Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Forbedret fremgangsmåte for fremstilling av en human cellebasert kontakt Model of the Blood-Brain Barrier

Published: November 12, 2013 doi: 10.3791/50934
Automatic Translation
1, 1
1Australian Centre for Blood Diseases, Monash University

Summary

Etablering av humane modeller av blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​kan dra nytte forskning på hjerne tilstander forbundet med BBB svikt. Vi beskriver her en forbedret teknikk for fremstilling av en kontakt BBB-modell, som tillater coculturing av humane astrocytter og hjerne endotelceller på hver sin side av en porøs membran.

Abstract

Den blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​omfatter ugjennomtrengelige, men kan tilpasses hjernekapillærer som ligger tett styrer hjernen miljø. Unnlatelse av BBB har vært antydet i etiologien av mange hjernesykdommer, skaper et behov for utvikling av human in vitro BBB modeller for å bistå i klinisk relevant forskning. Blant de tallrike BBB modellene hittil er beskrevet, et statisk (uten strømning), kontakt BBB-modellen, hvor astrocytter og hjerne endotel celler (BECS) er cocultured på hver sin side av en porøs membran, dukket opp som en forenklet, men likevel autentisk system for å simulere BBB med høy gjennomstrømming screening kapasitet. Likevel generering av en slik modell presenterer noen tekniske utfordringer. Her beskriver vi en protokoll for utarbeidelse av en kontakt menneskelig BBB-modellen benytter en ny kombinasjon av primære humane Becs og udødelig menneskelige astrocytter. Vi har nærmere bestemt detalj en nyskapende fremgangsmåte for celle-seeding på omvendte innsatser så vel som spesifiserer innrykkett fargeteknikker og eksemplifisere hvordan vi bruker vår modell for BBB-relatert forskning.

Introduction

BBB er en spesialisert grensesnitt mellom det perifere blodsirkulasjonen og det sentrale nervesystemet, det avgjørende er ansvarlig for vedlikehold av hjernen hemostase. Det består av forskjellige hjerne mikrovaskulære endotelceller (BECS) som er funksjonsmessig påvirket av noen celle-og acellulære komponenter (nedenfor) for å danne en tett og dynamisk gateway inn i hjernen. Under fysiologiske betingelser BBB begrenser passasjen av blodceller, plasma-komponenter og skadelige stoffer, som alle potensielt nevrotoksisk, inn i hjernen. Parallelt BBB selektivt utveksler viktige ioner og næringsstoffer (glukose og aminosyrer med) og metabolske avfallsprodukter mellom hjernen og blodsirkulasjonen til nettopp å opprettholde hjernen miljøet 1,2. I de senere år er det blitt klart at svikt av BBB forekommer i en rekke kroniske hjernesykdommer, for eksempel neurodegenerative og betennelsessykdommer (for eksempel Alzheimers sykdom og multiple sklerose, henholdsvis) 3, så vel som i akutte tilstander som hjerneinfarkt 4..

De unike egenskaper av BBB hjerne endotel celler (BECS) er i stor grad forårsaket av deres cerebral miljø 5, og i særdeleshet ved astrocytter 6,7. Det er en økende forståelse for at andre celletyper, for eksempel pericytes 8, nevroner og microglia 1,3, samt basalmembranen 9, støtte Becs og danner sammen en funksjonell enhet kalt "neurovascular enhet" (NVU) som samtidig par nevronale metabolske krav til sine forsyne kapillærer 10.

Involvering av BBB i patologiske situasjoner ligger under mange forsøk på å utvikle in vitro BBB modeller for å bistå i BBB-relatert forskning 11,12. Disse modellene tar sikte på å etterligne så nært som mulig in vivo BBB egenskaper i henhold til NVU prinsippet. In vitro 13, menneskelig 14, rotte 15, mus 16, og svin 17,18 opprinnelse), dyrket på en porøs membran sammen med støtte astrocytter (utstrakt anmeldt av Deli et al. 2005 11).

Astrocytter kan dyrkes i ikke-kontaktforholdene på undersiden av et vevskultur godt separert fra BECS (dyrket på den øvre overflaten av membranen) av kulturmediet ennå kommuniserer med BECS via løselige faktorer 16. I mer avanserte modeller som bedre ligner den anatomiske strukturen av BBB in vivo, er astrocytter opprettholdes i kontaktforhold og dyrket direkte på den motsatte side av membranen i nær tilknytning til BECS 13,15,17 (fig. 1). Denne konfigurasjonen gjør det mulig fysisk kontakt mellom Becs og astrocytter, etablert når astrocytter prosjektderes prosesser gjennom den porøse membran. Viktigere, for en ekte kontakt for å oppstå porene bør være ≥ 1/iM i diameter, siden astrocytic slutt fot ikke kan passere gjennom mindre pore størrelser (dvs. 0,4 mikrometer) 14,15. Spesielt, er kontakt BBB-systemer demonstrert i noen studier å være bedre enn sine ikke-kontakt kolleger om deres trans-endothelial elektrisk motstand (Teer) og endothelial permeabilitet verdier av ulike sporstoffer 13,17,18. En ytterligere dimensjon av mediastrømmen nylig ble tilsatt i en rekke in vitro-modeller BBB å anvende skjærkrefter til endotelet for nærmere simulering av hjernens blodkar 12,19.

En teknisk hindring for å overvinne ved generering av en kontakt BBB modellen er såing av astrocytter mot tyngdekraften på abluminal overflaten av den porøse membran. Tidligere protokoller 13,20, hvor astrocytter ble bare seeded i en dråpe media på toppen av en iomregnet innsats, tillates kun kort seeding ganger (dvs. 10 min 13 eller 2 hr 20) som ble funnet i våre hender for å være utilstrekkelig for riktig celle vedlegg. Ved hjelp av denne grunnleggende metode, en lengre astrocyte feste periode krever konstant overvåking av innsatsene ved hyppig åpning av inkubator (forårsaker variasjoner i temperatur, pH og fuktighet), og er også utsatt for ujevn celle seeding grunn av lekkasje av mediet gjennom porene, særlig hvis porer større enn 1 pm blir anvendt.

Her beskriver vi en generell protokoll for utarbeidelse av en kontakt BBB modell. Vår prosedyre inkluderer en alternativ metode for celle-seeding på omvendte inserts, som omhandler de nevnte begrensninger. Fremgangsmåten gjør det mulig uforstyrret tilslutning av astrocytter på abluminal membranoverflaten, i en inkubator ekvilibrert, over en lengre tidsperiode. Som et resultat, er en enhetlig såing av astrocytter oppnådd som øker barrierekvalitetenog minimerer basal permeabilitet variasjoner mellom innsatser.

Etter hvert som bruken av humane celler er viktig for human-relevant forskning 21, vi i tillegg viser i denne artikkelen den spesifikke anvendelse av en ny kombinasjon av primære humane BECS og udødeliggjort human astrocytter for opprettelse av en kontakt human BBB-modell med en høy gjennomløpsscreening kapasitet . Siden visning av celler på porøse membraner kan være vanskelige, har vi også detaljfargeteknikker som kan bistå i fastsettelse av samløpet og cellemorfologi på de porøse membraner. Endelig eksemplifisere vi hvordan vår human BBB-modellen kan bli anvendt for å undersøke effekten av tissue-type plasminogen-aktivator (t-PA) - en blodpropp spreng enzym som tjener som eneste behandling for akutt iskemisk hjerneslag - on BBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Cell Culture (3-7 dager før BBB Assembly)

1.1. Primære Human Brain mikrovaskulær endotelceller (Becs)

Becs ble kommersielt oppnådd. Cellene ble fremstilt ved dispase dissosiasjon av normal human hjerne cortex vev og gitt frosset på passasjen 3 (<12 populasjons fordoblinger).

  1. Grunnen: Coat vev-kultur fartøy med "Attachment Factor" i henhold til produsentens instruksjoner.
  2. Cell vedlikehold: Opprett BECS i serum-inneholdende fullstendig medium. For eksperimentering, kultur BECS i fullstendig serumfritt medium. Oppretthold cellene i en fuktet 5% CO2, 21% O 2 inkubator ved 37 ° C
    Merk: Som et alternativ til spesialiserte reagenser, 0,1% (w / v) gelatin-løsning kan brukes som et belegg reagens mens DMEM/F-12 supplert med 15 mM HEPES, 10% (v / v) føtalt kalveserum (FCS), 2 mM L-glutamin, 50 ug/ Ml gentamycin, 20 pg / ml heparin og 20 pg / ml endotelceller veksttilskudd kan brukes til BEC vedlikehold.
  3. Sub-dyrkning for eksperimentering: Delt konfluente BECS i et forhold på 1:03 til 1:06, avhengig av den tilsiktede tid for neste gangs bruk (3-7 dager). Endre vedlikehold medium hver 3. dag. Bruk becs opptil 15 passasjer.

1.2. SVG Menneskelig Fetal Astroglial Cell-linjen

SVG humane føtale astroglial celler 22 ble opprinnelig hentet fra primærkulturer av menneskelig fosterets hjerne transformert med replikering-mangel Simian virus 40.

  1. Vedlikehold: Culture SVG celler i minimum essensielt medium med Earles balanserte saltløsning supplert med 20% (v / v) FCS (samme serum prosent brukt til å opprettholde sin sperre galvaniske elementer 22), 2 mM L-glutamin, 50 U / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin. Oppretthold cellene i en fuktet 5% CO2, 21% O 2
  2. Sub-dyrkning for eksperimentering: Delt konfluente SVGs i et forhold på 1:05 til 1:10, avhengig av den tilsiktede tid for neste gangs bruk (3-7 dager). Fjerning av trypsin er ikke nødvendig på grunn av det høye innhold av serum i medium. Endre medium hver 3. dag. Bruk SVGs opptil 20 passasjer.

2. Montering og Coculturing av Human In vitro BBB Modell (Dag 0)

Kommentar: Den menneskelige in vitro kontakt BBB-modellen er utarbeidet i henhold til publiserte protokoller 13,23, med modifikasjoner.

2.1. Belegg av Setter

  1. Plasser vev-kultur innlegg (6,5 mm i diameter med polyester porøs membran, 3 um pore-størrelse) i brønnene til den medfølgende 24-brønns plate. Coat den luminale overflate av innsatsene over natten i en fuktet 37 ° C inkubator med rotte kollagen I (20 mikrogram / ​​cm 2, 50 ul av 132 ug/ Ml kollagen jeg i 0,02% eddiksyre i Milli-Q vann (MQH 2 O)). Vask en gang innsatser (begge fra abluminal og luminale side) med MQH 2 O for å fjerne gjenværende syre.
    Merk: Kjeller membran av hjernen kapillærer inneholder ingen kollagen jeg, men hovedsakelig laminins, kollagen type IV isoformer, nidogens, og heparansulfat proteoglykaner ni. Av denne grunn er noen forskere utnytte belegningsmidler slik som collagen IV, fibronektin 13 eller Matrigel (BD Biosciences) 16 for et mer autentisk BBB modellering.

2.2. Seeding SVGs På undersiden (Abluminal) Membran Surface

  1. Invert innsatsen og passer lett rundt kanten av den porøse membran av et kort stykke av elastisk silikonslanger ("ytre rør»; ~ 10 mm langt og 8 mm innvendig diameter, 1,6 mm vegg), og skaper i det vesentlige et nytt godt over abluminal overflaten (Figur 2A).
  2. Undersiden av innsatsen needs som skal forsegles for å unngå lekkasje media. Først utarbeide en plugg (fig. 2A og 2B) er laget av et silikonrør (betegnet "indre rør"; ~ 8 mm lang, 3,2 mm indre diameter, 1,6 mm vegg, figur 2B), forseglet i en ende med en plast forsegling kjegle (~ 3 mm lang, fremstilt ved å kutte i bunnen av en 0,2 ml polymerase kjedereaksjon (PCR) rør, figur 2B). Denne konus ikke bare tetter de indre slangens lysåpning, men også utvider dens kant for tettere tilpasning inn i innsatsen. Deretter bruker en steril pinsett, setter silikonpluggen i luminal hulrom og avansere det før det når opp til ~ 1-2 mm fra membranen (Figur 2A).
  3. Neste, frø 4 x 10 4 SVG-celler i 200 mL SVG vedlikehold medium (seDette skjer 1.2.2 over) direkte inn i silikon godt over den abluminal membranoverflaten (figur 2A). Tillat SVGs å følge i minst fire timer i inkubatoren.
    Merk: For å opprettholde sterilitet transportere den sammensatte innsett mellom to 6-brønns plater (en plate invertert over den andre, figur 2C) for å minimalisere eksponering av ufiltrert luft under prosedyren. Silikon rør og plugger er vasket i etanol og autoklaveres for senere bruk.
    Merk: Bruk plugger (pkt. 2.2.2) bare for innsatser med membran pore størrelser som er større enn 1 mikrometer. Membraner med porediameter ≤ 1 mikrometer sjelden lekke og krever bare montering av den ytre silikonslanger (avsnitt 2.2.1). I tillegg er noen belegg andre enn kollagen agenter I (se note til § 2.1) kan hindre leakiness selv gjennom tre mikrometer porer. Bestem dette empirisk.
  4. For å overvåke etterlevelse tilstand av dine astrocytter, frø parallelt innen standard 96-brønns et identisk volum av astrocyte celle-suspensjon. Denne brønnen har samme overflateareal som den 6,5 mm innsatsen (0,33 cm 2), og tillater lettere visualisering av cellene ved fase-kontrast mikroskop enn innsats membran. Når du observerer tilstrekkelig etterlevelse av astrocyte i kontroll 96-brønnen, har de astrocytter tilstrekkelig levd også til innsatsen membran.
  5. Når astrocytter har tilstrekkelig levd i kontroll 96-brønnen, overføre innleggs forsamlinger til panseret vev kultur (se note ovenfor), og fjern forsiktig ytre silikonslanger og plugger. Returinnsatser til den normale (dvs. loddrett) stilling til de medfølgende brønner inneholdende 800 ul / brønn av BEC vedlikeholdsmedium (seksjon 1.1.2 ovenfor).

2.3. Seeding av Becs inn i Luminal Chamber over Astrocytes

Seed 2x10 4 becs i 200 mL bort på kollagen-belagt luminal overflaten og returnere inserts inn i inkubatoren.

2.4. Coculturing

Coculture de SVG / BEC-seeded innsatser for tre dager i BEC medium uten media endring før eksperimentering.

Tre. Eksperimentering med Human BBB Modell (Dag 3)

  1. For å stimulere in vitro BBB første vaske celler ved å erstatte de abluminal og luminal media med 600 mL og 100 mL av serum-free Becs medium, henholdsvis.
  2. Aspirer luminal mediet igjen, og erstatt med 100 ul serumfritt medium med stimulerende midler.
    Merk: Ved stimulering av abluminal kammeret er nødvendig (for å aktivere in vitro BBB fra astrocytic rommet), suge abluminal medium og erstatt med 600 ul serumfritt medium med stimulerende midler.
  3. Test hver forsøksgruppe i tre eksemplarer (derav, hvis luminal stimulering er utført, som krever 3 x 100 mL, anbefaler vi fortynne re midler til deres endelige konsentrasjoner i 350 pl av serumfritt medium per gruppe for å minimere pipettering feil mellom brønner).
  4. Utfør standard paracellular-og / eller transcellular permeabilitet analyser av merkede tracere 16,24 (for sistnevnte vi bruke fluorescein-isothiocyanat (FITC)-konjugert albumin) og / eller måling av teer 13,16,25 som tidligere beskrevet.

For å veie opp for svingninger i baseline permeabilitet mellom eksperimenter, analysere endringer i permeabilitet i forhold til en belagt innsats uten celler (som fungerer som en referanse for maksimal permeabilitet) og til kjøretøyet gruppen behandlet ved hjelp av formelen: permeabilitet (% av maks) = ( permeabilitet verdi på eksperimentell innsats - gjennomsnittlig permeabilitet verdien av kjøretøyet gruppe) / (permeabilitet verdien av blindinnsats - gjennomsnittlig permeabilitet verdien av kjøretøyet gruppe) x 100.

4. Visualisering av celler på porøse membraner

nt "> Kommentar: Unstained celler på innsats membraner er vanskelig å observere ved fase kontrast eller kontrast differensial forstyrrelser (DIC) mikros siden membranen er ganske ugjennomsiktig og forstyrrer lysgjennomgang For å håndtere dette problemet vi utviklet ulike farvningsprosedyrer av celler på. innsatser, noe som i stor grad forbedrer celleopptreden på membranen. Vanligvis beis innleggs membraner mens den fortsatt er festet til innsatsen, i brønnene. Membranene må fjernes kun ved slutten av fargingsprosedyre for monteringsformål.

4.1. Hematoxylin Farging

  1. Fiks innsatser med iskald 4% (w / v) paraformaldehyd (PFA) i fosfat-bufret saltvann (PBS, 130 mM NaCl, 10 mM Na HPO 2 4, 10 mM NaH 2 PO 4, pH 7,2) i 20 min. Vask en gang i PBS.
  2. Senk innsatsen i 0,1% Mayers hematoxylin løsning for 2 min.
  3. Forsiktig vaske innsatsen med vann fra springen (ved å senke modulerERT i et beger med vann fra springen og forsiktig pipettering overflødig vann ut). Overfør innsatsen til Scotts vann-løsning (2 g / l NaHCO3, 20 g / l MgSO 4) for ~ 20 sek inntil den ønskede blå farge vedvarer. Vask innsatsen igjen med vann fra springen (kapittel 4.1.3). En valgfri eosin flekken kan innføres her ved dypping innsatsen i 1% eosin-løsning i 10 sekunder etterfulgt av en vannkran vask.
  4. Lufttørk innsatsen membran. Ved hjelp av en skalpell (kutte rundt membran kanten) fjerner membranen og montere den på et glass lysbilde for lyse-feltet bildebehandling
    Merk: Hvis di-N-butylphthalateinxylene (DPX) monteringsmedium benyttes vaske innsatsen med 100% etanol, etterfulgt av xylen før fjerning og påsetting av membranen.

4.2. Scanning Electron Microscope (SEM)

  1. Fiks innsatser med iskald 4% (w / v) PFA i PBS i 20 min. Vask tre ganger i PBS.
  2. Post-løse membranene i 30 minutter i 1% (w / v) Osmiumtetroksid i MQH 2 O.
  3. Vask innsatser i vann (avsnitt 4.1.3), og dehydrerer i en stigende gradient etanol (50%, 70%, 90% i 5 minutter hver, og deretter 3 ganger med 100% etanol i 10 min pr intervall).
  4. Unn dehydrerte innlegg med en blanding av heksametyldisilazan (HMDS): etanol (01:02 deretter 02:01 i 5 min).
  5. Unn innstikk med 100% HMDS for 5 min, lufttørke og oppbevar i henhold uttørrede forhold.
  6. Fjern membranen ved hjelp av en skalpell (kutte rundt membran kanten). Undersøk membraner ved scanning-elektronmikroskopi.

4.3. Immunfluorescens

  1. Fiks innsatser med iskald 4% (w / v) PFA i PBS i 20 min, vaskes en gang i Tris-bufret saltvann (TBS, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 154 mM NaCl, 0,22 um filtrert).
  2. Utføre farging av cellene på innsatsen membran som tidligere beskrevet 26.
  3. Fjern membranen ved hjelp av en skalpell (kutte rundt membran kanten) og montere den på aglass lysbilde med fluorescens monteringsmedium. Undersøke membran av fluoriserende mikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å etablere et menneske, kontakt BBB modell vi måtte dyrke SVGs og BECS på porøse membraner med en 3 um pore-størrelse, er vist for å tillate passasje av astrocyte endeføtter for kontakt med endotelceller 14,15,27,28. En skjematisk fremstilling av den komplette kontakt modellen er illustrert i figur 1 (venstre figur). De viktigste tekniske utfordring med en kontakt-systemet er behovet for å frø astrocytter mot tyngdekraften på abluminal overflaten av membranen. Vi har lykkes i denne oppgaven ved hovedsakelig å skape en fjernbar silikon vel på toppen av abluminal membranoverflaten samtidig som det hindrer lekkasje av medier med en ekstra silikonplugg innsatt i luminale hulrommet (figur 2). Fremgangsmåten tillot en optimal, uavbrutt seeding periode på SVGs (minst 4 timer), noe som igjen ble sterkt festet til den porøse overflaten med minimalt tap av celle. Faktisk, tre dager etter seeding både SVGs og Becs appeared konfluent og dekket membranen jevnt, bedømt fra bilder av hematoxylin-farget inserts (se avsnitt 4.1, figur 3A, venstre panel). I tillegg, begge celletyper opprettholdt sin celle-spesifikke markører på porøse membraner (en diffus flekker mønster av glial fibrillary surt protein i SVGs 22 og uttrykk av von Willebrand faktor i Wiebel-Palade organer og cytoplasmatiske vesikler i Becs, figur 3A, høyre panel) , observert av immunfluorescens (pkt. 4.3). Videre, fra SEM imaging (avsnitt 4.2) ble det klart at SVGs og BECS var i stand til å vokse direkte over membranen porene (figur 3A, midtre paneler, piler), et fenomen som kunstig bidrar til den fysiske barriere funksjon av in vitro BBB kontakt modeller1 3,28. Funksjonelt, i nærvær av SVGs den endoteliale permeabiliteten verdi (Pe) 16,24 fluorescerende albumin 28 forbeVed ~ 4 ganger i forhold til Becs alene (P <0,01, n = 4), fra 0,574 ± 0,199 x10 -3 til 0,126 ± 0,028 x10 -3 cm / min uten eller med astrocytter (SVGs), henholdsvis. Disse Albumin Pe resultater er sammenlignbare med en annen studie ved hjelp av muse becs med rotte C6 gliomceller 29. Vår seeding protokollen ble vellykket anvendt også til fersk-isolert primære muse Becs og primære muse astrocytter dyrket på en mikrometer porer. I denne musemodellen kontakt erholdt vi et rimelig fysisk barriere for de små hydrofile tracer natrium-fluorescein (Pe = 0,83 ± 0,22 x10 -3 cm / min, n = 3). Derfor kan vår seeding metoden utvides for utarbeidelse av BBB modeller fra andre arter.

Det mest fundamentale trekk ved en kontakt BBB modell er muligheten for astrocytter å projisere deres slutt frem gjennom membran-porene til fysisk kontakt med endotelceller. Noen få studier gjort bruk av scanning elektronmikroskopi å idensere astrocytter prosesser som passerer fra abluminal membran overflate (der astrocytter er seeded) til luminal overflaten, som et bevis på prinsippet om at kontakten mellom astrocytter og EC er plausibel 14,15,27. Etter disse studiene vi fotografert av SEM luminal membran etter seeding SVGs på abluminal overflaten. Som vist på figur 3B, kan astrocytic (SVG) slutt fot observeres passerer gjennom 3 um porer i den luminale rommet, noe som bekrefter at kontakt potensielt kan eksistere mellom SVGs og BECS utsådd på porene i denne dimensjon. Kollektivt, vår seeding metoden var enkel, effektiv, og gitt en autentisk kontakt BBB modell.

Vi har benyttet vår menneskelig kontakt BBB modell for å utforske virkningen av t-PA, et fibrinolytisk middel, på den BBB. En rekke artikler har antydet at t-PA kan være i stand til å fremkalle åpning av BBB under sin intravenøs administrering for behandling av akutt iskemisk slag 30-33. Dette samspillet mellom t-PA og BBB kan bidra til blødningskomplikasjoner forbundet med t-PA-indusert trombolyse 4,34,35 og er således et tema for dagens forskningsinnsats. Våre studier in vitro bekreftet at t-PA faktisk økte permeabilitet av det intakte BBB på en konsentrasjons (figur 4A), og tidsavhengig måte (figur 4B), som var både innen en farmakologisk relevante området 36,37. Videre kan dramatiske morfologiske endringer på SVG astrocytter observeres på de porøse membraner post eksponering til t-PA (figur 4C), noe som tyder på at astrocytic svar på t-PA ligger til grunn for t-PA-indusert BBB åpning. Etterfølgende undersøkelse funnet at t-PA stimulerer astrocytter via aktivering av plasminogen - dens naturlige substrat - inn i den potente og bredspektret proteasen plasmin. Videre ble t-PA og plasmin funnet å aktivere Rho-kinase (ROCK) signalering i astrocytter, og blokade av ROCK pathway forhindret t-PA-indusert BBB åpning 28. Dette er et godt eksempel på at utnyttelsen av BBB-modeller kan føre til identifisering av nye biologiske prosesser og terapeutiske muligheter.

Figur 1
Figur 1. Sett-baserte konfigurasjoner av in vitro BBB-modeller. Skjematisk representasjoner av statisk (uten flyt) in vitro BBB modeller. I basismodeller hjernen endotelceller (ECS, oransje) dyrkes alene på en porøs membran (gul). I mer avanserte tilnærminger egenkapitalbevis er cocultured med astrocytter (grønn). Astrocytter kan dyrkes enten i ikke-kontaktforhold, på bunnen av brønnen (høyre), eller på den abluminal overflaten av den porøse membran i kontaktforhold (til venstre).nk "> Klikk her for å se større bilde.

Fig. 2
Figur 2. En forbedret fremgangsmåte for astrocyte seeding på abluminal membranoverflaten for fremstilling av en kontakt BBB-modell. (A) Innsatsen er invertert, et kort stykke av silikonslange ("ytre tubing") er satt sammen rundt sin omkrets, og en silikonplugg montert i det luminale hulrommet. Denne sammenstilling gir en brønn på toppen av abluminal overflate og hindrer mediet fra å lekke gjennom porene. Celler kan bli utsådd i brønnen og tillates å holde seg i ro i lengre tidsperioder (til høyre) (B) Et silikon pluggen er fremstilt av en annen del av silikonslange («indre rør»), forseglet i en ende med en tettende membran hvilken er satt inn i hulrommet. (C) seedet Når denmonterte innsettinger transporteres inn mellom to til 6-brønns plater (en plate invertert over den andre) for å minimalisere risikoen for forurensning. for å vise større bilde .

Figur 3
Figur 3. Visualisering av hjernen endotelceller (Becs) og astrocytter på en tre mikrometer porøs membran A) Hematoxylin (venstre panel), scanning elektronmikroskop (SEM;. Middel paneler) og immunofluorescence bilder (høyre panel) av SVGs (på abluminal overflaten, 40000 per 6.5 mm innsats, topplater) og becs (20 000 per 6.5 mm innsats på collagen jeg belagt, luminal overflaten, bunnplater) dyrket på en tre mikrometer porøs membran for tre dager (uten coculturing). Begge celletyper nå samløpet innenfor dette tids FRAmeg og opprettholde sin celle-spesifikke markører (glial fibrillary surt protein (GFAP) for SVG og von Willebrand faktor (vWF) i Wiebel-Palade organer for Wien, høyre panel) på membranen. Pil hoder i SEM paneler videre vise evne til begge celletyper å direkte vokse over og dekke porene, mens piler representerer cellekjerner. Scale barer på SEM bilder representerer 25 mikrometer (øverst) eller 20 mikrometer (nederst). Scale barer på immunofluorescence bildene representerer 40 mikrometer. (B) SEM bilder av SVG-end-fot passerer gjennom tre mikrometer porer i den luminale (BEC) overflate 3d innlegg seeding av SVGs (alene) på abluminal membranoverflaten. Disse bildene validere potensialet for utvikling av ekte kontakt mellom SVGs og Becs i vår menneskelige BBB modell. Scale barer representerer 6 mikrometer på venstre panel og 12 mikrometer på høyre panel. Klikk her for å se større bilde .

figur 1, venstre panel.

Figur 4
Figur 4. tissue-type plasminogen-aktivator (t-PA)-mediert økning i BBB permeabilitet er drevet av morfologiske endringer av astrocytter. (A) Økende t-PA-konsentrasjoner ble tilsatt til den luminale kammer av human in vitro BBB og permeabilitet ble målt 24 timers senere ved passering av fluorescerende albumin inn i abluminal kammeret. t-PA øker BBB permeabilitet på en konsentrasjonsavhengig måte. n = 4 til 6 for alle grupper, men 10 nM t-PA, hvor n = 2. *** P <0,001 sammenlignet med alle andre grupper av enveis ANOVA med Newman-Keuls post hoc. (B) t-PA (1 mM) ble tilsatt til den luminale kammer av human invitro BBB for 8 timer og 24 timer før permeabilitet vurdering. Som vist, t-PA-mediert BBB åpningen var allerede betydelige 8 timers etter stimulering (70,26% av det maksimale ved 24 timer), men en ytterligere økning ble observert etter 24 timer. n = 6, *** p <0,001, ** P <0.01compared til null etter én måte ANOVA med Newman-Keuls post hoc. I begge (A) og (B), barer / datapunkter representerer gjennomsnitt ± SEM. (C) Representative lyse-feltet bilder av haematoxylin-farget SVGs (topplater) eller scanning elektron mikrografer av SVGs (nederst paneler) på polyester innsats membraner (3 pm pore-størrelse) 24 timer etter behandling med bærer eller t-PA (1 uM). Uttalt t-PA-indusert morfologiske endringer og forstyrrelse av SVG monolaget integritet kan observeres, noe som tyder på at astrocytic responser til t-PA ligger til grunn for virkningen av t-PA på BBB permeabilitet. Bildene er representative for to uavhengige eksperimenter. Scale barer på SEM bilder represendte 61 mikrometer (til venstre) eller 120 mikrometer (til høyre). Klikk her for å se større bilde .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Medisinsk forskning på hjernesykdommer lider mye translasjonell vanskelighetsgrad. I området av akutt iskemisk hjerneslag, for eksempel, mange legemidler som viste store løftet i dyremodeller mislyktes på klinikken 38,39. Årsakene til disse skuffende resultatene er variert og inkluderer utroskap av de prekliniske testsystemer for det menneskelige slag scenario og overvurdering av resultatene fra dyrestudier 21. En strategi for å bedre prediktiv verdi på prekliniske funn til den kliniske fase er ytterligere utvikling av menneskelig celle-basert in vitro-modeller, og disse kan gi kraftige og kostnadseffektive verktøy for screening romanen medisiner og mekanismer, og gi bedre fokus på klinisk-relevante veier 21. I denne sammenheng, er beskrevet vi her i detalj den prosess som gjennomføres i vårt laboratorium for etablering av en menneskelig kontakt BBB modell benytte en ny kombinasjon av human udødelig astrocytes (SVGs) og menneskelige primær becs for undersøkelse av slagrelaterte fenomener.

Under statiske forhold (uten strømning), kontakt BBB-modeller (figur 1) ligner beste in vivo anatomisk struktur og er vist å være overlegen i sine barriereegenskaper 13,17,18. Viktigere, ekte kontakt mellom Becs og astrocytter oppstår bare på membraner med større pore diameter (≥ 1 mikrometer), som tillater passasje av astrocytic slutt føtter og påfølgende induksjon av strammere (mindre gjennomtrengelig) BEC monolayers 14,15,27. Imidlertid er såing av astrocytter på inverterte innsatser med større porestørrelse - kjernen teknisk element ved fremstilling av en kontakt BBB-modell - presenterer en dobbel teknisk utfordring, da det i tillegg til det begrensede volum medium som kan tilsettes til de inverterte 6,5 mm innlegg (~ 50 ul), membraner er også utsatt for lekkasje av medium på grunn av deres store pore diameter. Disse begrensningene kan gjøre astrocytic seeding vanskelig og inkonsekvent.

Våre innovative teknikk for seeding astrocytter på omvendte inserts med tre mikrometer porer tilbyr en enkel men effektiv løsning for denne prosedyren. Ved å opprette en fjernbar, ugjennomtrengelig silikon vel på toppen av abluminal overflate var sterkt forbedret astrocytter evne til å kunne overholde den porøse membranen. Dette muliggjør jevn vekst av astrocytter på abluminal overflate og tillater reproduserbar fremstilling av et stort antall innsatser for samtidig screening av mange eksperimentelle parametere (for eksempel vår nylig gjennomført screening av effekten av fem forskjellige plasminogen-aktivatorer på BBB 28). Derfor, til tross for sin enkelhet, har vi funnet vår metode for å dramatisk forbedre gjennomstrømningen og kvaliteten på vår forskning ved hjelp av denne kontakten BBB modell. En begrensning av vår astrocyte seeding metoden er kravet for ekstra manuell håndtering av innleggene, som rommer tynn (10 μm tykke) membraner. Overdreven eller røff behandling kan føre til mikro-tårer og skade på membranen. Derfor er bruken av myke og fleksible silikonslanger avgjørende som montering / demontering må utføres med minimal kraft.

Om sin totale konseptet, ble vår menneskelige BBB-modellen etablert basert på en tidligere beskrevet protokoll 14,23 som opprinnelig benyttet primære humane celler. Til tross for deres overlegenhet for BBB modellering, en ulempe i sysselsettingen på primære humane hjerneceller er manglende evne til rutinemessig tilgang til levende menneske hjernevev for regulær produksjon av primære Becs og astrocytter og / eller kostnadene involvert i kommersielt skaffe dem. Siden mange BBB modeller med hell erstatte primær astrocytter med udødelig astrocytter (for eksempel med en rotte C6 gliomceller 29), var det rimelig å bruke SVG astrocytter 22 som en roman, rikelig og kostnadseffektivt alternativ for menneskelig BBB modellering. Evnen til SVGs tilpositivt påvirke BEC barrierefunksjon validert i prinsippet deres egnethet for BBB studier. I kontrast, valgte vi å holde primær becs i vår BBB modell for sin kritiske rolle i BBB in vivo 1,2,9. Viktigere, kan langvarig dyrking av primære BECS føre til de-differensiering og forringelse av deres BBB-spesifikk fenotype. Dette faktisk kan være tydelige i vårt system med en ganske høy endothelial permeabilitet verdier for albumin. Av denne grunn har vi brukt vår modell hovedsakelig i en relativ mote 28 (figur 4), tar hensyn til sin opphøyde basal permeabilitet. Hvis en meget stram human BEC monolag er ønsket barrierefunksjonen kan bli ytterligere forbedret ved tilsetning av kjemikalier slik som glukokortikoid hydrokortison 17 eller cyklisk AMP med fosfodiesteraseinhibitorer 13. Udødeliggjorte humane Wien, slik som hCMEC/D3 cellelinjen 40, kunne også benyttes for deres evne til å opprettholde bedre tiGHT veikryss over tid. Likevel, BEC cellelinjer ofte vise reduserte barriere kvaliteter sammenlignet med lav-passasje primære Becs 41,42 og må vurderes nøye på grunn av andre mulige endringer (dvs. endret uttrykk av celle-overflate reseptorer).

Kollektivt, vår modifisering av astrocytic celletype (dvs. ansettelse av SVGs) og betydelig bedring til astrocyte seeding protokollen resulterte i generasjon av en reproduserbar, lett å montere og autentisk menneskelig kontakt BBB modell. Med tanke på sine begrensninger, kan dette systemet tjene som et nyttig verktøy for in vitro undersøkelse ikke bare av akutt iskemisk hjerneslag, som vi eksemplifisert her 28, men også av flere andre hjernesykdommer som involverer modulering av BBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble finansiert av bevilgninger til RLM fra National Health and Medical Research Council of Australia (stipend # 606658).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attachment Factor Cell-Systems Corporation 4Z0-210
Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human Cell-Systems Corporation ACBRI 376
Complete medium Cell-Systems Corporation 4Z0-500 Supplemented with CSC JetFuel
Complete serum-free medium Cell-Systems Corporation SF-4Z0-500 Supplemented with CSC RocketFue
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Endothelial cells growth supplement (from bovine origin) Sigma-Aldrich E2759-15MG
External silicone tubing Watson-Marlow 913.A080.016 Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall
Foetal calf serum Lonza 14-501F
Gentamycin sulfate Life Technologies 15750-060
Heparin sodium Pfizer 1,000 U/ml
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma-Aldrich H4875
Human brain microvascular endothelial cells Cell-Systems Corporation ACBRI 376
Internal silicone tubing Watson-Marlow 913.A032.016 Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall
L-Glutamine Life Technologies 25030
Mayer’s hematoxylin solution Amber Scientific MH
Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution HyClone Laboratories SH30244.01
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140
Rat collagen I Trevigen 3440-100-01 Cultrex brand
Tissue culture inserts Corning Life Sciences 3472 Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol. Dis. 37, 13-25 (2010).
  3. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  4. Vivien, D., Gauberti, M., Montagne, A., Defer, G., Touze, E. Impact of tissue plasminogen activator on the neurovascular unit: from clinical data to experimental evidence. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2119-2134 (2011).
  5. Stewart, P. A., Wiley, M. J. Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail--chick transplantation chimeras. Dev. Biol. 84, 183-192 (1981).
  6. Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325, 253-257 (1987).
  7. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
  8. Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathol. 122, 1-9 (2011).
  9. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin. Immunopathol. 31, 497-511 (2009).
  10. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100, 328-335 (2006).
  11. Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 59-127 (2005).
  12. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12, 1784-1792 (2012).
  13. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. Eur. Pharm. Sci. 12, 215-222 (2001).
  14. Hurwitz, A. A., Berman, J. W., Rashbaum, W. K., Lyman, W. D. Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells. Brain Res. 625, 238-243 (1993).
  15. Demeuse, P., et al. Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier. J. Neurosci. Methods. 121, 21-31 (2002).
  16. Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab. Invest. 85, 734-746 (2005).
  17. Cohen-Kashi Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in vivo and in vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  18. Kroll, S., et al. Control of the blood-brain barrier by glucocorticoids and the cells of the neurovascular unit. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1165, 228-239 (2009).
  19. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 312-328 (2008).
  20. Li, G., et al. Permeability of endothelial and astrocyte cocultures: in vitro blood-brain barrier models for drug delivery studies. Ann. Biomed. Eng. 38, 2499-2511 (2010).
  21. Antonic, A., Sena, E., Donnan, G., Howells, D. Human In Vitro Models of Ischaemic Stroke: a Test Bed for Translation. Transl. Stroke Res. 3, 306-309 (2012).
  22. Major, E. O., et al. Establishment of a line of human fetal glial cells that supports JC virus multiplication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1257-1261 (1985).
  23. Eugenin, E. A., Berman, J. W. Chemokine-dependent mechanisms of leukocyte trafficking across a model of the blood-brain barrier. Methods. 29, 351-361 (2003).
  24. Dehouck, M. P., et al. Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models. J. Neurochem. 58, 1790-1797 (1992).
  25. Perriere, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).
  26. Niego, B., Samson, A. L., Petersen, K. U., Medcalf, R. L. Thrombin-induced activation of astrocytes in mixed rat hippocampal cultures is inhibited by soluble thrombomodulin. Brain Res. 1381, 38-51 (2011).
  27. Ma, S. H., Lepak, L. A., Hussain, R. J., Shain, W., Shuler, M. L. An endothelial and astrocyte co-culture model of the blood-brain barrier utilizing an ultra-thin, nanofabricated silicon nitride membrane. Lab Chip. 5, 74-85 (2005).
  28. Niego, B., Freeman, R., Puschmann, T. B., Turnley, A. M., Medcalf, R. L. t-PA-specific modulation of a human BBB model involves plasmin-mediated activation of the Rho-kinase pathway in astrocytes. Blood. , (2012).
  29. Deli, M. A., Abraham, C. S., Niwa, M., Falus, A. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm. Res. 52, 39-40 (2003).
  30. Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nat. Med. 14, 731-737 (2008).
  31. Yepes, M., et al. Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein. J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).
  32. Abu Fanne, R., et al. Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity. Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).
  33. Wang, X., et al. Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator. Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).
  34. Wang, X., et al. Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke. Stroke. 35, 2726-2730 (2004).
  35. Donnan, G. A., et al. How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke. Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).
  36. Acheampong, P., Ford, G. A. Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).
  37. Derex, L., Nighoghossian, N. Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).
  38. Garber, K. Stroke treatment--light at the end of the tunnel. Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).
  39. Liebeskind, D. S. Reversing Stroke in the 2010s. Stroke. 40, 3156-3158 (2009).
  40. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  41. Song, L., Pachter, J. S. Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).
  42. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).

Tags

Bioteknologi Blood-hjerne barrieren modell cellekultur astrocytter hjerne endotelceller insert membraner
Forbedret fremgangsmåte for fremstilling av en human cellebasert kontakt Model of the Blood-Brain Barrier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Niego, B., Medcalf, R. L. Improved… More

Niego, B., Medcalf, R. L. Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier. J. Vis. Exp. (81), e50934, doi:10.3791/50934 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter