Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ

Published: November 12, 2013 doi: 10.3791/50934
Automatic Translation
1, 1
1Australian Centre for Blood Diseases, Monash University

Summary

إنشاء نماذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​يمكن أن تستفيد من البحث في الظروف الدماغ المرتبطة فشل BBB. نحن هنا وصف تقنية محسنة لإعداد نموذج BBB الاتصال، والذي يسمح coculturing من الخلايا النجمية والخلايا البطانية الإنسان الدماغ على طرفي نقيض من غشاء يسهل اختراقها.

Abstract

وتضم حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​الشعيرات الدموية في الدماغ ولكن غير منفذة للتكيف التي تتحكم بإحكام البيئة الدماغ. وقد ضمنا فشل BBB في مسببات العديد من الأمراض في الدماغ، وخلق الحاجة إلى تنمية الموارد البشرية في نماذج BBB المختبر للمساعدة في البحوث ذات الصلة سريريا. من بين العديد من النماذج BBB صفها حتى الآن، وهو ثابت (بدون تدفق)، اتصل BBB النموذج، حيث يتم cocultured الخلايا النجمية والخلايا البطانية الدماغ (BECS) على طرفي نقيض من غشاء يسهل اختراقها، برزت تبسيط النظام حتى الآن لمحاكاة أصيلة BBB مع قدرة إنتاجية عالية الفرز. مع ذلك الجيل من هذا القبيل نموذج تحديات التقنية قليلة. هنا، نحن تصف بروتوكول لإعداد BBB نموذج الاتصال البشري باستخدام تركيبة جديدة من BECS الإنسان الأولية والخلايا النجمية الإنسان خلد. على وجه التحديد، ونحن من التفصيل طريقة مبتكرة لخلية البذر على إدراج مقلوب وكذلك تحديد INSERتقنيات تلطيخ ر ومثالا كيف نستخدم نموذجنا للبحوث المتعلقة BBB-.

Introduction

بي بي بي هي واجهة المتخصصة بين الدورة الدموية الطرفية والجهاز العصبي المركزي، والمسؤولة بشكل حاسم للحفاظ على الارقاء الدماغ. ويضم خلايا الدماغ متميزة البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (BECS) والتي تتأثر وظيفيا من قبل عدد قليل من المكونات الخلوية وديكي (أدناه) لتشكيل بوابة ضيقة والحيوية في الدماغ. في ظل الظروف الفسيولوجية وBBB يقيد مرور خلايا الدم، مكونات البلازما والمواد الضارة، وكلها يمكن أن تكون أعصاب، إلى الدماغ. في موازاة ذلك، BBB يتبادل انتقائي الأيونات والمواد المغذية (الجلوكوز والأحماض الأمينية) الأساسية ومنتجات النفايات الأيضية بين الدماغ والدورة الدموية للحفاظ على البيئة بدقة 1،2 الدماغ. في السنوات الأخيرة هو أنه أصبح واضحا أن فشل BBB يحدث في مجموعة متنوعة من الأمراض المزمنة في المخ، مثل الأمراض العصبية أو ذات الصلة التهابات (مثل مرض الزهايمر وmultiplه التصلب، على التوالي) 3، وكذلك في الحالات الحادة مثل السكتة الدماغية 4.

وبفعل خصائص فريدة من نوعها BBB من الخلايا البطانية في الدماغ (BECS) إلى حد كبير البيئة الدماغي على 5، وعلى وجه الخصوص من قبل الخلايا النجمية 6،7. هناك فهم متزايد بأن غيرها من أنواع الخلايا، مثل pericytes 8، الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة 1،3، فضلا عن الغشاء القاعدي 9، ودعم BECS وتشكل معا وحدة وظيفية تسمى "وحدة وعائية عصبية" (NVU) والتي في وقت واحد الأزواج العصبية مطالب الأيضية إلى الشعيرات الدموية التي تزود 10.

إشراك BBB في حالات المرضية وراء العديد من المحاولات لتطوير في نماذج BBB المختبر للمساعدة في البحوث المتعلقة BBB-11،12. تهدف هذه النماذج إلى تقليد أقرب مكان ممكن في الجسم الحي خصائص BBB وفقا لمبدأ NVU. في المختبر 13، الإنسان 14، 15 الفئران، والماوس 16، والخنازير 17،18 أصول)، مثقف على غشاء يسهل اختراقها مع الخلايا النجمية دعم (على نطاق واسع مراجعتها من قبل ديلي وآخرون 2005 11).

يمكن زراعتها الخلايا النجمية في ظروف عدم الاتصال على الجزء السفلي من نسيج الثقافة جيدا، وفصلها عن BECS (المزروعة على السطح العلوي للغشاء) من مستنبت بعد التواصل مع BECS عبر العوامل القابلة للذوبان 16. في نماذج أكثر تقدما والتي تشبه أفضل بنية التشريحية للBBB في الجسم الحي، تتم المحافظة على الخلايا النجمية في ظروف الاتصال ومثقف مباشرة على الجانب الآخر من الغشاء على مقربة من BECS 13،15،17 (الشكل 1). هذا التكوين يتيح الاتصال الجسدي بين BECS والخلايا النجمية، التي أنشئت عندما مشروع النجميةعملياتها من خلال غشاء يسهل اختراقها. الأهم من ذلك، لجهة اتصال وفيا لتحدث المسام ينبغي ≥ 1μm في القطر، ومنذ نهاية نجمي قدم لا يمكن أن تمر من خلال المسام أحجام أصغر (أي 0.4 ميكرون) 14،15. وخاصة، وأثبتت أنظمة الاتصال BBB في بعض الدراسات لتكون متفوقة على نظيراتها عدم الاتصال بهم بشأن مقاومتهم عبر البطانية الكهربائية (طير) والقيم نفاذية البطانية من مختلف استشفاف 13،17،18. وأضاف بعدا إضافيا من تدفق وسائل الاعلام مؤخرا في عدد من نماذج في المختبر BBB لتطبيق قوى القص إلى البطانة لمحاكاة أقرب من الأوعية الدموية في الدماغ 12،19.

