. Кроме того, драматические морфологические изменения SVG астроцитов можно было наблюдать на пористые мембраны после воздействия на ТАП (Рисунок 4C), предполагая, что астроцитарных ответы на ТАП лежат ТАП-индуцированный открытие ВВВ. Последующее расследование установлено, что ТАП стимулирует астроциты с помощью активации плазминогена - его естественная подложки - в мощной и широкого спектра действия протеазы плазмина. Кроме того, ТАП и плазмин были найдены, чтобы активировать Rho-киназы (ROCK) сигнализации в астроциты и блокаду Скалы пути предотвратить ТАП-индуцированный ВВВ отверстие 28. Это хороший пример того, как использование моделей BBB может привести к идентификации новых биологических процессов и терапевтических возможностей.

Рисунок 1
Рисунок 1. Вставьте основе конфигурации в пробирке моделей BBB. Схематические изображения статических (без потока) в пробирке моделей BBB. В базовых моделей эндотелиальных клетках головного мозга (ECS; оранжевые) культивируют в одиночестве на пористую мембрану (желтый). В более продвинутых подходов по этике являются совместно культивировали с астроцитов (зеленый). Астроциты могут быть выращены либо в бесконтактных условиях, на дне колодца (справа) или на abluminal поверхности пористой мембраны в условиях контакта (слева).НК "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2
Рисунок 2. Усовершенствованный метод астроцитов посева на abluminal поверхности мембраны для подготовки модели контакт BBB. (A) Пластина инвертирована, короткий кусок силиконовой трубки («внешний трубки") собран по его периметру и силикон вилка в просвета полости. Этот узел создает скважину на верхней части abluminal поверхности и предотвращает утечку носитель через поры. Клетки могут быть высевают в скважину и дают возможность прилипать покое в течение длительных периодов времени (справа) (B) силиконовый вилка, полученных из другой части силиконовой трубки ("внутренние трубки"), запечатанной на одном конце с уплотнительным конусом, который вставляется в ее полости. (C) После того, как затравку,собранные вставки перевозятся между двумя 6-луночные планшеты (одна пластина перевернутой над другим), чтобы свести к минимуму риск загрязнения. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 3
Рисунок 3. Визуализация эндотелиальных клетках головного мозга (БЭК) и астроцитах на 3 мкм пористую мембрану А) гематоксилин (слева панели), сканирующего электронного микроскопа (SEM;. Средними панел) и иммунофлюоресценции изображений (правые панели) от SVGs (на поверхности abluminal, 40000 за 6,5 мм вставки, верхних панелей) и БЭК (20000 в 6,5 мм вставки на коллагена I-покрытием, просвета поверхность, донные панели), выращенной на пористую мембрану 3 мкм в течение 3 дней (без сокультивировани). Оба типа клеток достичь слияния в течение этого времени фрамне и поддерживать свои специфические клеточные маркеры (глиальных фибриллярного кислого белка (GFAP) для SVG и фактора фон Виллебранда (ФВ) в Wiebel-Палада органов для БЭК, правых панелях) на мембране. Стрелка головы в панелях SEM дальше показать способность обоих типах клеток непосредственно расти снова и покрыть поры, в то время как стрелки представляют клеточные ядра. Масштабные бары на РЭМ-изображений представляют 25 мкм (верхний) или 20 мкм (внизу). Масштабные бары на иммунофлюоресценции изображений представляют 40 мкм. (В) СЭМ изображения SVG конечных ног, проходящих через 3 мкм поры в просвета (БЭК) поверхность 3d сообщение посев SVGs (в одиночку) на abluminal поверхности мембраны. Эти образы проверки потенциал для развития истинного контакта между SVGs и БЭК в нашей человеческой модели BBB. Масштабные полоски представляют 6 мкм на левой панели и 12 мкм на правой панели. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

рис 1, левую панель.

Рисунок 4
Рисунок 4. тканевого активатора плазминогена (ТАП)-опосредованной увеличение проницаемости BBB приводится в морфологических изменений астроциты. (а) повышение концентрации т-ПА были добавлены к камере просвета человека в пробирке BBB и проницаемости оценивали через 24 часа позже прохождения флуоресцентного альбумина в abluminal камеры. ТАП увеличился ВВВ проницаемость в зависимости от концентрации. п = 4-6 для всех групп, но ТАП 10 нМ, где п = 2. *** Р <0,001 по сравнению со всеми другими группами по одну сторону ANOVA с Newman-Keuls ретроспективный. (B) т-ПА (1 мкМ) была добавлена ​​к камере просвета человека вVitro BBB в течение 8 часов и 24 часов, после чего оценки проницаемости. Как показано, трет-PA-опосредованной открытие BBB уже существенным 8 ч после стимуляции (70,26% от максимума в 24 часов), но дальнейшее увеличение наблюдалось в 24 час. п = 6, *** р <0,001, ** Р <0.01compared нулю одним способом ANOVA с Ньюмана-Keuls постфактум. В обоих (А) и (Б), точки бары / данных представляют среднее ± SEM. (С) Представительства ярко-полевые образы Гематоксилин окрашенных SVGs (верхние панели) или сканирующей электронной микроскопии микрофотографии SVGs (нижние панели) на полиэфирных вставки мембран (размер пор 3 мкм) 24 часа после обработки транспортного средства или с т-АП (1 мкМ). Каждого ТАП-индуцированные морфологические изменения и нарушение целостности монослоя SVG можно наблюдать, предполагая, что астроцитарных ответы на ТАП лежат в основе эффекта ТАП на проницаемость ГЭБ. Изображения представитель двух независимых экспериментов. Масштабные бары на РЭМ-изображений представотправлено 61 мкм (слева) или 120 мкм (справа). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Медицинские исследования в патологии мозга страдает много поступательное трудности. В области острого ишемического инсульта, например, многие препараты, которые показали большие перспективы в моделях на животных не удалось в клинике 38,39. Причины этих разочаровывающих результатов разнообразны и включают неверность доклинических тест-систем к сценарию человеческой хода и завышению результатов, полученных в результате исследований 21 животных. Одна из стратегий для улучшения прогностическую ценность доклинических исследований для клинической фазы является дополнительным развитие клеток человека на основе в пробирке моделей, поскольку они могут обеспечить мощные и экономичные инструменты для скрининга новых лекарств и механизмы и позволяют лучше упором на клинически соответствующие направления 21. В этом контексте, мы описали здесь подробно процесс осуществляется в нашей лаборатории для создания человеческого модели контакт BBB с использованием новой комбинацией человеческого увековечены астроциты (SVGS) и человека первичные БЭК для рассмотрения явлений инсульта, связанных с.

В статических условиях (без потока), обратитесь модели BBB (рис. 1) напоминают лучший в естественных условиях анатомическое строение и показаны, чтобы быть выше в их барьерных свойств 13,17,18. Важно отметить, что верно контакт между БЭК и астроцитов происходит только на мембранах с большим диаметром пор (≥ 1 мкм), которые позволяют прохождение астроцитарных конечных ног и последующей индукции жестких (менее проницаемые) BEC монослоев 14,15,27. Тем не менее, посев астроцитов на инвертированных вставок с более высоким размером пор - основные технические элемента в подготовке модели контакт BBB - представляет собой двойную техническую проблему, так как в дополнение к ограниченной среднего объема, который может быть добавлен к инвертированных 6,5 мм вставки (~ 50 мкл), мембраны также склонны к утечке среды из-за их большой диаметр пор. Эти ограничения могут сделать астrocytic посев неловко и непоследовательными.

Наша инновационная технология для посева астроциты на перевернутых вставками с 3 мкм поры предлагает простой, но эффективное решение для этой процедуры. Создавая съемным, непроницаемый силикон хорошо на верхней части поверхности abluminal мы значительно улучшена способность астроцитов "успешно прилипать к пористой мембраны. Это позволяет равномерный рост астроцитов на abluminal поверхности и позволяет воспроизводимый подготовка большого числа вставок для одновременного скрининга многих экспериментальных параметров (например, наш недавно выполненных скрининга эффекта пяти различных плазминогена-активаторов на BBB 28). Таким образом, несмотря на свою простоту, мы нашли наш метод, чтобы значительно улучшить пропускную способность и качество наших исследований с помощью этого контакта ВВВ модель. Одним из ограничений нашего метода астроцитов посева является требование дополнительной ручной обработки вставок, которые укрывают тонким (10 μм толщиной) мембраны. Чрезмерное или грубое обращение может привести к микро-слезы и повреждения мембраны. Следовательно, использование мягкого и гибкого силиконовой трубки имеет важное значение, поскольку монтаж / демонтаж должен быть выполнен с минимальным усилием.

Что касается его общей концепции, наша человеческая модель BBB была создана на основе ранее описанного протокола 14,23 который первоначально используемого первичные клетки человека. Несмотря на их превосходство для BBB моделирования, один недостаток в трудоустройстве первичных человеческих клеток головного мозга является неспособность регулярно доступ живого человека мозговую ткань для регулярного производства первичных БЭК и астроцитов и / или расходов, связанных с коммерческой их получения. Поскольку многие модели BBB успешно заменяют первичные астроциты с увековечены астроцитов (например с крысой С6 клеток глиомы 29), что это было разумно использовать SVG астроциты 22 как роман, обильные и экономичный вариант для моделирования человеческого BBB. Способность SVGs кположительное влияние на барьерную функцию БЭК утвержденный в принципе их пригодности для исследований BBB. В отличие от этого, мы приняли решение оставить основные БЭК в нашей BBB модели для их важной роли в BBB в естественных условиях 1,2,9. Важно отметить, что длительное культивирование первичных БЭК может привести к де-дифференциации и ухудшению их BBB-конкретного фенотипа. Это действительно может быть очевидным в нашей системе на довольно высоких значениях проницаемости эндотелия для альбумина. По этой причине, мы использовали нашу модель в основном в относительной форме 28 (рис. 4), принимая во внимание его повышенный базальный проницаемость. Если очень плотно человеческий БЭК монослой желательно барьерной функции может быть дополнительно улучшена добавлением химических веществ, таких, как глюкокортикоиды гидрокортизона 17 или циклического АМФ с ингибиторов фосфодиэстеразы 13. Иммортализованные человеческие БЭК, такие как линии клеток hCMEC/D3 40, также могут быть использованы для их способности лучше поддерживать тиGHT переходы с течением времени. Тем не менее, BEC клеточных линий часто демонстрируют снижение барьерных качеств по сравнению с низким уровнем прохода первичного БЭК 41,42 и нуждается в тщательном рассмотрении, потому что других потенциальных изменений (т.е. измененной экспрессии рецепторов клеточной поверхности).

