Drosophila larver er et attraktivt modellsystem for levende avbildning på grunn av deres gjennomskinnelig skjellaget og kraftige genetikk. Denne protokollen beskriver hvordan du kan utnytte en single-layer PDMS enhet, kalt 'larve chip "for levende avbildning av cellulære prosesser i nevroner av 3 rd instar Drosophila larver.
Live-avbildning er en viktig teknikk for å studere cellebiologiske prosesser, men dette kan være utfordrende i levende dyr. Den gjennomsiktige cuticle av Drosophila larven gjør det til et attraktivt modellorganisme for live imaging studier. Men, er en viktig utfordring for live imaging teknikker for å invasivt immobilisere og plassere et dyr på mikroskopet. Denne protokollen presenterer en enkel og lett å bruke metoden for å immobilisere og bildebehandling Drosophila larver på en polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic enhet, som vi kaller den "larve chip". Larvene brikken består av en tettsittende PDMS mikrokammeret som er festet til en tynn glass dekkglass, som ved påføring av et vakuum via en sprøyte, immobiliserer dyret og bringer ventrale strukturer som for eksempel nerveledning, segmental nerver, og kropps veggen muskler, i umiddelbar nærhet til dekkglass. Dette gjør det mulig for bildebehandling med høy oppløsning, og viktigere, unngår bruk av anesthetics og kjemikalier, noe som letter studiet av en rekke fysiologiske prosesser. Siden larver gjenopprette lett fra immobilisering, kan de lett utsettes for flere imaging sesjoner. Dette gjør det mulig for longitudinelle studier over tid kurs som spenner fra timer til dager. Denne protokollen beskriver steg-for-steg hvordan du forberede chip og hvordan du kan utnytte brikken for live avbildning av nevrale hendelser i 3. stadiums larver. Disse hendelsene inkluderer rask transport av organeller i aksoner, kalsium svar til skade, og time-lapse undersøkelser om smugling av foto-konvertible proteiner over lange avstander og tidsskalaer. En annen anvendelse av brikken er å studere regenerativ og degenerative responser til aksonal skade, slik at den andre delen av denne protokoll beskriver en ny og enkel fremgangsmåte for å skade aksoner i perifere nerver av en segmental nerve knuse.
Bananflue, Drosophila melanogaster, har vært benyttet som modellorganisme i over 100 år, og har vist seg instrumental i å definere grunnleggende signal-og utviklingsveier som er bevart fra virvelløse dyr til menneske. Live-avbildning er en viktig tilnærming til å studere cellulære mekanismer, og den enkle kroppen plan og gjennomskinnelig cuticle av Drosophila larven gjør det til et attraktivt system for sanntidsavbildning, spesielt siden det er mange genetiske verktøy tilgjengelig for å uttrykke fluorescently merket proteiner i bestemte celletyper.
En viktig utfordring for live bildeteknikker er å invasivt immobilisere og plassere et dyr for mikroskopi. Konvensjonelle metoder omfatter immobilisering disseksjon 1,2 eller bruk av kloroform, som begge avlive dyret. De anestetika ether 4 og isofluorane 5-8 har også blitt brukt. Mens bedøvelse gir mange fordeler, De også hemmer nevral aktivitet og viktig fysiologi (inkludert hjerteslag) 9-11, dermed kan påvirke prosessen studert og skape stress på dyret. Det er også menneskelig sikkerhet bekymringer for å jobbe med eter og isofluorane.
Vi har utviklet et stoff-fri metode for å immobilisere Drosophila larver i et enkelt lag PDMS microfluidic enhet, som vi kaller den "larve chip '12. Denne protokollen vil beskrive hvordan få tak i eller lage larven chip, og hvordan du kan utnytte det for live bildebehandling i tidlig-iscenesatt 3 rd stadiums larver. Brikken består av en tettsittende mikrokammeret, som ved påføring av et vakuum via en sprøyte, immobiliserer dyret via skånsom mekanisk kraft. Immobilisering metoden bringer ventral strukturer som nerve ledningen, segmental nerver, og kroppen veggen muskler, med nærhet til et glass dekkglass. Dette gir høy oppløsning avbildning av slike strukturer med høy numerisk aperTure (høy forstørrelse) siktemål.
Fordeler med larve-brikken fremfor andre konvensjonelle teknikker, omfatter følgende: (i) Anvendelse av larven chip erstatter bruk av kjemikalier, noe som åpner for in vivo avbildning av unanesthetized dyr. (Ii) Larver komme umiddelbart etter frigjøring fra brikken (i motsetning til en 2 timers restitusjonsperiode for isofluorane 8,13). Dette gjør det mulig for bildebehandling enn brede tidsskalaer, fra millisekunder til minutter, til timer og dager. (Iii) Anvendelse av PDMS, som er en gass-permeable materiale, gjør det mulig for kontinuerlig diffusjon av oksygen / luft fra omgivelsene inn i den larve kroppen. (Iv) Brikken er enkel og trygg å bruke, og (v) den er gjenbrukbar, og kan fremstilles til en rimelig pris.
I tillegg til instruksjoner for bruk larven chip, vil denne protokollen gir flere eksempler på bruken for å studere nevrale hendelser i 3. stadiums larver. Disse inkluderer direkte avbildning av axonal transport, kalsium svar til skade, og time-lapse undersøkelser om smugling av foto-konvertible proteiner over lange avstander og tidsskalaer.
En annen anvendelse av brikken er å studere neuronal respons på aksonal skade. For dette en ekstra prosedyre er beskrevet (i del 3) for å ha skadet axons innenfor perifere nerver ved en sekvensiell nerve knuse. Denne enkle analysen kan utføres både hurtig og reproduserbart under en standard disseksjon stereomikroskop, som gjør det mulig for mange dyr som skal behandles på samme tid. Cellulære reaksjoner på skaden kan studeres av levende avbildning i larven chip.
Å gjøre eller skaffe larven chip:
Larvene brikken består av en PDMS-blokken (kalt "PDMS chip") festet til en glass dekkglass. Protokollen i trinn 1 beskriver fremgangsmåten for å lage og bruke larva chips, forutsatt en SU-8 mold er tilgjengelig. SU-8 mold er microfabricated av photolithographically mønster en 140 mikrometer tykt SU-8 fotoresistsjiktet på en silisiumskive (for detaljer se Ghannad-Rezaie et al. 12). Som microfabrication av SU-8 mold krever tilgang til spesialisert utstyr, anbefaler vi å bestille den fra en microfabrication anlegget (f.eks. LNF-anlegget ved University of Michigan 14), eller fra et støperi ved å sende dem chip design som er gitt som en tilleggsfilen. Dersom man ønsker å endre utformingen av PDMS-brikke (for eksempel for bruk med larver av forskjellige størrelser), et CAD-programvare som håndterer DXF filer (f.eks Autocad) kan brukes. En SU-8 mugg kan også gjøres i huset å følge instruksjonene i Mondal et al. 27 Mange lesere kan finne det praktisk å bare få en prøve PDMS chip for å prøve ut den teknikken før fabrikere sine egne brikker. Dette vil bli gjort fritt tilgjengelig på forespørsel.
Bruk av microfluidic 'larve chip "for direkte avbildning:
Den immobiliserende metode i larven chip unngår bruk av bedøvelsesmidler, og i stedet innebærer trykk, via anvendelse av et vakuum, for å begrense dyrets bevegelser. Mens dyr kan overleve immobilisering i brikken for flere timer 12, en kortere immobilisering periode (5-15 min) er anbefalt. Dette er nok tid for imaging mange cellulære hendelser av interesse, inkludert endringer i intracellulært kalsium, eller rask aksonal transport. Dette er også tilstrekkelig tid til ønskede manipulasjoner i levende dyr, for eksempel laser baserte mikrokirurgi, fotobleking, og photoconverSion.
For å studere arrangement i lengderetningen over lengre tidsrom i et enkelt dyr, kan dyrene bli plassert inn i brikken og avbildes flere ganger, separert ved hvileperioder. Drue juice agar plater er ideelle for hvile mellom bilde økter, som de gir en enkel matkilde og fuktighet. Flere bildebehandlings økter gjør påvirker larve overlevelse til en grad, ettersom hver økt bærer noen risiko for å skade dyret (se del 2 i feilsøking, nedenfor). Dyr kan rutinemessig avbildes> 5 ganger i løpet av to dager med en større enn 50% overlevelsesrate. Siden dyrene ikke bedøves, de friske og motile umiddelbart etter frigjøring av vakuumet i brikken. Det er derfor ikke behov for utvinning tid mellom avbildnings sesjoner, slik at tidsavstanden mellom sesjoner er fleksibel og kan bli justert til målene for forsøket.
Feilsøking:
Den vanligste teknisk ersaksøker med larve chip og anbefalte løsninger er følgende:
(1) Dyret beveger seg for mye. For mye mobilitet kan interferere med de bildedannende mål. De vanligste årsakene til dette i larven chip er a) dyret er for liten for chip, eller b) vakuumtrykket brukes under immobilisering trinnet er kompromittert. Larven chip beskrevet i denne protokollen er designet for tidlig iscenesatt 3 rd stadiums larver. Den optimale størrelse for dyret er 3,5-4 mm i lengde (langs anteroposteriøre akse). For å sikre at vakuumtrykket er tilstrekkelig, Trekk sprøyten 2-2,5 ml, eller til du kjenner motstand i håndtaket. En indikasjon på at vakuumet virker, er at små bobler i den ytre kanal kan ses å bevege seg langsomt mot vakuumkilden. En annen indikasjon på at dekk bør alltid ha med brikken når brikken er løftet fra toppen (og dette er den anbefalte metode for transport av kammeretnår larvene er posisjonert og vakuumet er på). Vakuumet kan bli svekket hvis det er sprekker i slangen, eller om det er olje i slangen. Dette kan enkelt løses ved å erstatte 23 G dispense nålespissen og polyetylen-50 rør (fra trinn 01.06 til 01.14).
(2) Dyret dør etter bildebehandling i brikken. Fremgangsmåten er beregnet til å forårsake minimal belastning på dyret, og dyr av villtype genotype har en> 90% overlevelse, selv etter en time for immobilisering på brikken 12.. Siden enkelte genotyper kan være mindre motstandsdyktige mot stress av chip, først sjekke at vill type dyr (for eksempel, Canton S) overleve immobilisering teknikk. a) Den vanligste årsaken til dødelighet er korrekt posisjonering av larven (se figurene 2G-H). Dersom deler av hårstråene, hodet og luftrøret er ikke helt og holdent inne i kammeret, så de kan bli ødelagt i løpet av immobilisering, og enlarve som er for stor for chip (> 4 mm) er mindre sannsynlighet for å overleve. b) En mindre vanlig årsak til dødelighet er bruken av for mye trykk eller vakuum ved lasting av brikken. Når den er riktig plassert i brikken, trykket som genereres av vakuum er godt tolerert. Men overdreven press, enten fra vakuum eller i den innledende fasen av posisjonering dyret kan være et problem. Det er best å lære graden av press som trengs empirisk ved forsøk med villtype larver av riktig størrelse. c) Hvis for mye Halocarbon olje dekker dyrets luftrøret dyret kan potensielt ha problemer med langsiktig overlevelse. Oljen spiller flere viktige roller i chip: er det viktig for etableringen av vakuum, optikken under bildebehandling, og det motvirker uttørking i brikken. Men overdreven olje bør unngås. (Dette kan også føre til at olje i røret og sprøyten, kompromittere vakuum). De foreslåtte protokoll strøk bare ventral side av larven med olje, deretter removes overflødig olje ved plassering av larven på en ren dekkglass før de overføres til den endelige dekkglass for bildebehandling. d) fototoksistet kan oppleves fra bildebehandlings økten. Som med alle levende bildebehandlingsprogrammet, er det ideelt å bruke korte eksponeringstider med lav intensitet laserlys, noe som er best oppnås ved hjelp av en svært følsom kamera eller detektor. Prøv å minimere belysning med UV-lys, inkludert bredspektret lys skapt av Hg lyskilder.
Andre problemstillinger og fremtidige retninger:
Siden denne metoden ikke utnytter bedøvelsesmidler, fortsetter dyrets hjerte å slå. Dette skaper noen uunngåelig mobilitet, noe som påvirker bilde enkelte steder mer enn andre. Eksemplene her viser at den ventrale nerve ledningen, segmental nerver, og kroppsveggen lett kan avbildes uten innblanding fra hjerterytme. I tilfeller der hjerterytme påvirker bildebehandling, kan de vanlige bevegelser noen ganger korrigeres for medi analyseprogramvare (for eksempel bildestabilisator plugin for ImageJ). Dette fungerer godt når enkelte objektene beveger seg på en rask tidsskala (for eksempel ~ 1 mikrometer / sek for rask aksonal transport) eller på en veldig langsom tidsskala (minutter til timer). Imidlertid, når det objekt (er) av interesse trekk med en rekke hastigheter og retninger, kan det være vanskeligere å korrigere for hjerterytme indusert bevegelser.
En annen sak er liten variasjon i optikk fra dyr til dyr, eller mellom flere imaging økter av samme dyr i brikken. Jo dypere objektet av interesse er innen dyret, jo større denne variasjonen blir. Segment nerver og ventrale nerve ledningen er vanligvis altfor dypt inne så dyr til å bli fotografert på en vanlig mikroskop. Men det mildt press opplevd i larven chip skyver disse strukturene svært nær skjellaget og dekkglass. Den nøyaktige avstanden til disse strukturene fra dekk vil ha små variasjoner fra trIAL til rettssaken. Variasjonen for objekter lukke skjellaget, slik som celle likene av sensoriske nerveceller, er mindre. Det er derfor viktig, spesielt for å gjøre målinger av intensiteten til å utnytte et stort antall dyr og uavhengige forsøk for å redegjøre for variasjon i optikken.
Mens de som vises her eksempler har fokusert på prosesser i nevroner, bør tilnærmingen være mottagelig for bildebehandling noen struktur i dyret som kan bringes i fokus dybden av mikroskop mål. Dette inkluderer skjellaget, kroppen veggen muskler, og deres NMJs. Trachea på den ventrale side av dyret og potensielt deler av fordøyelseskanalen kan også avbildes. Dyret kan også være plassert med sin dorsale side mot dekkglass for kortvarig avbildning av strukturer nær den dorsale overflate. Evnen til å bildestrukturer dypt inne i dyret er begrenset av arbeidsavstanden til mikroskopobjektiv anvendes. Strukturer som imVagina-plater er utilgjengelige for høy forstørrelse (f.eks 40X) mål.
Larven chips som er beskrevet i denne protokollen er designet for larver tidlig i det 3. instar scenen (som varierer i størrelse 3,5 til 4 mm). Men mange interessante spørsmål krever bildebehandling på ulike larvestadier. Mindre brikker for å imøtekomme 2 nd stadiums larver, eller større chips å imøtekomme sene 3 rd instars kan enkelt utformet etter samme prinsipp. (Supplerende Figur 1 inneholder en lett modifiserbare DXF fil for å lage silisium muggsopp med endrede kammerstørrelser). Den enkle prinsippet for reversibel tetning kan også festes på andre organismer som for eksempel C. elegans eller sebrafisk, med hoved variant blir kammeret størrelse. En nyttig fremtidige retningen er å utforme en chip som kan immobilisere mange dyr på en gang, for å bruke for screening formål. Men for denne, vil utformingen må være vesentlig forskjelligfra dagens enhet, der spørsmål om plassering av dyr i brikken må behandles med for hvert dyr uavhengig.
Den nerve knuse analysen for å studere skade responser i larve perifere nerver:
Den nerve knuse analysen beskrevet her for larve segmentell nerver er en enkel metode for å innføre en skade i perifere axoner i Drosophila. Fordelene ved denne fremgangsmåte omfatter: a) det er lett å gjennomføre med standard verktøy som finnes i et Drosophila lab (et stereomikroskop CO to source-og tang), b) den kan gjennomføres raskt for mange dyr, slik biokjemisk analyse av nerveledning etter skade gjennomfør 14, c) de molekylære og cellulære responser til denne skaden er svært reproduserbare 14,15,28 og kan brukes til å oppdage prosesser som også er viktige i virveldyr nevroner 29,30.
Alternative metoder for å skade nerveceller er å focusa høyeffekts laser, for eksempel en pulset-UV eller femtosecond laser, for å bryte en axon via laser mikro 17,31-33. Larvene brikken er en ideell metode for posisjonering av dyr for en slik mikrokirurgi. Imidlertid, på grunn av små forskjeller i optikken mellom studier diskutert ovenfor, kan laserbasert metode være vanskeligere å reprodusere i larver, spesielt i larve segmentell nerver. Også laserbasert aksonal skade krever mer tid for å plassere hvert dyr, og derfor er vanskeligere å utføre i stor målestokk (med et stort antall dyr).
Feilsøking:
Den hyppigst påtruffet teknisk problem fra nerve forelskelsen er død av skader på indre organer. Når du driver trengselen, er det viktig ikke å klemme den ventrale nerve ledningen, spyttkjertlene, eller tarmen. Det er også viktig ikke å punktere skjellaget. Disse problemene er best unngås ved å bringe pinsett i en 45 ° vinkel til skjellaget surface (se figur 3).
Kvaliteten på tang har en stor innvirkning på effektiviteten av knuse-og overlevelses etterpå. Vi anbefaler Dumostar nummer fem tang. For å beholde sin skarphet, må pinsett håndteres med forsiktighet, ikke brukes til andre formål, og erstattet når de blir sløve eller bøyd.
Størrelsen av dyret kan også påvirke effektiviteten av knuse. Små dyr (mindre enn 3 mm i lengde) er mye mindre sannsynlighet for å overleve skaden. Med store dyr, (vandrende 3 rd instars), er det vanskeligere å finne de nervene og unngå skade på de større spyttkjertlene og tarmer, og det er mindre tid til å studere skade svar før forpupping. Denne nerve knuse blir mest effektivt utført i begynnelsen 3. instar larver (som er ~ 3 til 4,5 mm i lengde langs anteroposteriøre aksen).
Den matkilde at dyret er hevet over kan påvirkestyrken på skjellaget og overlevelse etter trengselen. Det anbefales å heve dyr i mat laget av en standard gjær-glukose oppskrift.
Den beste metoden for å lære hvordan du gjør knuse effektivt er å øve på mange dyr, først med det primære målet om å oppnå overlevelse (og ikke pupation) 24 timer etter trengselen. Nybegynnere har normalt en lav overlevelse (f.eks 10%), men når teknikken er lært, kan overlevelsen nå ~ 90%.
Andre problemstillinger og fremtidige retninger:
Den knuse analysen gir en kraftig metode for å studere spirende av axon proksimale til skade området og degenerasjon av axoner og synapser distalt for skaden området. Selv om utbredelsen av degenerasjon variere mellom ulike typer nevroner, er de svært reproduserbare innenfor et gitt neuron-type, som gir bevis på reproduserbarheten av skaden assay.
I kontrast til den "regenerative" sproutingrespons observert i proksimale axons er mer utfordrende å studere. Alle aksoner i segmental nerve initiere omfattende spirende nærheten av skadestedet (for eksempel, se figur 6 og figur 3). Men graden av spirende kan variere fra nervecelle til neuron, og det er vanskelig å kvantifisere. En tilsvarende grad og variasjon i spirende kan observeres etter flere fokale lesjoner av single motoneurons i segmental nerver introdusert ved hjelp av en UV Pulsed dye laser. Vi tolker at nondiscriminate retningen på den spirende skyldes fravær av veiledning pekepinner i segmentell nerver. I kontrast, sensoriske nervecellen axons skadet av laser i nærheten av sine celle organer gjennomgå ny aksonal vekst i samme retning som den tapte axon 34. Axoner i denne regionen av dyret er trolig utsatt for mer spesifikk posisjonsinformasjon for veiledning av de regenererende axoner. Miljøet innen segmental nervene er usannsynlig å ha mye resemblance til miljøet som axons opprinnelig navigert under deres veiledning i embryoet, dermed ikke forventes å ha opplysninger å veilede regenererende axons.
En annen begrensning for å studere regenerering bruke den segmental nerve knuse analysen er at skadde sensoriske og motoneuron axons fortsatt ha en betydelig avstand til å dekke (0.25-1 mm) for å nå sine mål, og en begrenset tidsramme (<3 dager) før dyret gjennomgår pupation. En fersk studie har identifisert en genetisk manipulering av prothoraciotropic hormon reseptor som tredobler varigheten av 3. instar larvestadiet 35. Dette manipulasjon vil forlenge tidsrammen for å studere utvinning og degenerasjon av nerveceller etter skade betydelig, til ni i stedet for tre dager. Dette kan være lang nok til å observere nye hendelser, som for eksempel ny tilkobling av en skadet akson med sin postsynaptiske mål, spesielt hvis skaden er forårsaket nær den synaptiske ending.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation, (stipend nummer IOS-0842701 til CAC), og National Institute of Health (R00MH080599 til BY, R21 NS062313 til NC, og NS069844 til CAC). Vi ønsker å takke James Schutt, Emily Han, og Leni Truong for teknisk support, og Bloomington Stock senter for flueliner. Alle brikkene ble fabrikkert på Lurie Nanofabrication Facility ved University of Michigan.
0.5 mm Polyethylene tubing | Fisher scientific | 14-170-11B | Polyethylene tubing, I.D. = 0.023’’, O.D. = 0.038’’ |
1 mm Polyurethane tubing | Fisher scientific | BB521-63 | Polyurethane tubing, I.D. = 0.063’’, O.D. = 0.125’’ |
barb to barb connector | Bio Rad | 732-8300 | 0.8 mm barb to barb connector |
3-way stopcock valve | Bio Rad | 732-8104 | Screw on valve for the syringe |
Syringe (20 ml) | Fisher scientific | 14-817-33 | Screw on 20 ml syringe for generating vacuum |
Dispensing needles, 23 G (.4mm I.D., .6mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A684 | Needle for outlet connection |
Dispensing needles, 21 G, (.6mm I.D., .8mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A679 | Needle for outlet connection |
Halocarbon oil | Sigma | H8898 | Halocarbon oil 700 |
Dumostar Number 5 Forceps | Roboz | RS-498 | For nerve crush |
PDMS Kit (Base and curing agent) | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear |
Glass Coverslips | Fisher scientific | 12-544-C | 24 x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective) |
Disposable Plastic Cup (9 oz.) | |||
Plastic coffee stirrer stick | |||
Razor Blade | |||
Grape juice agar plates | See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe |