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Bioengineering

Amélioration de la méthode pour la préparation d'une base de cellules humaines, Contactez modèle de la barrière hémato-encéphalique

Published: November 12, 2013 doi: 10.3791/50934
Automatic Translation
1, 1
1Australian Centre for Blood Diseases, Monash University

Summary

Création de modèles humains de la barrière hémato-encéphalique (BHE) peut bénéficier des recherches sur les conditions du cerveau associées à l'échec du Bureau. Nous décrivons ici une technique améliorée pour la préparation d'un modèle de BBB de contact, ce qui permet de co-culture d'astrocytes humains et les cellules endothéliales du cerveau sur les côtés opposés d'une membrane poreuse.

Abstract

La barrière hémato-encéphalique (BHE) comprend capillaires du cerveau imperméables mais adaptables qui contrôlent étroitement l'environnement du cerveau. L'échec de la BHE a été impliqué dans l'étiologie de nombreuses pathologies cérébrales, créant un besoin de développement des ressources humaines dans des modèles in vitro BBB pour aider à la recherche cliniquement pertinentes. Parmi les nombreux modèles BBB décrites à ce jour, un statique (sans écoulement), contactez modèle du Bureau, où les astrocytes et les cellules endothéliales du cerveau (BEC) sont co-cultivées sur les côtés opposés d'une membrane poreuse, est apparue comme un système encore authentique simplifié pour simuler la Bureau avec une capacité de criblage à haut débit. Néanmoins, la production de ce modèle présente quelques défis techniques. Ici, nous décrivons un protocole pour la préparation d'un modèle du Bureau contact humain en utilisant une nouvelle combinaison de BEC humains primaires et les astrocytes humains immortalisés. Plus précisément, nous détaillons une méthode innovante de culture des cellules sur des inserts inversées ainsi que indiquons insertiontechniques de coloration de t et illustrent la façon dont nous utilisons notre modèle pour la recherche du Bureau liées.

Introduction

Le Bureau est une interface spécialisée entre la circulation du sang périphérique et le système nerveux central, cruciale responsable de l'entretien de cerveau hémostase. Il comprend des cellules distinctes du cerveau endothéliales microvasculaires (BEC) qui sont fonctionnellement influencée par quelques composants cellulaires et acellulaires (ci-dessous) pour former un passage étanche et dynamique dans le cerveau. Dans les conditions physiologiques du Bureau restreint le passage des cellules du sang, les composants du plasma et des substances nocives, tous potentiellement neurotoxique, dans le cerveau. En parallèle, le Bureau échange sélectivement des ions et des éléments nutritifs (glucose et des amino-acides) et des clés de produits de déchets métaboliques entre le cerveau et la circulation de maintenir avec précision l'environnement de 1,2 cerveau. Ces dernières années, il est devenu évident que l'échec de la BHE a lieu dans une variété de pathologies cérébrales chroniques telles que les maladies neuro-dégénératives ou inflammatoires liées (par exemple la maladie d'Alzheimer et multiple sclérose, respectivement) 3, ainsi que dans les maladies aiguës, comme un AVC ischémique 4.

Les propriétés uniques de la BBB cellules endothéliales cérébrales (BEC) sont en grande partie induites par leur environnement cérébral 5, et en particulier par les astrocytes 6,7. Il existe une prise de conscience croissante que d'autres types de cellules, telles que les pericytes 8, les neurones et les microglies 1,3, ainsi que la membrane basale 9, supportent les CEB et forment ensemble une unité fonctionnelle appelée "unité neurovasculaire" (NVU) qui simultanément couples neuronale besoins métaboliques de leurs capillaires fournissant 10.

La participation du Bureau dans des situations pathologiques sous-tend de nombreuses tentatives pour développer des modèles in vitro BBB pour aider dans la recherche du Bureau liées à 11,12. Ces modèles ont pour but d'imiter aussi près que possible des caractéristiques BBB in vivo selon le principe NVU. In vitro 13, 14 humain, le rat 15, 16 souris, et porcine 17,18 origines), cultivées sur une membrane poreuse avec l'appui des astrocytes (largement examiné par Deli et al. 2005 11).

Les astrocytes peuvent être cultivées dans des conditions de non-contact sur ​​le fond d'une culture de tissu et, séparé de BEC (cultivées sur la surface supérieure de la membrane) par le milieu de culture pour l'instant des communications avec les CEB par des facteurs solubles 16. Dans les modèles plus avancés qui ressemblent mieux la structure anatomique de la BHE in vivo, les astrocytes sont maintenues dans des conditions de contact et cultivées directement sur ​​le côté opposé de la membrane à proximité de BEC 13,15,17 (figure 1). Cette configuration permet un contact physique entre les CAE et les astrocytes, établie quand les astrocytes projetleurs processus à travers la membrane poreuse. Il est important, pour un vrai contact pour produire les pores doivent être ≥ 1 um de diamètre, puisque pieds astrocytaires peuvent pas passer à travers des tailles de pores de petite taille (0,4 um) 14,15. Notamment, les systèmes de contact de BBB sont démontrés dans des études pour être supérieurs à leurs homologues non-contact en ce qui concerne leur résistance électrique trans-endothéliale (TEER) et les valeurs de perméabilité endothéliales de différents traceurs 13,17,18. Une dimension supplémentaire du flux média a été ajouté récemment dans un certain nombre de modèles in vitro BBB pour appliquer des forces de cisaillement à l'endothélium pour la simulation proche de la vascularisation cérébrale 12,19.

Un obstacle technique à surmonter lors de la génération d'un modèle de contact avec la BHE est l'ensemencement des astrocytes contre la gravité sur la surface abluminale de la membrane poreuse. Protocoles antérieurs 13,20, où les astrocytes ont été tout simplement ensemencées dans une goutte de médias sur le dessus d'un àinsert convertis, permis fois seulement à court de semis (soit 10 min 13 ou 2 h 20) qui ont été trouvées dans nos mains pour être insuffisant pour la fixation des cellules appropriée. En utilisant cette méthode de base, une plus longue période de fixation des astrocytes nécessite une surveillance constante des inserts par l'ouverture fréquente de l'incubateur (causant des fluctuations de température, le pH et l'humidité) et est également sujette à l'ensemencement des cellules inégale due à une fuite de médias à travers les pores, en particulier si les pores de plus de 1 um sont utilisés.

Ici, nous décrivons un protocole général pour la préparation d'un modèle de contact de Bureau. Notre procédure inclut une méthode alternative pour en culture des cellules sur des inserts inversées, qui traite les limitations mentionnées ci-dessus. Le procédé permet l'adhérence non perturbée des astrocytes sur la surface de la membrane abluminale, dans un incubateur équilibré, pour une période de temps prolongée. En conséquence, un ensemencement uniforme d'astrocytes est atteint ce qui augmente la qualité de la barrièreet minimise les variations de perméabilité entre les inserts basales.

Comme l'utilisation de cellules humaines est importante pour la recherche de l'homme pertinents 21, nous démontrons en outre dans cet article l'utilisation spécifique d'une nouvelle combinaison de BEC humains primaires et immortalisé astrocytes humains pour l'établissement d'un modèle du Bureau contact humain avec une capacité de criblage à haut débit . Depuis l'affichage de cellules sur des membranes poreuses peut être, nous avons aussi des techniques de coloration de détail difficiles qui peuvent aider dans la détermination de la confluence et la morphologie des cellules sur les membranes poreuses. Enfin, nous illustrons comment notre modèle BHE humaine peut être utilisée pour examiner l'effet de type activateur tissulaire du plasminogène (t-PA) - une enzyme thrombolytique qui sert comme une option de traitement unique pour l'AVC ischémique aigu - le Bureau.

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Protocol

Une. Culture cellulaire (3-7 jours avant l'Assemblée Bureau)

1.1. Les cellules endothéliales microvasculaires humaines cerveau primaires (BEC)

CAE ont été obtenus dans le commerce. Les cellules ont été produites par dissociation dispase de tissu cérébral humain de cortex normal et pour autant figé au passage 3 (<12 doublements de population).

  1. Substrat: navires Manteau de culture de tissus avec "facteur d'attachement» selon les instructions du fabricant.
  2. entretien cellulaire: Maintenir BEC dans un milieu complet contenant du sérum. Pour l'expérimentation, de la culture BEC dans un milieu sans sérum complet. Maintenir les cellules dans un humidifiée à 5% de CO2, 21% d'O 2 incubateur à 37 ° C
    Remarque: Comme alternative aux réactifs spécialisés, 0,1% (p / v) de solution de gélatine peut servir de réactif de revêtement tout en DMEM/F-12 complété avec HEPES 15 mM, 10% (v / v) de sérum de veau foetal (SVF), 2 mM de L-glutamine, 50 pg/ Ml de gentamicine, 20 pg / ml d'héparine et 20 ug / complément de croissance des cellules endothéliales ml peuvent être utilisées pour l'entretien BEC.
  3. Sous-culture de l'expérimentation: BEC confluentes de Split dans un rapport de 1:3 à 1:6 en fonction de l'heure prévue pour la prochaine utilisation (3-7 jours). Changer le support d'entretien tous les 3 jours. Utilisez BEC jusqu'à 15 passages.

1.2. SVG humain fœtal astrogliale Cell-ligne

SVG cellules astrocytes foetaux humains 22 étaient issues de cultures primaires de cerveau fœtal humain transformé avec réplication déficiente virus simien 40.

  1. Entretien: Les cellules de la culture SVG dans du milieu essentiel minimum avec une solution saline équilibrée de Earle additionné de 20% (v / v) de SVF (même pourcentage de sérum utilisé pour maintenir leurs cellules primaires parentales 22), 2 mM de L-glutamine, 50 U / ml de pénicilline et 50 pg / ml de streptomycine. Maintenir les cellules dans un humidifiée à 5% de CO2, 21% d'O 2
  2. Sous-culture de l'expérimentation: SVG confluentes de Split dans un rapport de 1:5 à 1:10, en fonction de l'heure prévue pour la prochaine utilisation (3-7 jours). L'élimination de la trypsine n'est pas nécessaire en raison de la teneur élevée de sérum dans le milieu. Changer le milieu tous les 3 jours. Utilisez SVG jusqu'à 20 passages.

2. Assemblée et co-culture de l'humain in vitro du Bureau Modèle (jour 0)

Commentaire: L'humain in vitro modèle contact du Bureau est préparé selon des protocoles publiés 13,23, avec des modifications.

2.1. Revêtement de Inserts

  1. Placez inserts de culture de tissus (6,5 mm de diamètre avec polyester membrane poreuse, 3 um taille des pores) dans les puits de la plaque de 24 puits fourni. Enduire la surface luminale des inserts pendant une nuit dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec du collagène de rat I (20 ug / cm 2; 50 ul de 132 pg/ Ml de collagène I dans de l'acide acétique à 0,02% dans de l'eau Milli-Q (MQH 2 O)). Laver les inserts fois (à la fois du côté abluminale et luminale) avec MQH 2 O pour éliminer l'acide résiduel.
    Remarque: La membrane basale des capillaires du cerveau ne contient pas de collagène I, mais surtout des laminines, des isoformes de collagène de type IV, nidogens, et les protéoglycanes de sulfate d'héparane 9. Pour cette raison, certains chercheurs utilisent des agents de revêtement tels que le collagène IV, la fibronectine 13 ou Matrigel (biosciences BD) 16 pour une modélisation plus authentique du Bureau.

2.2. SVG semis sur la face inférieure (abluminale) Membrane Surface

  1. Inversez l'insert et monter doucement autour de la jante de la membrane poreuse un court morceau de tube en silicone élastique ("tube externe"; ~ 10 mm de long, 8 mm de diamètre intérieur de 1,6 mm mur), essentiellement la création d'un nouveau bien au-dessus de la surface abluminale (Figure 2A).
  2. La face inférieure de l'insert de needs à sceller pour éviter la fuite des médias. Tout d'abord, à préparer une prise (figure 2A et 2B) constituée d'un tube en silicone (appelé "tube interne"; ~ 8 mm de long, 3,2 mm de diamètre intérieur, 1,6 mm de paroi, la figure 2B), scellé à une extrémité avec un cône d'étanchéité en matière plastique (~ 3 mm de long; préparé en coupant le fond d'une réaction en chaîne de 0,2 ml de la polymérase (PCR) de tube, la figure 2B). Ce cône non seulement assure l'étanchéité de la lumière de tubes internes, mais aussi élargit son bord pour le montage serré dans l'insert. Ensuite, en utilisant une pince stérile, insérer le bouchon de silicone dans la cavité luminale et avance jusqu'à ce qu'il atteigne la mise à ~ 1-2 mm à partir de la membrane (Figure 2A).
  3. Ensuite, semences 4 x 10 4 cellules SVG dans 200 milieu d'entretien de SVG pi (soiction 1.2.2 ci-dessus) directement dans la silicone bien au-dessus de la surface de la membrane abluminale (Figure 2A). Permettre SVG à adhérer pendant au moins 4 heures dans l'incubateur.
    Remarque: pour maintenir la stérilité de transporter les inserts assemblés entre deux plaques de 6 puits (une plaque inversée sur l'autre; Figure 2C) pour minimiser l'exposition à l'air non filtré au cours de la procédure. des tubes et des bouchons en silicone sont lavées dans de l'éthanol et à l'autoclave pour une utilisation ultérieure.
    Remarque: Utilisez des bouchons (section 2.2.2) que pour les insertions avec pores de la membrane taille est supérieure à 1 um. Membranes d'un diamètre de pores ≤ 1 um fuite et ne nécessitent que rarement le raccord de la tubulure en silicone externe (section 2.2.1). En outre, certains agents d'enrobage autres que le collagène I (voir la note à la section 2.1) peuvent empêcher leakiness même à travers 3 pm pores. Déterminez ce de manière empirique.
  4. Afin de surveiller l'état de vos astrocytes de respect, de semences en parallèle dans96 puits un volume identique niveau de l'astrocyte suspension cellulaire. Ce bien a la même surface que l'insert 6,5 mm (0,33 cm 2) et permet une visualisation plus facile des cellules par microscopie à contraste de phase de la membrane de l'insert. Lorsque vous observez une adhérence suffisante de l'astrocyte dans le contrôle de 96 puits, les astrocytes ont bien adhéré aussi à la membrane de l'insert.
  5. Lorsque les astrocytes ont suffisamment respectées dans le contrôle de 96 puits, transférer les ensembles d'insertion à la hotte de culture de tissus (voir la note ci-dessus) et retirez délicatement le tube et les bouchons de silicone externe. Inserts revenir à l'(c.-à-droite) orientation normale dans les puits contenant 800 fournis pl / puits de milieu de maintenance BEC (section 1.1.2 ci-dessus).

2.3. Ensemencement des CAE dans la Chambre Luminal dessus des astrocytes

Semences 2x10 4 BEC dans 200 pi sur la surface luminale collagène enduit et de restituer le insécuritérts dans l'incubateur.

2.4. Co-culture

Co-cultiver les inserts SVG / BEC graines pendant 3 jours dans un milieu BEC sans changement de support avant l'expérimentation.

3. Expérimentation avec le modèle du Bureau humain (Jour 3)

  1. Pour stimuler in vitro BBB cellules de lavage dans les premiers en remplaçant les médias abluminales et luminal avec 600 ul et 100 ul de milieu sans sérum BEC, respectivement.
  2. Aspirer le milieu luminale et remplacer de nouveau avec 100 ul de milieu sans sérum avec des agents stimulants.
    Remarque: si la stimulation de la chambre abluminale est nécessaire (pour activer le vitro Bureau à partir du compartiment astrocytaire), aspirer le milieu abluminale et la remplacer par 600 ul de milieu sans sérum avec des agents stimulants.
  3. Testez chaque groupe expérimental en trois exemplaires (donc, si la stimulation luminale est effectuée, qui nécessite 3 x 100 pi, nous vous conseillons de diluer la re agents à leurs concentrations finales dans 350 ul de milieu sans sérum par groupe afin de minimiser les erreurs de pipetage entre les puits).
  4. Effectuer paracellulaire standard et / ou des dosages de perméabilité transcellulaire des traceurs marqués 16,24 (pour ce dernier, nous utilisons l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) conjugué à de l'albumine) et / ou la mesure de la TEER 13,16,25 comme décrit précédemment.

Pour tenir compte des fluctuations de la perméabilité à la ligne de base entre les expériences, analyser les variations de la perméabilité par rapport à un insert enrobé sans cellules (qui sert de référence pour la perméabilité maximale) et au groupe traité avec le véhicule en utilisant la formule: perméabilité (% du max) = ( La valeur de la perméabilité de l'insert expérimentale - valeur de perméabilité moyen du groupe de véhicule) / (valeur de perméabilité de l'insert blanc - valeur de perméabilité moyen du groupe de véhicule) x 100.

4. Visualisation des cellules sur membranes poreuses

nt "> Commentaire: cellules non colorées sur les membranes d'insertion sont difficiles à observer par contraste de phase ou contraste d'interférence différentiel (DIC) microscopie puisque la membrane est très opaque et interfère avec la transmission de lumière Pour faire face à ce problème, nous avons développé différents procédés de coloration de cellules sur. des inserts, ce qui améliore grandement l'apparence des cellules sur la membrane. Généralement, les membranes tache d'insertion tout en fixées à l'insert, dans les puits. Les membranes doivent être enlevés seulement à la fin de la procédure de coloration à des fins de montage.

4.1. Hematoxylin coloration

  1. Fixer des inserts avec glacé à 4% (p / v) de paraformaldehyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS; mM NaCl 130, 10 mM de Na 2 HPO 4, 10 mM de NaH 2 PO 4, pH 7,2) pendant 20 min. Laver une fois dans du PBS.
  2. Immerger l'insert dans la solution d'hématoxyline de Mayer 0,1% pendant 2 min.
  3. Lavez délicatement l'insert avec de l'eau du robinet (en submergeant les tenantsert dans un bécher contenant de l'eau du robinet et pipetage l'excès d'eau). Transférer l'insert à l'eau du robinet de la solution de Scott (2 g / L NaHCO 3, 20 g / L MgSO 4) pour ~ 20 secondes jusqu'à ce que la couleur bleue souhaité se développe. Laver ensuite l'insert avec de l'eau du robinet (section 4.1.3). Une tache d'éosine en option peut être introduit ici par trempage de la plaquette dans une solution d'éosine à 1% pendant 10 s, suivi par un lavage à l'eau du robinet.
  4. Air-sécher la membrane d'insertion. L'utilisation d'un scalpel (découpe sur le bord de la membrane) retirer la membrane et le monter sur une lame de verre pour l'imagerie à champ lumineux
    Remarque: Si di-N-butylphthalateinxylene (DPX) milieu de montage est utilisé laver l'insert avec de l'éthanol à 100%, suivi par le xylène avant de retirer et le montage de la membrane.

4.2. Microscope électronique à balayage (MEB)

  1. Fixer des inserts avec glacé à 4% (p / v) de PFA dans du PBS pendant 20 min. Laver trois fois dans du PBS.
  2. Post-fixer les membranes pendant 30 min dans 1% (w / v) Tétroxyde d'osmium dans MQH 2 O.
  3. Laver les inserts dans l'eau (section 4.1.3) et se déshydrater dans un gradient d'escalade de l'éthanol (50%, 70%, 90% pendant 5 minutes chacun, puis 3 fois avec de l'éthanol à 100% pendant 10 min par intervalle).
  4. Traiter inserts déshydratés avec un mélange d'hexaméthyldisilazane (HMDS): éthanol (1:2 puis 2:1 pour 5 min).
  5. Traiter avec inserts 100% HMDS pendant 5 min, l'air sec et conserver dans des conditions desséchées.
  6. Retirer la membrane à l'aide d'un scalpel (découpe sur le bord de la membrane). Examiner les membranes par microscopie électronique à balayage.

4.3. Immunofluorescence

  1. Fixer des inserts avec glacé à 4% (p / v) de PFA dans du PBS pendant 20 min, lavage une fois dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 154 mM de NaCl, 0,22 um filtré).
  2. Effectuer immunomarquage des cellules sur la membrane de l'insert 26, comme décrit précédemment.
  3. Retirer la membrane à l'aide d'un scalpel (découpe sur le bord de la membrane) et le monter sur agdiapositive jeune fille avec la fluorescence milieu de montage. Examiner membrane par microscopie à fluorescence.

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Representative Results

Afin d'établir un humain, modèle contact du Bureau, nous avons dû cultiver SVG et BEC sur les membranes poreuses avec un 3 um de taille de pores, montré pour permettre le passage des astrocytes finaux pieds pour le contact avec les cellules endothéliales 14,15,27,28. Une représentation schématique du modèle de contact complet est illustré à la Figure 1 (illustration de gauche). Le défi technique principal présenté par un système de contact est nécessaire pour ensemencer les astrocytes encontre de la gravité sur la surface abluminale de la membrane. Nous avons réussi à cette entrée par la création d'un puits principalement silicone amovible sur le dessus de la surface de la membrane, tout en empêchant les fuites abluminale de support avec un bouchon de silicone supplémentaire inséré dans la cavité luminale (figure 2). La méthode a permis une période optimale, sans interruption ensemencement des fichiers SVG (au moins 4 h), qui à son tour est devenu très attaché à la surface poreuse avec une perte de cellule minimale. En effet, trois jours après l'ensemencement deux fichiers SVG et BEC applicationoreilles confluentes et couvert la membrane uniformément, à en juger par les images d'inserts hématoxyline teinté (voir la section 4.1, la figure 3A, panneaux de gauche). En outre, les deux types de cellules ont maintenu leurs marqueurs spécifiques des cellules sur des membranes poreuses (un motif de coloration diffuse de protéine acide fibrillaire gliale dans SVGs 22 et l'expression du facteur de von Willebrand dans les organes Wiebel-Palade et des vésicules cytoplasmiques dans les CEB; figure 3A, panneaux de droite) , observée par immunofluorescence (section 4.3). En outre, à partir de l'imagerie SEM (section 4.2), il est devenu évident que SVG et les CAE étaient capables de croître directement sur ​​les pores de la membrane (figure 3A, panneaux intermédiaires, pointes de flèches), un phénomène qui contribue artificiellement à la fonction de barrière physique de vitro du Bureau en Contact modèles1 3,28. Sur le plan fonctionnel, en présence d'SVGs de la valeur de perméabilité endothéliale (Pe) 16,24 fluorescent de l'albumine 28 improved ~ 4 fois par rapport à BEC seul (P <0,01, n = 4), de 0,574 ± 0,199 x10 -3 à 0,126 ± 0,028 x10 -3 cm / min avec ou sans les astrocytes (SVG), respectivement. Ces résultats Pe albumine sont comparables à une autre étude utilisant BEC de souris avec des cellules C6 de gliome de rat 29. Notre protocole d'ensemencement a été appliquée avec succès aussi fraîchement isolé BEC primaires de souris et les astrocytes primaires de souris cultivés sur 1 um pores. Dans ce modèle de contact de la souris, nous avons obtenu une barrière physique raisonnable pour le petit hydrophile traceur fluorescéine de sodium (Pe = 0,83 ± 0,22 x 10 -3 cm / min, n = 3). Par conséquent, notre méthode de semis peut être prolongée pour la préparation de modèles BBB provenant d'autres espèces.

La caractéristique la plus fondamentale d'un modèle contact du Bureau est la capacité des astrocytes à projeter leurs terminaux pieds à travers les pores de la membrane de contact physique avec les cellules endothéliales. Quelques études ont utilisé la microscopie électronique à balayage d'identifier astrocytes processus qui passent de la surface de la membrane abluminale (où les astrocytes sont ensemencées) à la surface luminale, comme une preuve de principe que le contact entre les astrocytes et les CE est plausible 14,15,27. Suite à ces études, nous avons imagé par SEM de la membrane luminale après l'ensemencement SVGs sur la surface abluminale. Comme le montre la figure 3B, astrocytaire (SVG) d'extrémité des pieds ont pu être observés en passant par 3 um pores dans le compartiment luminal, ce qui confirme que le contact peut potentiellement exister entre SVGs et ensemencée sur des BEC pores de cette dimension. Collectivement, notre méthode d'ensemencement était simple, efficace, et a abouti à un modèle authentique contact du Bureau.

Nous avons utilisé notre modèle de contact de BHE humaine à explorer l'effet du t-PA, un agent fibrinolytique, sur le Bureau. Un certain nombre d'articles ont suggéré que le t-PA peut être capable d'induire l'ouverture du Bureau lors de son administration par voie intraveineuse pour le traitement de l'AVC ischémique aigu 30-33. Cette interaction entre le t-PA et le Bureau peut contribuer à des complications hémorragiques associés à la thrombolyse t-PA induite 4,34,35 et est donc un sujet pour les efforts de recherche actuels. Nos études in vitro ont confirmé que le t-PA en effet augmenté la perméabilité de la BHE intacte en une concentration (figure 4A) et d'une manière dépendante du temps (figure 4B), qui étaient toutes deux dans une plage pharmacologiquement pertinentes 36,37. En outre, les changements morphologiques spectaculaires d'astrocytes SVG peuvent être observés sur les membranes poreuses après l'exposition à t-PA (figure 4C), ce qui suggère que les réponses à astrocytaires t-PA à la base de l'ouverture du Bureau du t-PA-induite. Une enquête subséquente a révélé que le t-PA stimule astrocytes via l'activation du plasminogène - son substrat naturel - dans la protéase plasmine puissant et à large spectre. En outre, le t-PA et la plasmine sont révélés activer la Rho-kinase (ROCK) de signalisation dans les astrocytes, et blocus de la voie de ROCK empêché t-PA induite Bureau ouverture 28. C'est un bon exemple de la façon dont l'utilisation de modèles BBB peut mener à l'identification de nouveaux procédés biologiques et les possibilités thérapeutiques.

Figure 1
Figure 1. Configurations basées insérer des modèles in vitro à BBB. Des représentations schématiques de statique (sans écoulement) dans des modèles in vitro BBB. Dans les modèles de base des cellules endothéliales du cerveau (ECS; orange) sont cultivées seul sur une membrane poreuse (jaune). En plus avancé approches EC sont co-cultivées avec des astrocytes (vert). Les astrocytes peuvent être cultivées soit dans des conditions de non-contact, sur le fond du puits (à droite), ou sur la surface abluminale de la membrane poreuse dans les conditions de contact (à gauche).nk "> Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2
Figure 2. Un procédé amélioré pour astrocyte ensemencement sur ​​la surface de la membrane abluminale pour la préparation d'un modèle de contact avec la BBB. (A) L'insert est inversé, un court morceau de tuyau en silicone ("de tubage externe") est assemblé autour de son périmètre et un bouchon de silicone monté dans la cavité luminale. Ce montage crée un puits au-dessus de la surface abluminale et empêche de fuir à travers les médias les pores. Les cellules peuvent être ensemencées dans des puits et laissées adhérer au repos pendant des périodes prolongées (de droite) (B) Le bouchon de silicone est préparé à partir d'un autre morceau de tube en silicone ("tuyaux internes»), fermé à une extrémité avec un cône d'étanchéité, qui est inséré dans sa cavité. (C) Une fois ensemencé, leinserts assemblés sont transportés entre deux plaques de 6 puits (une plaque inversée sur l'autre) afin de minimiser le risque de contamination. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 3
Figure 3. La visualisation des cellules endothéliales cérébrales (BEC) et les astrocytes sur une um membrane poreuse 3 A) d'hématoxyline (panneaux de gauche), au microscope électronique à balayage (SEM;. Panneaux du milieu) et des images d'immunofluorescence (panneaux de droite) de SVGs (sur la surface abluminale, 40000 par 6,5 mm insert, panneaux supérieurs) et CAE (20.000 par 6,5 mm insertion sur le collagène I-enduit, surface luminale, panneaux de fond) cultivées sur une membrane poreuse 3 pm pendant 3 jours (sans co-culture). Deux types de cellules atteignent la confluence dans ce délai framoi et maintenir leurs marqueurs spécifiques des cellules (protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) pour SVG et le facteur de von Willebrand (FvW) dans les organes Wiebel-Palade pour BEC, panneaux de droite) sur la membrane. Têtes de flèche dans les panneaux au MEB montrent en outre la capacité des deux types de cellules à croître directement au-dessus et recouvrir les pores, tandis que les flèches représentent des noyaux cellulaires. Barres d'échelle sur les images SEM représentent 25 pm (en haut) ou 20 um (en bas). Barres d'échelle sur les images d'immunofluorescence représentent 40 um. (B) images MEB de SVG finaux pieds en passant par 3 um pores dans la luminale (BEC) 3d surface après l'ensemencement de fichiers SVG (seul) sur la surface de la membrane abluminale. Ces images de valider le potentiel de développement de vrai contact entre SVG et CAE dans notre modèle du Bureau humaine. Barres d'échelle représentent 6 pm sur le panneau de gauche et 12 um sur le panneau de droite. Cliquez ici pour agrandir l'image .

la figure 1, panneau de gauche.

Figure 4
Figure 4. de type activateur de plasminogène tissulaire augmentation (t-PA) à médiation dans perméabilité de la BHE est entraîné par des changements morphologiques des astrocytes. (a) en augmentant les concentrations de t-PA ont été ajoutés à la chambre luminale de l'humain in vitro Bureau et de la perméabilité a été évaluée 24 heures par la suite le passage de l'albumine fluorescent dans la chambre abluminale. t-PA a augmenté perméabilité de la BHE d'une manière dépendante de la concentration. n = 4-6 pour tous les groupes, mais le t-PA 10 nM, où n = 2. *** P <0,001 par rapport à tous les autres groupes par une ANOVA à un facteur avec Newman-Keuls post-hoc. (B) du t-PA (1 uM) a été ajouté à la chambre luminale de l'humain enin vitro du Bureau pour 8 heures et 24 heures avant l'évaluation de la perméabilité. Comme indiqué, l'ouverture du Bureau du t-PA médiation était déjà stimulation 8 h de poste important (70,26% du maximum à 24 h), mais une nouvelle hausse a été observée à 24 h. n = 6, *** P <0,001, ** P <0.01compared à zéro par une analyse de la variance avec Newman-Keuls post hoc. Dans les deux (A) et (B), les points de bars / données représentent la moyenne ± SEM. (C) représentatifs images lumineux champ de SVG hématoxyline-coloration (panneaux supérieurs) ou au microscope électronique à balayage de fichiers SVG (panneaux de fond) sur les membranes d'insertion de polyester (taille de pores de 3 um) 24 h de traitement avec le véhicule de poste ou t-PA (1 uM). Changements morphologiques prononcée t-PA-induits et de la perturbation de l'intégrité de la monocouche SVG peuvent être observées, ce qui suggère que les réponses à astrocytaires t-PA à la base de l'effet du t-PA sur perméabilité de la BHE. Les images sont représentatives de deux expériences indépendantes. Barres d'échelle sur les images SEM repréenvoyé 61 um (à gauche) ou 120 um (à droite). Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Discussion

La recherche médicale sur les pathologies du cerveau souffre de difficultés de traduction. Dans le domaine de l'AVC ischémique aigu, par exemple, de nombreux médicaments qui ont montré de grandes promesses dans des modèles animaux ont échoué à la clinique 38,39. Les raisons de ces résultats décevants sont diverses et comprennent l'infidélité des systèmes de test précliniques pour le scénario de la course humaine et surestimation des résultats provenant d'études animales 21. Une stratégie visant à améliorer la valeur prédictive des résultats précliniques pour la phase clinique est le développement supplémentaire de l'homme dans des modèles in vitro à base de cellules; ceux-ci peuvent fournir des outils puissants et rentables pour le dépistage de nouveaux médicaments et les mécanismes et permettra de mieux se concentrer sur les avenues cliniquement pertinentes 21. Dans ce contexte, nous avons décrit ici en détail le processus entrepris dans notre laboratoire pour la mise en place d'un modèle de contact de BHE humaine en utilisant une nouvelle combinaison de humaines immortalisées astrocytes (SVG) et CAE primaires humains pour l'examen de phénomènes liés à l'AVC.

Dans des conditions statiques (sans écoulement), contacter modèles BBB (Figure 1) ressemblent au mieux la structure anatomique vivo dans et sont montré supérieur dans leurs propriétés de barrière 13,17,18. Surtout, vrai contact entre CAE et les astrocytes se produit uniquement sur ​​les membranes avec un plus grand diamètre de pore (≥ 1 pm), qui permettent le passage des pieds astrocytaires et induction ultérieure de resserrement (moins perméables) BEC monocouches 14,15,27. Cependant, l'ensemencement des astrocytes sur inserts inversé avec une plus grande taille de pore - l'élément technique de base pour la préparation d'un modèle de contact avec la BBB - présente un défi technique double, car en plus du volume de fluide limité, qui peut être ajouté aux inversées 6,5 mm inserts (~ 50 ul), les membranes sont également sujettes à une fuite du produit en raison de leur grand diamètre de pores. Ces limitations peuvent faire l'astensemencement rocytic maladroite et incohérente.

Notre technique innovante pour l'ensemencement astrocytes sur inserts inversées avec 3 pm pores offre une solution simple et efficace pour cette procédure. Par bien la création d'un amovible, silicone imperméable au-dessus de la surface abluminale nous avons grandement amélioré la capacité des astrocytes à adhérer avec succès à la membrane poreuse. Cela permet une croissance uniforme des astrocytes sur la surface abluminale et reproductible, permet de préparer un grand nombre de pièces rapportées pour le criblage simultané de plusieurs paramètres expérimentaux (par exemple, notre criblage effectué récemment de l'effet de cinq plasminogène-activateurs différents sur la BHE 28). Ainsi, malgré sa simplicité, nous avons trouvé notre méthode pour améliorer considérablement le débit et la qualité de notre recherche en utilisant ce modèle contact du Bureau. Une limitation de notre méthode astrocytes de semis est l'exigence d'une manipulation manuelle supplémentaire des inserts, qui abritent mince (10 μm d'épaisseur) membranes. Manipulation excessive ou rugueuse peut causer des micro-déchirures et les dommages à la membrane. Par conséquent, l'utilisation d'un tube de silicone souple et flexible est essentiel que le montage / démontage doit être effectué avec une force minimale.

En ce qui concerne son concept global, notre modèle BHE humaine a été établi sur la base d'un protocole décrit précédemment 14,23 qui à l'origine utilisé des cellules humaines primaires. En dépit de leur supériorité pour la modélisation du Bureau, un inconvénient de l'emploi de cellules primaires du cerveau humain est l'impossibilité d'accéder régulièrement tissu vivant de cerveau humain pour la production régulière des CAE et des astrocytes primaires et / ou le coût impliqué dans les obtenir dans le commerce. Depuis de nombreux modèles BBB remplacer avec succès les astrocytes primaires avec des astrocytes immortalisés (par exemple avec un cellules C6 de rat de gliome 29), il était raisonnable d'employer les astrocytes SVG 22 comme un roman, l'option abondante et rentable pour la modélisation du Bureau humaine. La capacité de SVG àinfluencer positivement la fonction barrière BEC validé en principe leur pertinence pour les études du Bureau. En revanche, nous avons choisi de garder BEC primaires dans notre modèle du Bureau pour leur rôle essentiel dans le Bureau in vivo 1,2,9. Surtout, culture prolongée des CAE primaires peut entraîner des dé-différenciation et la détérioration de leur phénotype BBB-spécifique. Cela peut en effet être évident dans notre système par une des valeurs de perméabilité endothéliales assez élevés pour l'albumine. Pour cette raison, nous avons utilisé notre modèle principalement dans un mode par rapport 28 (figure 4), en tenant compte de sa perméabilité basale élevée. Si une monocouche très serré BEC humain est souhaité de la fonction de barrière peut être encore améliorée par l'addition de produits chimiques tels que l'hydrocortisone ou des glucocorticoïdes 17 d'AMP cyclique avec des inhibiteurs de phosphodiesterase 13. CEB humaines immortalisées, telles que la lignée cellulaire hCMEC/D3 40, pourraient également être utilisées pour leur capacité à mieux maintenir tijonctions ght au fil du temps. Pourtant, BEC lignées cellulaires présentent souvent des qualités de barrière réduites par rapport à faible passage primaire BEC 41,42 et doit être examinée avec soin en raison d'autres changements potentiels (c'est à dire de l'expression altérée de récepteurs de surface cellulaire).

Collectivement, notre modification du type de cellule astrocytaire (c'est à dire l'emploi des fichiers SVG) et l'amélioration substantielle de l'astrocyte protocole d'ensemencement a donné lieu à la production d'un reproductible, facile à assembler et authentique modèle du Bureau de contact humain. Ayant à l'esprit ses limites, ce système peut servir comme un outil utile pour la recherche in vitro non seulement de l'AVC ischémique aigu, comme nous illustrés ici 28, mais aussi de plusieurs autres pathologies du cerveau impliquant la modulation du Bureau.

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Disclosures

Les auteurs ont rien à révéler.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par des subventions accordées aux RLM du Conseil national de la santé et de recherche médicale de l'Australie (subvention # 606658).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attachment Factor Cell-Systems Corporation 4Z0-210
Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human Cell-Systems Corporation ACBRI 376
Complete medium Cell-Systems Corporation 4Z0-500 Supplemented with CSC JetFuel
Complete serum-free medium Cell-Systems Corporation SF-4Z0-500 Supplemented with CSC RocketFue
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Endothelial cells growth supplement (from bovine origin) Sigma-Aldrich E2759-15MG
External silicone tubing Watson-Marlow 913.A080.016 Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall
Foetal calf serum Lonza 14-501F
Gentamycin sulfate Life Technologies 15750-060
Heparin sodium Pfizer 1,000 U/ml
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma-Aldrich H4875
Human brain microvascular endothelial cells Cell-Systems Corporation ACBRI 376
Internal silicone tubing Watson-Marlow 913.A032.016 Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall
L-Glutamine Life Technologies 25030
Mayer’s hematoxylin solution Amber Scientific MH
Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution HyClone Laboratories SH30244.01
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140
Rat collagen I Trevigen 3440-100-01 Cultrex brand
Tissue culture inserts Corning Life Sciences 3472 Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size

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Bioingénierie Numéro 81 barrière hémato-encéphalique le modèle la culture de cellules les astrocytes des cellules endothéliales du cerveau insert membranes
Amélioration de la méthode pour la préparation d&#39;une base de cellules humaines, Contactez modèle de la barrière hémato-encéphalique
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Niego, B., Medcalf, R. L. Improved… More

Niego, B., Medcalf, R. L. Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier. J. Vis. Exp. (81), e50934, doi:10.3791/50934 (2013).

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