واحدة للتغلب على عقبة الفنية عند إنشاء نموذج الاتصال BBB هو البذر من الخلايا النجمية ضد الجاذبية على سطح مجافي اللمعة للغشاء يسهل اختراقها. البروتوكولات السابقة 13،20، حيث كانت المصنفة الخلايا النجمية ببساطة في قطرة من وسائل الاعلام على رأس من فيإدراج verted، سمحت مرات البذر قصيرة فقط (أي 10 دقيقة أو 13 ساعة 2 20) والتي تم العثور عليها في أيدينا غير كافية لمرفق الخلايا السليمة. باستخدام هذه الطريقة الأساسية، وهي فترة أطول مرفق نجمية يتطلب مراقبة مستمرة من قبل إدراج افتتاح متكررة من الحاضنة (يسبب تقلبات في درجة الحرارة، ودرجة الحموضة والرطوبة)، وأيضا عرضة للبذر الخلية متفاوتة بسبب تسرب سائل الإعلام من خلال المسام، وخاصة إذا يعملون المسام أكبر من 1 ميكرون.

هنا، نحن تصف بروتوكول العامة لإعداد نموذج الاتصال BBB. ويشمل الإجراء لدينا طريقة بديلة لخلية البذر على إدراج المقلوب، الذي يتناول القيود المذكورة أعلاه. يسمح أسلوب الالتزام دون عائق من الخلايا النجمية على سطح غشاء مجافي اللمعة، في حاضنة معايرتها، لفترة ممتدة من الزمن. ونتيجة لذلك، يتم التوصل إلى بذر موحدة من الخلايا النجمية مما يزيد جودة حاجزويقلل من الاختلافات بين نفاذية القاعدية إدراج.

مثل استخدام الخلايا البشرية من المهم للبحوث ذات الصلة الإنسان 21، علينا أن نظهر في هذه المقالة بالإضافة إلى استخدام محددة من تركيبة جديدة من BECS الإنسان الابتدائية وخلدت الخلايا النجمية الإنسان لإنشاء BBB نموذج الاتصال البشري مع قدرة عالية الإنتاجية الفرز . منذ عرض من الخلايا في أغشية مسامية يمكن أن يكون صعبا، ونحن أيضا تقنيات تلطيخ التفاصيل التي يمكن أن تساعد في تحديد نقطة التقاء ومورفولوجيا الخلايا على أغشية مسامية. أخيرا، ونحن مثالا كيف يمكن استخدام لدينا نموذج BBB الإنسان لدراسة تأثير الأنسجة من نوع منشط البلازمينوجين (ر-PA) - جلطة خرق انزيم التي هي بمثابة الخيار الوحيد لعلاج السكتة الدماغية الحادة - على BBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الثقافة الخلية (3-7 أيام قبل الجمعية BBB)

1.1. الأولية خلايا الدماغ البشري البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (BECS)

تم الحصول عليها تجاريا BECS. تم إنتاج الخلايا عن طريق التفكك dispase من الأنسجة الطبيعية قشرة الدماغ البشري، وقدمت المجمدة في مرور 3 (<12 الأضعاف السكان).

  1. التحتية: السفن معطف الأنسجة الثقافة مع "عامل مرفق" وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. صيانة الخلية: الحفاظ على BECS في المحتوية على مصل المتوسطة كاملة. للتجريب والثقافة في BECS كاملة خالية من مصل المتوسطة. الحفاظ على خلايا في ترطيب 5٪ CO 2، 21٪ O 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية
    ملاحظة: كبديل لالكواشف المتخصصة، 0.1٪ (ث / ت) حل الجيلاتين يمكن أن تكون بمثابة كاشف طلاء حين تستكمل مع 15 ملي DMEM/F-12 HEPES، 10٪ (V / V) مصل العجل الجنين (FCS)، 2 مم L-الجلوتامين، 50 ميكروغرام/ مل جنتاميسين، 20 ميكروغرام / مل الهيبارين و 20 ميكروغرام / مل الخلايا البطانية تكملة النمو يمكن استخدامها لصيانة BEC.
  3. زراعة الفرعية للتجريب: BECS متموجة سبليت بنسبة 1:03 حتي 1:06، اعتمادا على الوقت المقصود للاستخدام المقبل (3-7 أيام). تغيير متوسطة صيانة كل 3 أيام. استخدام BECS تصل إلى 15 الممرات.

1.2. SVG الإنسان الجنين Astroglial الخط الخلوي

SVG خلايا الجنين astroglial الإنسان 22 ومستمدة في الأصل من الثقافات الأولية من دماغ الجنين البشري يتحول مع تكرار نقص القردي فيروس 40.

  1. الصيانة: خلايا الثقافة SVG في الحد الأدنى المتوسطة الأساسية مع محلول ملحي متوازن ايرل تستكمل مع 20٪ (V / V) FCS (نسبة المصل نفسها المستخدمة للحفاظ على الخلايا الأبوية الأولية 22)، 2 مم L-الجلوتامين، 50 U / البنسلين مل و 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين. الحفاظ على خلايا في ترطيب 5٪ CO 2، 21٪ O 2
  2. زراعة الفرعية للتجريب: SVGs متموجة سبليت بنسبة 1:05 حتي 1:10، اعتمادا على الوقت المقصود للاستخدام المقبل (3-7 أيام). ليس مطلوبا إزالة التربسين نظرا لنسبة عالية من المصل في المتوسط. تغيير المتوسطة كل 3 أيام. استخدام ما يصل إلى 20 SVGs الممرات.

2. التجمع وCoculturing من الإنسان في المختبر النموذجي BBB (يوم 0)

التعليق: تم إعداد الإنسان في المختبر نموذج الاتصال BBB وفقا لبروتوكولات نشرت 13،23، مع بعض التعديلات.

2.1. طلاء إدراجات

  1. وضع إدراج الأنسجة ثقافة (6.5 ملم في القطر مع البوليستر غشاء يسهل اختراقها، 3 ميكرون مسام الحجم) في الآبار لتزويد 24 لوحة جيدا. معطف السطح اللمعية من إدراج بين عشية وضحاها في ترطيب الحاضنة 37 درجة مئوية مع الفئران الكولاجين الأول (20 ميكروغرام / سم 2، و 50 ميكرولتر من 132 ميكروغرام/ مل الكولاجين أنا في حامض الخليك 0.02٪ في المياه الملة، س (MQH 2 O)). غسل إدراج مرة واحدة (سواء من الجانب مجافي اللمعة واللمعية) مع MQH 2 O لإزالة حمض المتبقية.
    ملاحظة: قبو غشاء الشعيرات الدموية في الدماغ لا يحتوي على الكولاجين أنا ولكن أساسا laminins، الإسوية نوع الكولاجين الرابع، nidogens، والبروتيوغليكان كبريتات heparan 9. لهذا السبب، فإن بعض الباحثين الاستفادة من وكلاء طلاء مثل الكولاجين الرابع، فبرونيكتين 13، أو Matrigel (العلوم البيولوجية دينار بحريني) 16 لBBB النمذجة أكثر واقعية.

2.2. SVGs البذر على الجانب السفلي (مجافي اللمعة) غشاء السطح

  1. عكس إدراج وتناسب بلطف حول حافة الغشاء المسامي قطعة قصيرة من مرونة أنابيب السيليكون ("الأنابيب الخارجية"؛ ~ 10 مم طويل، 8 ملم القطر الداخلي و 1.6 مم الجدار)، وخلق أساسا الجديدة أعلى بكثير من سطح مجافي اللمعة (الشكل 2A).
  2. الجانب السفلي من إدراج نيس إلى أن تكون مختومة لتجنب تسرب سائل الإعلام. الأولى، إعداد المكونات (الشكل 2A و 2B) مصنوعة من أنابيب السيليكون (وهو ما يسمى "أنابيب داخلية"؛ ~ 8 ملم طويلة، 3.2 مم القطر الداخلي و 1.6 مم الجدار؛ الشكل 2B)، مختومة في نهاية واحدة مع البلاستيك ختم مخروط (~ 3mm من طويلة؛ أعده قطع الجزء السفلي من سلسلة من ردود الفعل 0.2 مل البلمرة (PCR) أنبوب؛ الشكل 2B)، وهذا المخروط الأختام ليس فقط لمعة الأنابيب الداخلية، ولكن أيضا يوسع حافته لتركيب أكثر تشددا في إدراج. المقبل، وذلك باستخدام ملقط معقم، تضاف المكونات سيليكون في تجويف اللمعية وتقدم عليه حتى تصل إلى ما يصل إلى 1-2 مم ~ من الغشاء (الشكل 2A).
  3. المقبل، البذور 4 × 10 4 خلايا SVG في 200 ميكرولتر SVG الصيانة المتوسطة (حد ذاتهاكشن 1.2.2 أعلاه) مباشرة في سيليكون أعلى بكثير من سطح الغشاء مجافي اللمعة (الشكل 2A). تسمح SVGs الالتزام لمدة لا تقل عن 4 ساعة في الحاضنة.
    ملاحظة: للحفاظ على العقم نقل إدراج تجميعها في اثنين من بين 6 لوحات جيدة (لوحة واحدة مقلوب على الآخر؛ الشكل 2C) لتقليل التعرض للهواء غير المرشحة أثناء العملية. تغسل أنابيب السيليكون والمقابس في الإيثانول وتعقيمها لاستخدامها لاحقا.
    ملاحظة: استخدام المقابس (القسم 2.2.2) فقط من أجل إدراج مع مسام غشاء أحجام أكبر من 1 ميكرون. الأغشية مع قطر المسام ≤ 1 ميكرومتر نادرا ما تسرب وتتطلب سوى تركيب أنابيب السيليكون الخارجية (القسم 2.2.1). بالإضافة إلى ذلك، بعض وكلاء طلاء أخرى من الكولاجين الأول (انظر الملاحظة إلى القسم 2.1) قد منع التسرب حتى من خلال 3 ميكرون المسام. تحديد هذا تجريبيا.
  4. من أجل رصد حالة تمسك الخلايا النجمية الخاص بك، البذور بالتوازي في96 جيدا وحدة تخزين متطابقة القياسية للخلايا نجمية التعليق. هذا جيد لديه مساحة نفس 6.5 ملم إدراج (0.33 سم 2) ويسمح التصور أسهل من الخلايا عن طريق التخلص من النقيض المجهر غشاء إدراج. عند مراقبة التقيد كافية من نجمية في السيطرة 96 جيدا، والخلايا النجمية انضمت كاف أيضا لغشاء إدراج.
  5. عندما الخلايا النجمية انضمت بما فيه الكفاية في السيطرة 96 جيدا، ونقل المجالس الإدراج إلى نسيج الثقافة هود (انظر الملاحظة أعلاه) وبلطف إزالة أنابيب السيليكون الخارجية والمقابس. العودة إلى إدراج العادي (أي تستقيم) التوجه إلى الآبار التي تحتوي على 800 ميكرولتر الموردة / جيد من BEC المتوسطة الصيانة (القسم 1.1.2 أعلاه).

2.3. البذر من BECS في غرفة اللمعية فوق النجمية

البذور 2X10 4 BECS في 200 ميكرولتر على سطح اللمعية المغلفة الكولاجين وإعادة INSEالمحطة المذكورة في الحاضنة.

2.4. Coculturing

Coculture يدرج SVG / BEC المصنف لمدة 3 أيام في BEC المتوسطة دون تغير وسائل الاعلام قبل التجريب.

3. التجريب مع نموذج BBB الإنسان (يوم 3)

  1. لتحفيز الخلايا في المختبر BBB غسل الأولى عن طريق استبدال وسائل الإعلام ومجافي اللمعة اللمعية مع 600 ميكرولتر و 100 ميكرولتر من المصل خالية BECS المتوسطة، على التوالي.
  2. نضح المتوسطة اللمعية مرة أخرى واستبدالها مع 100 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة مع عوامل محفزة.
    ملاحظة: إذا كان مطلوبا التحفيز للغرفة مجافي اللمعة (لتنشيط في المختبر BBB من المقصورة نجمي)، نضح المتوسطة مجافي اللمعة واستبدالها مع 600 من المجاهدين مصل المتوسطة الحرة مع تحفيز وكلاء.
  3. اختبار كل المجموعة التجريبية في ثلاث نسخ (وبالتالي، إذا تم تنفيذ التحفيز اللمعية، الأمر الذي يتطلب 3 × 100 ميكرولتر، نوصي تمييع إعادة وكلاء لتركيزات النهائي في 350 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة لكل مجموعة للحد من الأخطاء pipetting لبين الآبار).
  4. أداء paracellular القياسية و / أو فحوصات النفاذية العابر للخلايا من استشفاف المسمى 16،24 (لهذا الأخير نستخدم ثيوسيانات فلوريسئين (FITC)، مترافق الزلال) و / أو قياس طير 13،16،25 كما هو موضح سابقا.

لحساب التقلبات في نفاذية خط الأساس بين التجارب، وتحليل التغيرات في النفاذية النسبية لإدراج المغلفة دون الخلايا (التي هي بمثابة مرجعية لنفاذية القصوى) وإلى المجموعة التي عولجت مركبة باستخدام الصيغة: نفاذية (٪ من حد أقصى) = ( قيمة نفاذية إدراج التجريبية - متوسط ​​قيمة نفاذية مجموعة مركبة) / (قيمة نفاذية إدراج فارغة - متوسط ​​قيمة نفاذية مجموعة المركبات) X 100.

4. التصور من خلايا الأغشية المسامية على

الإقليم الشمالي "> تعليق: الخلايا غير ملوثين على الأغشية إدراج يصعب مراقبة من قبل الطوري أو تدخل الفرق النقيض (DIC) المجهري منذ غشاء غير شفاف تماما ويتداخل مع انتقال الضوء للتعامل مع هذه القضية وضعنا إجراءات تلطيخ مختلفة من الخلايا على. إدراج، والذي يعزز إلى حد كبير مظهر الخلية على الغشاء. عموما، وصمة عار على الأغشية إدراج في حين لا تزال تعلق على إدراج، في الآبار. يجب إزالة الأغشية فقط في نهاية الإجراء تلطيخ لأغراض التركيب.

4.1. الهيماتوكسيلين تلطيخ

  1. إصلاح تدرج مع الثلج الباردة 4٪ (ث / ت) بارافورمالدهيد (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 130 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي نا 2 هبو 4، 10 ملم ناه 2 ص 4، ودرجة الحموضة 7.2) لمدة 20 دقيقة. يغسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني.
  2. غمر إدراج في حل الهيماتوكسيلين 0.1٪ ماير لمدة 2 دقيقة.
  3. غسل بلطف إدراج مع ماء الصنبور (عن طريق غمر خصوصياتERT في دورق يحتوي على ماء الصنبور وpipetting بلطف المياه الزائدة خارج). نقل إدراج إلى حل سكوت ماء الصنبور (2 غرام / لتر NaHCO 3 و 20 جرام / لتر MgSO 4) ل~ 20 ثانية حتى يتطور اللون الأزرق المطلوب. غسل إدراج مرة أخرى مع ماء الصنبور (القسم 4.1.3). ويمكن إدخال ليوزين وصمة عار اختياري هنا عن طريق غمس إدراج في 1٪ محلول يوزين لمدة 10 ثانية تليها غسل ماء الصنبور.
  4. الهواء الجاف غشاء إدراج. باستخدام مشرط (قطع حول حافة الغشاء) إزالة الغشاء وتركيبها على شريحة زجاجية للتصوير مشرق الميدان
    ملاحظة: إذا تم استخدام دي-N-butylphthalateinxylene (DPX) تصاعد المتوسطة غسل إدراج مع الإيثانول بنسبة 100٪ تليها الزيلين قبل إزالة وتركيب الغشاء.

4.2. المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)

  1. إصلاح تدرج مع الثلج الباردة 4٪ (ث / ت) PFA في برنامج تلفزيوني لمدة 20min. يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني.
  2. بعد إصلاح الأغشية لمدة 30 دقيقة في 1٪ (ث / ت) رباعي أكسيد الأوزميوم في MQH 2 O.
  3. غسل إدراج في الماء (القسم 4.1.3) ويذوى في تصاعد التدرج الايثانول (50٪، 70٪، 90٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما، ثم 3X مع الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 دقيقة في الفاصل الزمني).
  4. علاج إدراج المجففة مع خليط من hexamethyldisilazane (HMDS): الإيثانول (1:2 ثم 2:01 لمدة 5 دقائق).
  5. علاج إدراج مع 100٪ HMDS لمدة 5 دقائق، والهواء الجاف وتخزينها في ظل ظروف المجفف.
  6. إزالة الغشاء باستخدام مشرط (قطع حول حافة الغشاء). دراسة الأغشية بواسطة المجهر الإلكتروني.

4.3. المناعي

  1. إصلاح تدرج مع الثلج الباردة 4٪ (ث / ت) PFA في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة، ويغسل مرة واحدة في المياه المالحة تريس مخزنة (TBS، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6، 154 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.22 ميكرون تصفية).
  2. أداء المناعية للخلايا على الغشاء إدراج كما هو موضح سابقا 26.
  3. إزالة الغشاء باستخدام مشرط (قطع حول حافة الغشاء) وتركيبها على آغالشريحة معشوقة مع مضان المتوسطة المتزايدة. فحص الغشاء بواسطة المجهر الفلورسنت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من أجل إنشاء الإنسان، نموذج الاتصال BBB كان علينا أن زراعة SVGs وBECS على الأغشية التي يسهل اختراقها مع 3 ميكرون مسام الحجم، كما هو موضح للسماح بمرور نجمية نهاية القدمين للاتصال مع الخلايا البطانية 14،15،27،28. ويتضح تمثيل التخطيطي للنموذج الاتصال كاملة في الشكل 1 (اليسار التوضيح). التحدي التقني الرئيسي الذي قدمه نظام الاتصال هو الحاجة إلى البذور النجمية ضد الجاذبية على سطح مجافي اللمعة من الغشاء. نجحنا في هذه المهمة من خلال خلق أساسا سيليكون قابلة للإزالة بشكل جيد على أعلى سطح غشاء مجافي اللمعة في حين منع تسرب وسائل الإعلام مع المكونات سيليكون إضافية إدراجها في تجويف اللمعية (الشكل 2). يسمح أسلوب أمثل، فترة البذر دون انقطاع SVGs (لا يقل عن 4 ساعة)، والتي أصبحت بدورها تعلق بقوة إلى السطح التي يسهل اختراقها مع الحد الأدنى من فقدان الخلية. في الواقع، 3 أيام بعد البذر SVGs وBECS التطبيق على حد سواءذو أذنين متكدسة وغطت غشاء بشكل موحد، كما ترى من الصور من إدراج ملطخة الهيماتوكسيلين (انظر القسم 4.1؛ الشكل 3A، لوحات اليسار). بالإضافة إلى ذلك، حافظت كل من أنواع الخلايا علامات على خلية محددة على الأغشية المسامية (نمط منتشر من تلطيخ ييفي الدبقية البروتين الحمضية في SVGs 22 والتعبير عن عامل فون ويلبراند في الهيئات Wiebel-بالادي والحويصلات في هيولي BECS؛ الشكل 3A، لوحات اليمين) ، لوحظ من قبل المناعي (القسم 4.3). علاوة على ذلك، من SEM التصوير (القسم 4.2) أصبح واضحا أن SVGs وBECS كانت قادرة على النمو مباشرة عبر مسام الغشاء (الشكل 3A، والألواح المتوسطة، ورؤساء السهم)، وهي ظاهرة تساهم بشكل مصطنع إلى وظيفة حاجز مادي في المختبر BBB الاتصال models1 3،28. وظيفيا، في حضور SVGs قيمة البطانية نفاذية (بي) 16،24 من الفلورسنت الزلال 28 المنتجعاVED ~ 4 أضعاف نسبة إلى BECS وحده (P <0.01، ن = 4)، من 0.574 ± 0.199 X10 -3 إلى 0.126 ± 0.028 سم X10 -3 / دقيقة دون أو مع (SVGs) النجمية، على التوالي. هذه النتائج قابلة للمقارنة بي الألبومين إلى دراسة أخرى باستخدام الماوس BECS مع الخلايا C6 الفئران دبقي 29. تم تطبيق بروتوكول البذر لدينا بنجاح أيضا إلى عزل طازجة BECS الماوس الابتدائية والخلايا النجمية الماوس الأساسي نمت على 1 ميكرومتر المسام. في هذا النموذج الاتصال الماوس حصلنا على حاجز مادي معقول للماء صغيرة فلوريسئين التتبع الصوديوم (بي = 0.83 ± 0.22 سم X10 -3 / دقيقة، ن = 3). وبالتالي، يمكن تمديد طريقة البذر من أجل إعداد نماذج BBB من الأنواع الأخرى.

الميزة الأكثر الأساسية للنموذج الاتصال BBB هو قدرة الخلايا النجمية لمشروعهم أقدام النهائي من خلال مسام الغشاء في الاتصال جسديا الخلايا البطانية. قدم عدد قليل من الدراسات استخدام المجهر الإلكتروني إلى الاتساعtify النجمية العمليات التي تمر من سطح غشاء مجافي اللمعة (حيث النجمية هي المصنفة) على سطح اللمعية، كدليل على المبدأ القائل بأن الاتصال بين الخلايا النجمية والمفوضية الأوروبية من المعقول 14،15،27. بعد هذه الدراسات ونحن التقط بواسطة SEM الغشاء اللمعية بعد البذر SVGs على سطح مجافي اللمعة. كما هو مبين في الشكل 3B، ويمكن ملاحظة نجمي (SVG) نهاية القدمين مرورا 3 ميكرون المسام في مقصورة اللمعية، مؤكدا أن الاتصال يمكن أن يحتمل وجود بين SVGs والمصنفة BECS على مسام هذا البعد. بشكل جماعي، وكان لدينا طريقة البذر بسيطة وفعالة، وأسفرت عن نموذج الاتصال BBB أصيلة.

لقد استخدمت لدينا نموذج الاتصال BBB الإنسان لاستكشاف تأثير ر والسلطة الفلسطينية، وكيل حال للفبرين، على BBB. وقد اقترح عدد من المقالات التي ر والسلطة الفلسطينية قد تكون قادرة على حمل افتتاح BBB خلال إدارته عن طريق الوريد لعلاج السكتة الدماغية الحادة 30-33. هذا التفاعل بين طن والسلطة الفلسطينية وBBB قد تسهم في مضاعفات النزيف المرتبطة الجلطات ر والسلطة الفلسطينية التي يسببها 4،34،35، وبالتالي موضوعا للالجهود البحثية الحالية. أكدت دراساتنا في المختبر أن ر-PA زادت بالفعل نفاذية BBB سليمة في (4A الشكل) تركيز وبطريقة تعتمد على الوقت (الشكل 4B)، والتي كانت على حد سواء ضمن نطاق عقاقيري ذات الصلة 36،37. علاوة على ذلك، يمكن ملاحظة التغيرات المورفولوجية دراماتيكية من الخلايا النجمية SVG على الأغشية المسامية بعد التعرض لر-PA (الشكل 4C)، مما يوحي بأن ردود نجمي لر-PA-PA تكمن وراء ر يسببها افتتاح BBB. حددت التحقيقات اللاحقة أن تي PA يحفز الخلايا النجمية عبر تفعيل منشط - الركيزة الطبيعي - في امكانات واسعة الطيف البروتيني بلازمين. وعلاوة على ذلك، تم العثور على طن والسلطة الفلسطينية وبلازمين لتفعيل رو كيناز (ROCK) يشير في الخلايا النجمية، والحصار من مسار ROCK منعت ر-PA التي يسببها افتتاح BBB 28. هذا هو مثال جيد على كيفية استخدام نماذج BBB يمكن أن يؤدي إلى تحديد العمليات البيولوجية الرواية والفرص العلاجية.