В совокупности, наша модификация астроцитов типа клеток (т.е. занятости SVGs) и существенного улучшения к протоколу астроцитов посева привело к генерации воспроизводимого, легко собрать и подлинной модели человеческий контакт BBB. Принимая во внимание свои ограничения, эта система может служить в качестве полезного инструмента для экстракорпорального расследования в не только острого ишемического инсульта, как мы на примере здесь 28, но и ряда других патологий головного мозга, связанных с модуляцию BBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование финансировалось за счет грантов, присужденных RLM от Национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (грант № 606658).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attachment Factor Cell-Systems Corporation 4Z0-210
Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human Cell-Systems Corporation ACBRI 376
Complete medium Cell-Systems Corporation 4Z0-500 Supplemented with CSC JetFuel
Complete serum-free medium Cell-Systems Corporation SF-4Z0-500 Supplemented with CSC RocketFue
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Endothelial cells growth supplement (from bovine origin) Sigma-Aldrich E2759-15MG
External silicone tubing Watson-Marlow 913.A080.016 Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall
Foetal calf serum Lonza 14-501F
Gentamycin sulfate Life Technologies 15750-060
Heparin sodium Pfizer 1,000 U/ml
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma-Aldrich H4875
Human brain microvascular endothelial cells Cell-Systems Corporation ACBRI 376
Internal silicone tubing Watson-Marlow 913.A032.016 Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall
L-Glutamine Life Technologies 25030
Mayer’s hematoxylin solution Amber Scientific MH
Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution HyClone Laboratories SH30244.01
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140
Rat collagen I Trevigen 3440-100-01 Cultrex brand
Tissue culture inserts Corning Life Sciences 3472 Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol. Dis. 37, 13-25 (2010).
  3. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  4. Vivien, D., Gauberti, M., Montagne, A., Defer, G., Touze, E. Impact of tissue plasminogen activator on the neurovascular unit: from clinical data to experimental evidence. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2119-2134 (2011).
  5. Stewart, P. A., Wiley, M. J. Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail--chick transplantation chimeras. Dev. Biol. 84, 183-192 (1981).
  6. Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325, 253-257 (1987).
  7. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
  8. Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathol. 122, 1-9 (2011).
  9. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin. Immunopathol. 31, 497-511 (2009).
  10. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100, 328-335 (2006).
  11. Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 59-127 (2005).
  12. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12, 1784-1792 (2012).
  13. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. Eur. Pharm. Sci. 12, 215-222 (2001).
  14. Hurwitz, A. A., Berman, J. W., Rashbaum, W. K., Lyman, W. D. Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells. Brain Res. 625, 238-243 (1993).
  15. Demeuse, P., et al. Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier. J. Neurosci. Methods. 121, 21-31 (2002).
  16. Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab. Invest. 85, 734-746 (2005).
  17. Cohen-Kashi Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in vivo and in vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  18. Kroll, S., et al. Control of the blood-brain barrier by glucocorticoids and the cells of the neurovascular unit. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1165, 228-239 (2009).
  19. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 312-328 (2008).
  20. Li, G., et al. Permeability of endothelial and astrocyte cocultures: in vitro blood-brain barrier models for drug delivery studies. Ann. Biomed. Eng. 38, 2499-2511 (2010).
  21. Antonic, A., Sena, E., Donnan, G., Howells, D. Human In Vitro Models of Ischaemic Stroke: a Test Bed for Translation. Transl. Stroke Res. 3, 306-309 (2012).
  22. Major, E. O., et al. Establishment of a line of human fetal glial cells that supports JC virus multiplication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1257-1261 (1985).
  23. Eugenin, E. A., Berman, J. W. Chemokine-dependent mechanisms of leukocyte trafficking across a model of the blood-brain barrier. Methods. 29, 351-361 (2003).
  24. Dehouck, M. P., et al. Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models. J. Neurochem. 58, 1790-1797 (1992).
  25. Perriere, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).
  26. Niego, B., Samson, A. L., Petersen, K. U., Medcalf, R. L. Thrombin-induced activation of astrocytes in mixed rat hippocampal cultures is inhibited by soluble thrombomodulin. Brain Res. 1381, 38-51 (2011).
  27. Ma, S. H., Lepak, L. A., Hussain, R. J., Shain, W., Shuler, M. L. An endothelial and astrocyte co-culture model of the blood-brain barrier utilizing an ultra-thin, nanofabricated silicon nitride membrane. Lab Chip. 5, 74-85 (2005).
  28. Niego, B., Freeman, R., Puschmann, T. B., Turnley, A. M., Medcalf, R. L. t-PA-specific modulation of a human BBB model involves plasmin-mediated activation of the Rho-kinase pathway in astrocytes. Blood. , (2012).
  29. Deli, M. A., Abraham, C. S., Niwa, M., Falus, A. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm. Res. 52, 39-40 (2003).
  30. Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nat. Med. 14, 731-737 (2008).
  31. Yepes, M., et al. Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein. J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).
  32. Abu Fanne, R., et al. Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity. Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).
  33. Wang, X., et al. Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator. Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).
  34. Wang, X., et al. Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke. Stroke. 35, 2726-2730 (2004).
  35. Donnan, G. A., et al. How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke. Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).
  36. Acheampong, P., Ford, G. A. Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).
  37. Derex, L., Nighoghossian, N. Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).
  38. Garber, K. Stroke treatment--light at the end of the tunnel. Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).
  39. Liebeskind, D. S. Reversing Stroke in the 2010s. Stroke. 40, 3156-3158 (2009).
  40. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  41. Song, L., Pachter, J. S. Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).
  42. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).

Tags

Биоинженерия выпуск +81 гематоэнцефалический барьер модель культура клеток астроциты эндотелиальных клетках головного мозга вставка мембраны
Улучшенная способ получения человеческой клетки на основе, Связаться Модель гематоэнцефалического барьера
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Niego, B., Medcalf, R. L. Improved… More

Niego, B., Medcalf, R. L. Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier. J. Vis. Exp. (81), e50934, doi:10.3791/50934 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter