Summary
Establecimiento de modelos humanos de la barrera sangre-cerebro (BBB) puede beneficiar a la investigación de las condiciones del cerebro asociadas con la acreditación fracaso. Se describe aquí una técnica mejorada para la preparación de un modelo de acreditación de contacto, que permite que el cocultivo de astrocitos humanos y las células endoteliales del cerebro en los lados opuestos de una membrana porosa.
Abstract
La barrera sangre-cerebro (BBB) comprende impermeables pero adaptables capilares del cerebro que controlan estrechamente el medio ambiente cerebro. El fallo de la BBB ha sido implicado en la etiología de muchas patologías cerebrales, creando una necesidad para el desarrollo de humano en modelos in vitro de BBB para ayudar en la investigación clínica relevante. Entre los numerosos modelos de BBB descritas hasta ahora, una estática (sin flujo), en contacto con la acreditación modelo, donde los astrocitos y las células endoteliales del cerebro (BEC) se co-cultivaron en los lados opuestos de una membrana porosa, surgió como un sistema todavía auténtica simplificado para simular el acreditación con capacidad de cribado de alto rendimiento. Sin embargo, la generación de dicho modelo presenta unos desafíos técnicos. Aquí se describe un protocolo para la preparación de un modelo de acreditación contacto humano que utiliza una combinación nueva de BEC humanos primarios y astrocitos humanos inmortalizados. Concretamente, se detalla un método innovador para la célula-siembra en inserciones invertidas, así como especificar la insercióntécnicas y tinción camisetas ejemplifican cómo usamos nuestro modelo para la investigación relacionada con la acreditación.
Introduction
La acreditación es una interfaz especializada entre la circulación de la sangre periférica y el sistema nervioso central, de manera crucial responsable del mantenimiento de la hemostasia cerebro. Se compone de células cerebrales distintas endoteliales microvasculares (BEC) que son funcionalmente influenciada por pocos componentes celulares y acelulares (a continuación) para formar una puerta de entrada ajustado y dinámico en el cerebro. En condiciones fisiológicas la acreditación restringe el paso de las células sanguíneas, componentes del plasma y sustancias nocivas, todos potencialmente neurotóxico, en el cerebro. En paralelo, la acreditación intercambia selectivamente iones y nutrientes (glucosa y amino-ácidos) clave y los productos de desecho metabólicos entre el cerebro y la circulación para mantener con precisión el entorno de 1,2 cerebro. En los últimos años cada vez es más evidente que el fallo de la BBB se produce en una variedad de patologías cerebrales crónicas, tales como enfermedades neurodegenerativas o relacionados con la inflamación (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer y multiple esclerosis, respectivamente) 3, así como en condiciones agudas como accidente cerebrovascular isquémico 4.
Las propiedades únicas de BBB de las células endoteliales del cerebro (BEC) se inducen en gran medida por su entorno cerebral 5, y en particular por los astrocitos 6,7. Hay una creciente comprensión de que otros tipos de células, tales como pericitos 8, neuronas y microglia 1,3, así como la membrana basal 9, apoyan BEC y juntos forman una unidad funcional denominada "unidad neurovascular" (NVU), que al mismo tiempo parejas neuronal demandas metabólicas a sus capilares que suministran 10.
La participación de la acreditación en situaciones patológicas subyace numerosos intentos de desarrollar modelos in vitro de BBB para ayudar en la investigación relacionada con la acreditación 11,12. Estos modelos tienen como objetivo imitar lo más cerca posible in vivo características de BBB de acuerdo con el principio NVU. In vitro 13, 14 humana, de rata 15, ratón 16, y porcinos 17,18 orígenes), cultivadas en una membrana porosa junto con astrocitos de apoyo (ampliamente revisado por Deli et al. 2005 11).
Los astrocitos pueden ser cultivadas en condiciones sin contacto en la parte inferior de un pocillo de cultivo tisular, separado de las BEC (cultivadas en la superficie superior de la membrana) por el medio de cultivo todavía la comunicación con las BEC a través de factores solubles 16. En modelos más avanzados que mejor se asemejan a la estructura anatómica de la BBB in vivo, los astrocitos se mantienen en condiciones de contacto y se cultivaron directamente en el lado opuesto de la membrana en las proximidades de las BEC 13,15,17 (Figura 1). Esta configuración permite el contacto físico entre BEC y astrocitos, establecido cuando el proyecto astrocitossus procesos a través de la membrana porosa. Es importante destacar que, para un verdadero contacto a producirse los poros debe ser ≥ 1μm de diámetro, desde astrocíticos-pies finales no pueden pasar a través de tamaños de poro más pequeños (es decir, 0,4 micras) 14,15. En particular, los sistemas de contacto de BBB se demuestran en algunos estudios para ser superior a sus homólogos sin contacto con respecto a su resistencia eléctrica trans-endotelial (TEER) y los valores de permeabilidad del endotelio de diversos trazadores 13,17,18. Una dimensión adicional de flujo de medios de comunicación se añadió recientemente en un número de modelos in vitro de BBB para aplicar fuerzas de cizallamiento al endotelio para más cerca de la simulación de la vasculatura del cerebro 12,19.
Un obstáculo técnico a superar cuando se genera un modelo de contacto acreditación es la siembra de los astrocitos en contra de la gravedad sobre la superficie abluminal de la membrana porosa. Protocolos anteriores 13,20, donde los astrocitos se sembraron en simplemente una gota de medios de comunicación en la parte superior de una eninserto verted, permitió veces sólo a corto siembra (es decir, 10 min 13 o 2 horas 20) que se encuentra en nuestras manos para ser insuficiente para la fijación celular adecuada. El uso de este método básico, un período más largo de fijación de astrocitos requiere un constante monitoreo de los insertos mediante la apertura frecuente de la incubadora (causar fluctuaciones en la temperatura, el pH y la humedad) y también es propensa a la siembra de células irregular debido a las fugas de los medios de comunicación a través de los poros, especialmente Si se emplean poros de más de 1 m.
Aquí se describe un protocolo general para la preparación de un modelo de contacto BBB. Nuestro procedimiento incluye un método alternativo para la célula-siembra en inserciones invertidas, que aborda las limitaciones mencionadas anteriormente. El método permite la adherencia sin perturbaciones de los astrocitos en la superficie de la membrana abluminal, en un incubador equilibrado, durante un período prolongado de tiempo. Como resultado, se consigue una siembra uniforme de los astrocitos que aumenta la calidad de barreray minimiza las variaciones de permeabilidad basales entre insertos.
A medida que el uso de células humanas es importante para la investigación humana correspondiente 21, que, además demostramos en este artículo la utilización específica de una novedosa combinación de las BEC humanos primarios e inmortalizado astrocitos humanos para el establecimiento de un modelo de acreditación de contacto humano con una alta capacidad de rastreo de . Desde la visualización de las células en membranas porosas puede ser, nosotros también las técnicas de tinción de detalles difíciles que pueden ayudar en la determinación de la confluencia y la morfología de las células de las membranas porosas. Finalmente, se ejemplifican cómo nuestro modelo de acreditación humano puede ser utilizado para examinar el efecto de tipo activador del plasminógeno tisular (t-PA) - una enzima para disolver coágulos que sirve como una opción de tratamiento único para el accidente cerebrovascular isquémico agudo - en la acreditación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultivos Celulares (3-7 días antes de la acreditación de la Asamblea)
1.1. Primaria células cerebrales humanas endoteliales microvasculares (BEC)
BEC se obtuvieron comercialmente. Las células fueron producidas por disociación dispasa de tejido normal corteza cerebral humana y presenten en estado congelado en el paso 3 (<12 duplicaciones de la población).
- Sustrato: vasos Escudo de cultivo de tejidos con "factor de unión" de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Mantenimiento celular: Mantener BEC en medio completo que contiene suero. Para la experimentación, la cultura BEC en un medio libre de suero completo. Mantener las células en un humidificado 5% de CO 2, 21% de O 2 incubadora a 37 ° C
Nota: Como alternativa a los reactivos especializados, 0,1% (w / v) de solución de gelatina puede servir como un reactivo de recubrimiento, mientras que DMEM/F-12 complementado con 15 mM de HEPES, 10% (v / v) de suero de ternera fetal (FCS), 2 mM de L-glutamina, 50 g/ Ml de gentamicina, 20 mg / ml de heparina y 20 mg de suplemento de crecimiento de células endoteliales / ml se pueden utilizar para el mantenimiento de BEC. - Sub-cultivo para la experimentación: BEC confluentes Split en una proporción de 01:03-01:06, dependiendo de la hora prevista para el próximo uso (3-7 días). Cambie el medio de mantenimiento cada 3 días. Utilice BEC hasta 15 pasajes.
1.2. SVG humano fetal astrogliales Cell-line
Células astrogliales SVG humanos fetales 22 se derivaron originalmente de cultivos primarios de cerebro fetal humano transformado con replicación deficiente virus de simio 40.
- Mantenimiento: células de cultivo de SVG en medio esencial mínimo con solución salina equilibrada de Earle suplementado con 20% (v / v) de FCS (mismo porcentaje de suero utilizada para mantener sus células primarias de los padres 22), 2 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina. Mantener las células en un humidificado 5% de CO 2, 21% de O2
- Sub-cultivo para la experimentación: IVS confluentes Split en una proporción de 1:5 a 1:10, dependiendo de la hora prevista para el próximo uso (3-7 días). La eliminación de la tripsina no es necesario debido al alto contenido de suero en el medio. Cambie el medio cada 3 días. Utilice SVGs hasta 20 pasajes.
2. Asamblea y cocultivo del humano in vitro BBB Modelo (día 0)
Comentario: El humana in vitro modelo de contacto acreditación se preparó de acuerdo con los protocolos publicados 13,23, con modificaciones.
2.1. Recubrimiento de las inserciones
- Coloque los insertos de cultivo de tejidos (6,5 mm de diámetro con poliéster membrana porosa, 3 micras de tamaño de poro) en los pocillos de la placa de 24 pocillos se suministra. Cubra la superficie luminal de los insertos
Nota: La membrana basal de los capilares del cerebro no contiene colágeno I, pero principalmente lamininas, isoformas de colágeno tipo IV, nidogens y proteoglicanos heparán sulfato 9. Por esta razón, algunos investigadores utilizan agentes de revestimiento tales como colágeno IV, fibronectina 13, o Matrigel (BD Biosciences) 16 para una más auténtico modelado de la acreditación.
2.2. SVGs Siembra en la parte inferior (Abluminal) superficie de la membrana
- Invierta la inserción y ajuste suavemente por el borde de la membrana porosa de un pequeño trozo de tubo de silicona elástica ("tubing externa"; ~ 10 mm de largo, 8 mm de diámetro interior y 1,6 mm de pared), básicamente la creación de un nuevo muy por encima de la superficie abluminal (Figura 2A).
- La parte inferior de la Nee insertods a sellar para evitar la fuga de los medios de comunicación. En primer lugar, preparar un enchufe (Figura 2A y 2B) hecha de un tubo de silicona (denominado "tubo interno"; ~ 8 mm de largo, 3,2 mm de diámetro interno, 1,6 mm de pared; Figura 2B), sellado en un extremo con un cono de sellado de plástico (~ 3 mm de largo; preparado por el corte de la parte inferior de una reacción en cadena de 0,2 ml de la polimerasa (PCR) del tubo; Figura 2B). Este cono no sólo sella el lumen de los tubos internos, pero también amplía su borde más apretado para encajar en el inserto. A continuación, utilizando unas pinzas esterilizadas, inserte el tapón de silicona en la cavidad luminal y avanzar hasta que llegue hasta a ~ 1-2 mm de la membrana (Figura 2A).
- A continuación, las semillas 4 x 10 4 células SVG en 200 medio de mantenimiento SVG l (SEcción 1.2.2 anterior) directamente en la silicona muy por encima de la superficie de la membrana abluminal (Figura 2A). Permitir SVGs se adhieran durante al menos 4 horas en la incubadora.
Nota: Para mantener la esterilidad transportar los insertos montados entre dos placas de 6 pocillos (una placa invertida sobre la otra; Figura 2C) para reducir al mínimo la exposición al aire sin filtrar durante el procedimiento. Tubos de silicona y tapones se lavan en etanol y en autoclave para su uso posterior.
Nota: Utilice tapones (apartado 2.2.2) sólo para plaquitas con poro de la membrana de tamaño mayor que 1 m. Las membranas con poros de diámetro ≤ 1 m rara vez se escapan y sólo requieren la instalación de la tubería de silicona externo (sección 2.2.1). Además, algunos agentes de recubrimiento que no sean de colágeno I (véase la nota a la sección 2.1) pueden impedir leakiness incluso a través de 3 micras poros. Determinar esto empíricamente. - Con el fin de supervisar el estado de cumplimiento de los astrocitos, sembrar en paralelo enun estándar de 96 pocillos un volumen idéntico de la célula astrocito-suspensión. Este pozo tiene la misma superficie que el inserto de 6,5 mm (0,33 cm 2) y permite la fácil visualización de las células por microscopía de contraste de fase de la membrana de inserción. Cuando se observa la adherencia suficiente de la astrocitos en el control de 96 pocillos, los astrocitos han adecuadamente adherido también a la membrana de inserción.
- Cuando los astrocitos se han adherido suficientemente en el control de 96 pocillos, transferir los conjuntos de inserto a la campana de cultivo de tejido (ver nota anterior) y retire suavemente el tubo de silicona externa y tapones. Inserciones Volver a la orientación normal (es decir, en posición vertical) en los pocillos suministrados contienen 800 l / pocillo de medio de mantenimiento BEC (sección 1.1.2).
2.3. Siembra de BEC en la Cámara por encima de los astrocitos Luminal
Seed 2x10 4 BEC en 200 l sobre la superficie luminal de colágeno recubierto y devolver la inseguridadRTS en la incubadora.
2.4. Cocultivo
Cocultivo los insertos SVG / BEC sembrados durante 3 días en medio BEC sin cambio de medio antes de la experimentación.
3. La experimentación con el modelo de acreditación Humano (Día 3)
- Para estimular las células in vitro primera colada de BBB en los medios de comunicación mediante la sustitución abluminal y luminal con 600 l y 100 l de medio libre de suero BEC, respectivamente.
- Aspirar el medio luminal de nuevo y reemplazar con 100 l de medio libre de suero con agentes estimulantes.
Nota: Si es necesaria la estimulación de la cámara abluminal (para activar la acreditación vitro desde el compartimiento astrocítica), aspirar el medio abluminal y reemplazar con 600 ul de medio libre de suero con agentes estimulantes. - Pon a prueba cada grupo experimental en tres ejemplares (por lo tanto, si no se realiza la estimulación luminal, que requiere 3 x 100 l, se recomienda diluir la re agentes a sus concentraciones finales en 350 l de medio libre de suero por grupo para reducir al mínimo los errores de pipeteo entre pozos).
- Realizar paracelular estándar y / o ensayos de permeabilidad transcelular de trazadores marcados 16,24 (para el último usamos isotiocianato de fluoresceína (FITC) y conjugado con albúmina) y / o la medición de la TEER 13,16,25 como se describe anteriormente.
Para tener en cuenta las fluctuaciones en la permeabilidad de la línea de base entre los experimentos, analizar los cambios en la permeabilidad relativa a un inserto revestido sin células (que sirve como una referencia para la permeabilidad máxima) y al grupo tratado con vehículo usando la fórmula: Permeabilidad (% de max) = ( valor de permeabilidad de inserción experimental - valor promedio de la permeabilidad del grupo del vehículo) / (valor de permeabilidad de la inserción en blanco - el valor promedio de la permeabilidad del grupo del vehículo) X 100.
4. La visualización de las células en membranas porosas
nt "> Comentario: las células no teñidas en las membranas de inserción son difíciles de observar por contraste de fase o el contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía ya que la membrana es bastante opaca e interfiere con la transmisión de la luz Para hacer frente a este problema, hemos desarrollado diversos procedimientos de tinción de células en. inserciones, que mejoran en gran medida la apariencia de células en la membrana. Generalmente, las manchas de las membranas de inserción mientras que todavía unido a la pieza de inserción, en los pozos. Las membranas deben ser retirados sólo al final del procedimiento de tinción para los propósitos de montaje.4.1. Hematoxilina tinción
- Fijar insertos con helado 4% (w / v) paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS; NaCl 130 mM, 10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, pH 7,2) durante 20 min. Lavar una vez con PBS.
- Sumerja el inserto en solución de hematoxilina de Mayer 0,1% durante 2 min.
- Lave suavemente la boquilla con agua del grifo (sumergiendo las insert en un vaso que contiene el agua del grifo y pipetear suavemente el exceso de agua). Transferir el inserto a la solución de Scott agua del grifo (2 g / l de NaHCO3, 20 g / L MgSO4) durante ~ 20 s hasta que el color azul deseado desarrolla. Lave el inserto de nuevo con agua del grifo (punto 4.1.3). Una tinción de eosina opcional se puede introducir aquí por inmersión de la pieza de inserción en la solución de eosina 1% durante 10 s seguido por un lavado con agua del grifo.
- Aire secar la membrana de inserción. Usando un bisturí (corte alrededor del borde de la membrana) quitar la membrana y montarlo en un portaobjetos de vidrio para la imagen de campo claro
Nota: Si se utiliza di-N-butylphthalateinxylene (DPX) medio de montaje lavar el inserto con etanol al 100%, seguido de xileno antes de retirar y montar la membrana.
4.2. Microscopio Electrónico de Barrido (SEM)
- Fijar insertos con enfriado con hielo 4% (w / v) de PFA en PBS durante 20 min. Lavar tres veces en PBS.
- Post-fijar las membranas durante 30 min en 1% (w / v) Tetróxido de osmio en MQH 2 O.
- Lavar insertos en agua (sección 4.1.3) y se deshidratan en un gradiente creciente de etanol (50%, 70%, 90% durante 5 min cada uno, y luego 3 veces con etanol al 100% durante 10 minutos por intervalo).
- Tratar insertos deshidratados con una mezcla de hexametildisilazano (HMDS): etanol (1:2 y luego 2:1 para 5 min).
- Tratar insertos con 100% HMDS de 5 min, aire seco y almacenar en condiciones desecadas.
- Retire la membrana utilizando un bisturí (corte alrededor del borde de la membrana). Examine las membranas por microscopía electrónica de barrido.
4.3. Inmunofluorescencia
- Fijar insertos con enfriado con hielo 4% (w / v) de PFA en PBS durante 20 min, se lava una vez en solución salina tamponada con Tris (TBS; 50 mM de Tris-HCl, pH 7,6, NaCl 154 mM, 0,22 m filtrada).
- Realizar la inmunotinción de las células en la membrana de inserción como se ha descrito anteriormente 26.
- Retire la membrana utilizando un bisturí (corte alrededor del borde de la membrana) y montarlo en agdiapositiva lass con medio de montaje de fluorescencia. Examine membrana mediante microscopía de fluorescencia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Con el fin de establecer un modelo de contacto acreditación humana tuvimos que cultivar IVS y BEC en membranas porosas con un tamaño de poro de 3 micras, que se muestra para permitir el paso de astrocitos finales pies para el contacto con las células endoteliales 14,15,27,28. Una representación esquemática del modelo de contacto completa se ilustra en la Figura 1 (la ilustración de la izquierda). El principal desafío técnico presentado por un sistema de contacto es la necesidad de sembrar astrocitos contra de la gravedad en la superficie abluminal de la membrana. Hemos tenido éxito en esta tarea mediante la creación de principalmente una silicona extraíble bien en la parte superior de la superficie de la membrana abluminal, mientras que la prevención de fugas de los medios de comunicación con un tapón de silicona adicional insertado en la cavidad luminal (Figura 2). El método permitió un período óptimo, sin interrupción de la siembra de IVS (por lo menos 4 horas), que a su vez se convirtió fuertemente unido a la superficie porosa con la pérdida de células mínima. De hecho, 3 días después de la siembra de ambos SVGs y BEC aplicaciónespigado confluentes y cubierta de la membrana de manera uniforme, a juzgar por las imágenes de plantillas hematoxilina-manchado (ver sección 4.1, la figura 3A, paneles de la izquierda). Además, ambos tipos de células mantuvieron sus marcadores específicos de células en membranas porosas (un patrón de tinción difusa de la proteína ácida glial fibrilar en SVGs 22 y la expresión del factor de von Willebrand en los cuerpos Wiebel-Palade y vesículas citoplasmáticas en las BEC; Figura 3A, paneles de la derecha) , observada por inmunofluorescencia (sección 4.3). Además, a partir de imágenes SEM (sección 4.2) se hizo evidente que el IVS y CEBs fueron capaces de crecer directamente sobre los poros de la membrana (Figura 3A, paneles de media, cabezas de flecha), un fenómeno que contribuye artificialmente a la función de la barrera física de in vitro acreditación contacto models1 3,28. Funcionalmente, en la presencia de IVS el valor de la permeabilidad endotelial (Pe) 16,24 fluorescente de albúmina de 28 ImproVed ~ 4 veces en relación con las BEC sola (P <0,01, n = 4), desde 0,574 ± 0,199 x10 -3 a 0,126 ± 0,028 x10 -3 cm / min sin o con astrocitos (IVS), respectivamente. Estos resultados albúmina Pe son comparables a otro estudio que utilizó las BEC ratón con células de glioma C6 de rata 29. Nuestro protocolo de siembra se aplicó con éxito también a aisló recién BEC ratón primarios y astrocitos primarios de ratón cultivadas en 1 m poros. En este modelo de contactos de ratón se obtuvo una barrera física razonable para el pequeño trazador de fluoresceína de sodio hidrófilo (Pe = 0,83 ± 0,22 x 10 -3 cm / min, n = 3). Por lo tanto, nuestro método de siembra se puede extender para la preparación de modelos de BBB de otras especies.
La característica más fundamental de un modelo de contactos de acreditación es la capacidad de los astrocitos para proyectar sus pies finales a través de los poros de la membrana para ponerse en contacto físicamente las células endoteliales. Unos pocos estudios hicieron uso de la microscopía electrónica de barrido para identificar astrocitos procesos que pasan de la superficie de la membrana abluminal (donde los astrocitos se siembran) a la superficie luminal, como una prueba de principio de que el contacto entre los astrocitos y la CE es plausible 14,15,27. Después de estos estudios nos imaginada por SEM de la membrana luminal después de la siembra SVGs en la superficie abluminal. Como se muestra en la Figura 3B, los astrocitos (SVG) finales pies se podían observar que pasa a través de 3 micras poros en el compartimiento luminal, lo que confirma que el contacto puede potencialmente existir entre IVS y BEC sembró en los poros de esta dimensión. Colectivamente, nuestro método de siembra era simple, eficiente, y cedió un auténtico modelo de contacto BBB.
Hemos utilizado nuestro modelo de acreditación de contacto humano para explorar el efecto de t-PA, un agente fibrinolítico, por el BBB. Un número de artículos han sugerido que el t-PA puede ser capaz de inducir la apertura de la BBB durante su administración intravenosa para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico agudo 30-33. Esta interacción entre el t-PA y la acreditación puede contribuir a complicaciones hemorrágicas asociadas con trombólisis inducida por t-PA 4,34,35 y es por tanto un tema de los esfuerzos de investigación actuales. Nuestros estudios in vitro confirman que el t-PA de hecho aumentó la permeabilidad de la BHE intacta en una concentración-(Figura 4A) y de manera dependiente del tiempo (Figura 4B), que eran tanto dentro de un rango farmacológicamente relevante 36,37. Además, los cambios morfológicos drásticos de astrocitos SVG se pudieron observar en las membranas porosas después de la exposición a la t-PA (Figura 4 C), lo que sugiere que las respuestas de los astrocitos a t-PA son la base inducida por t-PA acreditación apertura. La investigación subsiguiente identificó que el t-PA estimula los astrocitos a través de la activación de plasminógeno - su sustrato natural - en la plasmina proteasa potente y de amplio espectro. Además, el t-PA y plasmina se encontraron para activar la quinasa Rho (ROCK) de señalización en los astrocitos, y el bloqueo de la vía ROCA impedido inducida por t-PA acreditación abertura 28. Este es un buen ejemplo de cómo la utilización de modelos de BBB puede conducir a la identificación de nuevos procesos biológicos y las oportunidades terapéuticas.
Figura 1. Configuraciones basadas Insertar-vitro de modelos en BBB. Representaciones esquemáticas de estática (sin flujo) en los modelos de BBB vitro. En los modelos básicos de las células endoteliales del cerebro (EC; naranja) se cultivan solamente en una membrana porosa (amarillo). En más avanzados enfoques ECs se co-cultivaron con astrocitos (verde). Los astrocitos pueden ser cultivadas ya sea en condiciones de no-contacto, en la parte inferior del pozo (derecha), o en la superficie abluminal de la membrana porosa en condiciones de contacto (izquierda).nk "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. Un método mejorado para la siembra de los astrocitos en la superficie de la membrana abluminal para la preparación de un modelo de contacto BBB. (A) La inserción es invertida, un pequeño trozo de tubo de silicona ("tubing externo") se reunió en torno a su perímetro y un tapón de silicona encaja en la cavidad luminal. Este conjunto crea un pozo en la parte superior de la superficie abluminal y evita el escape de medios a través de los poros. Las células pueden ser sembradas en el pocillo y se dejaron adherir en reposo durante largos períodos de tiempo (derecha) (B) El tapón de silicona se preparó a partir de otra pieza de tubo de silicona ("tubo interno"), sellada en un extremo con un cono de sellado que se inserta dentro de su cavidad. (C) Una vez sembrada, lainsertos montados son transportados entre dos placas de 6 pocillos (una placa invertida sobre la otra) para reducir al mínimo el riesgo de contaminación. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. La visualización de las células endoteliales del cerebro (BEC) y astrocitos en un 3 micras membrana porosa A) Hematoxilina (paneles de la izquierda), el microscopio electrónico de barrido (SEM;. Paneles centrales) y las imágenes de inmunofluorescencia (paneles de la derecha) de IVS (en la superficie abluminal, 40000 por 6.5 mm de inserción, paneles superiores) y el BEC (20.000 por 6,5 mm de inserción en el colágeno I-revestido, superficie luminal, paneles inferiores) se cultiva en una membrana porosa 3 m por 3 días (sin cocultivo). Ambos tipos de células alcanzan la confluencia dentro de este tiempo FRAme y mantener sus marcadores específicos de células (proteínas ácida glial fibrilar (GFAP) para SVG y el factor de von Willebrand (vWF) en los cuerpos Wiebel-Palade de BEC, paneles de la derecha) en la membrana. Puntas de flecha en los paneles de SEM muestran aún más la capacidad de ambos tipos de células para crecer directamente sobre y cubrir los poros, mientras que las flechas representan los núcleos celulares. Las barras de escala en las imágenes SEM representan 25 micras (arriba) o 20 m (inferior). Las barras de escala en las imágenes de inmunofluorescencia representan 40 micras. (B) imágenes de SEM de SVG finales pies pasan a través de 3 micras poros en el luminal (BEC) superficie 3d después de la siembra de IVS (solo) sobre la superficie de la membrana abluminal. Estas imágenes validan el potencial para el desarrollo de un verdadero contacto entre el IVS y BEC en nuestro modelo de acreditación humano. Las barras de escala representan 6 micras en el panel izquierdo y 12 micras en el panel derecho. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 4. de tipo activador del plasminógeno tisular aumento (t-PA) mediada-en permeabilidad de la BHE es impulsado por los cambios morfológicos de los astrocitos. (A) se añadieron concentraciones crecientes de t-PA a la cámara de luminal de la humana in vitro la acreditación y la permeabilidad se evaluó 24 horas más tarde por el paso de la albúmina fluorescente en la cámara de abluminal. t-PA aumenta permeabilidad de la BHE de una manera dependiente de la concentración. n = 4-6 para todos los grupos, pero t PA-10 nM, donde n = 2. *** P <0,001 en comparación con todos los demás grupos por ANOVA de una vía con Newman-Keuls post hoc. (B) t-PA (1 M) se añadió a la cámara luminal de lo humano envitro acreditación durante 8 horas y 24 horas antes de la evaluación de la permeabilidad. Como se muestra, mediada por t-PA acreditación de apertura ya fue sustancial después de 8 horas de estimulación (70,26% del máximo a las 24 horas), pero un mayor aumento se observó a las 24 horas. n = 6, *** P <0,001, ** P <0.01compared a cero por ANOVA de una vía con Newman-Keuls post hoc. En ambos (A) y (B), los puntos de bares / datos representan la media ± SEM. (C) Las imágenes de campo brillante representativos de SVGs teñidas con Hematoxilina (paneles superiores) o micrografías electrónicas de barrido de IVS (paneles inferiores) en las membranas de inserción de poliéster (3 m de tamaño de poro) 24 h post-tratamiento con vehículo o t-PA (1 M). Cambios morfológicos inducidos por el t-PA pronunciada y alteración de la integridad de la monocapa SVG se pueden observar, lo que sugiere que las respuestas de los astrocitos a t-PA subyacen al efecto de t-PA en la permeabilidad de la BHE. Las imágenes son representativos de dos experimentos independientes. Las barras de escala en las imágenes SEM repreenviado 61 micras (izquierda) o 120 m (derecha). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La investigación médica en patologías cerebrales sufre mucha dificultad de traslación. En el área de accidente cerebrovascular isquémico agudo, por ejemplo, muchos fármacos que mostraron una gran promesa en modelos animales fallaron en la clínica 38,39. Las razones de estos resultados decepcionantes son diversos e incluyen la infidelidad de los sistemas de pruebas preclínicas con el escenario de derrame cerebral humana y la exageración de los resultados obtenidos a partir de estudios en animales 21. Una de las estrategias para mejorar el valor predictivo de los hallazgos preclínicos para la fase clínica es el desarrollo adicional de los derechos humanos de las células basadas en modelos in vitro, los cuales pueden proporcionar herramientas potentes y rentables para la selección de nuevos fármacos y mecanismos y permitir una mejor centrarse en avenidas clínicamente relevantes 21. Dentro de este contexto, se describe en detalle el proceso llevado a cabo en nuestro laboratorio para el establecimiento de un modelo de contacto acreditación humana utilizando una combinación nueva de humana inmortalizada astrocitos (IVS) y BEC primarios humanos para el examen de los fenómenos relacionados con el accidente cerebrovascular.
En condiciones estáticas (sin flujo), póngase en contacto con los modelos de BBB (Figura 1) se parecen mejor la estructura anatómica en vivo y están demostrado ser superior en sus propiedades de barrera 13,17,18. Es importante destacar que, el verdadero contacto entre BEC y astrocitos se produce sólo en las membranas con mayor diámetro de poro (≥ 1 micras), que permite el paso de-pies terminales astrocíticos y la posterior inducción de endurecimiento (menos permeables) monocapas BEC 14,15,27. Sin embargo, la siembra de los astrocitos en insertos invertidas con mayor tamaño de poro - el elemento de núcleo técnica en la preparación de un modelo de contacto acreditación - presenta un desafío técnico doble, ya que además de el volumen del medio limitado que puede ser añadido a los invertidas 6,5 mm inserciones (~ 50 ul), las membranas también son propensos a las fugas de medio debido a su gran diámetro de poro. Estas limitaciones pueden hacer la astsiembra rocytic torpe e incoherente.
Nuestra técnica innovadora para la siembra de los astrocitos en inserciones invertidas con 3 micras poros ofrece una solución sencilla y eficaz para este procedimiento. Mediante la creación de un extraíble, de silicona impermeable bien en la parte superior de la superficie abluminal hemos mejorado en gran medida la capacidad de los astrocitos 'para adherirse correctamente a la membrana porosa. Esto permite el crecimiento uniforme de los astrocitos en la superficie abluminal y permite la preparación reproducible de un gran número de insertos para la detección simultánea de muchos parámetros experimentales (por ejemplo, nuestra cribado realizado recientemente del efecto de cinco plasminógeno-activadores diferentes sobre la acreditación 28). Por lo tanto, a pesar de su sencillez, nos encontramos el método para mejorar drásticamente el rendimiento y la calidad de nuestra investigación el uso de este modelo de contacto BBB. Una limitación de nuestro método de siembra de astrocitos es el requisito para la manipulación manual adicional de los insertos, que albergan delgada (10 μm de espesor) membranas. Manipulación excesiva o áspera puede causar micro desgarres o daño a la membrana. Por lo tanto, el uso de tubo de silicona suave y flexible es esencial, ya que el montaje / desmontaje tiene que ser realizada con una fuerza mínima.
En cuanto a su concepto general, nuestro modelo de acreditación humano fue establecida sobre la base de un protocolo descrito previamente 14,23 que originalmente utilizó células humanas primarias. A pesar de su superioridad para la acreditación de modelado, un inconveniente en el empleo de las células cerebrales humanas primarias es la imposibilidad de acceder rutinariamente tejido cerebral humano vivo para la producción regular de las BEC primarios y astrocitos y / o los costos involucrados en la obtención comercialmente ellos. Dado que muchos modelos de BBB sustituyen con éxito los astrocitos primarios con astrocitos inmortalizados (por ejemplo con una células de glioma C6 de rata 29), era razonable emplear astrocitos SVG 22 como una novela, opción abundante y rentable para el modelado de la acreditación humano. La capacidad de IVS ainfluir positivamente en la función de barrera BEC validado, en principio, su idoneidad para los estudios de BBB. Por el contrario, se optó por mantener las BEC primarios en nuestro modelo de acreditación por su papel fundamental en la acreditación en vivo 1,2,9. Es importante destacar que el cultivo prolongado de BEC primarios puede dar lugar a la desdiferenciación y el deterioro de su fenotipo acreditación específica. Este hecho puede ser evidente en nuestro sistema por un lugar altos valores de permeabilidad endoteliales para la albúmina. Por esta razón, hemos utilizado nuestro modelo principalmente en forma relativa 28 (Figura 4), teniendo en cuenta su elevada permeabilidad basal. Si se desea una muy apretado monocapa BEC humana la función de barrera puede mejorarse aún más mediante la adición de productos químicos tales como la hidrocortisona glucocorticoide 17 o AMP cíclico con inhibidores de la fosfodiesterasa 13. BEC humanas inmortalizadas, tales como la línea celular hCMEC/D3 40, también podrían ser empleados por su capacidad para mantener una mejor TIuniones ght en el tiempo. Sin embargo, BEC líneas celulares a menudo muestran cualidades de barrera reducida en comparación con los de bajo pasaje principal BEC 41,42 y necesita ser cuidadosamente considerada debido a otros cambios potenciales (es decir, la expresión alterada de los receptores de la superficie celular).
Colectivamente, nuestra modificación del tipo de célula de los astrocitos (es decir, el empleo de IVS) y la mejora sustancial para el protocolo de siembra de astrocitos resultó en la generación de una, fácil de montar y auténtico modelo de acreditación contacto humano reproducible. Teniendo en cuenta sus limitaciones, este sistema puede servir como una herramienta útil para la investigación in vitro no sólo de accidente cerebrovascular isquémico agudo, como lo ejemplificado aquí 28, sino también de varias otras patologías cerebrales que implican la modulación de la BBB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue financiado por subvenciones concedidas a RLM de la Salud y medicina Consejo de Investigación Nacional de Australia (subvención # 606658).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attachment Factor | Cell-Systems Corporation | 4Z0-210 | |
| Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Complete medium | Cell-Systems Corporation | 4Z0-500 | Supplemented with CSC JetFuel |
| Complete serum-free medium | Cell-Systems Corporation | SF-4Z0-500 | Supplemented with CSC RocketFue |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Endothelial cells growth supplement (from bovine origin) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| External silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A080.016 | Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| Foetal calf serum | Lonza | 14-501F | |
| Gentamycin sulfate | Life Technologies | 15750-060 | |
| Heparin sodium | Pfizer | 1,000 U/ml | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | H4875 | |
| Human brain microvascular endothelial cells | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Internal silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A032.016 | Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Mayer’s hematoxylin solution | Amber Scientific | MH | |
| Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution | HyClone Laboratories | SH30244.01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Rat collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | Cultrex brand |
| Tissue culture inserts | Corning Life Sciences | 3472 | Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size |
References
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
- Vivien, D., Gauberti, M., Montagne, A., Defer, G., Touze, E. Impact of tissue plasminogen activator on the neurovascular unit: from clinical data to experimental evidence. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2119-2134 (2011).
- Stewart, P. A., Wiley, M. J. Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail--chick transplantation chimeras. Dev. Biol. 84, 183-192 (1981).
- Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325, 253-257 (1987).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E.
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathol. 122, 1-9 (2011).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin. Immunopathol. 31, 497-511 (2009).
- Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100, 328-335 (2006).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 59-127 (2005).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12, 1784-1792 (2012).
- Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. Eur. Pharm. Sci. 12, 215-222 (2001).
- Hurwitz, A. A., Berman, J. W., Rashbaum, W. K., Lyman, W. D. Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells. Brain Res. 625, 238-243 (1993).
- Demeuse, P., et al. Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier. J. Neurosci. Methods. 121, 21-31 (2002).
- Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab. Invest. 85, 734-746 (2005).
- Cohen-Kashi Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in vivo and in vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
- Kroll, S., et al. Control of the blood-brain barrier by glucocorticoids and the cells of the neurovascular unit. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1165, 228-239 (2009).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 312-328 (2008).
- Li, G., et al. Permeability of endothelial and astrocyte cocultures: in vitro blood-brain barrier models for drug delivery studies. Ann. Biomed. Eng. 38, 2499-2511 (2010).
- Antonic, A., Sena, E., Donnan, G., Howells, D. Human In Vitro Models of Ischaemic Stroke: a Test Bed for Translation. Transl. Stroke Res. 3, 306-309 (2012).
- Major, E. O., et al. Establishment of a line of human fetal glial cells that supports JC virus multiplication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1257-1261 (1985).
- Eugenin, E. A., Berman, J. W. Chemokine-dependent mechanisms of leukocyte trafficking across a model of the blood-brain barrier. Methods. 29, 351-361 (2003).
- Dehouck, M. P., et al. Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models. J. Neurochem. 58, 1790-1797 (1992).
- Perriere, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).
- Niego, B., Samson, A. L., Petersen, K. U., Medcalf, R. L. Thrombin-induced activation of astrocytes in mixed rat hippocampal cultures is inhibited by soluble thrombomodulin. Brain Res. 1381, 38-51 (2011).
- Ma, S. H., Lepak, L. A., Hussain, R. J., Shain, W., Shuler, M. L. An endothelial and astrocyte co-culture model of the blood-brain barrier utilizing an ultra-thin, nanofabricated silicon nitride membrane. Lab Chip. 5, 74-85 (2005).
- Niego, B., Freeman, R., Puschmann, T. B., Turnley, A. M., Medcalf, R. L. t-PA-specific modulation of a human BBB model involves plasmin-mediated activation of the Rho-kinase pathway in astrocytes. Blood. , (2012).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Niwa, M., Falus, A. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm. Res. 52, 39-40 (2003).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nat. Med. 14, 731-737 (2008).
- Yepes, M., et al. Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein. J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).
- Abu Fanne, R., et al. Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity. Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).
- Wang, X., et al. Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator. Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).
- Wang, X., et al. Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke. Stroke. 35, 2726-2730 (2004).
- Donnan, G. A., et al. How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke. Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).
- Acheampong, P., Ford, G. A. Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).
- Derex, L., Nighoghossian, N. Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).
- Garber, K. Stroke treatment--light at the end of the tunnel. Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).
- Liebeskind, D. S.
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
- Song, L., Pachter, J. S. Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).
- Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).