الشكل 1
الشكل 1. تكوينات يستند إدراج من نماذج في المختبر BBB. تمثيل تخطيطي ثابت (بدون تدفق) في المختبر نماذج BBB. في النماذج الأساسية الخلايا البطانية الدماغ (ECS؛ البرتقال) هي وحدها مثقف على غشاء مسامي (الصفراء). في أكثر تقدما وcocultured النهج ECS مع الخلايا النجمية (الخضراء). يمكن زراعتها النجمية إما في ظروف عدم الاتصال، على قاع البئر (يمين)، أو على سطح مجافي اللمعة من الغشاء المسامي في ظروف الاتصال (يسار).NK "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
الشكل 2. طريقة محسنة لنجمية البذر على سطح غشاء مجافي اللمعة لإعداد نموذج الاتصال BBB. (A) هو مقلوب الإدراج، يتم تجميعها قطعة قصيرة من أنابيب السيليكون ("الأنابيب الخارجية") حول محيطها والمكونات سيليكون تركيبها في تجويف اللمعية. هذا التجمع يخلق جيدا على أعلى سطح مجافي اللمعة ويمنع وسائل الإعلام من التسرب من خلال المسام. الخلايا يمكن المصنف في البئر وسمح التمسك دون عائق لفترات طويلة من الزمن (يمين) (B) يتم إعداد المكونات سيليكون من آخر قطعة من أنابيب السيليكون ("الأنابيب الداخلية")، مختومة في نهاية واحدة مع مخروط الختم الذي يتم إدراجها في تجويف لها. (C) المصنفة مرة واحدة، وويتم نقل إدراج تجميعها في بين اثنين من 6 لوحات جيدة (لوحة واحدة مقلوب على الآخر) للحد من مخاطر التلوث. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 3
الرقم 3. التخيل من الخلايا البطانية في الدماغ (BECS) والخلايا النجمية على 3 ميكرومتر غشاء مسامي A) الهيماتوكسيلين (لوحات اليسار)، المجهر الإلكتروني الماسح (SEM؛ وحات وسط) والصور المناعي (لوحات اليمين) من SVGs (على سطح مجافي اللمعة، 40،000 في إدراج 6.5 ملم، لوحات أعلى) وBECS (20،000 في إدراج 6.5 ملم على الكولاجين أنا المغلفة، سطح اللمعية، لوحات القاع) نمت على 3 ميكرومتر غشاء مسامي لمدة 3 أيام (من دون coculturing). كلا النوعين الخلية تصل إلى نقطة التقاء في هذا الوقت FRA لي والحفاظ على علامات الخلية المحددة (ييفي الدبقية الحمضية البروتين (GFAP) لSVG وعامل فون ويلبراند (VWF) في الهيئات Wiebel-بالادي لBECS، لوحات اليمين) على الغشاء. سهم رؤساء في لوحات SEM مزيد من إظهار قدرة كل من أنواع الخلايا أن تنمو مباشرة عبر وتغطية المسام، بينما تمثل الأسهم نواة الخلية. أشرطة النطاق على الصور ووزارة شؤون المرأة تمثل 25 ميكرومتر (أعلى) أو 20 ميكرون (القاع). أشرطة النطاق على الصور المناعي تمثل 40 ميكرومتر (B) وصور SEM من SVG نهاية القدمين مرورا 3 ميكرون المسام في اللمعية (BEC) سطح 3D بعد البذر من SVGs (وحدها) على سطح غشاء مجافي اللمعة. التحقق من صحة هذه الصور من احتمال تطوير الاتصال الحقيقية بين SVGs وBECS في نموذجنا BBB الإنسان. أشرطة النطاق تمثل 6 ميكرون على اللوحة اليسرى و 12 ميكرومتر على اللوحة اليمنى. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الطبقة = "jove_content"> * لمزيد من التوضيح لموقف الخلايا يرجى الرجوع إلى الشكل 1، لوحة اليسار.

الرقم 4
الشكل 4. هو الدافع وراء الأنسجة من نوع منشط البلازمينوجين الزيادة (ر-PA) بوساطة في نفاذية BBB بسبب التغيرات المورفولوجية من الخلايا النجمية. (A) تم إضافة زيادة تركيزات ر والسلطة الفلسطينية إلى غرفة اللمعية من الإنسان في المختبر ونفاذية BBB تم تقييم 24 ساعة في وقت لاحق من قبل مرور الألبومين الفلورسنت في غرفة مجافي اللمعة. زيادة ر-PA BBB نفاذية بطريقة تعتمد على التركيز. ن = 4-6 لجميع الفئات ولكن ر-PA 10nM، حيث n = 2. *** P <0.001 مقارنة لجميع الفئات الأخرى عن طريق واحد أنوفا مع نيومان Keuls آخر مخصص. (B) تم ادراج ر-PA (1 ميكرومتر) إلى غرفة اللمعية من الإنسان فيالمختبر BBB لمدة 8 ساعة و 24 ساعة قبل تقييم النفاذية. كما هو مبين، وكان ر والسلطة الفلسطينية بوساطة افتتاح BBB بالفعل كبير آخر 8 ساعة التحفيز (70.26٪ من الحد الأقصى في 24 ساعة)، ولكن لوحظ وجود زيادة أخرى في 24 ساعة. ن = 6، *** P <0.001 **، P <0.01compared إلى الصفر بحلول اتجاه واحد أنوفا مع نيومان Keuls آخر مخصص. في كل من (أ) و (ب)، ونقاط بارات / البيانات تمثل يعني ± SEM. (C) وصور الميدان مشرق ممثل SVGs Haematoxylin الملون (لوحات أعلى) أو الميكروسكوب الإلكتروني الماسح من SVGs (لوحات أسفل) على الأغشية البوليستر إدراج (3 ميكرون حجم المسام) 24 ساعة بعد العلاج مع مركبة أو تي PA (1 ميكرومتر). يمكن ملاحظة التغيرات المورفولوجية وضوحا ر-PA التي يسببها وتعطيل سلامة أحادي الطبقة SVG، مما يوحي بأن ردود نجمي لر-PA تكمن وراء تأثير ر والسلطة الفلسطينية على نفاذية BBB. الصور هي ممثل تجربتين مستقلة. أشرطة النطاق على الصور ووزارة شؤون المرأة تمثيلاأرسلت 61 ميكرون (يسار) أو 120 ميكرون (يمين). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأبحاث الطبية في أمراض الدماغ يعاني صعوبة كبيرة متعدية. في مجال السكتة الدماغية الحادة، على سبيل المثال، العديد من الأدوية التي أظهرت وعدا كبيرا في النماذج الحيوانية فشلت في العيادة 38،39. أسباب هذه النتائج المخيبة للآمال متنوعة وتشمل الخيانة من أنظمة الاختبار قبل السريرية لسيناريو السكتة الدماغية الإنسان والمبالغة في النتائج التي تم الحصول عليها من الدراسات على الحيوانات 21. استراتيجية واحدة لتحسين القيمة التنبؤية من النتائج قبل السريرية للمرحلة السريرية هو التنمية إضافية من الإنسان في المختبر النماذج المستندة إلى الخلايا، وهذه قد توفر أدوات قوية وفعالة من حيث التكلفة لفحص المخدرات وآليات الرواية وتسمح بالتركيز على أفضل السبل سريريا ذات الصلة 21. في هذا السياق، الذي وصفها هنا في التفاصيل العملية التي أجريت في مختبرنا لإنشاء نموذج الاتصال BBB الإنسان باستخدام تركيبة جديدة من خلد الإنسان الفلكيةcytes (SVGs) وBECS الأولية الإنسان لدراسة الظواهر المتعلقة السكتة الدماغية.

في ظل ظروف ثابتة (بدون تدفق)، اتصل النماذج BBB (الشكل 1) تشبه أفضل في الجسم الحي التركيب التشريحي ويتم عرض لتكون متفوقة في خصائص الحاجز بهم 13،17،18. الأهم من ذلك، الاتصال الحقيقية بين BECS والخلايا النجمية تحدث فقط على الأغشية مع أكبر قطر المسام (≥ 1 ميكرون)، والتي تسمح بمرور نجمي نهاية القدمين والحث اللاحقة من تشديد (أقل نفاذية) الطبقات الوحيدة BEC 14،15،27. ومع ذلك، فإن البذر من الخلايا النجمية على إدراج مقلوب مع ارتفاع حجم المسام - العنصر التقنية الأساسية في إعداد نموذج الاتصال BBB - يمثل تحديا تقنيا مزدوجة، منذ بالإضافة إلى حجم المتوسطة محدودة والتي يمكن أن تضاف إلى مقلوب 6.5 ملم إدراج (~ 50 شباط)، وأغشية هي أيضا عرضة للتسرب من المتوسط ​​بسبب قطر المسام الكبيرة بهم. ويمكن لهذه القيود تجعل ASTبذر rocytic محرجا وغير متناسقة.

لدينا تقنية مبتكرة لبذر الخلايا النجمية على إدراج مقلوب مع 3 ميكرون المسام يقدم حلا بسيطة لكنها فعالة لهذا الإجراء. من خلال خلق، سيليكون كتيمة قابلة للإزالة بشكل جيد على رأس السطح مجافي اللمعة أننا تحسنت كثيرا قدرة الخلايا النجمية "على الانضمام بنجاح إلى غشاء مسامي. وهذا يتيح النمو موحدة من الخلايا النجمية على سطح مجافي اللمعة ويسمح إعداد استنساخه من عدد كبير من إدراج للفحص في وقت واحد من العديد من المعلمات التجريبية (على سبيل المثال، لدينا فحص أداء مؤخرا من تأثير خمسة مختلفة منشط-BBB على تفعيل 28). وبالتالي، على الرغم من بساطته، وجدنا طريقة لدينا بشكل كبير لتحسين الإنتاجية وجودة أبحاثنا باستخدام هذا النموذج الاتصال BBB. القيد واحد من طريقة نجمية البذر هو شرط للحصول على المزيد المناولة اليدوية من إدراج، والتي تؤوي رقيقة (10 μم سميكة) الأغشية. التعامل المفرط أو خشنة يمكن أن يسبب الدموع الصغيرة والأضرار التي لحقت الغشاء. وبالتالي، فإن استخدام لينة ومرنة أنابيب السيليكون أمر ضروري لأن التجميع / التفكيك لابد من القيام بها مع الحد الأدنى من القوة.

فيما يتعلق مفهومها الشامل، وقد تم تأسيسها لدينا نموذج BBB الإنسان على أساس بروتوكول الموصوفة سابقا، والتي استخدمت أصلا 14،23 خلايا الإنسان الأولية. على الرغم من تفوقهم لBBB النمذجة، وعيب واحد في العمل من خلايا الدماغ البشري الأساسي هو عدم القدرة على الوصول بشكل روتيني الحية أنسجة المخ البشري لإنتاج العادية BECS والخلايا النجمية الأولية و / أو التكلفة التي ينطوي عليها في الحصول على تجاريا لهم. منذ العديد من النماذج BBB بديلا النجمية الابتدائي بنجاح مع الخلايا النجمية خلدت (على سبيل المثال مع خلايا الفئران دبقي C6 29)، كان من المعقول أن توظف الخلايا النجمية SVG 22 بوصفها رواية، والخيار وفيرة وفعالة من حيث التكلفة لنمذجة BBB الإنسان. قدرة SVGs لتؤثر إيجابا على وظيفة الحاجز BEC التحقق من حيث المبدأ ملاءمتها للدراسات BBB. في المقابل، اخترنا للحفاظ على BECS الأساسي في نموذج BBB لدينا لدورهم حاسما في BBB في الجسم الحي 1،2،9. الأهم من ذلك، زراعة لفترات طويلة من BECS الأولية يمكن أن يؤدي إلى إزالة التمايز وتدهور النمط الظاهري بهم BBB محددة. هذا الواقع قد يكون واضحا في نظامنا بنسبة عالية بدلا قيم نفاذية البطانية لالزلال. لهذا السبب، وقد استخدمنا نموذجنا أساسا بطريقة نسبية 28 (الشكل 4)، مع مراعاة نفاذية لها القاعدية مرتفعة. إذا كان المطلوب ضيق جدا أحادي الطبقة BEC الإنسان وظيفة الحاجز يمكن تحسينها عن طريق إضافة مواد كيميائية مثل الهيدروكورتيزون جلايكورتيكود 17 أو دوري امبير مع مثبطات فسفودايستراز 13. BECS الإنسان خلد، مثل خط الخلية hCMEC/D3 40، ويمكن أيضا أن تستخدم لقدرتها على الحفاظ على منظمة الشفافية الدولية على نحو أفضلتقاطعات GHT مع مرور الوقت. بعد، BEC خلية خطوط عرض في كثير من الأحيان انخفاض الصفات حاجز مقارنة المنخفضة مرور الأولية BECS 41،42 وتحتاج إلى النظر فيها بعناية بسبب التغيرات المحتملة الأخرى (أي التعبير غيرت من المستقبلات على سطح الخلية).

بشكل جماعي، أدى التعديل لدينا نوع من الخلايا نجمي (أي توظيف SVGs) والتحسن الكبير الذي طرأ على بروتوكول نجمية البذر في جيل من استنساخه، وسهلة لتجميع وأصيلة نموذج BBB الاتصال البشري. مع الأخذ في الاعتبار القيود، ويمكن هذا النظام بمثابة أداة مفيدة لفي المختبر التحقيق ليس فقط من السكتة الدماغية الحادة، ونحن هنا يتجلى 28، ولكن أيضا من عدة أمراض الدماغ الأخرى التي تنطوي على التشكيل من BBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذه الدراسة من المنح التي منحت لRLM من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في استراليا (منحة # 606658).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attachment Factor Cell-Systems Corporation 4Z0-210
Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human Cell-Systems Corporation ACBRI 376
Complete medium Cell-Systems Corporation 4Z0-500 Supplemented with CSC JetFuel
Complete serum-free medium Cell-Systems Corporation SF-4Z0-500 Supplemented with CSC RocketFue
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Endothelial cells growth supplement (from bovine origin) Sigma-Aldrich E2759-15MG
External silicone tubing Watson-Marlow 913.A080.016 Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall
Foetal calf serum Lonza 14-501F
Gentamycin sulfate Life Technologies 15750-060
Heparin sodium Pfizer 1,000 U/ml
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma-Aldrich H4875
Human brain microvascular endothelial cells Cell-Systems Corporation ACBRI 376
Internal silicone tubing Watson-Marlow 913.A032.016 Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall
L-Glutamine Life Technologies 25030
Mayer’s hematoxylin solution Amber Scientific MH
Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution HyClone Laboratories SH30244.01
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140
Rat collagen I Trevigen 3440-100-01 Cultrex brand
Tissue culture inserts Corning Life Sciences 3472 Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol. Dis. 37, 13-25 (2010).
  3. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  4. Vivien, D., Gauberti, M., Montagne, A., Defer, G., Touze, E. Impact of tissue plasminogen activator on the neurovascular unit: from clinical data to experimental evidence. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2119-2134 (2011).
  5. Stewart, P. A., Wiley, M. J. Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail--chick transplantation chimeras. Dev. Biol. 84, 183-192 (1981).
  6. Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325, 253-257 (1987).
  7. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
  8. Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathol. 122, 1-9 (2011).
  9. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin. Immunopathol. 31, 497-511 (2009).
  10. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100, 328-335 (2006).
  11. Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 59-127 (2005).
  12. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12, 1784-1792 (2012).
  13. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. Eur. Pharm. Sci. 12, 215-222 (2001).
  14. Hurwitz, A. A., Berman, J. W., Rashbaum, W. K., Lyman, W. D. Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells. Brain Res. 625, 238-243 (1993).
  15. Demeuse, P., et al. Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier. J. Neurosci. Methods. 121, 21-31 (2002).
  16. Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab. Invest. 85, 734-746 (2005).
  17. Cohen-Kashi Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in vivo and in vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  18. Kroll, S., et al. Control of the blood-brain barrier by glucocorticoids and the cells of the neurovascular unit. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1165, 228-239 (2009).
  19. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 312-328 (2008).
  20. Li, G., et al. Permeability of endothelial and astrocyte cocultures: in vitro blood-brain barrier models for drug delivery studies. Ann. Biomed. Eng. 38, 2499-2511 (2010).
  21. Antonic, A., Sena, E., Donnan, G., Howells, D. Human In Vitro Models of Ischaemic Stroke: a Test Bed for Translation. Transl. Stroke Res. 3, 306-309 (2012).
  22. Major, E. O., et al. Establishment of a line of human fetal glial cells that supports JC virus multiplication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1257-1261 (1985).
  23. Eugenin, E. A., Berman, J. W. Chemokine-dependent mechanisms of leukocyte trafficking across a model of the blood-brain barrier. Methods. 29, 351-361 (2003).
  24. Dehouck, M. P., et al. Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models. J. Neurochem. 58, 1790-1797 (1992).
  25. Perriere, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).
  26. Niego, B., Samson, A. L., Petersen, K. U., Medcalf, R. L. Thrombin-induced activation of astrocytes in mixed rat hippocampal cultures is inhibited by soluble thrombomodulin. Brain Res. 1381, 38-51 (2011).
  27. Ma, S. H., Lepak, L. A., Hussain, R. J., Shain, W., Shuler, M. L. An endothelial and astrocyte co-culture model of the blood-brain barrier utilizing an ultra-thin, nanofabricated silicon nitride membrane. Lab Chip. 5, 74-85 (2005).
  28. Niego, B., Freeman, R., Puschmann, T. B., Turnley, A. M., Medcalf, R. L. t-PA-specific modulation of a human BBB model involves plasmin-mediated activation of the Rho-kinase pathway in astrocytes. Blood. , (2012).
  29. Deli, M. A., Abraham, C. S., Niwa, M., Falus, A. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm. Res. 52, 39-40 (2003).
  30. Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nat. Med. 14, 731-737 (2008).
  31. Yepes, M., et al. Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein. J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).
  32. Abu Fanne, R., et al. Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity. Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).
  33. Wang, X., et al. Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator. Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).
  34. Wang, X., et al. Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke. Stroke. 35, 2726-2730 (2004).
  35. Donnan, G. A., et al. How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke. Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).
  36. Acheampong, P., Ford, G. A. Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).
  37. Derex, L., Nighoghossian, N. Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).
  38. Garber, K. Stroke treatment--light at the end of the tunnel. Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).
  39. Liebeskind, D. S. Reversing Stroke in the 2010s. Stroke. 40, 3156-3158 (2009).
  40. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  41. Song, L., Pachter, J. S. Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).
  42. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 81، حاجز الدم في الدماغ، نموذج، زراعة الخلايا، الخلايا النجمية والخلايا البطانية في الدماغ، إدراج، والأغشية
تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Niego, B., Medcalf, R. L. Improved… More

Niego, B., Medcalf, R. L. Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier. J. Vis. Exp. (81), e50934, doi:10.3791/50934 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter